Система и способ для связанной со временем микроскопии биологических организмов

Изобретение относится к микроскопии отдельных биологических организмов в жидком образце. Изображения, на которых могут быть идентифицированы отдельные биологические организмы, объединяют для создания наборов оптических срезов биологических организмов, и наборы оптических срезов анализируют для определения значения по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность указанного отдельного биологического организма в каждом контейнере для образца. Техническим результатом является уменьшение времени исследования, повышение надежности и экономической эффективности результата. 2 н. и 23 з.п. ф-лы, 23 ил.

 

Тестирование чувствительности к антибиотикам является очень важной дисциплиной, которая используется повсеместно в больницах, клиниках, медицинских производственных предприятиях, производстве пищи и напитков и т.д. Большое количество различных химических веществ и стандартных процедур и огромное количество тестов, выполняемых каждый год, дают простор для огромной промышленной выгоды от микроорганизмов, растущих повсеместно.

Некоторые из этих тестов являются косвенными тестами, т.е. измеряют или наблюдают наличие производных деятельности микроорганизмов, например, продуктов жизнедеятельности или окислительно-восстановительного индикатора, вместо наблюдения деятельности микроорганизмов напрямую.

Расходы, связанные с выполнением тестов чувствительности к антибиотикам, например, в больницах, огромны и постоянно растут. Кроме того, длительные инкубационные периоды тестирования до 6 дней представляют собой большую проблему, так как лечение не может ждать такого продолжительного времени реакции. Пациент может умереть к моменту, когда будет готов результат. Врачи, таким образом, прописывают антибиотики широкого спектра для начала лечения немедленно, до того как поступят результаты. Более быстрое получение результатов (в течение нескольких часов) может сделать возможным использование антибиотиков узкого спектра, нацеленных непосредственно на причину болезни, тем самым минимизируя риск создания устойчивости к антибиотикам в целом.

Одним из наиболее распространенных применяемых тестов чувствительности является анализ мочи на инфекции мочевыводящих путей (ИМП). Моча сама по себе является очень хорошей средой для роста, и необходимо принять наиболее тщательные меры предосторожности, чтобы не загрязнить мочу бактериями во время обработки образцов мочи. Кроме того, чтобы надежность результатов осталась в силе, необходимо, чтобы анализ в лаборатории начался в течение 1-2 часов. В целях сокращения расходов в системе здравоохранения многие небольшие лаборатории были закрыты, оставив только несколько крупных лабораторий, зачастую расположенных в больницах. Образец мочи должен, таким образом, поступить в центральную лабораторию в течение 1-2 часов, что не является проблемой в больших больницах, но когда образец получен семейным врачом (GP), расстояние и время транспортировки в лабораторию могут быть проблемой. В этих случаях может потребоваться заморозка образцов мочи и хранение их в специальных контейнерах до прибытия в лабораторию. Даже в больницах, где лаборатория может находиться в непосредственно близости, выгодно начинать тестирование чувствительности сразу после забора образца, так как это минимизирует время доставки результатов анализа. Таким образом, желательно иметь небольшое и простое в использовании устройство для проведения тестирования чувствительности локально по месту оказания медицинской помощи.

Тестирование чувствительности микроорганизмов включает в себя несколько уровней тестирования. Одним уровнем может быть определение типов микроорганизмов, присутствующих в образце, например бактерии, грибки, простейшие, водоросли или вирусы. Другим уровнем тестирования является установление того, какой тип антибиотика будет использоваться для устранения микроорганизмов. Типы антибиотиков могут включать в себя антибиотики узкого или широкого спектра, а также более специализированные типы. Аналогично, тесты могут определить лучший из препаратов одного типа, но разных производителей.

Кроме того, может оказаться важным протестировать чувствительность микроорганизмов к различным средам, например аэробным и анаэробным, и в некоторых случаях даже к фосфорным средам. В некоторых ситуациях может потребоваться тестирование влияния различных уровней и комбинаций питательных веществ, особенно при поиске специфичных типов микроорганизмов.

После того как определен лучший антибиотик для уничтожения микроорганизмов, важно определить концентрацию антибиотика для назначения. Как правило, тестируют по меньшей мере 5 различных концентраций, и могут использовать до 15 или более различных концентраций для определения оптимальной концентрации. Результатом тестирования концентрации может быть MIT - минимальная ингибирующая концентрация (Minimum Ingibitory Concentration), которая показывает концентрацию антибиотика, необходимую для предотвращения роста микроорганизмов. Если используют концентрации ниже MIT, то антибиотик будет устранять лишь часть микроорганизмов, с последующим риском развития устойчивости или чувствительности к антибиотикам у оставшихся микроорганизмов.

Как правило, результаты тестирования формулируют путем разделения антибиотиков-кандидатов на группы Устойчивые, Промежуточные или Чувствительные.

Современные способы тестирования требуют использования большого количества различных химических веществ и стандартизированных процедур. В США стандарты курируются CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, Институт клинических и лабораторных стандартов). Стандарты описывают подробности тестов, например, как проводить тесты, включая инокуляцию (концентрации), расстояния изоляции, температуры, проверку результатов роста, инкубационные периоды. Инкубационные периоды тестов могут варьироваться от нескольких часов (например, 16-24 часов) до нескольких дней (например, 3-6 дней).

Часто используют трехэтапный способ во время инкубирования микроорганизмов. Первый этап заключается в инкубировании первичной культуры. Когда получено достаточно высокое качество культуры, одну или несколько монокультур выбирают и изолируют. Монокультуры затем инкубируют снова для получения достаточно большого количества микроорганизмов для последнего этапа - для инкубирования микроорганизмов в чашках Петри или аналогичных, содержащих различные типы и концентрации антибиотиков. Три этапа, как правило, выполняются вручную и, таким образом, являются затратными по человеческим ресурсам, и время от получения первичной культуры до того, когда можно начинать тестирования чувствительности, часто составляет много часов или несколько дней.

Описанная сложность тестирования чувствительности говорит о преимуществах устройства, которое снижает время тестирования от многих часов в лучшем случае до всего лишь нескольких часов или даже минут. Кроме того, было бы полезно использовать более автоматические процедуры тестирования, чем мы видим сегодня, минимизируя ручную обработку в лабораториях. Наконец, снижение затрат на тест, очевидно, станет весьма полезным для всех частей системы здравоохранения.

Были представлены различные решения для преодоления по меньшей мере частично некоторых из описанных выше проблем.

Одним из таких решений является патент США 6153400 "Устройство и способ для тестирования микробной чувствительности к антибиотикам", Matsumara et al. Matsumara предоставляет способ и устройство для осуществления тестирования чувствительности микробов к антибиотикам, включающие одноразовые многокамерные планшеты и автоматический держатель планшет и инструмент получения и обработки изображений. Планшеты чувствительности инокулируют микроорганизмом и применяют антимикробный(е) агент(ы) таким образом, что микроорганизмы подвергаются воздействию ряда концентраций или градиента каждого антимикробного агента. Планшеты затем помещают в устройство, которое контролирует и измеряет рост микроорганизмов. Эти данные используют для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Такая система автоматизирует тестирование антимикробной чувствительности с использованием твердых сред и стандартизированное предоставление результатов Кирби-Бауэра. Система частично автоматическая, но имеет дело с агаровыми дисками для дискодиффузионного метода.

Другой подход показан в патенте США № 4448534 "Тестирование чувствительности к антибиотикам", Wertz et al. Устройство предназначено для автоматического электронного сканирования каждой лунки многолуночной кюветы, содержащей множество жидких образцов. Источник света, предпочтительно одиночный источник, проходит через лунки к матрице фоточувствительных ячеек, по одной на каждую лунку. Также имеется калибровочная или сравнительная ячейка, принимающая свет. Электронное устройство считывает последовательно каждую ячейку, быстро завершая сканирование без физического перемещения каких-либо частей. Полученные сигналы сравнивают с сигналом от сравнительной ячейки и с другими сигналами, или с сохраненными данными и производят вычисление, которое отображается или распечатывается. Тем самым могут быть решены такие вопросы, как определение минимальных ингибирующих концентраций (MIC) лекарственных средств и идентификация микроорганизмов. Устройство в соответствии с патентом США № 4448534 не получает наборов оптических срезов указанных биологических организмов.

Еще одна система подана в качестве заявки на патент США №US 2005/0068614. Микроскопическая система имеет предметный столик, на котором должен быть расположен наблюдаемый образец, включающий наблюдаемый объект и прозрачный элемент, линзу объектива, которую помещают лицом к наблюдаемому образцу, расположенному на предметном столике, блок фокусировки, который перемещает по меньшей мере один элемент из предметного столика и объектива для выполнения фокусировочного действия, и блок автоматической фокусировки, который управляет приводом фокусировки посредством так называемой TTL системы. После того как для прозрачного элемента блоком автоматической фокусировки проведена автоматическая фокусировка, привод фокусировки выполняет перемещение по меньшей мере одного из предметного столика и объектива на предопределенное постоянное расстояние. Устройство в соответствии с заявкой на патент США №2005/0068614 не получат наборов оптических срезов указанных биологических организмов.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение системы и способа для осуществления тестирования микробной чувствительности, которые преодолевают некоторые из указанных выше недостатков и дают быстрый, надежный и экономически эффективный результат по сравнению с известными системами и способами.

