Полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3, конъюгированные с вариантом челевеческого сывороточного альбумина (hsa), и их фармацевтические применения

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, и может быть использовано в медицине. Получают полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, конъюгированной на N-конце посредством линкерной аминокислотной последовательности, содержащей комбинацию аминокислот глицина и серина, с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA) с SEQ ID NO:4. Изобретение позволяет повысить эффективность терапии заболеваний, связанных с интегрином αvβ3. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 7 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³, где вариант родостомина конъюгирован с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA). Изобретение также относится к применению указанных слитых белков для лечения и профилактики заболеваний, связанных с интегрином αvβ3.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кость представляет собой сложную ткань, составленную из нескольких типов клеток, которые непрерывно подвергаются процессу обновления и репарации, именуемому «ремоделированием кости». Два основных типа клеток, ответственных за ремоделирование кости, представляют собой остеокласты, которые осуществляют резорбцию кости, и остеобласты, которые образуют новую кость. Известно, что ремоделирование кости регулируется несколькими системными гормонами (например, паратиреоидным гормоном, 1,25-дигидроксивитамином D₃, половыми гормонами и кальцитонином) и местными факторами (например, оксидом азота, простагландинами, факторами роста и цитокинами).

Интегрины представляют собой гетеродимерные матричные рецепторы, которые прикрепляют клетки к субстрату и передают полученные извне сигналы через плазматическую мембрану. Интегрин αvβ3 участвует в опосредованной остеокластами резорбции кости и in vivo, и in vitro. Данная гетеродимерная молекула распознает аминокислотный мотив Arg-Gly-Asp (RGD), содержащийся в матричных белках кости, таких как остеопонтин и сиалопротеин кости. Интегрин αvβ3 экспрессирован в остеокласте, и его экспрессия модулируется резорбтивными стероидами и цитокинами. На основании экспериментов блокирования интегрин αvβ3 был идентифицирован в качестве основного функционального рецептора адгезии на остеокластах. Ингибиторы интегрина αvβ3 снижают способность остеокластов связываться с костью и осуществлять ее резорбцию. Интегрин αvβ3 играет главную роль в функции остеокластов, и ингибиторы данного интегрина рассматриваются в качестве средств для лечения или профилактики остеопороза, остеолитических метастазов и гиперкальцемии, вызванной злокачественными процессами.

Существует много костных заболеваний, которые связаны с остеолизом, опосредуемым остеокластами. Остеопороз является наиболее распространенным костным заболеванием, которое вызывается, когда резорбция и формирование кости не координированы, и распад кости превышает построение кости. Остеопороз также вызывается другими состояниями, такими как гормональный дисбаланс, заболевания или медикаментозные способы лечения (например, кортикостероидами или противоэпилептическими средствами). Кости являются одним из наиболее частых участков метастазирования злокачественных новообразования молочных желез, предстательной железы, легких и щитовидной железы человека, а также других онкологических заболеваний. Остеопороз может также возникать в результате эстрогенной недостаточности в постменопаузе. Вторичный остеопороз может быть связан с ревматоидным артритом. Костные метастазы проявляют очень необычный этап остеопоротической резорбции кости, которая не наблюдается при метастазах других органов. Широко признано, что остеолиз, который связан с онкологическими заболеваниями, по существу опосредуется остеокластами, которые, как представляется, активируются и могут быть косвенно активированы через остеобласты или непосредственно опухолевыми продуктами. Кроме того, гиперкальцемия (повышенная концентрация кальция в крови) является важным осложнением остеолитических костных заболеваний. Она возникает относительно часто у пациентов с обширной деструкцией кости и особенно часто встречается при карциномах молочной железы, легких, почек, яичников и поджелудочной железы и при миеломе.

Дизинтегрины представляют собой семейство пептидов с низкой молекулярной массой, содержащих RDG, которые специфически связываются с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3, экспрессируемыми на тромбоцитах и других клетках, включая сосудистые эндотелиальные клетки и некоторые опухолевые клетки. В дополнение к их высокой антитромбоцитарной активности исследования дизинтегринов выявили новые виды применения при диагностике сердечносо-судистых заболеваний и разработке терапевтических средств для лечения артериального тромбоза, остеопороза и связанного с ангиогенезом роста и метастазированием опухолей. Было обнаружено, что родостомин (Rho), дизинтегрин, происходящий из яда Colloselasma rhodostoma, ингибирует агрегацию тромбоцитов in vivo и in vitro посредством блокады тромбоцитарного гликопротеина αllbβ3. Кроме того, сообщается, что родостомин ингибирует адгезию клеток карциномы молочных желез и предстательной железы с внеклеточными матрицами и неминерализованных, и минерализованных костей зависимым от дозы образом, не воздействуя на жизнеспособность опухолевых клеток. Кроме того, родостомин ингибирует миграцию и инвазию клеток карциномы молочной железы и предстательной железы. Было также показано, что родостомин ингибирует адипогенез и ожирение. Однако, ввиду того, что родостомин не специфически связывается с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3, фармацевтическое применение родостомина может вызвать тяжелые побочные эффекты. Например, при применении родостомина при лечении карцином ингибирование агрегации тромбоцитов представляет собой нежелательный побочный эффект.

Роль интегрина αvβ3 при костных заболеваниях была хорошо документирована. См., например, F. Patrick Ross et al, Nothing but skin and bone, the Journal of Clinical Investigation, Vol. 116, #5, May 2006; S. B. Rodan et al, Integrin function in osteoclasts, Journal of Endocrinology (1997) 154, S47-S56; Steven L. Teitelbaum, Editorial: Osteoporosis and Integrins, the Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, April 2005, 90(4): 2466-2468; Steven L. Teitelbaum, Osteoclasts, integrins, and osteoporosis, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2000) 18: 344-349; Ichiro Nakamura et al, Involvement of αvβ3 integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (2007) 25: 337-344; Le T. Duong et al, The role of integrins in osteoclast function, Journal of Bone and Mineral Metabolism, (1999) 17: 1 -6; and A Teti et al., The Role of the AlphaVbeta3 Integrin in the Development of Osteolytic Bone Metastases: A Pharmacological Target for Alternative Therapy?, Calcified Tissue International (2002) 71: 293-299.

В дополнение к костным заболеваниям интегрин αvβ3 играет важную роль в ангиогенезе и росте опухолей при состояниях, не связанных с костными заболеваниями.

Таким образом, может быть желательным создание полипептидов, селективных в отношении интегрина αvβ3, с улучшенной устойчивостью и длительно сохраняющимися эффектами. Данные пептиды потенциально подходят для лечения заболеваний и состояний, в развитии которых участвует интегрин αvβ3, включая без ограничения различные костные заболевания, онкологические заболевания и заболевания, вовлекающие ангиогенез.

Технология слияния человеческого сывороточного альбумина (HSA) использовалась в данной области для создания длительно действующих белковых фармацевтических средств. Однако полипептиды, конъюгированные с HSA, могут быть склонны к связанной с дисульфидом агрегации, особенно в кислотных условиях, приводя к образованию межмолекулярных димеров. Образование межмолекулярных димеров может снизить активность полипептидов и/или вызвать иммуногенность, когда эти полипептиды вводятся млекопитающим.

Соответственно, в данной области имеется потребность в создании полипептида, который является селективным в отношении интегрина αvβ3, имеет лучшую устойчивость и вызывает образование меньшего количества межмолекулярных димеров, чем полипептид, слитый с HSA дикого типа.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA), содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность варианта родостомина, имеющего вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 представляют две из возможных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 4 представляет аминокислотную последовательность варианта HSA, где остаток цистеина в положении 34 аминокислотной последовательности HSA был замещен серином. Данный вариант HSA именуется HSA C34S.

SEQ ID NO: 5 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34S.

В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность варианта HSA, где остаток цистеина в положении 34 аминокислотной последовательности HSA был замещен аланином. Данный вариант HSA именуется HSA C34A.

SEQ ID NO: 7 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34A.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, где указанный полипептид, кроме того, содержит линкерную аминокислотную последовательность или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В более предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит комбинацию аминокислот глицина и серина.

В более предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит SEQ ID NO: 8.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 9 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34S)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34S через линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34A)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34A через линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10.

В другом варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

Ввиду вырожденности генетического кода в данной области возможна модификация нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 для создания других полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению. Поэтому полипептиды по настоящему изобретению, кодируемые другими полинуклеотидами, также охватываются настоящим изобретением.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом высоко избирательны в отношении интегрина αvβ3 и проявляют сниженное связывание с интегрином αllbβ3 и/или α5β1, по сравнению с дизинтегрином дикого типа.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к αllbβ3 и/или α5β1 по меньшей мере в 5, 50 или 100 раз, по сравнению с родостомином.

