Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей



Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей
Способ выделения микрорнк из биологических жидкостей

 


Владельцы патента RU 2548816:

Мамонтова Марина Васильевна (RU)
Поспелов Вадим Игоревич (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу выделения микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. Способ включает последовательное центрифугирование, ультрафильтрацию и ультрацентрифугирование культуральной конденсированной среды. Растворяют полученный осадок в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют. Растворяют полученный осадок в воде. Подвергают полученный раствор электрофорезу в свободном потоке на приборе FFE System. Проводят ультрацентрифугирование каждой из полученных фракций. Очищают каждую фракцию от клеточных стенок экзосом посредством фильтрации и центрифугирования. Проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы. Останавливают реакцию нагреванием до 95°С в течение 5 минут. Предложенное изобретение позволяет выделить микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, с высоким выходом. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к способам выделения микроРНК из биологических жидкостей, и предназначено для выделения различных типов микроРНК из различных экзосомосодержащих биологических материалов для оценки отдельных фракций экзосом.

Экзосомы - маленькие, 20-100 нм, сферические пузырьки, формируемые клеткой для межклеточных взаимодействий. В экзосомах содержатся комплексы белков и микроРНК, которые представляют ценность как диагностические маркеры, а также могут использоваться для формирования иммунного ответа в онкологии. Однако для эффективного использования экзосом необходимо получение чистой фракции.

Экзосомы стабильны в биологических жидкостях, крови, моче, слюне, асците или культуральной жидкости в случае культивирования. Это делает доступной не инвазивную диагностику экзосом опухолевого происхождения в плазме крови и моче.

Экзосомы активно выделяются клетками иммунной системы - дендритные клетки и В-лимфоциты, клетками нервной ткани, секреторных тканей и особенно опухолевыми клетками [ K.Denzer et al. 2000, Huber et al. 005, P.Wwearsch 2009]. В случае дендритных клеток выделяются экзосомы содержащие маленькие (8-12 аминокислот) презентованные полипептиды в комплексе антигеном МНС I, присоединяющиеся к соответствующим рецепторам на CD8 цитотоксических Т-лимфоцитах, NK-клетках, а также в комплексе с МНС II, содержащие большие (12-16 аминокислот) презентированные полипептиды, к соответствующим рецепторам на CD4 цитотоксических Т-лимфоцитах. Экзосомы, выделяющиеся опухолевыми клетками, могут нарушать формирование противоопухолевогоответа цитотоксических Т-клеток за счет конкуренции с экзосомами дендритных клеток или макрофагов, учитывая, что концентрация экзосом увеличивается в плазме/сыворотке крови примерно в 50 раз при развитом раке [Taylor et al. 2008, Iero 2008].

Экзосомы содержат антигены МНС I и МНС II комплекса гистосовместимости, Rab-белки ряд интегринов, а также антигены и наборы микроРНК, определяемые тканевой принадлежностью и индивидуальными особенностями типа клеток. Так в экзосомах из мочи человека обнаружено присутствие 295 белков [ Pisitkun et al. 2004]. Около 50 белков встречаются регулярно во всех экзосомах [Gonzales et al., 2009]. В случае опухолей тканеспецифический набор белков и опухолевоспецифический набор микроРНК может использоваться для ранней диагностики или обоснования схемы лечения [Baj-Krzyworzeka et а1. 2007].

Для изучения специфических опухолевых экзосом необходимо их дифференцировать. Концентрация конкретных микроРНК является в таком случае критерием отбора экзосом из конкретных клеток.

Известен способ выделения экзосом из биологических жидкостей (см. ссылку http://tsitologiya.cytspb.rssi.ru/54 5/shtam ms.pdf сети Интернет), где собирают культуральную конденсированную среду (КС), проводят последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, далее полученную КС объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом из полученных препаратов концентрированной КС применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, разбивают на аликвоты, которые замораживают при -80 °С для дальнейших протеомных исследований.

Известный метод не позволяет разделить экзосомы на различные фракции, относящиеся к различным тканям, а следовательно, и осуществить оценку уровня микроРНК в выделенных образцах.

Техническим эффектом заявленного способа является возможность выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, в частности, возможность выделения отдельных типов, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК в дальнейшем позволит создавать вакцины, основанные на экзосомах из опухолевых клеток.

Вышеприведенный технический результат достигается тем, что в способе выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающем последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл, ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 часов, растворение полученного осадка в фосфатно-солевом буфере, повторное центрифугирование при тех же условиях, и растворение полученного осадка в 100 мкл воды, согласно настоящему изобретению, далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 минут, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H24 +25 мМ 2-пиридин-пропанол +мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно, в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно, к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин.

Далее, с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems спраймерами на отдельные типы, например, тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, а именно: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3р, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-3р, miR-432, miR-438, miR-574-3р, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c.

Затем при помощи программы GenEx qPCR software, вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, после чего полученные данные сводят в таблицу для сравнения профилей экспрессии микроРНК в образцах из разных тканей.