Способ можно использовать непосредственно на клиническом материале или на клиническом материале после простой подготовки, например, посредством разведения подходящим субстратом, смешивания, центрифугирования или фильтрации.

Система позволяет быстро определять резистентность бактерий к антимикробным веществам непосредственно на материале первичного клинического образца без предварительной изоляции отдельных агентов, присутствующих в клиническом образце.

Таким образом, система способна определять оптимальное антимикробное вещество, которое должно быть выбрано для лечения инфекции всего за один инкубационный этап, без обычных этапов инкубирования первичной культуры, выбора колоний для монокультуры и воспроизводства и повторного инкубирования, применяя полученный материал для общепринятого тестирования резистентности для еще одной инкубации.

В одном из вариантов осуществления систему и способ можно использовать для быстрого и надежного тестирования образцов мочи, инфицированных бактериями, для определения чувствительности к различным антибиотикам. Было установлено, что система и способ по настоящему изобретению обладают преимуществом по сравнению с другими системами, широко используемыми в учреждениях здравоохранения, поскольку она является более быстрой и экономически более эффективной, и в то же время сокращает потребность в человеческих ресурсах и ручной обработке образцов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения систему и способ можно использовать для исследования различных типов микроскопических биологических организмов посредством наблюдения отдельных экземпляров в течение периода времени в окружении, похожем на естественную среду обитания для организмов. При наблюдении за микроскопическими биологическими организмами с использованием традиционных микроскопов организмы должны быть помещены на предметное стекло микроскопа очень тонким слоем. Тонкий слой не оставляет места организмам для естественного поведения, и, как правило, невозможно контролировать среду с точки зрения питания, уровня кислорода, значения pH и т.д. Настоящее изобретение преодолевает по меньшей мере часть этих недостатков.

Микроскопические биологические организмы могут присутствовать в клиническом материале, таком как кал, образцы мазков с кожи, поражения, поверхностей серозных или слизистых оболочек, моча, лимфа, гной, мокрота, транссудат, экссудат, железистые выделения, например молоко, пот, слюна, слезная жидкость, сальные выделения, носовые или другие слизистые выделения, кровь, спинномозговая жидкость, опухолевая ткань, материал биопсии из любой ткани, внеклеточная жидкость, сыворотка, плазма.

Таким образом, в соответствии с одним из вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается система для определения значения по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность отдельных биологических организмов в жидком образце. Система содержит блок оптической регистрации, включающий по меньшей мере одно устройство получения изображения, адаптированное для получения изображений, на которых могут быть идентифицированы отдельные биологические организмы. Кроме того, система содержит по меньшей мере одно устройство для образцов, включающее в себя по меньшей мере один контейнер для образца для удерживания образца в жидком состоянии и по меньшей мере один перемещающий блок, организованный для перемещения устройства для образцов и блока оптической регистрации относительно друг друга. Система дополнительно содержит блок управления для управления указанным блоком оптической регистрации и указанным перемещающим блоком для получения изображений для формирования по меньшей мере первого набора оптических срезов в указанном жидком образце. Устройство анализа изображений предназначено для анализа указанного первого набора оптических срезов, указанное устройство анализа изображений содержит алгоритмы, адаптированные для определения указанного значения указанного по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность указанных отдельных биологических организмов в каждом контейнере для образца.

В одном из вариантов осуществления блок управления выполнен с возможностью последовательно получать наборы оптических срезов указанного образца, например первый набор оптических срезов и по меньшей мере второй набор оптических срезов.

Одна из задач настоящего изобретения обеспечивается способом для микробной активности в жидком образце. Способ включает в себя последовательное получение множества наборов оптических срезов указанного жидкого образца и выбор первого и второго набора оптических срезов из указанного множества наборов срезов. Значение по меньшей мере одного параметра для каждого набора оптических срезов вычисляют и определяют, возникло ли изменение значения по меньшей мере одного параметра между получениями двух наборов оптических срезов. Способ дополнительно включает в себя определение микробной активности в жидком образце на основе изменений значения по меньшей мере одного параметра

Одна из задач настоящего изобретения обеспечивается способом определения микробной активности в жидком образце, указанный способ включает получение по меньшей мере одного набора оптических срезов указанного жидкого образца и выбор первого набора оптических срезов из указанного по меньшей мере одного набора оптических срезов. Способ дополнительно содержит вычисление значения по меньшей мере одного параметра указанного первого набора оптических срезов и определение указанной микробной активности в указанном жидком образце на основании указанного значения по меньшей мере одного указанного параметра.

В контексте настоящего изобретения параметром, в принципе, могут быть любые измеряемые параметры, в качестве неограничивающих примеров, такие как скорость клеточного деления, жизнеспособность клетки, отношение количества живых/мертвых, броуновское движение, уровень метаболизма, морфология, фактор роста, кинетика или фокусное поведение. Под параметром может пониматься одно значение, комбинация нескольких значений или даже комбинация нескольких параметров.

В контексте настоящего изобретения фраза "биологические организмы" может относиться и к одному биологическому организму, и к ансамблю биологических организмов, например малым или большим группам биологических организмов. Способ и систему по настоящему изобретению, таким образом, можно использовать для определения значения по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность одного биологического организма в жидком образце, и для определения значения по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность множества отдельных биологических организмов в жидком образце.

Под микробной активностью можно понимать активность, создаваемую клеточным делением, клеточным движением, изменениями среды, метаболически индуцированными изменениями среды, гибелью клеток и т.д., вызывающую изменения в популяции микроскопических организмов, изменения в размере отдельных организмов или кластеров организмов или изменения положений или перемещений организмов. Микробную активность, таким образом, можно понимать в очень широком смысле как любое изменение, которое можно обнаружить для одного микроскопического организма, или в малой группе или в популяции микроскопических организмов.

Система по настоящему изобретению содержит блок оптической регистрации. Блок оптической регистрации содержит по меньшей мере одно устройство получения изображений, включающее CCD-камеру или CMOS-камеру. Блок оптической регистрации дополнительно может состоять из линз, призм, перегородок, отверстий и других широко распространенных оптических компонентов, используемых в микроскопии. Блок оптической регистрации может быть адаптирован для получения изображений, где могут быть идентифицированы отдельные биологические организмы. Один из вариантов осуществления блока оптической регистрации описан в предварительной заявке на патент США №61/146850, где представлено устройство для получения множества изображений образца, расположенных относительно устройства для образцов. Устройство содержит по меньшей мере первый блок оптической регистрации, включающий по меньшей мере первое устройство получения изображений. Первый блок оптической регистрации имеет оптическую ось и предметную плоскость. Предметная плоскость содержит область получения изображений, из которой первым устройством получения изображения в виде изображения могут быть зарегистрированы электромагнитные волны. Устройство дополнительно содержит по меньшей мере один перемещающий блок, расположенный для перемещения устройства для образцов и первого блока оптической регистрации относительно друг друга, и корпус, расположенный для удерживания указанного первого блока оптической регистрации и указанного перемещающего блока, где указанный первый блок оптической регистрации и указанный перемещающий блок расположены таким образом, что по меньшей мере часть указанного устройства для образцов проходит через указанную область захвата изображения. Движение устройства для образцов и первого блока оптической регистрации относительно друг друга осуществляется вдоль траектории сканирования, что определяет угол тета относительно оптической оси, где тета больше нуля. Патент США №61/146850 также описывает способ получения множества изображений образца. Этот способ включает в себя расположение указанного образца относительно устройства для образцов и расположение указанного устройства для образцов относительно устройства для получения множества изображений. Устройство содержит по меньшей мере первый блок оптической регистрации, имеющий по меньшей мере первое устройство получения изображений. Первый блок оптической регистрации имеет оптическую ось и предметную плоскость, где предметная плоскость имеет область получения изображений, электромагнитные волны из которой могут быть зарегистрированы первым блоком получения изображений в виде изображения. Область получения изображений пересекает по меньшей мере часть указанного образца. Устройство для образцов и указанный первый блок регистрации перемещаются относительно друг друга по длине сканирования вдоль первой траектории сканирования. Траектория сканирования и оптическая ось вместе определяют угол тета, который больше нуля. Способ дополнительно включает получение указанного множества изображений. В патенте США №61/146850 также описана система для получения множества изображений образца. Система включает в себя устройство для образцов и устройство, имеющее по меньшей мере первый блок оптической регистрации, содержащий по меньшей мере первое устройство получения изображений. Первый блок оптической регистрации устройства имеет оптическую ось и предметную плоскость. Эта предметная плоскость содержит область получения изображений, из которой первым устройством получения изображения в виде изображения могут быть зарегистрированы электромагнитные волны. Устройство этой системы дополнительно содержит по меньшей мере один перемещающий блок, расположенный для перемещения устройства для образцов и первого блока оптической регистрации относительно друг друга, и корпус, расположенный для того, чтобы удерживать указанный первого блок оптической регистрации и указанный перемещающий блок, где указанный первый блок оптической регистрации и указанный перемещающий блок расположены таким образом, что по меньшей мере часть указанного устройства для образца проходит через указанную область получения изображений. Движение устройства для образцов и первого блока оптической регистрации относительно друг друга осуществляется вдоль траектории сканирования, что определяет угол тета относительно оптической оси, где тета больше нуля. В принципе, траектория сканирования в патенте США № 61/146850 может включать в себя любое перемещение предметной плоскости и образца относительно друг друга. В частности, траектория сканирования может включать в себя практически прямую линию сканирования, расположенную вдоль оси сканирования. Траектория сканирования также может определяться по существу вращательным движением, в таком случае тета - это угол между указанной оптической осью и локальной касательной к указанному вращательному движению. В одном из вариантов осуществления траектория сканирования ограничивается плоскостью, например прямая линия, круговое движение, движение по спирали или любая другая подходящая траектория.