В другом варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере в 200 раз по сравнению с родостомином, предпочтительнее уменьшение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере в 500 раз по сравнению с родостомином.

В другом варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере в 20 раз по сравнению с родостомином, а предпочтительнее уменьшение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере примерно в 70 или 90 раз по сравнению с родостомином.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют уменьшение сродства к тромбоцитам по меньшей мере примерно в 5, 50, 100 или 150 раз по сравнению с родостомином.

В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид проявляет существенно сниженную активность в удлинении времени свертывания крови по сравнению с родостомином и/или дизинтегрином дикого типа.

В другом варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, включающей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В одном варианте осуществления изобретения заболевание, связанное с интегрином αvβ3, включает без ограничения остеопороз, костную опухоль или рост злокачественной опухоли и симптомы, связанные с ними, рост и метастазирование опухоли, связанные с ангиогенезом, метастазирование опухолей в кости, гиперкальцемию, вызванную злокачественными заболеваниями, болезнь Педжета, физиологическое изменение, вызванное овариэктомией, ревматический артрит, остеоартрит и глазные заболевания, связанные с ангиогенезом, включая без ограничения возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, заболевания роговицы с неоваскуляризацией, ретинопатию с вызванной ишемией неоваскуляризацией, высокую миопию и ретинопатию недоношенных.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу применения полипептида по изобретению для ингибирования и/или предотвращения роста опухолевых клеток в костях или других органах и связанных с ним симптомов у млекопитающего.

В другом варианте осуществления способ лечения и/или профилактики заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включает введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого активного средства. Другое активное средство может вводиться перед, во время или после введения полипептида по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления другое активное средство выбрано из группы, состоящей из антагонистов VEGF (сосудистого эндотелиального фактора роста), противовоспалительных средств и цитотоксических средств.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, включающему (a) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, включающему (a) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

Способы получения полипептидов по настоящему изобретению могут, кроме того, включать выращивание клетки-хозяина в культуральной среде, лишенной аминокислот, и сбор супернатанта для получения указанного полипептида.

Указанные способы могут, кроме того, включать добавление метанола к культуральной среде для индукции экспрессии полипептидов в клетках-хозяевах.

Способы могут, кроме того, включать стадию выполнения колоночной хроматографии для получения указанного полипептида.

В одном варианте осуществления способы могут, кроме того, включать стадию выполнения высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC, ВЭЖХ) для получения изолированного полипептида.

Указанные и другие аспекты станут очевидны из следующего описания различных вариантов осуществления, взятых в сочетании со следующими чертежами, хотя в них могут быть внесены изменения и модификации без отхода от сущности и объема новых концепций описания.

Следует понимать, что и предшествующее общее описание, и следующее детальное описание являются только иллюстративными и поясняющими, а не ограничивающими изобретение, представленное формулой изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A и 1B показаны профили HPLC соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1C и 1D показаны профили хроматографии с исключением по размеру (SEC) соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1E и 1F показаны фотографии профилей SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.1G показаны фотографии двумерных профилей SDS-PAGE HSA-ARLDDL, HSA(C34S)-ARLDDL и HSA.

На фиг.1H показаны ЯМР спектры HSA(C34S)-ARLDDL и BSA.

На фиг.2 показана аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.3A показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.3B показана нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 3 варианта ARLDDL родостомина.

На фиг.4A и 4B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 4 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5 мутанта HSA C34S.

На фиг.5A и 5B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 7 мутанта HSA C34A.

На фиг.6 показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 8 линкерной аминокислоты.

На фиг.7A и 7B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10 HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.8A и 8B показана соответственно аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 11 и нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 12 HSA(C34A)-ARLDDL.

На фиг.9A, 9B и 9C представлены фотографии гематопоэтических клеток костного мозга, показывающие, что HSA(C34S)-ARLDDL ингибирует дифференциацию остеокластов.

Фиг.10A, 10B и 10C представляют собой графики, показывающие, что HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL ингибируют дифференциацию остеокластов.

Фиг.11A, 11B, 11C и 11D представляют собой графики, показывающие, что HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL ингибируют ангиогенез на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP).

Фиг.11E, 11F и 11G представляют собой графики, показывающие ангиогенез на мышиной модели ретинопатии, вызванной кислородом. Они показывают, что HSA(C34S)-ARLDDL ингибирует ангиогенез при ретинопатии, вызванной у мышей кислородом.

Фиг.12A и 12B представляют собой фотографии мышей, которым инъецировали человеческие опухолевые клетки PC-3 (12A), а на фиг.12B показаны две мыши, подвергаемые обработке HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.12C и 12D представляют собой фотографии опухолей, иссеченных соответственно у контрольных мышей и мышей, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.13 представляет собой график, который показывает, что HSA(C34S)-ARLDDL значительно уменьшал размер опухоли и массу опухоли у мышей, которым инъецировали человеческие опухолевые клетки PC-3.

Фиг.14A представляет собой набор фотографий, показывающий сниженную плотность кровеносных сосудов в пробках MATRIGEL™ от мышей C57BL/6, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL, по сравнению с контрольными мышами, не подвергавшимися обработке.

Фиг.14B представляет собой график, показывающий содержание гемоглобина в пробках MATRIGEL™ от мышей C57BL/6, подвергаемых обработке HSA(C34S)-ARLDDL, по сравнению с контрольными мышами, не подвергаемыми обработке.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Теперь будут детально описаны различные варианты осуществления изобретения. Пока контекст ясно не диктует иного, используемое в описании и во всей формуле изобретения значение неопределенных и определенных артиклей единственного числа включает соответствующее множественное число. Также, пока контекст ясно не диктует иного, используемое в описании и во всей формуле изобретения значение «в» включает «в» и «на». Кроме того, некоторые термины, используемые в данном описании, конкретнее определены ниже.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины, используемые в описании, в целом, имеют их обычное значение, принятое в данной области, в пределах контекста изобретения и в определенном контексте, где используется каждый термин. Определенные термины, которые используются для описания изобретения, обсуждаются ниже или в других разделах описания, для обеспечения пользователя дополнительным руководством в отношении описания изобретения. Представление одного или более синонимов не исключает использования других синонимов. Использование примеров в любых разделах описания, включая примеры любых терминов, обсуждаемых в настоящем описании, является только иллюстративным и ни в коей мере не ограничивает объем и значение изобретения или любого иллюстрируемого термина. Изобретение не ограничивается различными вариантами осуществления, представленными в данном описании.

Пока нет других определений, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значении, которое обычно понятно среднему специалисту в данной области, для которого предназначено данное изобретение. В случае противоречия преобладающее значение имеет настоящий документ, включая определения.

«Около», «примерно» или «приблизительно» в целом означает в пределах 20%, в пределах 10%, в пределах 5, 4, 3, 2 или 1% данной величины или диапазона. Представленные числовые количества являются приблизительными, и это значит, что, если нет ясных указаний, то могут подразумеваться термины «около», «примерно» или «приблизительно».

Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «последовательность нуклеиновых кислот», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо для обозначения полимерных форм нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги и производные. Данный термин включает варианты. Варианты могут включать вставки, добавления, делеции или замещения. Нуклеотидные последовательности перечислены в направлении от 5' к 3'.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок», взаимозаменяемо используемые для обозначения полимерной формы аминокислот любой длины, которые могут включать встречающиеся в природе аминокислоты, кодируемые и не кодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные, дериватизированные или сконструированные аминокислоты, аналоги аминокислот, пептидомиметики и депсипептиды и полипептиды, имеющие модифицированные, циклические, бициклические, депси-циклические или депси-бициклические пептидные основные цепи. Данный термин включает одноцепочечный белок, а также мультимеры.

Данные термины также включают слитые белки, включая без ограничения слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST), слитые белки с гетерологичной аминокислотной последовательностью, такие как биолюминесцентные белки, например люциферин или экворин (зеленый флуоресцентный белок), с гетерологичными и гомологичными лидерными последовательностями, слитые белки с N-концевыми метиониновыми остатками и без них, пегилированные белки и иммунологически меченные или Н:S-меченные белки. Такие слитые белки также включают слияния с эпитопами. Такие слитые белки могут содержать мультимеры пептидов по изобретению, например, гомодимеры или гомомультимеры, и гетеродимеры и гетеромультимеры. Данный термин также включает пептидные аптамеры.

