Способ определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови



Способ определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови
Способ определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови

 


Владельцы патента RU 2546531:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" Сибирского отделения РАМН (RU)

Изобретение относится к области медицины, а именно к методу медицинской диагностики, и может быть использовано в лабораторно-диагностической практике для определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови, как в норме, так и при патологических состояниях организма, в том числе анемии. Приводят функциональную и количественную оценку продуктов реакции на пиридоксальфосфат в нативных эритроцитах путем обработки взвеси эритроцитов в инкубационном растворе при 37°C, в состав которого входят: 0,1 М фосфатный буфер pH 7,4-7,6; нитросиний тетразолий - 1 мг; НАДФ+ - 1 мг; пиридоксаль-5-фосфат - 26,5 мг. В 500 мкл инкубационного раствора помещают 200 мкл цельной крови с коагулянтом в пробирки PUTH КЗ ЭДТА. Инкубация проводится в течение 30 мин при 37°C. Готовят монослойный мазок и подсушивают при комнатной температуре, после чего изучают под цифровым микроскопом по компьютерной программе «Scion Corporation» цитофотометрическим методом плотность продуктов реакции, приходящуюся на 1 эритроцит. Изобретение позволяет решать диагностические и научно-исследовательские задачи. 2 ил.

 

1. Цель изобретения - разработать способ выявления в эритроцитах периферической крови беременных на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции гистохимическим методом содержание пиридоксальфосфата.

2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке метода, выявляющего гистохимическим способом содержание в эритроцитах пиридоксальфосфата, подавляющего оксигенацию гемоглобина.

3. Раскрытие изобретения

С помощью радиоактивной метки доказано, что пиридоксальфосфат, который является конкурентом 2,3-дифосфоглицерата (2,3ДФГ) в образовании комплекса с гемоглобином, образует связь с деоксигемоглобином посредством N-конечных α-аминных групп β-цепей (3). Блокирование N-концевых групп приводит к потере влияния 2,3ДФГ на сродство гемоглобина к кислороду [4]. Предполагают, что одной из этих групп, с которой 2,3ДФГ образует солевую связь, является α-аминная группа валина [2]. Однако до настоящего времени нет представлений, может ли меняться содержание пиридоксальфосфата в эритроцитах и под влиянием каких факторов, действующих на них в периферической крови. Для решения этого вопроса необходим метод, позволяющий выявлять содержание пиридоксальфосфата в эритроцитах и определять его количественное содержание.

4. Новая техническая задача

Разрабатывается новый метод, позволяющий гистохимическим способом выявлять пиридоксальфосфат в эритроцитах и цитофотометрически определять его содержание в отдельно взятом эритроците.

5. Предложенный метод принципиально отличается от ранее применявшихся, направленных на определение радиоактивной меткой только в присутствии пиридоксальфосфата в эритроцитах. Предложенный метод позволяет выявлять гистохимической реакцией не только наличие пиридоксальфосфата в отдельно взятом эритроците, но и регистрировать его содержание цитофотометрическим методом в зависимости от меняющихся условий воздействия на эритроциты периферической крови.

6. Осуществление изобретения

6.1. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ХЦМВИ) в стадии обострения на третьем триместре гестации (основная группа) и 15 беременных без таковой патологии (контрольная группа). Диагноз обострения ХЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM к ЦМВ или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также наличия ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекс авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