В одном из вариантов осуществления биологические организмы являются неподвижными во время получения изображения. В контексте настоящего приложения фраза "по существу неподвижны" относится к ситуации, когда движения организмов в неоднородном жидком образце не влияют на определение параметров образца, например, параметров организмов в образце. В одном из вариантов осуществления "по существу неподвижны" относится к ситуации, когда перемещение организмов в период времени, проходящий между получением двух последовательных изображений в последовательности пространственно разделенных изображений, должно быть значительно меньше, чем расстояние меду этими двумя последовательными изображениями, например, одна десятая расстояния. В одном из вариантов осуществления "по существу неподвижны" еще относится к ситуации, где отсутствует поток массы указанного образца во время получения по меньшей мере части указанных изображений. В одном из вариантов осуществления для визуализации клеток и их содержимого движение клетки может быть ограничено до такой степени, в которой могут быть получены достаточно резкие изображения клеток, так что можно будет определить детали, относящиеся, например, к ядру. В вариантах осуществления, приспособленных для определения параметров, относящихся к клеткам, термин "по существу неподвижны", таким образом, может означать, что движение указанных клеток на протяжении получения изображения может быть ограничено глубиной резкости изображаемого пространства (ГРИП), или частью ГРИП, например одной тысячной ГРИП, например одной сотой ГРИП, например одной десятой ГРИП, например одной пятой ГРИП, например одной третей ГРИП. ГРИП может быть в диапазоне от 0,1 микрометра до 200 микрометров. Движение организмов в жидком образце в неподвижных условиях может, таким образом, быть менее чем 0,001 микрометра в секунду, например менее чем 0,01 микрометра в секунду, например менее чем 0,1 микрометра в секунду, например менее чем 1 микрометр в секунду. Параметром организма в этом варианте осуществления может быть количество и размер ядер или расстояние между ядрами в клетке. В одном из вариантов осуществления, где детали организмов представляют меньший интерес, например для подсчета организмов, ограничение на движение организма является таким, чтобы движение не влияло на подсчет организмов.

Движение организмов, которые должны быть подсчитаны, должно быть, таким образом, менее чем 1 миллиметр в секунду, например менее чем 100 микрометров в секунду, например, менее чем 10 микрометров в секунду, например менее 1 микрометра в секунду, например, менее чем 0,1 микрометра в секунду.

Глубина резкости здесь определена как диапазон расстояний от оптической системы визуализации, в котором изображение объектов по существу не подвержено влиянию смещений от фокальной плоскости. Фокальная плоскость определяется как плоскость, в которой достигается наилучшее разрешение визуализации. Термин "по существу не подвержено влиянию" означает, что оцениваемые параметры, которые характеризуют признаки объекта, по существу не зависят от перемещения. В одном из вариантов осуществления "по существу не подвержены влиянию" означает, что отношение между FWHM (Full Width Half Max, полная ширина на половине высоты) распределения интенсивностей точечного источника в заданном положении в пределах глубины резкости к FWHM распределения интенсивностей точечного источника в фокальной плоскости менее чем 5, например менее чем 2, например менее чем 1,5, например менее чем 1,25, например менее чем 1,1, например менее чем 1,05.

Система по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одно устройство для образцов, включающее по меньшей мере один контейнер для образца для удержания образца в жидком виде. Устройство для образцов может состоять из стеклянного материала и/или из пластикового материала. В одном из вариантов осуществления материал по существу прозрачный на длине (длинах) волны электромагнитного излучения, используемой для получения набора оптических срезов. Устройство для образцов может быть одноразовым элементом для использования только один раз, хотя оно может состоять из повторно используемых материалов, таких как стекло. Количество жидкого образца в контейнере для образца может быть в диапазоне от 0,1 микролитра до 100 микролитров. Количество контейнеров для образцов в устройстве для образцов может варьироваться в зависимости от приложения. Устройство для образцов, которое содержит только один контейнер для образца, можно, например, использовать в варианте осуществления для мониторинга всего одного биологического организма. Устройство для образцов, содержащее несколько контейнеров для образцов, например 20 контейнеров, можно использовать для тестирования чувствительности. Количество N_cont контейнеров для образцов на указанном устройстве для образцов, может быть равным 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 14,15, 16, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, или более 30. В одном из вариантов осуществления N_cont контейнеров для образцов расположены в один или несколько рядов, например с одинаковым числом контейнеров для образцов в каждом ряду. Контейнер для образца может содержать входное отверстие, которое будет использовано для ввода жидкости в контейнер для образца, и может содержать выходное отверстие, которое будет использовано для выпуска лишней жидкости или воздуха во время ввода жидкости. Выходное отверстие также можно использовать для извлечения образца, если устройство для образцов должно быть использовано повторно с новым образцом жидкого образца. Контейнер для образца может быть открытым, т.е. может быть открытым по меньшей мере в одном направлении, в таком случае контейнер можно рассматривать как контейнер луночного типа, или образец может быть по существу закрытым, т.е. быть по существу закрытым во всех направлениях, кроме необязательных входного и выходного отверстий, в таком случае его можно рассматривать как контейнер кюветного типа.

Образец может быть в жидком виде во время получения наборов оптических срезов. В контексте настоящего изобретения образец рассматривается как находящийся в жидком состоянии, если образец может перетекать под действием гравитационных сил в контейнер для образца или быть втянутым в контейнер для образца с использованием капиллярных сил. Жидкий образец может вести себя как гель. В контексте настоящего изобретения гель является твердым, желеобразным материалом, который обладает свойствами, варьирующимися от мягкого и жидкого то твердого и вязкого. Гель проявляет отсутствие текучести в стационарном состоянии. По весу гели в основном являются жидкостями, но они ведут себя как твердые тела.

Набор оптических срезов образца в контейнере для образца содержит по меньшей мере одно изображение. Набор оптических срезов может также содержать несколько изображений, например 10 изображений или даже больше, например 25, 40, 60 или даже больше.

Система по настоящему изобретению содержит перемещающий блок для перемещения устройства для образцов и блока оптической регистрации относительно друг друга. Это может достигаться посредством расположения указанного устройства для образцов относительно опоры, которая затем перемещается относительно остальной системы, удерживая блок оптической регистрации неподвижным, или наоборот, смещая блок оптической регистрации относительно остальной системы, удерживая опору устройства для образцов неподвижной. Устройство для образцов и блок оптической регистрации могут перемещаться одновременно относительно остальной системы.

В одном из вариантов осуществления, где измерения должны проводиться только в одном контейнере для образца, перемещающий блок может быть отрегулирован для движения устройства для образцов относительно блока оптической регистрации небольшими шагами только при получении изображений для наборов оптических срезов. Размер шага может быть менее около 1000 микрометров, например менее около 100 микрометров, например менее около 10 микрометров, например менее около 1 микрометра, например менее около 0,1 микрометра.

Малые шаги могут изменяться от шага к шагу. Длина шагов может быть определена равной ГРИП или ее части или может быть равна k, умноженному на ГРИП, где k больше 1,0.

В другом варианте осуществления, где измерения должны проводиться в нескольких контейнерах для образцов в последовательности, перемещающий блок может быть отрегулирован для перемещения устройства для образцов относительно блока оптической регистрации большими шагами при движении от одного контейнера к следующему в последовательности, в то время как при получении изображений для набора оптических срезов в контейнере для образца шаги остаются маленькими.

В одном из вариантов осуществления изобретения устройство анализа изображений анализирует изображения и наборы оптических срезов, полученные от контейнеров для образцов.

При наличии набора оптических срезов образца соответствующие объекты, будь то клетки, бактерии или другие объекты, предоставляющие интерес, могут быть извлечены для дальнейшего анализа посредством применения первого алгоритма, включающего:

Применение функции решения к каждой точке набора оптических срезов, классифицируя каждую точку либо как объект, либо как фон. Функция решения может быть, например, основана на локальном контрасте вокруг точки в задаче.

Объединение точек объектов из каждого изображения набора оптических срезов для формирования фокусных стопок отдельных объектов. Фокусная стопка объекта состоит из одного или нескольких изображений объекта, снятых в разных плоскостях фокусировки. При построении фокусных стопок объекта необходимо проявлять осторожность, если набор оптических срезов получен с использованием наклонной оптической системы, как описано в предварительной заявке США № US 61/146850.

Для каждой фокусной стопки объекта можно определить точку оптимальной фокусировки, используя функцию фокусирования, применяемую к каждому изображению в фокусной стопке объекта В одном из вариантов осуществления, когда объектами в задаче являются амплитудные объекты, в качестве функции фокусирования можно использовать дисперсию интенсивностей точек. Считается, что объект в фокусе в изображении с максимальной дисперсией. Это изображение можно извлечь для дальнейшего анализа.