Термин «гибридизуется специфически» в контексте полинуклеотида относятся к гибридизации в строгих условиях. Условия, которые увеличивают строгость реакций гибридизации и ДНК/ДНК, и ДНК/РНК широко известны и опубликованы в данной области. Примеры строгих условий гибридизации включают гибридизацию в 4X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC), при температуре примерно 65-70°C, или гибридизацию в 4X SSC плюс 50% формамиде при температуре примерно 42-50°C, с последующим одним или более промываний в 1X SSC при температуре примерно 65-70°C.

Термин «лиганд» относится к молекуле, которая связывается с другой молекулой, включая рецептор.

Термин «млекопитающее» включает, но не ограничивается этим, человека.

Термин «клетка-хозяин» представляет собой отдельную клетку или клеточную культуру, которая может представлять собой или является реципиентом любого рекомбинантного вектора (векторов) или полинуклеотида. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство может необязательно быть полностью идентичным (по морфологии или по общей комплементарности ДНК) исходной материнской клетке вследствие естественной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные или инфицированные in vivo или in vitro рекомбинантным вектором или полинуклеотидом по изобретению. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор по изобретению, может называться «рекомбинантной клеткой-хозяином».

Термин «лечение» относится к любому введению или применению лекарственных средств по поводу заболеваний у млекопитающего и включает ингибирование заболевания, задержку его развития, облегчение течения заболевания, например, вызывая регрессию, или восстановление, или исправление утраченной, отсутствующей или нарушенной функции, или стимуляцию неэффективного процесса. Данный термин включает получение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта, охватывая любое лечение патологического состояния или расстройства у млекопитающего. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения расстройства или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения расстройства и/или неблагоприятного воздействия, которое может быть связано с расстройством. Он включает (1) предотвращение возникновения или рецидива расстройства у индивида, который может быть предрасположен к расстройству, но у которого еще нет симптомов его развития, (2) ингибирование расстройства, например задержку его развития, (3) остановку или прекращение расстройства или, по меньшей мере, связанных с ним симптомов, с тем, чтобы хозяин больше не страдал расстройством или его симптомами, например, вызывая регрессию расстройства или его симптомов, например, восстановлением или исправлением утраченной, отсутствующей или дефектной функции, или стимуляцию неэффективного процесса, или (4) облегчение, смягчение или ослабление расстройства или связанных с ним симптомов, где термин «ослабление» используется в широком смысле для обозначения по меньшей мере уменьшения величины параметра, такого как воспаление, боль и/или размер опухоли.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному компоненту препаративной формы или эксципиенту любого обычного типа. Фармацевтически приемлемый носитель является нетоксичным для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и совместим с другими ингредиентами состава.

Термин «композиция» относится к смеси, которая обычно содержит носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, который является обычным в данной области и который подходит для введения индивиду в терапевтических, диагностических или профилактических целях. Она может включать клеточную культуру, в которой полипептид или полинуклеотид присутствует в клетках или в культуральной среде. Например, композиции для перорального введения могут образовывать растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, составы с замедленным высвобождением, составы для полоскания ротовой полости или порошки.

Термин «заболевание» относится к любому состоянию, инфекции, расстройству или синдрому, который требует медицинского вмешательства или по поводу которого желательно медицинское вмешательство. Такое медицинское вмешательство может включать лечение, диагностику и/или профилактику.

Аббревиатуры «Rho» означает «родостомин», который представляет собой дизинтегрин, полученный из яда песчаной эфы Colloselasma rhodostorna. Родостомин не специфически связывается с интегринами αllbβ3, α5β1 и αvβ3 и удлиняет время свертывания крови путем ингибирования агрегации посредством блокады тромбоцитарного гликопротеина αllbβ3.

Термин «IC₅₀» или «половинная максимальная ингибирующая концентрация» относится к концентрации Rho или его варианта, которая требуется для 50% ингибирования его рецептора. IC₅₀ представляет собой показатель того, сколько Rho или его варианта требуется для ингибирования биологического процесса на 50%, такого как сродство варианта к его рецептору.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое при введении живому индивиду достигает желательного воздействия на живого индивида. Например, эффективное количество полипептида по изобретению для введения живому индивиду представляет собой количество, которое предотвращает и/или лечит заболевание, опосредованное интегрином αvβ3. Точное количество будет зависеть от цели лечения, и специалист в данной области сможет определить его, используя известные методики. Как известно в данной области, могут потребоваться поправки для системного в сравнении с местным введением с учетом возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, рациона питания, времени введения, лекарственного взаимодействия и тяжести состояния, и специалист в данной области сможет определить необходимые коррекции обычным экспериментированием.

Термин «антагонист рецептора» относится к связывающемуся с рецептором лиганду, который ингибирует функцию рецептора путем блокирования связывания агониста с рецептором или который обеспечивает возможность связывания агониста, но ингибирует способность агониста активировать рецептор.

Термин «по существу сниженная активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1» относится к сниженной по меньшей мере в пять раз активности блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 интегрина по сравнению с родостомином дикого типа или другими дизинтегринами. Например, для расчета снижения активности блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1, IC_5O варианта родостомина в отношении ингибирования связывания рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 интегрина с матричным белком, таким как фибриноген, сравнивается с IC₅₀ Rho.

Термин «вариант мотива RGD» относится к пептиду, содержащему модификацию в аминокислотной последовательности, которая охватывает последовательность RGD соответствующей последовательности дикого типа, такой как последовательность, содержащая RGD в родостомине.

Термин «ARLDDL» относится к варианту родостомина, имеющему вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³. Числа «48» и «53» относятся к положениям указанных аминокислот в аминокислотной последовательности родостомина дикого типа.

Термин «HSA C34S» относится к варианту человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен серином. HSA C34S содержит SEQ ID NO: 4.

Термин «HSA C34A» относится к варианту HSA, где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен аланином. HSA C34A содержит SEQ ID NO: 6.

Термин «HSA(C34S)-ARLDDL» относится к слитому белку, содержащему a) вариант человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен серином, b) линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и c) вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

HSA(C34S)-ARLDDL представлен SEQ ID NO: 9.

Термин «HSA(C34A)-ARLDDL» относится к слитому белку, содержащему a) вариант человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA дикого типа был замещен аланином, b) линкерную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 и c) вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

HSA(C34A)-ARLDDL представлен SEQ ID NO:11

Термин «ингибиторная селективность в отношении интегрина αvβ3 относительно рецепторов αllbβ3 и/или α5β1» относится к селективности связывания полипептида в отношении интегрина αvβ3 по сравнению с рецепторами αllbβ3 и/или α5β1, которые выражаются в виде отношения IC₅₀ варианта в отношении ингибирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1 в сравнении с ингибированием рецептора αvβ3.

Термин «по существу сниженная активность продления времени кровотечения» относится к сниженной способности полипептида ингибировать свертывание крови статистически значимым образом по данным измерения экспериментов времени кровотечения, описанным в описании.

Термин «пегилированный-ARLDDL» или «пег-ARLDDL» относятся к пегилированному продукту белка ARLDDL.

Термины «альбумин-ARLDDL» или «HSA-ARLDDL» относятся к конъюгированному с человеческим альбумином продукту белка ARLDDL.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Селективные варианты дизинтегрина αvβ3

В заявке на патент США под серийным № 12/004,045 описываются различные полипептиды, селективные в отношении интегрина αvβ3 и проявляющие сниженную активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или рецепторов α5β1 по сравнению с дизинтегрином дикого типа. Эти полипептиды кодируются модифицированными нуклеотидными последовательностями дизинтегрина, которые кодируют модифицированные аминокислотные последовательности. В результате созданы полипептиды, которые имеют по существу сниженную активность блокирования рецепторов αllbβ3 и/или α5β1.

Варианты дизинтегрина, такие как связанные с RD соединения, активно ингибируют дифференциацию остеокластов in vitro. Они также ингибируют резорбирующую активность остеокластов и вызванное овариэктомией увеличение образования остеокластов в исследованиях на животных. Кроме того, RD ингибирует рост опухоли предстательной железы человека и клеток рака молочной железы в кости. Вызванная злокачественными поражениями гиперкальцемия также эффективно блокировалась связанными с RD белками. Болезнь Педжета (также известная как деформирующий остеит) представляет собой хроническое костное нарушение, которое обычно приводит к увеличению и деформации костей вследствие неравномерного разрушения и образования костей. Бисфосфонаты были утверждены для лечения болезни Педжета. Остеоартрит также связан с увеличением активности остеокластов. На основании аналогичного механизма действия производные RD должны также быть эффективными для лечения указанных костных нарушений. Внутривенная инъекция RD или PGP в очень большой дозе 30 мг/кг не влияла на выживание мышей (n=3). Кроме того, длительное введение PGP (внутривенно, 0,5 мг/кг/день) в течение 6 недель не влияло на уровень креатинина, GOT и GPT в сыворотке, свидетельствуя об отсутствии побочных эффектов на почки и печень. Поэтому RD и его производные, в частности ARLDDL, представляют собой потенциальные перспективные лекарственные средства для лечения остеопороза, костных опухолей, вызванной злокачественными заболеваниями гиперкальцемии, болезни Педжета, ревматического артрита, остеоартрита и связанных с ангиогенезом глазных заболеваний.