Пример исследования

600 мл мочи, взятой у здорового донора подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H2SO4+25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч.. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК - образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-3р, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR-574-3р, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c результаты анализируют при помощи программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы 1 (см. фиг.1 - Распределение микроРНК, выделенной из 500 мл мочи здорового донора по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре).

Затем 600 мл мочи, взятой у пациента с раком молочной железы, подвергают последовательному центрифугированию в режиме 2000 и 10000g, далее полученную надосадочную жидкость объемом 500 мл концентрируют с помощью ультрафильтрации (Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore) до конечного объема 10 мл. В дальнейшем для выделения экзосом применяют ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. После центрифугирования надосадочную жидкость собирают в отдельную пробирку и исследуют методом лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) для проверки удаления из нее частиц экзосомального размера, осадок растворяют в максимальном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 100 мкл воды (MiliQ) или PBS, далее исследуемый образец подвергают электрофорезу в свободном потоке в специальных буферах на приборе FFE system (FFE Service GmbH) при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 минут, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА. Образец и маркер были введены при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно. Пробег проводили в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч. Для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5М тиомочевины + 6 M мочевины + 100 мМ H2SO4+25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол. Среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины +180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, с последующим сбором отдельных фракций, концентрированием образцов из отдельных лунок при помощи повторного ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч. Затем проводят выделение микроРНК по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, затем используют колонки Exiqon, для очистки микроРНК - образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером фирмы Exiqon, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды. Колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, а потом центрифугируют при 3000g на центрифуге eppendorf 5104, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems, с праймерами на следующие микроРНК: miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-203, miR-205, miR-214, miR-17-Зр, miR-106a, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192, miR-301a, miR-326, miR-331-Зр, miR-432, miR-438, miR-574-Зр, miR-625*, miR-92a, miR-584, miR-517c, miR-378, miR-520f, miR-142-5p, miR-451, miR-518d, miR-29a, miR-650, miR-151, miR-19b, miR-29c, результаты анализируют при помощи компьютерной программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы 2 (см. фиг.2 - Распределение микроРНК, выделенной из 500 мл мочи пациента с аденокарциномой легких по лункам. Концентрация представлена как log с основанием 2 копий микроРНК в микролитре).

Как видно из таблиц 1 и 2 в лунках 61-66 микроРНК miR-17-Зр, miR-106а, miR-146, miR-155, miR-191, miR-192 наблюдаются только у пациента с аденокарциномой легких и не выявляется у здорового донора, что указывает на то, что в эти лунки попадают только экзосомы из опухолевых клеток аденокарциномы легких, следовательно, заявленным способом возможно выделять чистые фракции отдельных типов микроРНК, в том числе тканеспецифичных и опухолевоспецифичных микроРНК, из биологических жидкостей, содержащих экзосомы.

Способ выделения отдельных типов микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, включающий последовательное центрифугирование в режиме 2000 и 10000g, ультрафильтрацию полученной надосадочной жидкости на цетрифужном концентраторе Центрикон плюс-70, 100 кДа, Millipore до конечного объема 10 мл и ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, далее полученный осадок растворяют в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют при тех же условиях, затем полученный осадок растворяют в 100 мкл воды, отличающийся тем, что далее полученный раствор подвергают электрофорезу в свободном потоке в бункерах для анодной и катодной стабилизации на приборе FFE System с последующим сбором отдельных фракций при следующих условиях: общее время проведения электрофореза 5 мин, подаваемое напряжение 900 В и ток 34 мА, образец и маркер вводят при скорости потока 2,5 мл/ч и 280 мл/ч соответственно, пробег проводят в режиме циклического интервала FF-ZE при 85 мл/ч и фракционированный образец элюируют при 320 мл/ч, для анодной стабилизации используют следующий буфер: 1,5 М тиомочевины + 6 M мочевины +100 мМ H2SO4 +25 мМ 2-пиридин-пропанол + 300 мМ 2-пиридин-этанол; среда для разделения имеет следующий состав: 1,8 M тиомочевины + 6 M мочевины + 55 мМ MOPS + 55 мМ 2-пиридин-пропанол; для катодной стабилизации используют следующий буфер: 1,8 M тиомочевины + 76 M мочевины + 180 мМ NaOH + 25 мМ Трис + 35 мМ МОПС + 280 мМ EPPS, далее отдельные фракции повторно ультрацентрифугируют на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000g в течение 2 ч, затем проводят выделение микроРНК из каждой отдельной фракции, а именно в каждую из отдельных фракций добавляют 5 мкМ протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 ч, далее наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000g, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000g на центрифуге eppendorf 5104, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды, далее колонку оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 3000g, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы (Exiqon), а именно к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 ч при температуре 60°С, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95°в течение 5 мин.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к предварительной оценке эффективности трансплантации аутологичного клеточного материала для стимуляции роста кровеносных сосудов, и может быть использовано в медицине.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ выявления генома вируса инфекционной анемии лошадей предусматривает постановку полимеразной цепной реакции, амплификацию ДНК вируса, оценку проведения реакции.