В одном из вариантов осуществления изобретения устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения скорости клеточного деления. При наличии набора наборов оптических срезов образца на равноудаленных или неравноудаленных временных интервалах скорость клеточного деления рассчитывается путем извлечения соответствующих клеток с использованием первого алгоритма. Для каждого извлеченного объекта можно рассчитать параметр, относящийся к клетке. Им может быть, например, количество субкомпонентов, площадь объекта, периметр объекта, размер веретена деления и т.д. Можно рассчитать среднее значение параметра для всех объектов в наборе оптических срезов. Это повторяют для всех наборов оптических срезов образца в задаче. Наблюдая как изменяются во времени средние значения, можно установить скорость клеточного деления. Другие, отличающиеся от среднего значения параметра, статистические показатели также можно рассматривать, например, медиану, дисперсию или другие более высокого порядка и/или нелинейные показатели.

В одном из вариантов осуществления изобретения устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения жизнеспособности клеток. При наличии одного набора оптических срезов образца степень жизнеспособности клеток можно установить посредством первого применения указанного выше способа для извлечения фокусных стопок соответствующих объектов. Для каждого объекта можно рассчитать жизнеспособность путем рассмотрения таких параметров, как поведение функции фокусирования, профиль интенсивности объекта в фокусе, общий контраст объекта, отклик некоторых биологических окрашиваний и т.д. Применяя это для всех зарегистрированных объектов в стопке, можно использовать статистические показатели, такие как среднее арифметическое, для оценки общей жизнеспособности клеток в образце.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает алгоритмы, приспособленные для определения отношения количества живых/мертвых. Имея набор наборов оптических срезов образца на равноудаленных или неравноудаленных временных интервалах, отношение живых/мертвых рассчитывают путем извлечения соответствующих клеток с использованием первого алгоритма. Для каждого извлеченного объекта можно рассчитать параметр, относящийся к свойствам живые/мертвые.

Это может быть, например, поведение функции фокусирования, профиль интенсивности объекта в фокусе, общий контраст объекта, реакция на некоторые биологические окрашивания и т.д. Можно рассчитать среднее значение параметра для всех объектов в наборе оптических срезов. Это повторяют для всех наборов оптических срезов образца в задаче. Наблюдая, как изменяются во времени средние значения, можно установить отношение количества живых/мертвых. Другие статистические показатели, отличающиеся от среднего значения параметра, также можно рассматривать, например медиану, дисперсию или другие более высокого порядка и/или нелинейные показатели.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения броуновского движения, которое определяют посредством вычислений. Имея один набор оптических срезов образца, степень броуновского движения можно устанавливать путем первого применения указанного выше способа для извлечения фокусных стопок соответствующих объектов. Для каждой фокусной стопки объекта степень движения можно рассчитать, рассматривая движение центра тяжести объекта в разных плоскостях фокусировки. Применяя это ко всем зарегистрированным объектам в стопке, можно использовать статистические показатели для оценки, является ли движение броуновским, или есть ли желаемое направление потока объектов в образце.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритм, приспособленный для определения морфологических параметров. Имея один набор оптических срезов образца, морфологические параметры объекта в образце могут быть установлены путем применения сначала указанного выше способа для извлечения соответствующих объектов в фокусе. Для каждого объекта в фокусе можно определять различные морфологические параметры, например количество субкомпонентов, форм-фактор, периметр объекта, округлость, гранулярность, круговая дисперсия и т.д. Применяя это ко всем зарегистрированным объектам в наборе оптических срезов, статистические показатели можно использовать для расчета общих морфологических параметров объектов в образце.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритм, приспособленный для определения морфологических изменений во времени. При наличии множества наборов оптических срезов образца на равноудаленных или неравноудаленных временных интервалах скорость клеточного деления рассчитывается путем извлечения соответствующих клеток с использованием первого алгоритма. Для каждого извлеченного объекта можно рассчитать параметр, относящийся к клетке. Это может быть, например, количество субкомпонентов, форм-фактор, периметр объекта, округлость, гранулярность, круговая дисперсия и т.д. Можно рассчитать среднее значение параметра для всех объектов в наборе оптических срезов. Это повторяют для всех наборов оптических срезов образца в задаче. Наблюдая, как изменяются во времени средние значения, можно установить морфологические изменения во времени. Другие, отличающиеся от среднего значения параметра, статистические показатели также можно рассматривать, например, медиану, дисперсию или другие более высокого порядка и/или нелинейные показатели.

Система и способ могут быть приспособлены для определения фактора роста биологических организмов. Фактор роста можно определять для, например, извлечения информации о том, как на рост биологических организмов влияют условия роста, такие как окружающая среда образца и/или введение одного или нескольких агентов, которые взаимодействуют с биологическими организмами. В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения фактора роста. При наличии множества наборов оптических срезов образца на равноудаленных или неравноудаленных временных интервалах скорость клеточного деления можно рассчитать путем извлечения соответствующих клеток с использованием первого алгоритма. Для каждого извлеченного объекта можно рассчитать параметр, относящийся к клетке. Это может быть, например, количество субкомпонентов, площадь объекта, периметр объекта, размер веретена деления, характеристики поверхности и т.д. Может быть рассчитано среднее значение значений параметра для всех объектов в оптическом срезе. Это повторяют для всех наборов оптических срезов образца в задаче. Наблюдая, как изменяются во времени средние значения, можно установить кривую роста. Другие, отличающиеся от среднего значения параметра, статистические показатели также можно рассматривать, например, медиану, дисперсию или другие более высокого порядка и/или нелинейные показатели.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения кинетики. Имея один набор оптических срезов образца, кинетику объекта в образце можно устанавливать путем первого применения указанного выше способа для извлечения фокусных стопок соответствующих объектов. Для каждой фокусной стопки объекта степень движения можно рассчитать, отслеживая движение центра тяжести объекта в разных плоскостях фокусировки. Это может быть сделано путем применения простой двумерной корреляции изображений. В дальнейшем могут быть извлечены различные параметры кинетики - направление движения, скорость и т.д. Применяя это ко всем зарегистрированным объектам в наборе оптических срезов, статистические показатели можно использовать для расчета общих параметров кинетики объектов в образце.

В одном из вариантов осуществления устройство анализа изображений включает в себя алгоритмы, приспособленные для определения фокусного поведения. Имея одну стопку изображений объекта, поведение фокусировки можно анализировать, рассматривая функцию фокусирования. Можно определять различные показатели, например, метод фокусировочной кривой может выявить оптические свойства, такие как является ли объект амплитудным объектом или фазовым объектом. Можно применять также другие показатели, такие как ширина фокусировочной кривой.

Система дополнительно содержит блок управления, например вычислительное устройство, такое как ПК или аналогичное. Блок управления может быть специальным вычислительным устройством, содержащим процессор, RAM, внешние подключаемые устройства, такие как устройства, подключаемые с помощью USB. Блок управления может быть внешним блоком, расположенным снаружи, например, корпуса микроскопа, построенного по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения блок оптической регистрации дополнительно содержит устройство освещения изображения. Устройство освещения может состоять из лазера, диодного лазера, светодиода, лампы накаливания, источника белого света или источника поляризованного света, но также и другие источники света следует считать попадающими в объем настоящего изобретения. Устройством освещения изображения может управлять блок управления для освещения контейнера для образца во время получения изображения.

В одном из вариантов осуществления изобретения к жидкому образцу применяют внешнее стимулирование. Система может содержать стимулирующее устройство для обеспечения стимуляции жидкого образца в контейнере для образца. Стимуляцией может быть введение электромагнитного поля в образец, введение магнитного или электрического поля в образец или приложение акустических волн к образцу. В одном из вариантов осуществления микроскопические организмы могут быть визуализированы во время стимулирования для определения особенностей поведения организмов, что может помочь определить вид и природу организмов. Стимулирующим устройством может управлять блок управления для стимулирования контейнера для образца во время захвата изображения, или оно может стимулировать контейнер для образца на протяжении более длительного периода времени, чтобы вызвать более постоянные изменения в поведении организмов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения система дополнительно содержит устройство контроля окружения жидкого образца. Устройство контроля окружения жидкого образца может быть приспособлено для контроля физического окружения указанных биологических организмов в указанном жидком образце, например температуры указанного жидкого образца. Устройство контроля окружения жидкого образца может также быть приспособлено для контроля химического окружения указанного жидкого образца, например значения pH, уровня питательных веществ, парциального давления газов, таких как кислород, азот, водород и углекислый газ, солености, уровня ионов щелочных металлов, таких как Li⁺, Na⁺ и K⁺, уровня щелочноземельных металлов, таких как Mg²⁺ и Ca²⁺.

Изобретение, в принципе, можно применять для определения параметров в отношении микробной активности любого биологического организма. В одном из вариантов осуществления настоящих системы и способа биологические организмы выбраны из группы бактерий, архей, дрожжей, грибов, пыльцы, вирусов, лейкоцитов, например гранулоцитов, моноцитов, эритроцитов, тромбоцитов, ооцитов, спермы, зигот или стволовых клеток.

Биологический организм может содержаться в клиническом материале, выбранном из группы кала, образцы мазков с кожи, пораженных участков, поверхностей серозных или слизистых оболочек, мочи, лимфы, гноя, мокроты, транссудата, экссудата, железистых выделений, таких как молоко, пот, слюна, слезная жидкость, сальных выделений, носовых или других слизистых выделений, крови, спинномозговой жидкости, опухолевой ткани, материала биопсии из любой ткани, внеклеточной жидкости, сыворотки, плазмы.

