Способ определения новокаина в биологическом материале
Владельцы патента RU 2546294:
Шорманов Владимир Камбулатович (RU)
Коренман Яков Израильевич (RU)
Галушкин Святослав Геннадьевич (RU)
Чибисова Татьяна Викторовна (RU)
Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий новокаин, измельчают, трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,6 мл/мин и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика. Достигается повышение чувствительности определения. 2 пр., 3 табл.
Изобретение относится к биологии, токсикологической и аналитической химии, а именно к способам определения новокаина в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.
Известен способ определения новокаина в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект обрабатывают смесью ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, подвергают процессу перколяции с использованием в качестве извлекающего агента смеси ацетона и воды в соотношении 2:1 по объему, при этом элюирование анализируемого вещества осуществляют со скоростью 5-6 мл/мин, элюат отделяют, подщелачивают 25% раствором аммиака до pH 10,0, насыщают хлоридом натрия для разделения водного и ацетонового слоев, встряхивают, ацетоновый слой отделяют, водный слой дважды встряхивают с ацетоном, ацетоновые экстракты объединяют, ацетон из объединенного экстракта упаривают, водный остаток охлаждают, обрабатывают ацетоном, образовавшийся осадок отфильтровывают, ацетон упаривают из фильтрата, водный остаток подкисляют концентрированной хлороводородной кислотой до pH 2-3, встряхивают с эфиром, эфирный экстракт удаляют, водный слой подщелачивают раствором аммиака до pH 10,0, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирный экстракт упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм с использованием двухкомпонентной подвижной фазы диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и определяют методом фотометрии (Садыков З.К., Икрамов Л.Т. Обнаружение новокаина и n-аминобензойной кислоты в трупном материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 1990. - Т.33, №4. - С.32-34).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и не предусматривает возможности количественного определения новокаина.
Известен способ определения новокаина в биологическом материале путем неоднократного настаивания биологического объекта с 1 М раствором хлорной кислоты, очистки полученного извлечения с применением сорбции в колонке с полиамидом, элюирования из сорбента 95% этанолом, переведения анализируемого вещества, элюированного из колонки, в азокраситель при использовании в качестве азосоставляющего 3-α,γ-дикарбоксипропилроданина и последующего фотометрирования образующегося окрашенного раствора (Вощинина Н.А. Химико-токсикологическое исследование производных n-аминобензойной кислоты (анестезина, новокаина, новокаинамида): Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Курский государственный медицинский университет. - Курск, 2000. - С.9-10, 12-13).
Способ отличается недостаточно высокими чувствительностью и селективностью.
Наиболее близким является способ определения новокаина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект обрабатывают ацетоном, содержащим 30% воды, жидкое извлечение отделяют фильтрованием, биоматериал на фильтре промывают ацетоном, содержащим 30% воды, контролируя полноту выделения анализируемого вещества из биологического объекта реакцией образования азокрасителя, извлечение объединяют с порциями промывной жидкости, объединенное извлечение насыщают хлоридом натрия для разделения фаз, образующуюся ацетоновую фазу отделяют, упаривают из нее ацетон при 50°C на водяной бане, водный остаток объединяют с водно-солевой фазой, объединенный раствор подщелачивают раствором аммиака до pH 10, экстрагируют диэтиловым эфиром, растворитель из эфирного экстракта испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в ацетоне, хроматографируют в тонком слое силикагеля L 5/40 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу диоксан-25% раствор аммиака в соотношении 100:0,5 по объему, после проявления хроматограммы анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием в набивной колонке длиной 100 м и внутренним диаметром 0,3 см, заполненной неподвижной фазой, представляющей собой 3% SE-30 на инертном носителе Supelcoport (80-120 меш), при температуре термостата колонки 190°C, испарителя - 250°C, с использованием в качестве газа-носителя азота, который пропускается со скоростью 60 мл/мин, скорость пропускания водорода составляет 40 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин (Садиков З.К. Изолирование, обнаружение и определение новокаина и n-аминобензойной кислоты при судебно-химических исследованиях: Автореф. дис.… канд. фармац. наук: (15.00.02). - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова. - Москва, 1990. - С.11, 13, 14-16).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.