Заявители прямо включают путем ссылки в настоящую заявку все описание заявки на патент США под серийным № 12/004,045, включая полипептиды.

Настоящее изобретение в целом относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где указанные полипептиды конъюгированы с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA), где цистеиновый остаток в положении 34 аминокислотной последовательности HSA был замещен или серином для создания мутантного белка HSA C34S, или аланином для создания мутантного белка HSA C34A.

SEQ ID NO: 1 представляет аминокислотную последовательность варианта родостомина, имеющего вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 представляют две из возможных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют вариант родостомина, имеющий вариант мотива RGD ⁴⁸ARLDDL⁵³.

SEQ ID NO: 4 представляет аминокислотную последовательность мутантного белка HSA C34S.

SEQ ID NO: 5 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34S.

SEQ ID NO: 6 представляет аминокислотную последовательность мутантного белка HSA C34A.

SEQ ID NO: 7 представляет нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант HSA C34A.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, где указанный полипептид, кроме того, содержит линкерную аминокислотную последовательность, или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит комбинацию аминокислот глицина и серина.

В другом предпочтительном варианте осуществления линкерная аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или к фармацевтически приемлемой соли указанного полипептида.

SEQ ID NO: 9 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34S)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34A посредством линкерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 11 представляет аминокислотную последовательность слитого белка HSA(C34A)-ARLDDL, где вариант родостомина ARLDDL слит с вариантом HSA C34A посредством линкерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления изобретение относится к полипептиду, кодированному полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10.

В другом варианте осуществления полипептид по изобретению кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 12.

Вследствие вырожденности генетического кода в данной области известна возможность модификации нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12 для создания других полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению. Поэтому полипептиды по настоящему изобретению, кодируемые другими полинуклеотидами, также охватываются настоящим изобретением.

Полипептиды по изобретению в целом высокоизбирательны в отношении интегрина αvβ3 и проявляют сниженное связывание с интегрином αllbβ3 и/или α5β1 по сравнению с дизинтегрином дикого типа.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют снижение сродства к αllbβ3 и/или α5β1 по меньшей мере в 5, 50 или 100 раз по сравнению с родостомином.

В другом варианте осуществления полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют снижение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере примерно в 200 раз по сравнению с родостомином, предпочтительнее снижение сродства к интегрину αllbβ3 по меньшей мере примерно в 500 раз, по сравнению с родостомином.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют снижение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере примерно в 20 раз, по сравнению с родостомином, предпочтительнее уменьшение сродства к интегрину α5β1 по меньшей мере примерно в 70-90 раз по сравнению с родостомином.

Полипептиды по настоящему изобретению в целом проявляют снижение сродства к тромбоцитам по меньшей мере примерно в 5, 50, 100 или 150 раз по сравнению с родостомином.

В еще одном варианте осуществления изобретения полипептид проявляет существенно сниженную активность удлинения времени свертывания крови по сравнению с родостомином и/или дизинтегрином дикого типа.

Полипептиды по изобретению

Полипептиды по изобретению могут быть созданы и экспрессированы с использованием способов, известных в данной области. Для получения полипептидов по изобретению подходят способы на основе клеток и бесклеточные способы. Способы на основе клеток в целом включают введение конструкции нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин in vitro и культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии, затем сбор пептида или из культуральной среды, или из клетки-хозяина (например, разрушением клетки-хозяина), или обоими способами. Изобретение также относится к способам получения пептида с использованием бесклеточных способов транскрипции/трансляции in vitro, которые хорошо известны в данной области.

Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические или эукариотические клетки, включая, например, бактериальные, дрожжевые, грибковые, растительные клетки и клетки насекомых и млекопитающих.

В примере 1 ниже описаны конструкция и экспрессия одного полипептида в соответствии с изобретением, HSA(C34S)-ARLDDL.

Обычно полипептид по изобретению может экспрессироваться сам по себе и может включать сигналы секреции и/или секреторную лидерную последовательность. Секреторная лидерная последовательность по изобретению может направлять определенные белки в эндоплазматический ретикулум (ER). ER отделяет связанные с мембраной белки от других белков. При локализации в ER белки могут далее направляться в аппарат Гольджи для распределения в пузырьки, включая секреторные пузырьки, плазматическую мембрану, лизосомы и другие органеллы.

Кроме того, в дополнение к варианту HSA в полипептиды по изобретению могут добавляться пептидные части и/или метки очистки. Данные пептидные части и/или метки очистки могут удаляться перед конечным получением полипептида. Подходящие метки очистки включают, например, V5, полигистидины, авидин и биотин. Конъюгация пептидов с соединениями, такими как биотин, может осуществляться с использованием методик, хорошо известных в данной области (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press). Полипептиды по изобретению могут также конъюгироваться с радиоизотопами, токсинами, ферментами, флуоресцентными метками, коллоидным золотом, нуклеиновыми кислотами, винорелбином и доксорубицином с использованием методик, известных в данной области (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press; Stefano et al. (2006).

Возможно также создание слитых белков, где мутантные слитые белки HSA-дизинтегрина по настоящему изобретению дополнительно слиты с другими белками. Партнеры слияния, подходящие для такого применения, включают, например, фетуин, Fc и/или один или более из их фрагментов. Предоставляются также конъюгаты полиэтиленгликоля со слитыми белками по настоящему изобретению.

Полипептиды по изобретению могут быть также химически синтезированы с использованием технологий, известных в данной области (например, см. Hunkapiller et al., Nature, 310:105 111 (1984); Grant ed. (1992) Synthetic Peptides, A Users Guide, W.H. Freeman and Co.; патент США № 6974884). Например, полипептид, соответствующий фрагменту полипептида, может быть синтезирован путем использования пептидного синтезатора или посредством использования твердофазных способов, известных в данной области.

Кроме того, при желании неклассические аминокислоты или химические аминокислотные аналоги могут вводиться в качестве замещения или добавления в полипептидную последовательность. Неклассические аминокислоты включают, без ограничения, D-изомеры обычных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, a-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, g-Abu, e-Ahx, 6-аминогексановую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, т-бутилглицин, т-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, b-аланин, фтор-аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как b-метил аминокислоты, Ca-метил аминокислоты, Na-метил аминокислоты и аналоги аминокислот в целом. Кроме того, аминокислота может быть D (правовращающей) или L (левовращающей).

Полипептиды по изобретению могут извлекаться и очищаться из химического синтеза и рекомбинантных клеточных культур стандартными способами, которые включают без ограничения осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, гидроксиапатитную хроматографию и лектин-хроматографию. В одном варианте осуществления для очистки используется высокоэффективная жидкостная хроматография («ВЭЖХ»). Хорошо известные технологии рефолдинга белка могут использоваться для регенерации активной конформации, когда полипептид денатурируется во время выделения и/или очистки.

Полипептид или пептидомиметик по изобретению может быть, кроме того, модифицирован или ковалентно связан с одним или более из разнообразия гидрофобных полимеров для увеличения растворимости и периода полувыведения из циркуляции полипептида. Подходящие небелковые гидрофильные полимеры для соединения с пептидом включают без ограничения полиалкилэфиры, иллюстрируемые полиэтиленгликолем и полипропиленгликолем, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, полиоксиалкены, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, целлюлозу и производные целлюлозы, декстран и производные декстрана. В целом, такие гидрофильные полимеры имеют среднюю молекулярную массу в диапазоне от примерно 500 до примерно 100000 дальтон, от примерно 2000 до примерно 40000 дальтон или от примерно 5000 до примерно 20000 дальтон. Пептид может быть дериватизирован или соединен с такими полимерами с использованием любого из способов, изложенных в Zallipsky, S. (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165, Monfardini, C., et al. (1995) Bioconjugate Chem., 6:62-69, патентах США №№ 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192, 4179337 или WO 95/34326.