В принципе, биологический организм может заключаться в жидком образце любого типа, например молоке, пиве, газированных напитках, фруктовых соках, жидкостях, используемых в процессах ферментации, маслах, образцах воды, таких как вода, забранная с различных этапов обработки муниципальной или промышленной воды и водоочистных сооружений, в воде в бутылках, воде, забранной из окружающей среды, например из озер, рек или океанов, в воде из лабораторных условий или производственных объектов.

Изобретение также может быть использовано для того, чтобы отличать биологические организмы от небиологических частиц и чтобы отличать живые биологические организмы от мертвых биологических организмов.

Микробная активность включает в себя микробную чувствительность указанных биологических организмов к агентам-антибиотикам.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один контейнер для образца инокулирован по меньшей мере первым агентом. Инокуляция может быть выполнена до введения указанного жидкого образца в контейнер для образца или может добавляться после введения жидкого образца в контейнер для образца, то есть когда указанный жидкий образец находится в указанном контейнере для образца. Агент может быть агентом-антибиотиком, предназначенным для уничтожения биологических организмов в контейнере, или может быть питательным агентом, предназначенным для ускорения роста биологических организмов. Агентом также может быть чистящее средство, предназначенное для уничтожения биологических организмов.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере часть контейнеров для образцов инокулированы N_agent различными агентами, где N_agent может быть равно 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 или более 20. Специалисту будет понятно, что количество различных агентов может зависеть от решаемой задачи измерения. Если, например, должна измеряться чувствительность бактерии к различным типам бактерий, может быть необходимо тестирование с помощью большого количества агентов. В некоторых случаях количество возможных бактерий может быть ограничено и соответственно может быть ограничено количество различных агентов. В одном из вариантов осуществления указанные контейнеры для образцов разделены на группы контейнеров для образцов, где контейнеры для образцов в каждой группе инокулируют одним и тем же агентом и контейнеры для образцов разных групп инокулируют разными агентами, например, первая группа указанных контейнеров для образцов инокулируют указанным первым агентом, вторую группу указанных контейнеров для образцов инокулируют вторым агентом, третью группу указанных контейнеров для образцов инокулируют третьим агентом, четвертую группу указанных контейнеров для образцов инокулируют четвертым агентом.

Контейнер для образца может так же быть приготовлен для исследования, например, чувствительности одного биологического организма к нескольким агентам, например к комбинации агентов. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один контейнер для образца инокулируют несколькими различными агентами.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один контейнер для образца по существу не содержит агентов. Под "по существу не содержит" подразумевается, что количество агентов, присутствующих в контейнере, должно быть меньше, чем количество агента, необходимое для создания влияния на организмы в контейнере.

В одном из вариантов осуществления первый агент инокулируют в различных концентрациях в по меньшей мере два разных контейнера для образцов. При определении минимальной концентрации ингибирования (MIT), которая показывает концентрацию антибиотика, необходимую для предотвращения роста микроорганизмов, целесообразно в одно и то же время использовать несколько различных концентраций в различных контейнерах. Это ускоряет измерения, и измерения можно сравнивать, так как они были выполнены с использованием одинаковых условий и одинакового окружения. В некоторых случаях может быть предпочтительным использование по меньшей мере 5 или 10 разных концентраций агентов при определении MIT. В других случаях предпочтительно другое количество разных концентраций агентов, например менее 5 концентраций или более 10 концентраций.

В одном из вариантов осуществления системы по настоящему изобретению блок управления приспособлен для получения наборов оптических срезов из по меньшей мере одного контейнера для образца в течение периода времени. Набор оптических срезов содержит по меньшей мере одно изображение и во многих случаях несколько изображений. Для некоторых приложений и биологических организмов период времени, используемый для получения набора (наборов) оптических срезов, может быть относительно продолжительным, например несколько дней или несколько часов. Для других приложений и биологических организмов период для получения наборов оптических срезов может быть значительно короче. В одном из вариантов осуществления указанный период времени составляет менее около 144 часов, например менее около 72 часов, например менее около 48 часов, например менее около 36 часов, например менее около 24 часов, например менее около 18 часов, например менее около 12 часов, например менее около 8 часов, например менее около 5 часов, например менее около 4 часов, например менее около 3 часов, например менее около 2 часов, например менее около 1,5 часа, например менее около 1 часа, например менее около 2700 секунд, например менее около 1800 секунд, например менее около 900 секунд, например менее около 600 секунд, например менее 480 секунд, например менее около 300 секунд, например менее около 120 секунд, например менее около 60 секунд, например менее около 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее около 2 секунд, например менее около 1 секунды. Специалисту следует понимать, что упомянутые периоды приведены в качестве примера и что период может варьироваться в зависимости от того, какие измерения должны быть выполнены, и период может быть изменен во время измерений в зависимости от значения параметра, определяемого во время измерений, например быть изменен индивидуально для разных контейнеров для образцов.

Система и способ по настоящему изобретению могут быть использованы для определения микробной активности биологических организмов, расположенных в множестве контейнеров для образцов. В системе блок управления может быть адаптирован для последовательного получения наборов оптических срезов из по меньшей мере двух разных контейнеров образцов. В одном из вариантов осуществления наборы оптических срезов получают из по меньшей мере двух разных контейнеров для образцов, с первым интервалом времени между получением следующих двух наборов оптических срезов. Первый интервал может быть менее около 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее около 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее около 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды.

Система и способ по настоящему изобретению могут определять микробную активность одного или нескольких биологических организмов, расположенных в контейнерах для образцов, из множества наборов оптических срезов. В системе блок управления может быть адаптирован для последовательного получения наборов оптических срезов. В одном из вариантов осуществления указанные наборы оптических срезов последовательно получают из контейнера с образцом со вторым интервалом времени между двумя последовательными наборами оптических срезов из контейнера для образца. Интервал может варьироваться в зависимости от того, какое измерение должно быть выполнено. Второй интервал времени может быть менее около 3600 секунд, например менее 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды. Если микробная активность образца является высокой, предпочтительным может являться использование коротких интервалов, тогда как низкая микробная активность может потребовать более длительного интервала без потери важной информации. Интервал может быть изменен во время измерения в зависимости от определенного значения параметра, например изменен индивидуально для разных контейнеров для образцов.

В одном из вариантов осуществления блок управления адаптирован для остановки получения изображений, когда значения параметра удовлетворяет заданному условию. Заданное условие может относиться к определению чувствительности к антибиотикам указанных биологических организмов или может относиться к определению минимальной ингибирующей концентрации (MIT).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Изобретение будет ниже объяснено более подробно по отношению к одному из вариантов осуществления и со ссылкой на чертежи, в которых:

на Фиг. 1 показана агаровая пластинка, инокулированная жидкостью, содержащей бактерии и таблетки, содержащие антибиотики,

на Фиг. 2 показан схематический вид сбоку стандартного оптического микроскопа,

на Фиг. 3 показан схематический вид сбоку измерительной установки, которую можно использовать в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения,

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение оптического сканирующего микроскопа, где изображения получают вертикально через жидкий образец,

на Фиг. 5 показан один из вариантов осуществления устройства для образцов, содержащего 8 контейнеров для образцов,

на Фиг. 6 показана система, содержащая оптический микроскоп и устройство для образцов,

на Фиг. 7 показана диаграмма, показывающая интервалы и периоды сканирования,

на Фиг. 8 показан процесс измерения одного образца в k различных временных точках,

на Фиг. 9 показан процесс измерения одного образца в одной временной точке,

на Фиг. 10 показан процесс измерения одного образца, где наблюдается один объект,

на Фиг. 11 показано изображение первого образца мочи, содержащее бактерии, кристаллы и лейкоциты,

на Фиг. 12 показано то же изображение, что и на предыдущем рисунке, но бактерии отмечены используя круги для каждой бактерии,

на Фиг. 13 показано изображение второго образца мочи, содержащее бактерии, где бактерии наблюдаются на протяжении приблизительно 20 с,

на Фиг. 14 показано изображение образца жидкости, содержащей хлебные дрожжи,

на Фиг. 15 показано изображение того же образца жидкости, что и на Фиг. 14, но спустя 19 часов,

на Фиг. 16 показан крупный план одной дрожжевой клетки, отслеживаемой 1140 минут для мониторинга клеточного деления,

на Фиг. 17 показаны две кривые роста для образцов дрожжей - одного, содержащего питательный агент, и другого без него,

на Фиг. 18 показан результат определения параметра, предназначенного для того, чтобы различить живые и мертвые клетки,

на Фиг. 19 показан набор оптических срезов окрашенной латексной сферы,

на Фиг. 20 показан набор оптических срезов бактерии Acidophilus,

на Фиг 21 показан образец, содержащий бактерии Acidophilus сразу после получения,

на Фиг. 22 показан тот же образец, что и на Фиг. 21, но спустя приблизительно 13 часов,

на Фиг. 23 показан тот же образец, что и на Фиг. 21, но спустя приблизительно 20 часов.

Фигуры являются схематичными и могут быть упрощены для наглядности. На всем протяжении одинаковые позиционные обозначения используются для идентичных или соответствующих частей.

Далее объем применения настоящего изобретения станет очевидным из подробного описания, представленного далее в настоящем документе. Тем не менее следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, при указании различных вариантов осуществления изобретения, приведены исключительно для иллюстрации, так как различные изменения и модификации в соответствии с духом и объемом изобретения станут очевидными специалисту в данной области из этого подробного описания.