Технический результат достигается тем, что биологический объект трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.
Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий новокаин, измельчают, трижды обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, жидкое извлечение отделяют, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с pH 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют двукратно порциями органического экстрагента, в качестве которого используют 30% раствор камфоры в метилацетате, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка, остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в колонку силикагеля КСС №3 80/120 мкм, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в метаноле и проводят определение методом газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 0,7 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани печени
К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани печени прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).
4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.
Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.
Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.
Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятом по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.
Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.
Построение градуировочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 мл 0,025% раствора новокаина в метаноле и доводят объем содержимого каждой колбы до метки метанолом.
4 мкл каждого из полученных растворов вводят в испаритель газожидкостного хроматографа.
Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.
Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.
Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.
По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 5·10-9-2,0·10-7 г.
Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S=124092·C+859,
где S - площадь хроматографического пика; С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.
Результаты количественного определения новокаина в ткани печени представлены в таблице 1.
Пример 2
Определение новокаина (2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоата гидрохлорида) в ткани легких
К 10 г измельченной (до размеров частиц 0,2-0,5 мм) ткани легких прибавляют 10 мг новокаина, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени биологический объект трижды по 45 минут обрабатывают при перемешивании ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 20 г каждая. Отдельные ацетоновые извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, ацетон из объединенного жидкого извлечения упаривают вместе с водой в токе воздуха при температуре 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, порциями по 15 г каждая при энергичном перемешивании, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха при 18-22°C до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл диэтилового эфира, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, прибавляя 10 мл данного растворителя, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с pH 1-2 по 20 мл каждая. Отдельные кисло-водные экстракты отделяют, объединяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до pH 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, экстрагируют органическим экстрагентом, в качестве которого используется 30% раствор камфоры в метилацетате, двукратно, порциями по 50 мл каждая, при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему. Органические экстракты отделяют, объединяют, растворитель из объединенного экстракта испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C до сухого остатка. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, полученный раствор вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.
Фракции элюата с 9 по 11 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°C. Остаток растворяют в 10 мл метанола (раствор А). 1,0 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят метанолом до метки (раствор Б).
4 мкл раствора Б вводят в испаритель газо-жидкостного хроматографа.
Определение проводят методом газо-жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6850 Network GC System с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5973 Network этой же фирмы.
Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой толщиной 0,33 мкм, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан.
Начальная температура термостата колонки составляет 80°C, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°C до 200°C со скоростью 40°C в минуту, затем от 200°C до 300°C со скоростью 12,5°C в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°C, температура квадруполя 150°C, температура интерфейса детектора 300°C, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество новокаина по площади хроматографического пика.
Газом-носителем является гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 0,7 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,5 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-500 m/z.
Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,14 мин соответствует новокаину. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 42, 58, 65, 71, 86, 92, 99, 120, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 86, интенсивность которой принимается за 100%.
Новокаин идентифицируют по сочетанию времени удерживания в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.
По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание новокаина, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.
Построение градуировочного графика
Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся в примере 1.
Результаты количественного определения новокаина в ткани легких представлены в таблице 2.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,0·102 раз повышает чувствительность определения в детектируемой пробе и в 1,6·102 раз - в биологическом материале.
Сравнительные характеристики предлагаемого и известного способов представлены в таблице 3.
