Способ определения новокаина в биологическом материале



 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2546294:

Шорманов Владимир Камбулатович (RU)
Коренман Яков Израильевич (RU)
Галушкин Святослав Геннадьевич (RU)
Чибисова Татьяна Викторовна (RU)

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий новокаин, измельчают, трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика. Достигается повышение чувствительности определения. 2 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения новокаина в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения новокаина в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект обрабатывают смесью ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, подвергают процессу перколяции с использованием в качестве извлекающего агента смеси ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, при этом элюирование анализируемого вещества осуществляют со скоростью 5-6 мл/мин, элюат отделяют, подщелачивают 25% раствором аммиака до pH 10,0, насыщают хлоридом натрия для разделения водного и ацетонового слоев, встряхивают, ацетоновый слой отделяют, водный слой дважды встряхивают с ацетоном, ацетоновые экстракты объединяют, ацетон из объединенного экстракта упаривают, водный остаток охлаждают, обрабатывают ацетоном, образовавшийся осадок отфильтровывают, ацетон упаривают из фильтрата, водный остаток подкисляют концентрированной хлороводородной кислотой до pH 2-3, встряхивают с эфиром, эфирный экстракт удаляют, водный слой подщелачивают раствором аммиака до pH 10,0, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирный экстракт упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм с использованием двухкомпонентной подвижной фазы диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и определяют методом фотометрии (Садыков З.К., Икрамов Л.Т. Обнаружение новокаина и n-аминобензойной кислоты в трупном материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 1990. - Т.33, №4. - С.32-34).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и не предусматривает возможности количественного определения новокаина.

Известен способ определения новокаина в биологическом материале путем неоднократного настаивания биологического объекта с 1 М раствором хлорной кислоты, очистки полученного извлечения с применением сорбции в колонке с полиамидом, элюирования из сорбента 95% этанолом, переведения анализируемого вещества, элюированного из колонки, в азокраситель при использовании в качестве азосоставляющего 3-α,γ-дикарбоксипропилроданина и последующего фотометрирования образующегося окрашенного раствора (Вощинина Н.А. Химико-токсикологическое исследование производных n-аминобензойной кислоты (анестезина, новокаина, новокаинамида): Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Курский государственный медицинский университет. - Курск, 2000. - С.9-10, 12-13).

Способ отличается недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.

Наиболее близким является способ определения новокаина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект обрабатывают ацетоном, содержащим 30% воды, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, биоматериал на фильтре промывают ацетоном, содержащим 30% воды, контролируя полноту выделения анализируемого вещества из биологического объекта реакцией образования азокрасителя, извлечение объединяют с порциями промывной жидкости, объединенное извлечение насыщают хлоридом натрия для разделения фаз, образующуюся ацетоновую фазу отделяют, упаривают из нее ацетон при 50°C на водяной бане, водный остаток объединяют с водно-солевой фазой, объединенный раствор подщелачивают раствором аммиака до pH 10, экстрагируют диэтиловым эфиром, растворитель из эфирного экстракта испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, после проявления хроматограммы анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием в набивной колонке длиной 100 м и внутренним диаметром 0,3 см, заполненной неподвижной фазой, представляющей собой 3% SE-30 на инертном носителе Supelcoport (80-120 меш), при температуре термостата колонки 190°C, испарителя - 250°C, с использованием в качестве газа-носителя азота, который пропускается со скоростью 60 мл/мин, скорость пропускания водорода составляет 40 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин (Садиков З.К. Изолирование, обнаружение и определение новокаина и n-аминобензойной кислоты при судебно-химических исследованиях: Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова. - Москва, 1990. - С.11, 13, 14-16).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий новокаин, измельчают, трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани печени

К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани печени прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.

Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.

Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 мл 0,025% раствора новокаина в метаноле и доводят объем содержимого каждой колбы до метки метанолом.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в испаритель газожидкостного хроматографа.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10-9-2,0·10-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=124092·C+859,

где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения новокаина в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани легких

К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани легких прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).

4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.

Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.

Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.

Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.

Результаты количественного определения новокаина в ткани легких представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,0·102 раз повышает чувствительность определения в детектируемой пробе и в 1,6·102 раз - в биологическом материале.

Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.

Таблица 1
Результаты определения новокаина в ткани печени (n=5; p=0,95)
Внесено новокаина, мг в 10 г ткани печени Найдено Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески
1 10,00 9076452 7,314·10-5 9,142 91,42
2 10,00 8652553 6,972·10-5 8,715 87,15 S=3,71
3 10,00 9484466 7,642·10-5 9,553 95,53
4 10,00 9420931 7,591·10-5 9,489 94,89
5 10,00 8797493 7,089·10-5 8,861 88,61
Таблица 2
Результаты определения новокаина в ткани легких (n=5; р=0,95)
Внесено новокаина, мг в 10 г ткани легких Найдено Метрологические характеристики, %
площадь пика на хроматограмме, усл. ед. мг в хроматографируемой пробе мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал % от внесенной в биоматериал навески
1 10,00 8953352 7,214·10-5 9,018 90,18
2 10,00 9535096 7,683·10-5 9,604 96,04 S=3,58
3 10,00 8762747 7,061·10-5 8,826 88,26
4 10,00 9515241 7,667·10-5 9,584 95,84
5 10,00 8964272 7,223·10-5 9,029 90,29
Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени)
Показатели Предлагаемый способ Известный способ
Чувствительность (открываемый минимум)
а) в 100 г биоматериала 5,0·10-8 г 8,0·10-6 г
б) в детектируемой пробе 2,5·10-9 г 5,0·10-7 г
Интервал линейности градуировочного графика (г в детектируемой пробе) 5·10-9-2,0·10-7 г 2,0·10-6-1,0·10-5 г
Степень извлечения 91,52±4,61% 58,44±5,07%

Способ определения новокаина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект обрабатывают ацетоном, жидкое извлечение отделяют, упаривают из него ацетон, проводят экстракцию из водно-щелочной среды органическим экстрагентом, растворитель из экстракта испаряют до сухого остатка, остаток растворяют, хроматографируют в силикагеле, используя двухкомпонентную подвижную фазу, и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии, в колонке с неподвижной фазой с использованием газа-носителя, отличающийся тем, что для обработки биологического объекта применяют ацетон, содержащий 0,2-0,4% воды, обработку ацетоном проводят трижды, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с рН 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до рН 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, в качестве органического экстрагента для экстракции из водно-щелочной среды используют 30% раствор камфоры в метилацетате, экстракцию проводят двукратно при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, после испарения растворителя из экстракта до сухого остатка остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, хроматографируют в колонке силикагеля КСС №3 80/120 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, перед определением методом газожидкостной хроматографии остаток растворяют в метаноле, при определении используют газо-жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, определение проводят в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, газом-носителем является гелий, используют масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, вычисляя количество новокаина по площади хроматографического пика.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и токсикологической химии, а именно к способам определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий.
Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской диагностике в области онкологии, и описывает способ прогнозирования развития метастазов у больных меланомой кожи.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования у пациента с влажной возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD) повышенной вероятности эффекта от лечения высокоаффинным антителом против VEGF, в частности ранибизумабом.
Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ дифференциальной диагностики стеатоза печени и стеатогепатита путем биохимического исследования, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют фосфолипазу A2, оксид азота и эндотоксин и при значении фосфолипазы A2 199,7-252,5 нг/мл, оксида азота 93-94,6 мкмоль/л и эндотоксина 2,2-2,6 ЕЭ/мл диагностируют стеатоз печени, а при значении фосфолипазы A2 412,5-576,5 нг/мл, оксида азота 137,5-168,5 мкмоль/л и эндотоксина 3,32-4,18 ЕЭ/мл диагностируют стеатогепатит.
Изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования высокого риска развития производственно обусловленных и профессиональных заболеваний у работников химического комплекса, занятых во вредных условиях труда, включающий определение в сыворотке крови общего антиоксидантного статуса, при этом дополнительно в сыворотке крови определяют количественное содержание продуктов перекисного окисления липидов и при одновременном увеличении количественного содержания перекисей в липидах более 4,31 мкмоль/л и снижении общего антиоксидантного статуса менее 1,3 ммоль/л прогнозируют высокий риск развития производственно обусловленных и профессиональных заболеваний.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для лечения вторичной митохондриальной дисфункции у детей с патологией мочевой системы.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики апоптоза лимфоцитов. Для этого клетки выделяют, инкубируют 48 часов при температуре 37°С и с 5% содержанием СО2, с добавлением индуктора апоптоза дексаметазона в концентрации 10-4 моль/мл.