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Группа изобретений относится к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров. Предложен многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов и способ изготовления многоканального элемента, входящего в состав многоканального наконечника.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому птичьему астровирусу; к антителам и их фрагментам, направленным против указанного нового вируса; к антигенным препаратам, белкам и ДНК-молекулам нового птичьего астровируса; к вакцинам на основе указанного нового вируса или к его антигенным препаратам, белку или ДНК; к способам получения таких вакцин и к диагностическим наборам.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта в виде молочнокислой закваски на основе аутоштаммов лактобактерий и способ лечения синдрома раздраженной кишки, сопровождающегося дисбиозом кишечника, с его использованием.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования у пациента с влажной возрастной дегенерацией желтого пятна (AMD) повышенной вероятности эффекта от лечения высокоаффинным антителом против VEGF, в частности ранибизумабом.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантные варианты рекомбинантной L-аспарагиназы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes, в которой аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток серина либо аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен набор олигонуклеотидных праймеров для амплификации участка генома патогенных буркхольдерий, последовательность которого гомологична фрагменту генома В.

Группа изобретений относится к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров. Предложен многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов и способ изготовления многоканального элемента, входящего в состав многоканального наконечника.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к автоматическому устройству и способу очистки и выделения целевой нуклеиновой кислоты из биологического образца, причем устройство обеспечивает возможность предотвратить загрязнение выделенной целевой нуклеиновой кислоты от аэрозоля и которое может быть применено ко всем видам оборудования выделения и очистки нуклеиновых кислот из множества биологических образцов, использующего магнитный стержень или мультипипеточный блок, движущийся в двух или трех осевых направлениях.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генетической инженерии. Предложен геном фага, фагмида и нитчатый фаг для использования в фаговом дисплее, система фагового дисплея, набор и фаговая библиотека для определения продукта экзогенного гена.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (CmAP) и маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (MBL-T).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа прогнозирования длины тела человека в рамках русской популяции. Представленный способ основан на исследовании ДНК, в котором с помощью метода ПЦР и при использовании определенных праймеров проводят исследование участков генов амелогенина (AML), используя локусы генов секреторного рецептора гормона роста (GSHR), ко-репрессороподобного лигандзависимого ядерного рецептора (LCORL) и связывающего белка циклин-зависимых киназ (CABLES1) в образцах ДНК мужского пола и генов хейджхок-взаимодействующего белка (HHIP) и ядерного белка с цинковыми пальцами (JAZF1) в образцах ДНК женского пола.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ селекции эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей желаемый уровень интересующего полипептида, включающий трансфекцию клеток гетерологичной нуклеиновой кислотой, содержащей по меньшей мере одну кассету, содержащую по меньшей мере первый полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, стоп-кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно стоп-кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, культивирование клеток-хозяев для экспрессии интересующего полипептида так, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде слитого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, причем такой слитый полипептид экспонируется на поверхности указанной клетки-хозяине, селекцию клетки по наличию или количеству слитого полипептида, экспонируемого на клеточной поверхности.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cпособу получения препаративных количеств вирусного антигена - белка вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК, PLRV), в составе химерных вирусных частиц, имитирующих вирионы ВСЛК, включающий создание рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, где кДНК ВПЖТ находится под контролем растительного промотора, на ее конце имеется терминатор транскрипции, а ген белка оболочки ВПЖТ заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, включающий создание агробактериального вектора (плазмиды) pCambia 1300, способного встраиваться в геном растения-хозяина и вызывать системную инфекцию, перенос созданной рекомбинантной ДНК в агробактериальный вектор pCambia, трансформацию растения-хозяина Nicotiana benthamian агробактериальным вектором pCambia, размножение химерного вируса, состоящего из РНК вируса, в растении-хозяине Nicotiana benthamian, выделение химерного вируса, содержащего кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), ген оболочки которого заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, из зараженных листьев растения-хозяина Nicotiana benthamian.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения одноцепочечной кольцевой РНК. Способ включает синтез смысловой цепи и антисмысловой цепи, содержащих нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигирование нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи и, наоборот, с использованием лигазы.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения дрожжевого экстракта, содержащего биологически активную высокополимерную РНК.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ определения уровня экспрессии гена МСР1 (CCL2) предусматривает оценку количества его мРНК методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с детекцией сигнала в реальном времени в образцах клеток, тканей и биологических жидкостей человека.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном. Способ включает контактирование совокупности гетеродимерных модифицированных убиквитинов, включающих два мономера убиквитина, связанных между собой по схеме голова к хвосту, с потенциальным лигандом дисплейным способом. При этом каждый из упомянутых мономеров модифицирован по-разному и содержит 5-8 замещений в положениях 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 и 68 SEQ ID NO:1. Далее идентифицируют гетеродимерный модифицированный белок, связавшийся с лигандом с сродством связывания Kd в диапазоне 10-7-10-12 М и одновалентной связывающей активностью. Предложены ДНК-библиотеки, отвечающие за получение популяции упомянутых гетеромультимерных убиквитинов, а также библиотеки белков, полученные путем экспрессии упомянутых ДНК-библиотек. Изобретение позволяет получить новые связывающие белки на основе гетеромультимерного убиквитина, способные специфически связываться с высоким сродством с выбранными лигандами. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 пр.
Наверх