| Таблица 1 | ||||||
| Результаты определения новокаина в ткани печени (n=5; p=0,95) | ||||||
| № | Внесено новокаина, мг в 10 г ткани печени | Найдено | Метрологические характеристики, % | |||
| площадь пика на хроматограмме, усл. ед. | мг в хроматографируемой пробе | мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал | % от внесенной в биоматериал навески | |||
| 1 | 10,00 | 9076452 | 7,314·10-5 | 9,142 | 91,42 |
|
| 2 | 10,00 | 8652553 | 6,972·10-5 | 8,715 | 87,15 | S=3,71 |
| 3 | 10,00 | 9484466 | 7,642·10-5 | 9,553 | 95,53 |
|
| 4 | 10,00 | 9420931 | 7,591·10-5 | 9,489 | 94,89 |
|
| 5 | 10,00 | 8797493 | 7,089·10-5 | 8,861 | 88,61 |
|
| Таблица 2 | ||||||
| Результаты определения новокаина в ткани легких (n=5; р=0,95) | ||||||
| № | Внесено новокаина, мг в 10 г ткани легких | Найдено | Метрологические характеристики, % | |||
| площадь пика на хроматограмме, усл. ед. | мг в хроматографируемой пробе | мг в пересчете на навеску, внесенную в биоматериал | % от внесенной в биоматериал навески | |||
| 1 | 10,00 | 8953352 | 7,214·10-5 | 9,018 | 90,18 |
|
| 2 | 10,00 | 9535096 | 7,683·10-5 | 9,604 | 96,04 | S=3,58 |
| 3 | 10,00 | 8762747 | 7,061·10-5 | 8,826 | 88,26 |
|
| 4 | 10,00 | 9515241 | 7,667·10-5 | 9,584 | 95,84 |
|
| 5 | 10,00 | 8964272 | 7,223·10-5 | 9,029 | 90,29 |
|
| Таблица 3 | ||
| Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени) | ||
| Показатели | Предлагаемый способ | Известный способ |
| Чувствительность (открываемый минимум) | ||
| а) в 100 г биоматериала | 5,0·10-8 г | 8,0·10-6 г |
| б) в детектируемой пробе | 2,5·10-9 г | 5,0·10-7 г |
| Интервал линейности градуировочного графика (г в детектируемой пробе) | 5·10-9-2,0·10-7 г | 2,0·10-6-1,0·10-5 г |
| Степень извлечения | 91,52±4,61% | 58,44±5,07% |
Способ определения новокаина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект обрабатывают ацетоном, жидкое извлечение отделяют, упаривают из него ацетон, проводят экстракцию из водно-щелочной среды органическим экстрагентом, растворитель из экстракта испаряют до сухого остатка, остаток растворяют, хроматографируют в силикагеле, используя двухкомпонентную подвижную фазу, и проводят определение методом газо-жидкостной хроматографии, в колонке с неподвижной фазой с использованием газа-носителя, отличающийся тем, что для обработки биологического объекта применяют ацетон, содержащий 0,2-0,4% воды, обработку ацетоном проводят трижды, ацетон из жидкого извлечения упаривают вместе с водой, остаток, полученный в результате упаривания, неоднократно обрабатывают ацетоном, содержащим 0,2-0,4% воды, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в диэтиловом эфире, полученный раствор разбавляют гексаном в соотношении 1:1 по объему, экстрагируют буферным раствором с рН 1-2, кисло-водный экстракт отделяют, нейтрализуют 10% раствором аммиака, подщелачивают аммонийным буферным раствором до рН 9,0-9,5, образующийся водно-щелочной раствор насыщают сульфатом аммония, в качестве органического экстрагента для экстракции из водно-щелочной среды используют 30% раствор камфоры в метилацетате, экстракцию проводят двукратно при соотношении водной и органической фаз 1:1 по объему, после испарения растворителя из экстракта до сухого остатка остаток растворяют в смеси дихлорметана и этанола, взятых в объемном отношении 1:1, хроматографируют в колонке силикагеля КСС №3 80/120 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу дихлорметан-этанол в соотношении 1:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, перед определением методом газожидкостной хроматографии остаток растворяют в метаноле, при определении используют газо-жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, определение проводят в капиллярной колонке DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м и внутренним диаметром 0,2 мм с неподвижной фазой, представляющей собой 5%-фенил-95%-метилполисилоксан, газом-носителем является гелий, используют масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 80°С, данная температура выдерживается в течение 1 минуты, в дальнейшем температура повышается от 80°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем от 200°С до 300°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 16 минут, температура инжектора составляет 200°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 300°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току, вычисляя количество новокаина по площади хроматографического пика.