6.2. Пиридоксальфосфат в эритроцитах периферической крови определяли следующим методом. Субстратом служил 0,1 М раствор пиридоксаль-5-фосфата (Reanal, Венгрия). Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера pH 7,4-7,6 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (USA) в конечной концентрации 5 ммоль, НАДФ+ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 ммоль. Состав инкубационной среды: 0,1 М фосфатный буфер рН 7,4-7,6; нитросиний тетразолий - 1 мг; НАДФ+ - 1 мг; пиридоксаль-5-фосфат - 26,5 мг. В 500 мкл раствора вносили 200 мкл цельной крови с коагулятом, взятой из локтевой вены утром натощак. Инкубационный раствор помещали в вакуумные пробирки PUTH, КЗ ЭДТА. Инкубация длилась 30 мин при 37°C. Каплю инкубационного раствора наносили на предметное стекло и готовили монослойный мазок на центрифуге «Diffe Spin-2» (USA). Полученные мазки высушивали при комнатной температуре и изучали с помощью цифрового микроскопа МТ (Япония), связанного с компьютерной программой «Scion Corporation», позволяющей на изображении мазка выделять отдельно взятый эритроцит , определять его площадь и автоматически получать количество продукта реакции.

6.3. Для контроля брали адекватное количество буфера.

6.4. Эффективность предложенного метода проверяли на эритроцитах, взятых от беременных после обострения цитомегаловирусной инфекции при титре 1:1600.

7. Содержание оксигемоглобина определяли по методу Эвелина и Мэллой (1).

8. Статистическую обработку данных осуществляли по критерию Манна-Уитни, гипотезу о статистической значимости различий двух выборок - с помощью t-критерия Стьюдента. Значения считали достоверными при p<0,01.

9. Полученные данные

Исследования показали, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации в периферической крови увеличивается число эритроцитов, содержащих высокую реакцию на пиридоксальфосфат до 65,0±1,2% (контроль - 7,90±0,09%). Интенсивность реакции при титре к цитомегаловирусу 1:1600 в одном эритроците резко возрастает и составляет 58,00±0,95 усл. ед. (контроль - 15,00±0,20 усл. ед.) Нарастание пиридоксальфосфата в эритроцитах резко снижает содержание в крови оксигемоглобина - до 94,5±1,2%, что становится угрозой формирования у беременной анемии.

Литература

1. Покровский А.А. Справочник. Биохимические методы и исследования. М.: Медицина. 1969. 337 с.

2. Федоров Н.А. Нормальное кроветворения и его регуляция. М.: Медицина. 1976. 543 с.

3. Benesch R.E., Benesch R. Interaction of red cell organic phosphates with hemoglobin // Forsvar med. 1969. V. 5. P. 154-159.

4. Bunn H., Briehl R. The interaction of 2,3-diphosphoglucerate with various human hemoglobins // J. Clin, invest. 1970. V. 49. P. 1088.

На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция в эритроцитах на пиридоксальфосфат у беременной на третьем триместре гестации при титре 1:1600. Интенсивность реакции - высокая и составляет 58,00±0,95 усл. ед. при цитофотометрическом анализе. Увеличение - 10×100.

На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция в эритроцитах на пиридоксальфосфат у беременной, не болевшей на протяжении всего периода гестации. Интенсивность реакции в эритроцитах - 15,00±0,20 усл. ед. Увеличение - 10×100.

Способ определения пиридоксальфосфата в эритроцитах периферической крови, включающий выполнение гистохимической реакции в инкубационном растворе, состоящем из 500 мкл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,4-7,6; нитросинего тетразолия 5 ммоль - 1 мг, НАДФ+ 1 ммоль - 1 мг, в который вносят 200 мкл цельной крови с коагулянтом, проводят реакцию при 37°C в течение 30 мин, после чего из капли инкубационной смеси готовят монослойный мазок, подсушивают и определяют продукты реакции на пиридоксальфосфат методом компьютерной цитофотометрии по относительной плотности продуктов реакции в условных единицах, приходящихся на 1 эритроцит, с учетом плотности окрашенных продуктов реакции.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для диагностики тяжести дисциркуляторной энцефалопатии у больных с гипергомоцистеинемией.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и биоаналитических исследований и может быть использовано для анализа мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания (ГКР).
Изобретение относится к области медицины, а именно к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования состояния венозного оттока из сосудов мозга у больных гриппом.