Полипептиды по изобретению могут включать встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе аминокислоты. Полипептиды могут включать D-аминокислоты, комбинацию D- и L-аминокислот и различные «сконструированные» или «синтетические» аминокислоты (например, β-метиламинокислоты, Ca-метил аминокислоты и Na-метил аминокислоты и т.д.) для придания определенных свойств. Кроме того, полипептиды могут быть циклическими. Полипептиды могут включать любые известные неклассические аминокислоты. Кроме того, аналоги аминокислот и пептидомиметики могут быть включены в полипептид для индукции или содействия определенным вторичным структурам, включая без ограничения LL-Acp (LL-3-амино-2-пропенидон-6-карбоновую кислоту), дипептидный аналог, индуцирующий β-поворот; аналоги, индуцирующие β-складку; аналоги, индуцирующие β-поворот; аналоги, индуцирующие α-спираль; аналоги, индуцирующие γ-поворот; аналоги поворота GIy-AIa; изостеру амидной связи; или третразол и тому подобные.

Кроме того, дезамино- или дезкарбоксиостатки могут быть включены в концы полипептида для уменьшения восприимчивости к протеазам или для ограничения конформации.

В одном варианте осуществления C-концевые функциональные группы по настоящему изобретению включают амид, низший алкиламид, низший диалкиламид, низший алкокси, гидрокси, карбокси, его сложноэфирные производные низших алкилов и их фармацевтически приемлемые соли.

Фармацевтические композиции

В другом варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид по изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к физиологически приемлемой композиции, содержащей полипептид, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтические композиции по изобретению могут быть предоставлены в виде препаративных форм с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами и разбавителями, которые известны в данной области. Эти фармацевтические носители, эксципиенты и разбавители включают те, которые перечислены в перечне фармацевтических эксципиентов Фармакопеи США. См. раздел Фармакопеи США «Эксципиенты», перечисленные по категориям, на стр. 2404-2406, 24 Фармакопея США и 19 Национальная Фармакопея, United States Pharmacopeial Convention Inc, Rockville, Md (ISBN 1-889788-03-1). Фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, являются вполне общедоступными. Кроме того, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как регуляторы pH и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты и тому подобные, которые вполне общедоступны.

Подходящие носители включают без ограничения воду, декстрозу, глицерин, солевой раствор, этанол и их комбинации. Носитель может содержать дополнительные агенты, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие pH агенты или адъюванты, которые повышают эффективность препаративной формы. Местные носители включают вазелиновое масло, изопропилпальмитат, полиэтиленоликоль, этанол (95%), полиоксиэтиленмонолаурат (5%) в воде или лаурилсульфат натрия (5%) в воде. При необходимости могут добавляться другие материалы, такие как антиоксиданты, увлажнители, стабилизаторы вязкости и аналогичные агенты. Могут быть также включены усилители проникновения через кожу, такие как Azone.

Полипептиды по изобретению могут включаться в состав препаратов для инъекции путем растворения, суспендирования или эмульгирования их в водном или неводном растворителе, таком как растительные или другие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоля, и, при желании, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты. Как обычно принято в данной области, могут использоваться другие препаративные формы для пероральной или парентеральной доставки.

Фармацевтические композиции по изобретению могут составляться в препараты в твердых, полутвердых, жидких или газообразных формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, инъекционные препараты, ингаляционные препараты и аэрозоли.

В фармацевтических лекарственных формах композиции по изобретению могут вводиться в форме их фармацевтически приемлемых солей или они могут также применяться отдельно или в подходящей ассоциации, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Обсуждаемые композиции составляются в соответствии с типом потенциального введения.

Способы введения

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики связанных с интегрином αvβ3 заболеваний, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, где полипептид конъюгирован с вариантом HSA, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики связанного с интегрином αvβ3 заболевания, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения и/или профилактики связанного с интегрином αvβ3 заболевания, включающему введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, кодируемого полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 10, или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида.

Связанное с интегином αvβ3 заболевание включает без ограничения остеопороз, костную опухоль или рост злокачественной опухоли и симптомы, связанные с ними, рост и метастазирование опухоли, связанные с ангиогенезом, и метастазирование опухолей в кости, гиперкальцемию, вызванную злокачественными заболеваниями, болезнь Педжета, физиологическое изменение, вызванное овариэктомией, ревматический артрит, остеоартрит и глазные заболевания, связанные с ангиогенезом, включая без ограничения возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, заболевания роговицы с неоваскуляризацией, с вызванной ишемией неоваскуляризацией ретинопатию, высокую миопию и ретинопатию недоношенных.

Остеопороз может быть связан с патологическим состоянием, выбранным из эстрогенной недостаточности в период постменопаузы, вторичного остеопороза, ревматоидного артрита, овариэктомии, болезни Педжета, злокачественного поражения костей, костной опухоли, остеоартрита, повышенного образования остеокластов и повышенной активности остеокластов. Кроме того, остеопороз включает без ограничения вызванный овариэктомией остеопороз в период постменопаузы, физиологическое изменение или потерю костной массы.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу применения полипептида по изобретению для ингибирования и/или предотвращения роста опухолевых клеток в костях и других органах и симптомов, связанных с ними, у нуждающегося в нем млекопитающего.

Патологические симптомы, связанные с ростом опухолевых клеток в костях, включают увеличенную активность остеокластов, увеличенную резорбцию кости, поражение костей, гиперкальцемию, потерю массы тела и любые их комбинации. Рост опухолевых клеток в кости включает костные злокачественные клетки и метастатические раковые клетки, исходящие из рака предстательной железы, рак молочной железы, рак легких, почечный рак, рак яичников, рак поджелудочной железы или злокачественную миелому.

Полипептиды по изобретению могут вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении, путем инъекции системно, например внутривенной инъекцией; или путем инъекции или нанесения на релевантный участок, например, прямой инъекцией или непосредственным нанесением на участок, когда участок открыт для доступа при хирургическом вмешательстве; или путем местного нанесения.

Полипептиды по изобретению могут применяться в качестве монотерапии. Альтернативно, полипептиды по изобретению могут применяться в комбинации с другим активным средством для лечения заболеваний, связанных с интегрином αvβ3.

В другом варианте осуществления способ лечения заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включает введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или фармацевтически приемлемую соль указанного полипептида в комбинации с терапевтически эффективным количеством другого активного средства. Другое активное средство может вводиться до, во время или после введения полипептида по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления другое активное средство выбрано из группы, состоящей из антагонистов VEGF, противовоспалительных средств, бисфофсонатов и цитотоксических средств.

Введение активных средств может достигаться различными путями, включая пероральное, буккальное, интраназальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутридермальное, трансдермальное, подкожное, внутривенное, внутриартериальное, внутрисердечное, внутрижелудочковое, внутричерепное, внутритрахеальное и подоболочечное введение, внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию, местное нанесение, включая без ограничения глазные капли, кремы и эмульсии, имплантацию и ингаляцию.

Способы получения полипептидов

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, включающему (a) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу получения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, включающему (a) конструирование гена, кодирующего указанный полипептид; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (a); (c) выращивание клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

Способы получения полипептидов по настоящему изобретению могут, кроме того, включать выращивание клетки-хозяина в культуральной среде, лишенной аминокислот; и сбор супернатанта для получения указанного полипептида.

Данные способы могут, кроме того, включать добавление метанола к культуральной среде для индукции экспрессии полипептида в клетках-хозяевах.

Способы могут, кроме того, включать стадию выполнения колоночной хроматографии для получения указанного полипептида.

В одном варианте осуществления способы могут, кроме того, включать стадию выполнения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для получения изолированного полипептида.

Настоящее изобретение конкретнее описано в следующих примерах, которые предназначены только для иллюстрации, поскольку для специалистов в данной области будут очевидны многие модификации и изменения, которые могут быть внесены в него.

Человеческие рекомбинантные RANKL и M-CSF были приобретены у компании R&D Systems (Minneapolis, MN). C-концевые телопептиды из набора для ELISA (иммуноферментного анализа) коллагена типа-1 получали у компании Cross Laps (Herlev, Denmark). Все другие химические соединения получали у компании Sigma.