Группа изобретений относится к инструментам для контроля качества и безопасности в ходе производства нейротоксинов. В частности, группа изобретений относится к способу определения количества частично процессированного и/или непроцессированного нейротоксин А полипептида (BoNT/A) в растворе, содержащем процессированный и частично процессированный и/или непроцессированный BoNT/A, где указанный способ содержит стадию контактирования образца указанного раствора с захватывающим антителом, которое специфически связывается с частично процессированным и непроцессированным BoNT/A в условиях, допускающих связывание указанного антитела с указанным частично процессированным и непроцессированным BoNT/A, в результате чего формируется комплекс, и стадию определения количества образованного комплекса, где количество комплекса является показателем количества частичного процессированного и/или непроцессированного BoNT/A в указанном растворе.
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Изобретение представляет способ дифференциальной диагностики типов хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) при влажной форме возрастной макулярной дистрофии, отличающийся тем, что производят забор влаги передней камеры глаза, определяют концентрацию фактора роста эндотелия сосудов, после чего оценивают результат по уровню данных показателей.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии, и может быть использовано для прогнозирования замедленной консолидации переломов. Описано прогнозирование замедленной консолидации переломов, которое осуществляют на основании определения относительного содержания ростового фактора (TGFβ1), лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА), дезоксипиридинолина (ДПИД), регистрации показателя микроциркуляции (ПМ) конечностей пациента на 10-е сутки посттравматического периода и расчета коэффициента по предлагаемой формуле, на основании значения которого прогнозируют замедленную консолидацию переломов.

Изобретение относится к медицине и токсикологической химии, а именно к способам определения 3-метоксигидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий.

Изобретение относится к области применения ионообменных процессов, ионитов, а именно комплексообразующих ионитов (комплекситов), например сильноосновных анионитов в форме комплексообразующих агентов, и может быть использовано для определения динамической сорбционной емкости комплекситов по ионам переходных металлов (ПМ).

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабо-раторий.

Изобретение используется для идентификации неизвестных компонентов сложных смесей веществ природного и технического происхождения в различных отраслях промышленности: химической, газовой, нефтяной, медицине, экологии, пищевой, парфюмерной и др.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано при анализе сыворотки венозной крови человека и животных методом жидкостной хроматографии, а также любым другим методом, непосредственным объектом исследования которого может являться водно-метанольный экстракт, получаемый из высушенной сыворотки крови.

Изобретение относится к способу получения активной фармацевтической субстанции для синтеза препаратов галлия-68, применяемых в позитронно-эмиссионной томографии.
Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения 2,4-дихлорфенола в крови.
Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции.

Изобретение относится к области защиты окружающей среды. Предложен способ определения содержания в газообразной среде труднолетучих органических соединений, таких как полиароматические углеводороды, карбоновые кислоты, спирты, сложные эфиры, н-алканы-С15-30.

Изобретение относится к регуляторам малых расходов газов, применяемых в газовых хроматографах. Технический результат заключается в повышение абсолютной и относительной точности поддержания расхода газа и точности анализа на хроматографах.

Изобретения относятся к фармацевтической композиции с антиишемической и антиоксидантной активностью в виде таблеток или капсул и способу ее получения. Композиция содержит 4-((3-оксо-3-этоксипропаноил)амино)бензойную кислоту в количестве от 40 до 80 мас.%, аминосодержащее соединение и фармацевтически приемлемые наполнители.
Наверх