Изобретение определено признаками независимого пункта (независимых пунктов) формулы изобретения. Любые позиционные обозначения в формуле изобретения не предназначены для ограничения ее объема.

Некоторые варианты осуществления были показаны в приведенной выше части документа, но следует подчеркнуть, что изобретение не ограничено ими, а может быть осуществлено другими способами в рамках предмета, определяемого приведенной ниже формулой изобретения.

На Фиг. 1 чашка Петри, содержащая Агар, используется для тестирования микробной чувствительности к антибиотикам. Бактерии были добавлены к Агару на пластине, и 12 разных таблеток, содержащих разные антибиотики, были равномерно распределены по пластине. После этого пластину инкубировали в течение периода, и чувствительность могла быть определена глядя на разные размеры искажений вокруг таблеток. Бактерии в чашке Петри являются бактериями с третьего этапа процесса изоляции бактерий, где первый этап заключался в инкубировании тестируемого клинического материала, второй этап заключался в изолировании одной культуры и ее инкубировании, и третий этап заключается в инкубировании одной культуры, помещенной в одну или несколько чашек Петри.

Как можно видеть, размер искаженных колец различается от очень малого на таблетке №1 до очень большого на таблетке №2. Остальные использованные таблетки имели кольца искажений различных размеров между размерами таблетки №1 и таблетки №2. Таким образом, можно определить, что антибиотики из таблетки №1 имеют очень малое воздействие на бактерии в агаровом субстрате, тогда как антибиотики из таблетки №2 имеют самое лучшее воздействие на бактерии. Если результаты теста должны быть использованы для назначения лекарства пациенту, то назначением, таким образом, должна быть таблетка №2. Инкубационный период составлял много часов, что было необходимо для точного определения лучших антибиотиков. Если бы был использован более короткий инкубационный период, то различия в размерах колец вокруг таблеток были бы значительно меньше, что делает точное определение лучших антибиотиков затруднительным.

На Фиг. 2 показана схема стандартного оптического микроскопа. Микроскоп содержит держатель 115 для удержания предметного стекла, содержащего образец для визуализации. Микроскоп дополнительно содержит увеличительную оптику 120, освещение 110 и оптику 135 освещения, и окуляр 130. Данный оптический микроскоп также содержит оптику 125 для добавления камеры 140 для захвата изображений субстрата на предметном стекле. Для того чтобы иметь возможность просматривать микроскопические частицы, субстрат, который необходимо визуализировать, должен быть тщательно подготовлен. Подготовка может включать добавление окрашивающего агента для окрашивания частиц в образце, и могут применяться другие способы, такие как фильтрация. Когда образец готов, его необходимо поместить на предметное стекло, и необходимо добавить покровное стекло. Покровное стекло гарантирует, что образец не испариться или не вытечет с предметного стекла, и оно создает очень тонкий слой образца, необходимый для того, чтобы оптический микроскоп работал должным образом. Используя оптический микроскоп, возможно просматривать бактерии и другие микроскопические частицы для установления их вида и природы. К сожалению, нет возможности следить за бактериями в течение длительного периода времени in-situ или в среде, аналогичной естественной среде обитания. Это является главным недостатком в исследовании бактерий. Например, невозможно просматривать бактерии при добавлении антибиотика к образцу - можно просмотреть только результат в определенное время после добавления антибиотика. Несмотря на то, что оптический микроскоп дает некоторое количество хороших изображений бактерий, это, как правило, не используется в тестировании микробной чувствительности к антибиотикам.

На Фиг. 3 показан схематический вид оптического микроскопа, подходящего для выполнения тестирования микробной чувствительности к антибиотикам. Оптический микроскоп подробно описан в предварительной заявке США № 61/146850.

Принцип Шаймпфлюга - это геометрическое правило, которое описывает ориентацию плоскости фокусировки оптической системы, где плоскость объектива не параллельна плоскости изображения. На Фиг. 4 показан схематический вид оптического микроскопа, где принцип Шаймплюга был применен при проектировании микроскопа. Более подробное описание этой оптической установки можно найти в предварительной заявке США № 61/146850.

На Фиг. 5 показан пример устройства 200 для образцов, содержащего 8 контейнеров 210 для образцов. Контейнеры 210 для образцов являются контейнерами открытого типа размещения, где образец можно добавлять в виде капель.

На Фиг. 6 показан оптический микроскоп 250, содержащий держатель 220 образца и устройство 200 для образцов, как показано на Фиг. 6. Держатель образца может быть перемещен к положению контейнеров 210 для образцов относительно системы 240 оптического формирования изображения для получения изображений образца. Освещение образца производится устройством 230 освещения.

Фиг. 7 представляет собой диаграмму, показывающую интервалы и периоды сканирования. На Фиг. 7a контейнер C1 для образца сканируют в периоды, обозначенные P1, с интервалами I2. Каждый период достаточно продолжительный для получения по меньшей мере одного набора оптических срезов образца. Интервал между каждыми периодами может быть очень коротким - т.е. оптическое формирование срезов осуществляется практически непрерывным образом, или он может быть более продолжительным для снижения количества получаемых данных. На Фиг. 7b контейнеры C1, C2 и C3 для образцов сканируют в периоды, обозначенные P1. Каждый период является достаточно продолжительным для получения по меньшей мере одного набора оптических срезов образца. Интервал между сканированиями C1 и C2 последовательных контейнеров обозначен I2. I2 должен быть достаточно продолжительным, чтобы позволить перемещающему устройство разместить устройство для образцов в правильное положение для сканирования следующего контейнера. Интервал I1 означает интервал между двумя последующими сканированиями одного и того же контейнера Cn. Интервал I1 должен быть достаточно продолжительным, чтобы позволить системе просканировать все контейнеры.

На Фиг. 8 показан процесс измерения одного образца в k разных временных точках 320, 321 и 322. Для некоторого времени t₁ 320 получен 300 набор оптических срезов образца. К набору оптических срезов применяют алгоритм 301, который выводит фокусные стопки объектов для всех N1 объектов, содержащихся в наборе оптических срезов 302. Каждая фокусная стопка объекта представлена на фигуре прямоугольником, содержащим изображения объектов в фокусной стопке объекта. Другой алгоритм 303 применяют к фокусным стопкам объектов, который выводит значение некоторого параметра для каждой фокусной стопки 304 объектов. Еще один алгоритм 305 применяют к значениям 304 параметров, который выводит единственное значение 306, описывающее объекты в наборе оптических срезов в момент времени t₁. Это значение обозначено X(t1) 306. Этот процесс повторяют для всех k временных точек, что дает вектор значений X(t), t=t₁,t₂,...,t_k, который изображается графически как функция времени 307. Точки могут соединяться прямыми линиями 308 или любыми другими линейными или нелинейными способами интерполяции.

На Фиг. 9 показан процесс измерения одного образца в одной временной точке. Получают 300 набор оптических срезов образца. К набору оптических срезов применяют алгоритм 301, который выводит фокусные стопки объектов для всех N1 объектов, содержащихся в оптическом срезе 302. Каждая фокусная стопка объекта представлена на фигуре прямоугольником, содержащим изображения объектов в фокусной стопке объекта. Другой алгоритм 303 применяют к фокусным стопкам объектов, который выводит значение некоторого параметра для каждой фокусной стопки 304 объектов. Еще один алгоритм 305 применяют к значениям 304 параметров, который выводит единственное значение 309, описывающее состояние объектов в образце. Им может быть, например, отношение между количествами живых и мертвых объектов, средняя площадь и т.д.

На Фиг.10 показан процесс измерения одного образца при наблюдении за одним объектом в k разных временных точках 320, 321 и 322. Для некоторого времени t₁ 320 получен 310 набор оптических срезов образца. Применяют алгоритма 311, который идентифицирует интересующий объект, и извлекает его фокусную стопку 312 объекта. Применяют другой алгоритм 313 к фокусной стопке 312 объекта, который рассчитывают значение некоторого параметра, описывающего объект. Значение параметра хранят в X(t) 314. Этот процесс повторяют для всех k временных точек, что дает вектор значений X(t), t=t₁,t₂,...,t_k, который изображают графически как функцию времени 315. Точки могут соединяться прямыми линиями 316. или любыми другими линейными или нелинейными способами интерполяции.

На Фиг. 11 показано изображение первого образца мочи, визуализированного с помощью светлопольного микроскопа. Образец содержит бактерии, эритроциты и лейкоциты и другие неидентифицированные клетки. Это изображение и последующие изображения получены с помощью оптической установки, аналогичной той, что изображена на Фиг. 3. Только приблизительно средняя четверть изображения может считаться находящейся в пределах глубины резкости оптической системы. На изображении можно видеть большое количество малых черных частиц, которые могут быть идентифицированы как бактерии. Кроме того, можно видеть некоторое количество лейкоцитов, а также несколько объектов, которые трудно идентифицировать. Нормальная моча содержит некоторые отходы жизнедеятельности из организма, и некоторые из этих отходов жизнедеятельности могут формировать кристаллоподобные объекты.