ПРИМЕР 1

Конструирование гена, кодирующего HSA(C34S)-ARLDDL

Пример 1A

Конструирование гена, кодирующего HSA(C34S)-ARLDDL, посредством ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов и лигирования

Структурный ген HSA C34S конструировали с использованием HSA (Invitrogen®, идентификация клона: IOH23065) в качестве матрицы. Мутацию C34S вызывали двухэтапной полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Первую ПЦР амплифицировали смысловым праймером, содержащим сайт мутации C34S, и антисмысловым праймером, содержащим сайты рестрикции Kpn I, Sac II и кодон остановки TAA. Вторую PCR амплифицировали смысловым праймером, содержащим сайт рестрикции BstB I и секреторную сигнальную последовательность, и антисмысловым праймером, содержащим сайты рестрикции Kpn I, Sac II и кодон остановки TAA. Секреторную сигнальную последовательность препропептида HSA, препропептида фактора α из Saccharomyces cerevisiae или слитый пептид преHSA и препропептида альфа-фактора использовали для экспрессии секреторного белка. Структурный ген ARLDDL амплифицировали ПЦР со смысловым праймером, содержащим сайт рестрикции Kpn I, и спейсерную область, содержащую последовательность GS (геномного секвенатора), и антисмысловым праймером, содержащим сайт рестрикции Sac II и кодон остановки TAA. Продукты ПЦР HSA C34S с секреторным сигнальным пептидом и мутантом Rho ARLDDL со спейсерной областью расщепляли с использованием фермента рестрикции Kpn I и затем лигировали. Полученный в результате генный продукт клонировали в сайты BstB I и Sac II рекомбинации с вектором дрожжей. Затем рекомбинантную плазмиду трансформировали в штамм Escherichia coli XL1-blue, и колонии отбирали с использованием агаровых чашек со средой LB с низким содержанием соли (1% трипсина, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl, 1,5% агара при pH 7,0) и 25 мкг/мл антибиотика зеоцина. Колонии E. coli XL1-blue извлекали и проводили выделение и секвенирование плазмидной ДНК.

Пример 1B

Конструкция гена, кодирующего HSA(C34S)-ARLDDL посредством синтеза гена

Синтезировали ДНК, кодирующую секреторную сигнальную последовательность HSA(C34S)-ARLDDL. Секреторную сигнальную последовательность препропептида HSA, препропептид альфа-фактора из Saccharomyces cerevisiae или слитый пептид преHSA и препропептида альфа-фактора использовали для экспрессии секреторного белка. Полученный в результате генный продукт клонировали в дрожжевой вектор рекомбинации с соответствующим сайтом рестрикции. Затем рекомбинантную плазмиду трансформировали в штамм XL1-blue Escherichia coli и колонии отбирали с использованием агаровых чашек со средой LB с низким содержанием соли (1% трипсина, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl, 1,5% агара при pH 7,0) и 25 мкг/мл антибиотика Zeocin. Колонии E. coli XL1-blue отбирали и проводили выделение и секвенирование плазмидной ДНК.

ПРИМЕР 2

Экспрессия и очистка белка HSA(C34S)-ARLDDL в P. Pastoris и характеристика HSA(C34S)-ARLDDL

После того как клон подтверждали, общее количество 10 мкг плазмид расщепляли ферментом с соответствующим сайтом рестрикции для линеаризации плазмид. Штамм-хозяин дрожжей Pichia трансформировали линеаризованными конструкциями способом теплового шока, используя набор Pichia EasyComp™ от компании Invitrogen®, или электропорацию. Трансформант интегрировался в локус 5' AOX1 одиночным кроссовером. ПЦР использовали для анализа интегрантов Pichia с целью определения того, были ли ген HSA(C34S)-ARLDDL интегрирован в геном Pichia. Колонии отбирали на агаровых чашках, содержащих среду YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы и 2% агара) и 100 мкг/мл Zeocin. Ряд клонов с множественными копиями вставок гена HSA(C34S)-ARLDDL выбирали для отбора клона с самой высокой экспрессией белка. Полученный в результате рекомбинантный HSA(C34S)-ARLDDL содержал 585 аминокислот HSA, спейсер, содержащий 17 аминокислотных остатков и 68 аминокислот мутанта ARLDDL родостомина.

Полученный рекомбинантный слитый белок HSA(C34S)-ARLDDL далее очищали ВЭЖХ (ВЭЖХ C18 на обращенной фазе).

Профили ВЭЖХ HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL показаны соответственно на фиг.1A и 1B.

Очищенный рекомбинантный HSA(C34S)-ARLDDL далее анализировали гель-фильтрационной хроматографией (также называемой хроматографией с исключением по размеру (SEC)) для разделения белков в соответствии с размером.

Профили SEC HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL показаны соответственно на фиг.1C и 1D. Анализ показал, что мутация в положении 34 с C по S в HSA-ARLDDL вызывала уменьшение образования агрегатов примерно в 5 раз.

В таблице 1 показано уменьшение белковых агрегатов на HSA(C34S)-ARLDDL

Таблица 1
Уменьшение белковых агрегатов В HSA(C34S)-ARLDDL
	HSA-ARLDDL	HSA(C34S)-ARLDDL
% мономеров	91,36	98,27
% агрегатов	8,64	1,73

На фиг.1E и 1F показаны фотографии профилей SDS-PAGE соответственно HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL.

Полоса 1 содержит маркеры молекулярной массы.

Полоса 2 содержит индукцию метанолом.

Полоса 3 содержит HSA-ARLDDL или HSA(C34S)-ARLDDL, очищенные хроматографией на голубой сефарозе.

Полоса 4 содержит HSA-ARLDDL или HSA(C34S)-ARLDDL, очищенные колоночной ВЭЖХ на обращенной фазе.

Линия 5 содержит выпускаемый промышленностью BSA.

Линия 6 содержит HSA-ARLDDL или HSA(C34S)-ARLDDL, очищенные хроматографией на голубой сефарозе с 2Me.

Линия 7 содержит HSA-ARLDDL или HSA(C34S)-ARLDDL, очищенные колоночной ВЭЖХ на обращенной фазе с 2Me.

Фотографии демонстрируют, что HSA(C34S)-ARLDDL имеет меньшее число димеров (представленное красной стрелкой), чем HSA-ARLDDL.

HSA(C34S)-ARLDDL, HSA-ARLDDL и человеческий сывороточный альбумин (HSA) также анализировали двумерным SDS-PAGE. Двумерный SDS-PAGE HSA(C34S)-ARLDDL, HSA-ARLDDL и HSA показаны на фиг.1G.

Анализ показал, что, подобно HSA, рекомбинантный HSA(C34S)-ARLDDL и HSA-ARLDDL, полученный из Pichia Pastoris, проявляли по меньшей мере пять изоформ по размеру, определяемому изоэлектрическим фокусированием.

HSA(C34S)-ARLDDL и бычий сывороточный альбумин (BSA) анализировали спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР). На фиг.1H показаны ЯМР спектры HSA(C34S)-ARLDDL и BSA. Анализ показал, что укладка HSA(C34S)-ARLDDL была аналогична укладке BSA. Стрелкой показаны сигналы протонов Hα из линкерной области (G₄S)₅.

ПРИМЕР 3

Анализ ингибирования клеточной адгезии

Ингибирующий эффект на интегрины αvβ3, α531 и αllbβ3

Анализ клеточной адгезии выполняли, как описано в заявке на патент США под серийным № 12/004,045. Вкратце, лунки 96-луночных микротитровальных планшетов Immulon-2 (Costar, Corning, USA) покрывали 100 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS: 10 мМ фосфатный буфер, 0,15M NaCl, pH 7,4), содержащего субстраты в концентрации 50-500 нМ, и инкубировали в течение ночи при 4°C. Субстраты и их концентрации в покрытии составляли: фибриноген (Fg) 200 мкг/мл, витронектин (Vn) 50 мкг/мл и фибронектин (Fn) 25 мкг/мл. Участки неспецифического связывания белка блокировали инкубацией каждой лунки с 200 мкл денатурированного нагреванием 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Calbiochem) при комнатной температуре (25°C) в течение 1,5 ч. Денатурированный нагреванием BSA удаляли, и каждую лунку промывали дважды 200 мкл PBS.

Клетки яичников китайских хомячков (CHO), экспрессирующие интегрины αvβ3 (CHO-αvβ3) и αllbβ3 (CHO-αllbβ3), поддерживали в 100 мкл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM). Клетки яичников китайских хомячков (CHO), экспрессирующие интегрины αvβ3 (CHO-αvβ3) и αllbβ3 (CHO-αllbβ3), были любезно предоставлены доктором Y. Takada (Scripps Research Institute). Клетки эритролейкоза человека K562 приобретали в ATCC (Американской Коллекции Типовых Культур) и культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки. Клетки CHO и K562, растущие в логарифмической фазе, открепляли трипсинизацией и использовали в анализе в концентрации соответственно 3×105 и 2,5×10⁵ клеток/мл. ARLDDL, пегилированные-ARLDDL, HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL добавляли к культивируемым клеткам и инкубировали при 37°C, в атмосфере 5% CO₂ в течение 15 минут. Rho и его варианты использовали в качестве ингибиторов в концентрациях 0,001-500 мкМ. Затем обработанные клетки добавляли в покрытый планшет и подвергали реакции при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение 1 часа. Затем раствор для инкубации удаляли и не прикрепленные к субстрату клетки удаляли промыванием дважды 200 мкл PBS. Связанные клетки количественно анализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Вкратце, лунки фиксировали 100 мкл 10% формалином в течение 10 минут и сушили. Затем 50 мкл 0,05% кристаллического фиолетового добавляли в лунку при комнатной температуре на 20 минут. Каждую лунку промывали 200 мкл дистиллированной воды четыре раза и сушили. Окрашивание проводили добавлением 150 мкл окрашивающего раствора (50% спирта и 0,1% уксусной кислоты). Полученную спектральную поглощательную способность считывали при 600 нм, и считывания коррелировали с числом прикрепленных клеток. Ингибирование определяли как % ингибирования = 100-[OD600 (образца, обработанного вариантом родостомина)/OD600 (необработанного образца)]×100.

Ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов

Определение ингибирующего эффекта ARLDDL и слитых белков на агрегацию тромбоцитов выполняли, как описано в заявке на патент США под серийным № 12/004,045.

Вкратце, образцы венозной крови (9 частей) от здоровых доноров, которые не получали медикаментозные средства в течение по меньшей мере двух недель, собирали в 3,8% цитрат натрия (1 часть). Образцы крови центрифугировали при 150 × g в течение 10 мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) и давали возможность отстояться в течение 5 мин, и собирали PRP. Плазму с низким содержанием тромбоцитов (PPP) получали из оставшейся крови центрифугированием при 2000 × g в течение 25 мин. Количество тромбоцитов в PPP измеряли на гематологическом анализаторе и разбавляли до 250000 тромбоцитов/мкл. Раствор 190 мкл PRP и 10 мкл или Rho, или буфера PBS инкубировали в течение 5 мин в агрометре Hema Tracer 601 при 37°C. 10 мкл 200 мкМ аденозиндифосфата (АДФ) далее добавляли для контроля реакции агрегации тромбоцитов при помощи светопропускания. Чем ниже IC_5O, тем больше специфичность или активность варианта.

Результаты

Таблица 2 демонстрирует ингибиторные эффекты HSA(C34S)-ARLDDL и других тестированных белков на интегрины αvβ3, α5β1 и αllbβ3 и на агрегацию тромбоцитов.

Таблица 2
Ингибирование агрегации тромбоцитов и адгезии клеток HSA(C34S)-ARLDDL и другими белками
IC50(нМ)
Белки	Агрегация тромбоцитов	αvβ3	α5β1	αllbβ3
ARLDDL	10380	48	6420	23171
Peg-ARLDDL	13210	115	>5850	15672
HSA-ARLDDL	11234	53	>5850	12321
HSA(C34S)-ARLDDL	10973	38	>5850	11432

Как демонстрируется в таблице 2, модификация C34S в конструкте HSA-ARLDDL по существу не оказывала эффекта на активность при ингибировании связывания интегрина αllbβ3 или α5β1 с матричными белками. Однако избирательность к интегрину αvβ3 увеличивалась в результате модификации последовательности (IC₅₀ 38, в сравнении с 53).

ПРИМЕР 4

Воздействия HSA(C34S)-ARLDDL на остеокластогенез

Остеокласты являются членами специализированного семейства моноцитов/макрофагов, которые дифференцируются из гематопоэтических предшественников костного мозга. Культуры предшественников остеокластов в присутствии M-CSF (фактора, стимулирующего колонии макрофагов) (20 нг/мл) и sRANKL (суперсемейства активаторов рецептора лиганда ядерного фактора каппа-B) (50 нг/мл) в течение 8 дней вызывали образование крупных зрелых остеокластов с множественными ядрами, которые характеризовались приобретением зрелых фенотипических маркеров, таких как TRAP. Способ остеокластогенеза из культивируемых гематопоэтических клеток костного мозга и эффекты HSA(C34S)-ARLDDL и родственных белков исследовали следующим образом.

Клетки костного мозга получали удалением бедренных костей у 6-8-недельных крыс SD и промыванием полости костного мозга средой a-MEM (минимальной эссенциальной средой Игла), в которую добавляли 20 мМ HEPES

(гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислоты) и 10% инактивированной нагреванием FCS (фетальной телячьей сыворотки), 2 мМ глутамина, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Не прикрепленные к субстрату клетки (гематопоэтические клетки) собирали и использовали в качестве предшественников остеокластов через 24 ч. Клетки высевали в количестве 1×106 клеток/лунку (0,5 мл) в 24-луночные планшеты в присутствии человеческого рекомбинантного растворимого RANKL (50 нг/мл) и мышиного M-CSF (20 нг/мл). Культуральную среду заменяли через каждые 3 дня. Образование остеокластов подтверждали анализом устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (TRAP) на восьмой день. Вкратце, прикрепленные к субстрату клетки фиксировали 10% формальдегидом в солевом растворе с фосфатным буфером в течение 3 мин. После обработки этанолом/ацетоном (50:50 об./об.) в течение 1 мин, клеточную поверхность сушили воздухом и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в ацетатном буфере (0,1 M ацетат натрия, pH 5,0), содержащем 0,01% нафтол AS-MX фосфат (Sigma) и 0,03% соль быстрого красно-фиолетового LB (5-хлор-4-бензамидо-2-метилбензолдиазоний хлорид геми(цинк хлорида) (Sigma) в присутствии 50 мМ тартрата натрия. Балльную оценку подобных остеокластам TRAP-положительных клеток в каждой лунке определяли подсчетом числа TRAP-положительных и многоядерных клеток, содержащих более чем три ядра.

HSA(C34S)-ARLDDL и HSA-ARLDDL заметно ингибировали дифференциацию остеокластов.

Фиг.9A представляет собой контроль. Она демонстрирует остеокласты в клетках, которые не были обработаны какими-либо полипептидами.

На фиг.9B показаны клетки, обработанные 10 нМ HSA(C34S)-ARLDDL.

На фиг.9C показаны клетки, обработанные 30 нМ HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.10A представляет собой график, демонстрирующий, что по мере увеличения концентрации алендроната число остеокластов уменьшается. По данным измерения IC₅₀ для алендроната составила 1,9 мкМ.

Фиг.10B представляет собой график, демонстрирующий, что по мере увеличения концентрации HSA-ARLDDL число остеокластов уменьшается. По данным измерения, IC₅₀ для HSA-ARLDDL составила 11,7 нМ.

Фиг.10C представляет собой график, демонстрирующий, что по мере увеличения концентрации HSA(C34S)-ARLDDL число остеокластов уменьшается. По данным измерения IC₅₀ для HSA(C34S)-ARLDDL составила 6,7 нМ.

Как демонстрирует данный эксперимент, и HSA(C34S)-ARLDDL, и HSA-ARLDDL были значительно более эффективны, чем алендронат, в снижении числа остеокластов.

ПРИМЕР 5

Ингибирование ангиогенеза HSA-ARLDDL и HSA(C34S)-ARLDDL на мышиной модели ретинопатии недоношенных

Экспериментальная модель ретинопатии недоношенных у мышей была создана путем использования вызванного гипоксией ангиогенеза, как описано в публикации Wilkinson-Berka et al. (Wilkinson-Berka, J. L., Alousis, N. S., Kelly DJ., et al (2003) COX-2 inhibition and retinal angiogenesis in a mouse model of retinopathy of prematurity. Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 974-979.28). Вкратце, семидневных мышат и их мать содержали в герметично закрытых камерах, содержащих 75% O₂ и воздух. Мыши оставались в камере в течение пяти дней (гипоксический период, с P7 по P12) и затем содержали в атмосфере воздуха помещения в течение еще семи дней (вызванный гипоксией ангиогенный период, с 12 дней после рождения до 19 дней после рождения, или с P12 по P19). Или HSA-ARLDDL, или HSA(C34S)-ARLDDL в различных количествах вводили в стекловидное тело на 12-й день, и мышей умерщвляли на 19-й день.

Делали три среза одного из глаз каждого животного, парафин удаляли и окрашивали гематоксилином и эозином. Подсчитывали профили кровеносных сосудов (BVP) во внутренней сетчатке и включенные сосуды, прикрепленные к внутренней ограничивающей мембране. Подсчет выполняли на фотомикроскопе (Leica) при увеличении 100x.

Как показано на фиг.11A, HSA-ARLDDL ингибировал ангиогенез на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP). HSA-ARLDDL в дозах 0,001, 0,1 и 10 пкг/глаз уменьшал число сосудов на срез сетчатки по сравнению с группой, получавшей физиологический солевой раствор. Данные представлены в виде средней величины ± стандартное отклонение. За исключением группы, которой вводили 0,001 пкг/глаз HSA-ARLDDL, величина p составляла менее чем 0,001.

Эндотелиальные клетки в передней части слоя ганглионарных клеток и на внутренней ограничивающей мембране сетчатки подсчитывал индивид, которому препараты для подсчета предоставляли слепым методом. Результаты показаны на фиг.11B.

