Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов


 


Владельцы патента RU 2549707:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ростовский Государственный медицинский университет" Министерств здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России) (RU)
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии. Питательная среда содержит твердую и жидкую фазы. Твердая фаза питательной среды содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, агар, теллурит калия - 2% раствор и воду дистиллированную при заданном соотношении компонентов. Жидкая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, экстракт дрожжевой, глюкозу, агар, натрий хлористый, теллурит калия - 2% раствор, сыворотку крови крупного рогатого скота и воду дистиллированную в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить ингибирующие свойства питательной среды относительно микробов-ассоциантов - стафилококков. 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии.

В постэпидемический период основным источником дифтерийной инфекции являются бактерионосители токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. Наиболее опасны в этом отношении бактерионосители, страдающие острыми заболеваниями верхних дыхательных путей (Маркина С.С., Корженкова М.П., Максимова Н.М. Дифтерия // Фельдшер и акушерка. - 1992. - №1. - С.13-19), обусловленными сопутствующей микрофлорой, в частности стафилококками. При этом на долю стафилококков приходится 71,8% от общего числа микробов, выделенных из верхних дыхательных путей (Извин А.И., Катаева Л.В. Микробный пейзаж слизистой оболочки верхних дыхательных путей в норме и патологии // Вестник отоларингологии. - 2009. - №2. - С.64-68). Известно, что возбудители дифтерии и стафилококки, присутствуя на эпителии верхних дыхательных путей, не вступают в антагонистические взаимоотношения друг с другом (Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Васильева Г.И. Апоптоз макрофагов как один из механизмов патогенного действия возбудителя дифтерии // Журн. микробиол. и эпидемиол. - 2012. - №5. - С.63-66). В связи с этим, в материале, взятом для выделения возбудителя дифтерии от больных и бактерионосителей, содержатся помимо Corynebacterium diphtheriae представители сопутствующей микрофлоры - стафилококки, которые создают сложности при выделении дифтерийных микробов на питательных средах.

Поэтому разработка новых питательных сред для культивирования дифтерийных микробов, обладающих улучшенными ингибирующими свойствами в отношении стафилококков, является актуальной задачей современной микробиологии.

Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найдены различные питательные среды для культивирования дифтерийных микробов.

Так, в работе Мазуровой И.К., Бочковой В.А., Сальниковой Г.П. (Методические рекомендации «Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции», Москва. - 1980. - с.67) описана питательная среда Бучина, применяемая для культивирования дифтерийных микробов. Она содержит на 100 мл питательной агаровой основы 5 мл дефибринированной крови.

В работе Мазуровой И.К., Мельникова В.Г., Комбаровой С.Ю., Борисовой О.Ю. (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ. - Москва, 1998 г. - с.22) описана питательная среда для культивирования дифтерийных микробов - кровяной теллуритовый агар. Питательная среда содержит на 100 мл питательной агаровой основы 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови человека или животных, а также 2 мл 2% раствора теллурита калия.

Недостатком данных питательных сред является отсутствие ингибирующих свойств в отношении стафилококков (Методические указания МУ 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ. - Москва, 1998 г. - с.22).

В патенте РФ №2041947 (1995 г., БИ №23) описана "Питательная среда для выделения дифтерийного микроба". Указанная питательная среда представляет собой твердую фазу. Среда содержит питательную основу - гидролизат панкреатический рыбной муки с добавлением гидролизата ферментативного черного альбумина, натрий хлористый, агар, теллурит калия - 2% раствор, и воду дистиллированную, при заданном соотношении компонентов.

Недостатком данной питательной среды являются ее невысокие ингибирующие свойства относительно микробов-ассоциантов: стафилококков.

Патентом РФ №2412991 (2011 г. , БИПМ №6) защищена "Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов", содержащая жидкую фазу, состав которой определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу, содержащую коагулированную сыворотку и агарозу, при заданном соотношении компонентов.

Недостатком этой двухфазной среды является ее ограниченная область применения: ее невозможно использовать для культивирования дифтерийных микробов, так как для их культивирования необходимо наличие в ее составе не коагулированной, а нативной сыворотки (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ - Москва, 1998 г. - с.23-24).

Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является "Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов", защищенная патентом РФ №2455351 (2011 г., БИПМ №19). Указанная питательная среда - прототип, содержит твердую и жидкую фазы.