На Фиг. 12 показано то же изображение, что и на Фиг. 10, но с отмеченными бактериями, используя круги для каждой бактерии. Бактерии идентифицированы с использованием алгоритмов, включающих этап обнаружения, где каждую точку изображения классифицируют либо как бактерию, либо как фон используя функцию решения, основанную на критерии локального контраста, и этап идентификации, где связанные точки бактерий группируют в связанные компоненты точек, где каждый компонент представляет одну бактерию. После этого бактерии можно сосчитать или далее анализировать.

На Фиг. 13 показано изображение второго образца мочи. Образец состоит из патологической мочи и содержит бактерии и некоторые большие объекты, которые содержат эпителиальные клетки. Приведенное изображение является проекцией набора оптических срезов образца мочи. Набор оптических срезов образца содержит 20 изображений. Движение бактерии отслеживалось на протяжении 20 секунд, и белые следы показывают траектории каждой бактерии. Отслеживание осуществлено путем применения того же алгоритма, который описан на Фиг. 10, к каждому отдельному изображению набора оптических срезов. Между каждыми соседними изображениями объекты сопоставлены один к одному для отслеживания объектов в наборе оптических срезов. Координаты каждого объекта сохранены и могут быть проанализированы в дальнейшем. Можно увидеть, что траектория движения этого конкретного образца является комбинацией броуновского движения (случайного движения) и коллективного диагонального движения, вызванного потоком жидкости. В этом случае все отдельные бактерии обладают одинаковыми характеристиками движения. В других образцах, содержащих несколько культур бактерий, может быть возможным различить активные и неактивные (покоящиеся или мертвые) индивидуумы. В этом конкретном изображении используется только двухмерная информация. Используя информацию, полученную во время оптического формирования срезов, относящуюся к трехмерной информации о траекториях бактерий, можно определять трехмерную траекторию, дающую большее количество информации, относящейся к одной бактерии, и позволяющую различить разные виды бактерий.

На Фиг. 14 показано изображение дрожжей, разведенных в воде и смешанных с питательным агентом. Дрожжи широко используются в фрагментации, и в этом случае были использованы хлебные дрожжи, так как они очень просты в обращении. Образец дрожжей хранили при температуре 22°С, и питательный агент добавляли только в небольших количествах, чтобы избежать слишком бурного роста дрожжей. Как и на Фиг. 11 и 12, примерно только средняя четверть изображения может считаться как находящаяся в пределах глубины резкости изображаемого пространства (ГРИП) оптической системы. На изображении можно видеть большое число дрожжевых клеток. Некоторые из клеток расположены ниже ГРИП, тогда как другие расположены выше ГРИП. Хотя большинство клеток находятся за пределами ГРИП, они визуализированы с качеством, которое позволяет подготовить их к подсчету, и их можно использовать в сочетании с другими изображениями того же образца, но со слегка смещенной областью ГРИП для создания набора оптических срезов. Также возможно использовать изображение для подвижности объектов и кинетики роста.

На Фиг. 15 изображен тот же образец, содержащий дрожжи, спустя приблизительно 19 часов. Хотя температуру удерживали относительно низкой, и концентрация питательного объекта сохранялась на минимальном уровне, количество дрожжевых клеток значительно возросло за 19 часов.

На Фиг. 16a дрожжевая клетка была выделена для наблюдения. На Фиг. 16b-16f та же дрожжевая клетка показана на разных этапах. В течение 19 часов примерно 3 дополнительных поколения дрожжевых клеток были получены из изначально одной клетки, образуя небольшой кластер. Несколько других клеток из соседних кластеров также можно обнаружить на изображениях.

На Фиг. 17 отображены две кривые роста. Обе кривые роста определены с использованием образца, содержащего хлебные дрожжи. Кривые показывают общую площадь изображения, содержащую дрожжевые клетки. Нижняя кривая показывает образец дрожжей без добавления питательного агента. Видно, что количество дрожжевых клеток не меняется, и дрожжевые клетки не делятся для создания кластеров новых клеток. Верхняя кривая показывает образец дрожжей, аналогичных дрожжам в нижней кривой, но к образцу добавляли питательный агент для того, чтобы заставить дрожжевые клетки расти и делиться для формирования кластеров. На самом раннем этапе две кривые четко разделены, и было бы необязательным давать дрожжам расти 19 часов, чтобы решить какие из условий окружающей среды являются наиболее подходящими для дрожжевых клеток.

На Фиг. 18 показано еще одно изображение дрожжей. Образец содержит и живые, и мертвые дрожжевые клетки. Образец был получен путем смешивания двух образцов дрожжей - одного образца, содержащего живые клетки, и одного образца, в котором дрожжевые клетки были убиты путем повышения температуры образца до уровня, при котором все живые клетки погибают. Дрожжевые клетки были затем окрашены с использованием трипанового синего, который является хорошо известным способом различать живые и мертвые клетки. Живые клетки не позволят трипановому синему пройти через клеточную мембрану, в то время как мертвые клетки не поддерживают эту способность. В результате мертвые клетки окрашиваются, а живые клетки не окрашиваются.

Образец дрожжевых клеток был оптически разделен на срезы, и проекция набора оптических срезов была предоставлена путем извлечения участков изображений, где клетки отображаются в фокусе. Эта проекция, обычно обозначаемая как изображение с увеличенной глубиной резкости изображаемого пространства (Extended Depth Of Field image, EDOF), таким образом, содержит изображения клеток, каждая из которых отображена в фокусе. Исследование изображения дает два разных типа клеток - один тип имеет светлый центр, окруженный темной окружностью, тогда как другой тип имеет меньший и более темный центр (по сравнению с первым типом), окруженный темной окружностью. На Фиг. 18 были выбраны три примера каждого типа, и значения интенсивностей точек вдоль линии, проходящей через клетку, показаны для каждой выбранной клетки. Три выбранные клетки с левой стороны имеют яркий центр, показывающий, что клетки не были окрашены, тогда как три клетки с правой стороны имеют несколько более темный центр, показывающий, что клетки были окрашены. Сравнение с другими измерениями окрашенных живых и мертвых клеток до того, как клетки были смешаны, на самом деле показывает, что клетки с светлым центром являются живыми клетками, тогда как клетки с темным центром являются мертвыми клетками.

На Фиг. 19 справа показан набор оптических срезов окрашенной латексной сферы. Набор оптических срезов содержит 68 различных изображений латексной сферы. Латексная сфера имеет 5 мкм в диаметре. Такие латексные сферы широко используются в качестве калибровочных стандартов в области оптической микроскопии. Для каждого изображения набора оптических срезов была применена функция фокусирования, дающая значение фокусирования для каждого из 68 изображений. В этом случае функцией фокусирования является дисперсия интенсивности точек изображения. Значения фокусирования показаны графически в левой части фигуры как функция номера изображения. Окрашенные латексные сферы являются истинными амплитудными объектами, т.е. амплитуда света убывает в зависимости от толщины и плотности объекта. Как можно видеть, значение фокусирования становится выше ближе к латексной сфере, которая отображается в фокусе. Форма кривой функции фокусирования является четко одновершинной, т.е. она имеет один хорошо выраженный максимум.

На Фиг. 20 справа показан набор оптических срезов неокрашенной бактерии Acidophilus. Набор оптических срезов содержит 42 различных изображения бактерии. Бактерии являются истинно фазовыми объектами, т.е. невозможно увидеть бактерию в фокусе с использованием общепринятого обычного микроскопа. Но если микроскоп положительно или отрицательно расфокусирован вблизи фокуса бактерии, то возникнет изображение бактерии. Для каждого из 42 изображений в оптических срезах было вычислено значение фокусирования, и значения изображены графически как функция номера изображения справа на Фиг. 16. График явно бимодальный, т.е. имеется два хорошо выраженных максимума - один для каждой стороны оптимального положения фокуса. Это является типичным поведением фазового объекта. При некоторых обстоятельствах может быть важно различать фазовые объекты и амплитудные объекты. Анализируя форму фокусировочной кривой, это может быть обнаружено.

На Фиг. 21-23 показано развитие образца, содержащего бактерии Acidophilus. Бактерии изначально помещены в образец, содержащий питательный агент. Фиг. 21-23 содержат каждый по две субфигуры. Самая левая субфигура представляет собой изображение образца бактерий с использованием светлопольной микроскопии. Увеличенная часть изображения показана в верхней части изображения для улучшения видимости бактерий. Часть обозначена светлым прямоугольником. Самая правая субфигура показывает количество бактериальной массы как функцию времени, то есть является кривой роста. Количество бактериальной массы рассчитывается как общая площадь изображения, занятая бактериями. На Фиг. 21 показан образец сразу после получения. Обратите внимание на маленькие круглые бактерии. На Фиг. 22 показан тот же образец после приблизительно 13 часов. Обратите внимание, как бактерии изменяют форму за счет быстрого роста. На Фиг. 23 показан образец спустя 20 часов. Обратите внимание на кривую роста - это является примером экспоненциального роста.