Представленные результаты демонстрируют, что HSA-ARLDDL в дозе 0,001 пкг, 0,1 пкг и 10 пкг на глаз уменьшали число эндотелиальных клеток на срез сетчатки по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор.

Как показано на фиг.11C, HSA(C34S)-ARLDDL также ингибировал ангиогенез на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP). HSA(C34S)-ARLDDL в дозах 0,1, 10 и 1000 пкг/глаз уменьшал число сосудов на срез сетчатки по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор. Данные представлены в виде средней величины ± стандартное отклонение. Во всех случаях величина p составляла менее чем 0,001.

Эндотелиальные клетки в передней части слоя ганглионарных клеток и на внутренней ограничивающей мембране сетчатки подсчитывал индивид, которому препараты для подсчета предоставляли слепым методом. Результаты показаны на фиг.11D.

Представленные результаты демонстрируют, что HSA(C34S)-ARLDDL в дозе 0,1 пкг, 10 пкг и 1000 пкг на глаз уменьшали число эндотелиальных клеток на срез сетчатки по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор.

Фиг.11E, 11F и 11G представляют собой фотографии, показывающие ангиогенез на мышиной модели ретинопатии, вызванной кислородом. На фиг.11E показана нормоксия (контрольная группа), на фиг.11F показан ангиогенез у мыши с ретинопатией, вызванной кислородом, и на фиг.11G показано уменьшение ангиогенеза у мыши с ретинопатией, вызванной кислородом, которую лечили 10 пкг HSA(C34S)-ARLDDL.

Результаты эксперимента показывают, что HSA(C34S)-ARLDDL ингибирует ангиогенез у мыши с ретинопатией, вызванной кислородом.

ПРИМЕР 6

Ингибирование роста опухоли HSA(C34S)-ARLDDL

Клетки человеческого PC-3 (рака предстательной железы) имплантировали мышам с диабетом в комбинации с тяжелым иммунодефицитом без ожирения (NOD-SCID) следующим образом. Каждой мыши подкожно инъецировали в правый бок 1×10⁷ клеток. Опухоли контролировали один раз в два дня. На 27-й день исследования животных делили на две группы. Одну группу обрабатывали солевым раствором, а другую группу обрабатывали HSA(C34S)-ARLDDL (20 мг/кг внутривенно, дважды в неделю).

Размер опухоли в мм³ рассчитывали следующим образом:

Объем опухоли = w²×l/2, где w представляет ширину (мм) и l представляет длину (мм) опухоли.

Массу опухоли оценивали на основании допущения, что 1 мг эквивалентен 1 мм³ объема опухоли.

Фиг.12A представляет собой контроль, который показывает фотографию двух мышей, которым инъецировали клетки PC-3 человека. Фиг.12B представляет собой фотографию двух мышей, которым инъецировали клетки PC-3 человека и лечили HSA(C34S)-ARLDDL (20 мг/кг, внутривенно, дважды в неделю).

Фиг.12C представляет собой фотографию опухолей, иссеченных у контрольных мышей, а фиг.12D представляет собой фотографию опухолей, иссеченных у мышей, получавших лечение HSA(C34S)-ARLDDL.

Фиг.13 представляет собой график, который показывает, что HSA(C34S)-ARLDDL значительно ингибировали рост опухолей у мышей, получавших лечение этим белком, по данным измерения размера опухолей. Клетки на графике указывают инъекции HSA(C34S)-ARLDDL.

ПРИМЕР 7

Анализы действия против ангиогенеза, вызванного пробками MATRIGEL™

Для исследования того, может ли HSA(C34S)-ARLDDL ингибировать ангиогенез, использовали анализы ангиогенеза, вызванного пробками MATRIGEL™, как описано в публикации заявки на патент США № 2008-0188413 Al. Вкратце, аликвотное количество (500 мкл) MATRIGEL™ (Becton Dickinson Lab.), содержащее 200 нг/мл VEGF, инъецировали подкожно в область спины 6-8-недельных мышей C57BL/6. MATRIGEL™ быстро образовывал пробку. HSA(C34S)-ARLDDL в дозе 10 мг/кг или в дозе 1 мг/кг внутривенно вводили однократно на второй день, и мышей умерщвляли на седьмой день. На фиг.14A изображены фотографии пробок.

Количественный анализ вновь образованных сосудов проводили измерением гемоглобина в пробках как показателя образования кровеносных сосудов способом Драбкина и набором реагента Драбкина 525 (Sigma) (фиг.14B).

Как показывают фиг.14A и 14B, HSA(C34S)-ARLDDL был эффективен при ингибировании ангиогенеза при использовании анализов пробок MATRIGEL™.^*:P<0,05, в сравнении с контролем.

Аминокислотные и нуклеотидные последовательности, использованные в заявке

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность варианта ARLDDL родостомина. Она представлена на фиг.2.

SEQ ID NO: 2 представляет собой одну нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант ARLDDL родостомина. Она представлена на фиг.3A. SEQ ID NO: 3 представляет собой другую нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариант ARLDDL родостомина. Она представлена на фиг.3B.

SEQ ID NOS: 4 и 5 представляют собой соответственно аминокислотную и нуклеотидную последовательности мутанта HSA C34S. Они представлены на фиг.4A и 4B.

SEQ ID NOS: 6 и 7 представляют собой соответственно аминокислотную и нуклеотидную последовательности мутанта HSA C34A. Они представлены на фиг.5A и 5B.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность линкерной аминокислоты. Она представлена на фиг.6.

SEQ ID NOS: 9 и 10 представляют собой соответственно аминокислотную и нуклеотидную последовательности мутанта HSA(C34S)-ARLDDL. Они представлены на фиг.7A и 7B.

SEQ ID NOS: 11 и 12 представляют собой соответственно аминокислотную и нуклеотидную последовательности мутанта HSA(C34A)-ARLDDL. Они представлены на фиг.8A и 8B.

Предшествующее описание иллюстративных вариантов осуществления изобретения было представлено только в целях иллюстрации и описании и не предназначено быть исчерпывающим или ограничивающим изобретение конкретными раскрытыми формами. В свете представленных выше положений возможны многие модификации и варианты.

Другие варианты осуществления изобретения станут очевидными для специалистов в данной области в результате рассмотрения описания и раскрытого в нем практического осуществления изобретения. Предусматривается, что описание и примеры следует рассматривать только как иллюстративные, причем действительный объем и сущность изобретения указаны следующей формулой изобретения.

1. Полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, где полипептид конъюгирован посредством линкерной аминокислотной последовательности с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA), состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, или фармацевтически приемлемая соль указанного полипептида, где указанная линкерная аминокислотная последовательность содержит комбинацию аминокислот глицина и серина и где указанный вариант HSA слит с указанным полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, через указанную линкерную аминокислотную последовательность на N-конце указанного полипептида.

2. Полипептид по п. 1, где указанная линкерная аминокислотная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

3. Полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, или фармацевтически приемлемая соль указанного полипептида.

4. Физиологически приемлемая композиция для лечения заболевания, связанного с интегрином αvβ3, содержащая полипептид по п. 1 или его фармацевтически приемлемую соль в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Физиологически приемлемая композиция для лечения заболевания, связанного с интегрином αvβ3, содержащая полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или его фармацевтически приемлемую соль, в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Способ лечения заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающий введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида по п. 1 или 2, или его фармацевтически приемлемой соли.

7. Способ лечения заболевания, связанного с интегрином αvβ3, включающий введение нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида по п. 3 или его фармацевтически приемлемой соли.

8. Способ по п. 7, где указанное заболевание, связанное с интегрином αvβ3, представляет собой рост опухоли или метастазирование опухолей в кости.

9. Способ по п. 7, где указанное заболевание, связанное с интегрином αvβ3, представляет собой глазные заболевания, связанные с ангиогенезом, выбранные из группы, состоящей из возрастной дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии, заболеваний роговицы с неоваскуляризацией, возрастной ретинопатии с вызванной ишемией неоваскуляризацией, высокой миопии и ретинопатии недоношенных.

10. Способ по п. 7, где указанное заболевание, связанное с интегрином αvβ3, выбрано из группы, состоящей из остеопороза, гиперкальцемии, вызванной злокачественными заболеваниями, множественной миеломы и болезни Педжета.

11. Способ получения полипептида по п. 1, включающий (а) конструирование гена, кодирующего полипептид по п. 1 или 2; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (а); (с) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.

12. Способ получения полипептида по п. 3, включающий (а) конструирование гена, кодирующего полипептид по изобретению; (b) трансфекцию клетки-хозяина геном стадии (а); (с) выращивание указанной клетки-хозяина в культуральной среде; и (d) выделение указанного полипептида.