Группа изобретений относится к анализу биологических жидкостей различной природы. Способ определения концентрации аналита в образце, включает этапы, на которых: генерируют по меньшей мере одно значение выходного сигнала, зависящее от концентрации аналита в образце; определяют по меньшей мере одно значение ΔS из, по меньшей мере, одного параметра ошибки, при этом по меньшей мере одно значение ΔS представляет собой отклонение наклона или отклонение нормализованного наклона относительно по меньшей мере одной базовой корреляции; компенсируют, упомянутое по меньшей мере одно значение выходного сигнала с помощью по меньшей мере одной базовой корреляции и по меньшей мере одного значения ΔS и определяют концентрацию аналита в образце из упомянутого по меньшей мере одного значения выходного сигнала.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, хирургии, лабораторной диагностике. Изобретение представляет способ диагностики высокодифференцированного рака щитовидной железы, включающий проведение тонкоигольной аспирационной биопсии узлов щитовидной железы под контролем ультразвукового исследования, отличающийся тем, что пункционную иглу с содержащимся в ней аспиратом промывают двукратно 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, затем центрифугируют, отбирают супернатант и методом иммуноферментного анализа определяют галектин-3, причем если содержание галектина-3 ниже 1,0 нг/мл - расценивают как отсутствие высокодифференцированного рака щитовидной железы, в интервале 1,0-1,6 нг/мл - риск высокодифференцированного рака щитовидной железы, выше 1,6 нг/мл диагностируют высокодифференцированный рак щитовидной железы.