1. Система для определения значения по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность отдельных биологических организмов в жидком образце, содержащем биологические организмы, указанная система содержит:
- блок оптической регистрации, имеющий оптическую ось и содержащий по меньшей мере одно устройство получения изображения, адаптированное для получения изображений, в которых могут быть идентифицированы отдельные биологические организмы,
- по меньшей мере одно устройство для образцов, содержащее по меньшей мере один контейнер для образца для удержания образца в жидком виде,
- по меньшей мере один перемещающий блок, расположенный для перемещения указанного устройства для образцов и указанного блока оптической регистрации относительно друг друга,
- блок управления для управления указанным блоком оптической регистрации и указанным перемещающим блоком, указанный блок управления адаптирован для последовательного получения по меньшей мере первого набора оптических срезов и по меньшей мере второго набора оптических срезов биологических образцов в указанном жидком образце, при этом наборы оптических срезов получают вдоль траектории сканирования под углом относительно оптической оси, большим чем 0,
- устройство анализа изображений для анализа указанного первого набора оптических срезов, где указанное устройство анализа изображений содержит алгоритмы, адаптированные для определения указанного значения указанного по меньшей мере одного параметра, описывающего микробную активность указанных отдельных биологических организмов в каждом контейнере для образца.

2. Система по п.1, в которой указанный блок оптической регистрации дополнительно содержит устройство освещения изображения, при этом указанное устройство освещения изображения предпочтительно содержит источник света, выбранный из группы, включающей: лазер, диодный лазер, светодиод, лампу накаливания, источник белого света или источник поляризованного света.

3. Система по п.1, дополнительно содержащая стимулирующее устройство для обеспечения стимулирования указанного образца в указанном устройстве для образцов, при этом указанное стимулирование выбрано из группы, включающей в себя приложение электромагнитного поля, магнитного поля, электрического поля или акустической волны.

4. Система по п.1, дополнительно содержащая устройство контроля окружения жидкого образца.

5. Система по п.4, в которой указанное устройство контроля окружения жидкого образца приспособлено для контроля физического окружения указанных биологических организмов в указанном жидком образце, такого как температура жидкого образца.

6. Система по п.4 или 5, в которой указанное устройство контроля окружения жидкого образца приспособлено для контроля химического окружения указанного жидкого образца, такого как значение pH, уровень питательных веществ, парциальное давление газов, таких как кислород, азот, водород и углекислый газ, соленость, уровень ионов щелочных металлов, таких как Li⁺, Na⁺ и К⁺, уровень щелочноземельных металлов, таких как Mg²⁺ и Ca²⁺.

7. Система по п.1, в которой указанный параметр выбран из группы: скорость клеточного деления, жизнеспособность клеток, отношение числа живых/мертвых, броуновское движение, уровень метаболизма, морфология, фактор роста, кинетика и направленность поведения.

8. Система по п.1, в которой указанная микробная активность включает микробную чувствительность указанных биологических организмов к агентам-антибиотикам.

9. Система по п.1, в которой количество контейнеров для образцов N_cont в указанном устройстве для образцов равно 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30 или более 30, где указанные N_cont контейнеров для образцов предпочтительно расположены в один или несколько рядов, таких как с одинаковым числом контейнеров для образцов в каждом ряду.

10. Система по п.1, в которой указанный блок управления адаптирован для получения наборов оптических срезов от каждого контейнера для образца в течение периода времени, при этом указанный период времени составляет менее около 144 часов, например менее около 72 часов, например менее около 48 часов, например менее около 36 часов, например менее около 24 часов, например менее около 18 часов, например менее около 12 часов, например менее около 8 часов, например менее около 5 часов, например менее около 4 часов, например менее около 3 часов, например менее около 2 часов, например менее около 1.5 часа, например менее около 1 часа, например менее около 2700 секунд, например менее около 1800 секунд, например менее около 900 секунд, например менее около 600 секунд, например менее около 480 секунд, например менее около 300 секунд, например менее около 120 секунд, например менее около 60 секунд, например менее около 10 секунд, например менее около 5 секунд, например менее около 2 секунд, например менее около 1 секунды.

11. Система по п.1, в которой указанный блок управления приспособлен последовательно получать наборы оптических срезов от по меньшей мере двух разных контейнеров для образцов с первым интервалом времени между получениями следующих двух наборов оптических срезов, в которой указанный первый интервал времени составляет менее около 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды.

12. Система по п.1, в которой указанный блок управления адаптирован для последовательного получения наборов оптических срезов от контейнера для образца со вторым интервалом времени между двумя последовательными наборами оптических срезов из контейнера для образца, в которой указанный второй интервал времени составляет менее около 3600 секунд, например менее 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды.

13. Система по п.1, в которой указанный блок управления адаптировал для остановки получения изображений, когда указанное значение указанного параметра удовлетворят предопределенному условию, при этом указанное предопределенное условие относится к определению чувствительности к антибиотикам указанных биологических организмов и/или к определению минимальной ингибирующей концентрации (MIT).

14. Способ определения микробной активности в жидком образце, содержащем множество биологических организмов, указанный способ содержит:
- последовательное получение множества наборов оптических срезов вдоль траектории сканирования указанного жидкого образца с использованием блока оптической регистрации, имеющего оптическую ось, при этом траектория сканирования имеет угол относительно оптической оси, больший чем 0,
- выбор первого и второго набора оптических срезов из множества наборов оптических срезов,
- вычисление значения по меньшей мере одного параметра для каждого набора оптических срезов,
- определение того, возникло ли изменение указанного значения указанного по меньшей мере одного параметра между указанными первым и вторым наборами оптических срезов,
- определение указанной микробной активности в указанном жидком образце исходя из указанного изменения в указанном значении указанного по меньшей мере одного параметра, при этом предпочтительно указанный параметр выбран из группы: скорость клеточного деления, жизнеспособность клеток, отношение количества живых/мертвых, броуновское движение, уровень метаболизма, морфология, фактор роста, кинетика, подвижность объекта или направленность поведения.

15. Способ по п.14, в котором указанная микробная активность относится к биологическим организмам, выбранным из группы: бактерий, архей, дрожжей, грибов, пыльцы, вирусов, лейкоцитов, таких как гранулоцитов, моноцитов, эритроцитов, тромбоцитов, ооцитов, спермы, зигот или стволовых клеток.

16. Способ по п.14, в котором указанный жидкий образец заключен по меньшей мере в одном контейнере для образца, например в N_cont контейнерах для образца, где N_cont равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30 или более 30.

17. Способ по п.16, в котором наборы оптических срезов получают из двух различных контейнеров для образцов, и при этом указанная последовательность получения указанных наборов оптических срезов содержит ожидание заданного первого интервала времени между получениями двух следующих наборов оптических срезов, в котором предпочтительно указанный первый интервал составляет менее примерно 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды.

18. Способ по п.16 или 17, в котором указанная последовательность получения указанных наборов оптических срезов включает ожидание предопределенного второго интервала времени между получением наборов оптических срезов из одного и того же контейнера для образца, при этом предпочтительно указанный второй интервал составляет менее примерно 3600 секунд, например менее 1800 секунд, например менее 900 секунд, например менее 600 секунд, например менее 300 секунд, например менее 120 секунд, например менее 60 секунд, например менее 30 секунд, например менее 10 секунд, например менее 5 секунд, например менее 2 секунд, например менее 1 секунды, например менее 0,5 секунды, например менее 0,2 секунды, например менее 0,1 секунды, например менее 0,01 секунды, например менее 0,001 секунды.

19. Способ по п.16 или 17, в котором наборы оптических срезов из одного контейнера для образца получают на протяжении периода времени, при этом указанный период времени предпочтительно составляет менее около 72 часов, например менее около 48 часов, например менее около 36 часов, например менее около 24 часов, например менее около 18 часов, например менее около 12 часов, например менее около 8 часов, например менее около 5 часов, например менее около 4 часов, например менее около 3 часов, например менее около 2 часов, например менее около 1,5 часа, например менее около 1 часа.

20. Способ по п.19, в котором указанный период времени составляет менее около 2700 секунд, например менее около 1800 секунд, например менее около 900 секунд, например менее около 600 секунд, например менее около 480 секунд, например менее около 300 секунд, например менее около 120 секунд, например менее около 60 секунд, например менее около 10 секунд, например менее около 5 секунд, например менее около 2 секунд, например менее около 1 секунды.

21. Способ по п.14, в котором дополнительно применяется внешнее стимулирование указанного жидкого образца, при этом указанное стимулирование предпочтительно выбрано из группы: приложение магнитного поля, электрического поля, электромагнитного поля или акустической волны.

22. Способ по п.14, в котором указанный по меньшей мере один контейнер для образца инокулируют по меньшей мере первым агентом до того, как указанный жидкий образец вводят в указанный контейнер для образца и/или тогда, как указанный жидкий образец находится в указанном контейнере для образца, по выбору, по меньшей мере один контейнер для образца по существу не содержит агентов.

23. Способ по п.22, в котором по меньшей мере часть указанных контейнеров для образцов инокулируют N_agent разными агентами, где N_agent предпочтительно равно 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 или более 20, при этом, по выбору, указанные агенты инокулируют в разных концентрациях в по меньшей мере двух контейнерах для образцов.

24. Способ по п.23, в котором указанные агенты выбраны из группы: антибиотиков, питательных веществ, дезинфицирующих средств, чистящих средств или их комбинации.

25. Способ по п.14, в котором контролируется химическое окружение указанных биологических организмов в указанном жидком образце, такое как значение рН, уровень питательных веществ, парциальное давление газов, таких как кислород, азот, водород и углекислый газ, соленость, уровень ионов щелочных металлов, таких как Li⁺, Na⁺, К⁺, уровень щелочноземельных металлов, таких как Mg²⁺, Са²⁺, и/или физическое окружение указанных биологических организмов в указанном жидком образце, такое как температура указанного жидкого образца.