Твердая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, агар, теллурит калия - 2%-ный раствор и воду дистиллированнную, при следующем соотношении компонентов твердой фазы на каждый литр воды дистиллированной:

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 20,0-25,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 10,0-12,0
натрий хлористый, г 4,0-4,5
экстракт дрожжевой, г 3,0-5,0
глюкоза, г 3,0-5,0
агар, г 10,0-12,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 13,0-15,0

Жидкая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, сыворотку крови крупного рогатого скота и воду дистиллированнную, при заданном соотношении компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной.

Недостатком прототипа - питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, является ее недостаточно эффективные ингибирующие свойства относительно микробов-ассоциантов - стафилококков, обусловленные составом жидкой фазы питательной среды.

В сответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.2316-08) «Методы контроля бактериологических питательных сред» - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - с.38-39) характеристикой ингибирующих свойств питательных сред является «показатель ингибиции», который в указанных методических указаниях определен только лишь для плотных и жидких (полужидких) питательных сред. Поэтому в качестве характеристики ингибирующих свойств сред, содержащих твердую и жидкую фазы, т.е. двухфазных питательных сред, мы использовали «показатель ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф), который определяется как отношение среднего числа колоний микробов на твердой фазе, сформировавшихся после высева из жидкой фазы двухфазной питательной среды, к среднему числу колоний тех же микробов после их культивирования на соответствующих питательных средах (Алутина Э.Л., Айдинов Г.Т., Харсеева Г.Г., Гасретова Т.Д. Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов // Проблемы антибиотикорезистентности возбудителей внутрибольничных инфекций: сб. науч. - практ. работ / под общ. ред. Г.Г. Харсеевой. - Ростов-на-Дону: Издательство РостГМУ, 2013. - С.8). При этом соответствующими питательными средами являются среды, ростовые свойства которых полностью удовлетворяют потребностям микробов. Так, для штамма Staphylococcus aureus Wood-46 соответствующей питательной средой является 5% кровяной агар (Приказ №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» - М.: Министерство здравоохранения СССР, 1985. - С.55). А среднее число колоний микробов на твердой фазе, сформировавшихся после высева из жидкой фазы двухфазной питательной среды и среднее число колоний тех же микробов после их культивирования на соответствующих питательных средах определяется как среднее арифметическое результатов трех повторов культивирования.

Задачей предлагаемого изобретения является создание двухфазной, т.е. содержащей жидкую и твердую фазы питательной среды для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ингибирующими свойствами относительно микробов-ассоциантов.

Техническим результатом, проявляющимся при использовании данной питательной среды, является повышение ее ингибирующих свойств относительно микробов-ассоциантов: стафиллококков, а именно уменьшение значения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф) для культивирования дифтерийных микробов.

Технический результат достигается тем, что жидкая фаза двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, экстракт дрожжевой, глюкоза, натрий хлористый, сыворотка крови крупного рогатого скота и вода дистиллированная, дополнительно содержит агар и теллурит калия - 2% раствор. Соотношение компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной следующее:

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 8,0-9,0
пептон ферментативный, г 8,0-9,0
экстракт дрожжевой, г 3,0-5,0
глюкоза, г 3,0-5,0
натрий хлористый, г 4,0-4,5
агар, г 0,75-1,0
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл 80,0-100,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 13,0-15,0

Соотношение компонентов твердой фазы питательной среды для культивирования дифтерийных микробов на каждый литр воды дистиллированной следующее:

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 20,0-25,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 10,0-12,0
натрий хлористый, г 4,0-4,5
экстракт дрожжевой, г 3,0-5,0
глюкоза, г 3,0-5,0
агар, г 10,0-12,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 13,0-15,0

Заявляемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов готовится следующим образом.

Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях: гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, например, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства, например, ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотку крови крупного рогатого скота, например, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, например, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72).

Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтруют через бумажный фильтр, например бумажный фильтр производства завода «Химреактивкомплект» (ТУ 6-09-1706-82), помещают в стерилизатор, например в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°C, добавляют необходимые объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешивают.

Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, например, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975- 88), агар, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», (Индия), теллурит калия - 2% раствор, например, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72).

Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещают в стерилизатор, например "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°C, добавляют необходимый объем теллурита калия - 2% раствор, смешивают и разливают по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупоривают и оставляют в наклонном положении до застывания.

Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывают, вносят в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывают. Готовую питательную среду хранят в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.

Практическая реализуемость использования предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 0,8
пептон ферментативный, г 0,8
экстракт дрожжевой, г 0,3
глюкоза, г 0,3
натрий хлористый, г 0,04
агар, г 0,075
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл 8,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,3

Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.

Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 2,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 1,0
натрий хлористый, г 0,4
экстракт дрожжевой, г 0,3
глюкоза, г 0,3
агар, г 1,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,3

Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.

Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.

Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 1.

Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов.

Табл. 1
Разведения микробной взвеси Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре Показатель ингибиции ПИ
1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор средн знач. 1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор сред. знач.
10-1 5 5 7 5,7 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-2 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-3 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-4 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-5 0 0 0 0 380 364 371 371,7 0
10-6 0 0 0 0 48 54 51 51 0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ не вычисляется.

Пример 2: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 0,9
пептон ферментативный, г 0,9
экстракт дрожжевой, г 0,5
глюкоза, г 0,5
натрий хлористый, г 0,45
агар, г 0,1
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл 10,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,5

Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.

Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 2,5
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 1,2
натрий хлористый, г 0,45
экстракт дрожжевой, г 0,5
глюкоза, г 0,5
агар, г 1,2
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,5

Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.

Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.

Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 2.

Пример 3: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 0,85
пептон ферментативный, г 0,85
экстракт дрожжевой, г 0,4
глюкоза, г 0,4
натрий хлористый, г 0,42
агар, г 0,08
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл 9,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,4

Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов

Табл.2
Разведения микробной взвеси Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре Показатель ингибиции ПИ
1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор среди знач. 1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор сред. знач.
10-1 12 15 11 12,7 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-2 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-3 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-4 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-5 0 0 0 0 375 370 381 375,3 0
10-6 0 0 0 0 47 51 53 50,3 0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ не вычисляется.

Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.

Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 2,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 1,1
натрий хлористый, г 0,42
экстракт дрожжевой, г 0,4
глюкоза, г 0,4
агар, г 1,1
теллурит калия - 2% раствор, мл 1,4

Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ПС-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.

Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.

Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 3.

Для сравнения ингибирующих свойств прототипа и предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения показателей ингибиции вышеуказанных двухфазных питательных сред относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами было проведено 17 исследований ингибирующих свойств заявляемой питательной среды и среды-прототипа, для различных соотношений компонентов фаз указанных выше питательных сред. Каждое исследование состояло из трех повторов культивирования. Итоговые результаты исследований приведены в таблице 4.

Табл.3
Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов
Разведения микробной взвеси Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре Показатель ингибиции ПИ
1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор среди знач. 1-й повтор 2-й повтор 3-й повтор сред. знач.
10-1 8 11 12 10,3 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-2 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-3 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-4 0 0 0 0 сплошной рост сплошной рост сплошной рост - -
10-5 0 0 0 0 390 360 393 381,0 0
10-6 0 0 0 0 50 52 58 53,3 0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ не вычисляется.

Полученные результаты показали, что предлагаемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов обладает улучшенными ингибирующими свойствами по сравнению со средой-прототипом: значения ПИ у предлагаемой питательной среды (равные 0) много меньше соответствующих значений ПИ питательной среды-прототипа.

Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов позволяет значительно повысить ингибирующие свойства питательной среды для культивирования дифтерийных микробов относительно микробов-ассоциантов: стафилококков.

Табл.4
Результаты, полученные при характеристике ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов
Разведения микробной взвеси стафилококков Среднее количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде Среднее количество колоний на питательной среде-прототипе Среднее количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре Показатель ингибиции ПИ предлагаемой питательной среды Показатель ингибиции ПИ питательной среды-прототипа
10-1 9,5 180,2 сплошной рост - ~
10-2 0 130,5 сплошной рост - -
10-3 0 87,8 сплошной рост - -
10-4 0 58,6 сплошной рост - -
10-5 0 42,4 376,1 0 0,11
10-6 0 2,0 51,4 0 0,04
Примечание: при сплошном росте значение ПИ не вычисляется.

Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов, содержащая твердую фазу, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкоза, агар, теллурит калия - 2% раствор и вода дистиллированная, при следующем соотношении компонентов твердой фазы на каждый литр воды дистиллированной:

гидролизат панкреатический рыбной муки, г 20,0-25,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г 10,0-12,0
натрий хлористый, г 4,0-4,5
экстракт дрожжевой, г 3,0-5,0
глюкоза, г 3,0-5,0
агар, г 10,0-12,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 13,0-15,0

и жидкую фазу, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, экстракт дрожжевой, глюкоза, натрий хлористый, сыворотка крови крупного рогатого скота и вода дистиллированная, отличающаяся тем, что жидкая фаза дополнительно содержит агар и теллурит калия - 2% раствор, при следующем соотношении компонентов жидкой фазы фазы на каждый литр воды дистиллированной:
гидролизат панкреатический рыбной муки, г 8,0-9,0
пептон ферментативный, г 8,0-9,0
экстракт дрожжевой, г 3,0-5,0
глюкоза, г 3,0-5,0
натрий хлористый, г 4,0-4,5
агар, г 0,75-1,0
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл 80,0-100,0
теллурит калия - 2% раствор, мл 13,0-15,0



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен штамм микромицета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полисахаридов растительного и микробного сырья.

Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и к молочному пищевому продукту, содержащему указанный штамм. Предложенный штамм обладает специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложены композиция и способ для контроля численности моллюсков классов Gastropoda и Bivalvia.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены штаммы Cryptococcus flavescens 3C NRRL Y-50378 и Cryptococcus flavescens 4С NRRL Y-50379 для подавления и контроля фузариоза злаков, обладающие устойчивостью к протиоконазолу.
Изобретение относится к молочной промышленности, а именно к способу приготовления кисломолочного продукта. Для получения кисломолочного продукта обезжиренное коровье молоко после пастеризации и охлаждения заквашивают путем добавления суспензии, взятых в равных соотношениях штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП в 1%-ном растворе хлористого натрия в концентрации 5 млрд КОЕ/мл, сквашивают при температуре 38-42°C в течение 6-8 часов до кислотности 100-120°T, вымешивают в течение 30 мин, разливают и направляют на созревание.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способ получения лизогликолипида, способ биоконверсии гликолипидов и способ получения пищевого продукта.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается фармацевтической композиции. Представленная композиция содержит рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях.

Изобретение относится к области медицины, фтизиатрии и медицинской микробиологии и касается способа генотипирования штаммов Mycobacterium tuberculosis. Охарактеризованный способ основан на однонуклеотидном полиморфизме генов систем токсин-антитоксин II типа суперсемейств VapBC, HigAB и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора олигонуклеотидных праймеров для 10 генов систем токсин-анатоксин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток.

Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и к молочному пищевому продукту, содержащему указанный штамм. Предложенный штамм обладает специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ получения бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum с повышенным уровнем синтеза L-лизина, включающий высев культуры бактерии Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium flavum, способной продуцировать L-лизин, на среду, содержащую фузидиновую кислоту, и отбор среди выросших колоний таких, которые обладают повышенным уровнем синтеза L-лизина.
Изобретение относится к пищевой микробиологии, в частности к получению питательной среды для определения в кондитерских изделиях, микроорганизмов, вырабатывающих липазы.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 обладает деструктивной активностью в отношении группы стойких токсичных хлорароматических соединений - полихлорированных бифенилов (ПХБ).
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается фармацевтической композиции. Представленная композиция содержит рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р.

Изобретение относится к микробиологии. Питательная среда содержит лимонную кислоту, янтарную кислоту, глицин, фосфорнокислый калий двузамещенный, сернокислый магний, сернокислый цинк, сернокислое железо, хлористый натрий, глюкозу, глицерин и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus pentosus DSM 21980, продуцирующий бактериоцин.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных. Способ предусматривает подготовку фитоносителя путем смешивания содержащего клетчатку растительного сырья, водопроводной воды, автолизата пекарских дрожжей, калия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого и мелассы в заданном соотношении компонентов.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ получения персонифицированного аутопробиотического продукта в виде молочнокислой закваски на основе аутоштаммов лактобактерий и способ лечения синдрома раздраженной кишки, сопровождающегося дисбиозом кишечника, с его использованием.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Bifidobacterium longum NCIMB 41676, обладающий иммуномодулирующим действием.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства пробиотических препаратов. Способ приготовления питательной среды для культивирования лактобактерий включает предварительное приготовление кислотного гидролизата крови убойных животных, дрожжевого аутолизата и молочной сыворотки известными способами. Кислотный гидролизат крови убойных животных раскисляют до рН 6,7-6,9 и добавляют к нему дрожжевой аутолизат, молочную сыворотку, глюкозу и отвар капусты в заданном соотношении компонентов. Затем смесь нагревают и кипятят в течение 5-7 минут. Определяют pH питательной среды и доводят до значения 6,7-6,9. Полученную питательную среду фильтруют и фасуют во флаконы с последующей стерилизацией автоклавированием при 0,5 атм в течение 25-30 мин. Изобретение позволяет повысить выход биомассы и увеличить интенсивность ее роста. 3 табл., 3 пр.
Наверх