Изобретение касается способа оценки действия цитомегаловирусной инфекции на устойчивость мембран эритроцитов новорожденных от матерей, перенесших в третьем триместре беременности обострение цитомегаловирусной инфекции.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской диагностике, и описывает способ прогнозирования течения хронического эрозивного гастрита, ассоциированного с Helicobacter pylori.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения внутренней энергии биоспецифически реагирующей суспензии реакции агглютинации объемной (РАО) с бруцеллезными или туляремийными растворами антител и суспензиями клеток.
Изобретение относится к области гинекологии и представляет собой способ оценки состояния микрофлоры влагалища у девочек в возрасте от 0 до 3 лет, который отличается тем, что производят забор биоматериала со слизистой боковой стенки влагалища путем мазка-соскоба с помощью ПЦР в режиме реального времени определяют количество геном-эквивалентов представителей условно-патогенной микрофлоры и сравнивают с центильным интервалом соответствующей группы микроорганизмов; нормоценозом будет считаться общая бактериальная обсемененность в центильном интервале от 105,1 до 106,2 ГЭ/образец с представительством определенных микроорганизмов в установленных интервалах.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к терапевтическим устройствам для лечения пациента с использованием магнитных частиц. Устройство содержит первое средство нагревания, выполненное с возможностью нагревания первой области пациента, первое средство управления мощностью, направленной в первую область так, что мощность остается ниже порогового значения, средство нагревания частиц, выполненное с возможностью нагревания магнитных наночастиц внутри второй области пациента, используя изменяющееся во времени магнитное поле.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и может быть использовано для для оценки эффективности химиотерапии при лечении цитостатиками злокачественных новообразований эпителиальных тканей. Для этого у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей исследуют плазму крови и определяют концентрацию микроэлементов цинка и железа до лечения, при этом дополнительно определяют концентрацию лития в плазме крови и коэффициент степени эндогенной интоксикации. При увеличении коэффициента степени эндогенной интоксикации более чем в 2,5 раза, увеличении содержания лития не менее чем в 2 раза, железа не менее чем в 1,5 раза и цинка не менее чем в 1,2 раза после первого курса полихимиотерапии оценивают проводимую цитостатическую терапию как эффективную, при этом коэффициент степени эндогенной интоксикации рассчитывают по формуле КСЭИ=(МСМпл+МСМэр)/МСМмочи, где МСМпл - молекулы средней массы плазмы крови, МСМэр - молекулы средней массы эритроцитов, МСМмочи - молекулы средней массы мочи. Способ позволяет повысить прогностическую точность и специфичность оценки химиотерапии заболевания при сокращении времени оценки прогноза. 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине и описывает способ прогнозирования выраженности болевого синдрома после липосакции с помощью забора липоаспирата и его центрифугирования, при этом измеряют в миллиметрах высоту образовавшихся верхнего и нижнего слоев жира, вычисляют отношение верхнего слоя жира к нижнему и при значении данного показателя более 0,2 прогнозируют выраженный болевой синдром. Изобретение обеспечивает простоту и сокращение времени при высокой эффективности. 4 пр.
Изобретение относится к медицине и представляет собой способ прогнозирования развития полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, который осуществляется путем определения в крови пациентов показателей эндотоксикоза: лейкоцитов, молекул средней массы, креатинина, мочевины и скорости оседания эритроцитов; прогноз осуществляют с помощью дискриминантного уравнения: D=6,900×лейкоциты(×10^9/л)+2,640×скорость оседания эритроцитов (мм/ч)+17,819×молекулы средней массы (ед. оп. пл.)+1,127×креатинин (мкмоль/л)+24,801×мочевина(ммоль/л), где D - дискриминантная функция с граничным значением, равным - 223,12; при D, равном или большим граничного значения, прогнозируют развитие полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой, а при D меньше граничного значения прогнозируют отсутствие полипозного риносинусита у больных бронхиальной астмой. Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение прогнозирования полипозного риносинусита у больных с бронхиальной астмой с повышенной точностью. 2 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложена биосенсорная система и тестовые сенсоры (варианты) для определения концентрации анализируемого вещества в образце. Биосенсорная система включает тестовый сенсор, содержащий по меньшей мере два электрических проводника, реакционное средство, содержащее связующее средство, включающее по меньшей мере один водорастворимый полимерный материал, буферную соль, водорастворимый посредник для переноса одного или двух электронов, содержащий не более 20% (масс./масс.) неорганической соли непереходного металла, ферментативную систему и неионное поверхностно-активное средство. Биосенсорная система также включает измерительное средство для измерения скорости окислительно- восстановительной реакции анализируемого вещества. Предложенная группа обеспечивает точное определение зависимости выходного сигнала тестового сенсора, который содержит композиции реагента с низкой общей концентрацией соли, от концентрации анализируемого вещества в образцах цельной крови в широком диапазоне уровней гематокрита в пределах не более 7 секунд. 4 н. и 45 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 табл.
Изобретение относится к медицине, онкологии и может применяться для ранней диагностики опухолей позвонков. Проводят трехступенчатую диагностику всем больным с опухолевыми заболеваниями различной локализации. На первой ступени 1 раз в 6 месяцев проводят КТ-денситометрию и при выявлении очагов с измененной плотностью костной ткани позвонка на 30% и более переходят ко второй ступени диагностики - проводят транспедикулярную биопсию. При отсутствии в биоптате опухолевого материала переходят к третьей ступени диагностики - проводят позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ-КТ) с 18-фтордезоксиглюкозой. Способ обеспечивает улучшение ранней диагностики опухолей позвонков. 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и к патолого-анатомической диагностике, и может быть использовано для прогнозирования течения инфильтрирующего рака молочной железы. Способ осуществляют путем суммирования баллов шести основных микроморфологических параметров ткани опухолевого узла: степень дифференцировки, клеточный полиморфизм, митотическая активность опухолевых клеток, характер инвазивного роста, степень лимфогистиоцитарной инфильтрации, наличие опухолевых эмболов в сосудах стромы. Каждому показателю присваивают значения баллов. Суммарный балл злокачественности определяется путем простого суммирования значений баллов вышеуказанных шести микроморфологических параметров. При значении суммарного балла, равном 14 и менее, прогнозируют благоприятный исход заболевания с 95% вероятностью. Значения суммарного балла злокачественности, равные 15 и более, прогнозируют неблагоприятный исход заболевания. Изобретение обеспечивает возможность выбора адекватного индивидуального лечения для пациента. 3 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в онкологии, урологии, клинической лабораторной диагностике для цитологического и/или иммуноцитохимического анализа спиртового смыва мочевого пузыря для диагностики рака мочевого пузыря. В предлагаемом способе, включающем фиброцистоскопию, получение промывных вод мочевого пузыря спиртовым смывом, путем его катетеризации, после чего спиртовой смыв помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 1500 об/мин в течение 10 минут, после этого надосадочную жидкость сливают, к полученному осадку добавляют 4 мл питательной среды 199 для получения клеточной суспензии, которую затем помещают в фильтр-концентратор, центрифугируют в цитофуге, при этом происходит удаление фоновых элементов и разделение на фракции клеточных элементов для получения монослойного препарата, который после этого сушат на воздухе при комнатной температуре и используют для цитологического и/или иммуноцитохимического исследования. Оптимальный объем клеточной суспензии составляет от 100 до 400 мкл. Способ позволяет получить монослойные tospin-препараты с равномерным, тонкослойным (монослойным) распределением клеточного материала на небольшом участке предметного стекла. Изобретение обеспечивает повышение диагностических возможностей цитологической диагностики рака мочевого пузыря и его рецидивов. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

Изобретение относится к области судебной медицины, криминалистики и может быть использовано в этих областях при экспертном отождествлении личности умершего ребенка раннего возраста с диагнозом фетального алкогольного синдрома, а также для диагностики фетального алкогольного синдрома у умершего ребенка раннего возраста. Способ постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста заключается в следующем: головной мозг умершего ребенка взвешивают и фиксируют его массу. Выявляют морфологические изменения в головном мозге. Для этого вырезают блоки мозгового вещества из конвекситальной коры сенсомоторной зоны, гипоталамической области и мозжечка. Исследуют светооптической микроскопией с предварительным окрашиванием срезов мозгового вещества. Окрашивание выполняют гематоксилином-эозином, по Ван Гизону, по Нисслю. По результатам исследований диагностируют фетальный алкогольный синдром при наличии совокупности следующих морфологических изменений головного мозга: в мозговом веществе из конвекситальной коры сенсомоторной зоны имеются участки разряжения в средних слоях, хроматолиз цитоплазмы нервных клеток и пикнотические изменения, в мозговом веществе гипоталамической области имеются хроматолиз нервных клеток в форме маргинации ниссленсской субстанции, перицеллюлярный отек, в мозговом веществе мозжечка имеются разряжение клеток, дистрофические изменения клеток Пуркинье, при этом фиксированная масса головного мозга ниже минимально допустимой для нормально развитого ребенка аналогичного возраста. Достигаемый технический результат: повышение достоверности и расширение арсенала средств судебно-медицинской экспертизы для постнатальной диагностики фетального алкогольного синдрома у умерших детей раннего возраста. 3 ил., 1 пр.
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования. Для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов клетки фиксируют глутаровым альдегидом, отмывают дистиллированной водой и помещают на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, перемешивают и с помощью световой микроскопии наблюдают за агрегацией клеток. Появление агрегатов эритроцитов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Изобретение обеспечивает создание простого, быстрого, не требующего специального оборудования и дефицитных реактивов способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. 3 пр.
Изобретение относится к медицине и предназначено для диагностики развития синдрома кишечной недостаточности у больных с абортивными формами острого панкреатита. Проводят ультразвуковое и рентгенологическое исследование кишечного тракта, периферическую компьютерную электрогастроэнтерографию и бактериологическое исследование кала. Дополнительно, не менее чем через 24 часа от момента развития острого панкреатита и не позднее 72 часов, производят забор кала для микроскопического исследования, по результатам которого при обнаружении в кале большого количества клеток цилиндрического эпителия судят о развитии синдрома кишечной недостаточности. Способ позволяет проводить неинвазивную диагностику развития синдрома кишечной недостаточности у больных с абортивными формами острого панкреатита. 1 пр.
Наверх