Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии



Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии
Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии

 


Владельцы патента RU 2549953:

Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научный центр "Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей" (ФГУП "ГНЦ "НИОПИК") (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "МНИОИ им. П.А. Герцена" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии. Предложено применение мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина структурной формулы (I) в качестве фотосенсибилизатора в ближней ИК области спектра для фотодинамической терапии. Технический результат состоит в том, что мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорин обладает высокой фотоиндуцированной активностью в отношении опухолевых клеток человека различного эпителиального происхождения (величина ИК50 составляет 35±5 нМ) и обеспечивает высокую дозозависимую противоопухолевую эффективность у животных с опухолями различного генеза. Дозы заявленного фотосенсибилизатора в 1,0-2,5 мг/кг обеспечили 70-100% торможение роста опухоли, увеличение продолжительности жизни на 80-131% и 25-100% излеченность животных, за счет селективного накопления в опухоли и быстрого выведения из организма. 5 ил., 8 пр.

Структурная формула(I)

 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно - к фотосенсибилизаторам (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и ряда других патологических состояний.

Метод ФДТ основан на применении ФС, которые обладают способностью к избирательному накоплению (тропностью) в опухолевой ткани и при облучении светом определенной длины волны переходят в активированное состояние, которое инициирует образование цитотоксических агентов - синглетного кислорода и свободных радикалов, вызывающих разрушение структурных элементов опухолевой ткани.

Успешное применение метода ФДТ для лечения злокачественных новообразований стимулирует поиск новых ФС с улучшенными свойствами. Наиболее перспективные для ФДТ ФС с максимумом поглощения в дальнем красном и ближнем инфракрасном диапазонах (700-800 нм), так называемом «терапевтическом окне», где собственное поглощение биологической ткани минимально, что обеспечивает возможность более глубокого проникновения излучения в ткань и, как следствие, высокую эффективность терапии (Bonnett R.J. Heterocyclic Chem. 2002. V.39. P.455-470).

Перспективными ФС для ФДТ, поглощающими в ближнем инфракрасном диапазоне спектра, являются бактериохлорины (тетрагидропорфирины) (Миронов А.Ф., Грин М.А., Ципровский А.Г. и др. // Биоорганическая химия. 2003. Т.29. Вып.2. С.214-221). Так, тукад, палладиевое производное бактериохлорина (Tookad), с максимумом поглощения при 760 нм разрешен для лечения простаты.

Однако преобладающее количество бактериохлоринов является полусинтетическими препаратами, для получения которых используют в качестве исходных соединений вещества природного происхождения. Известные же бактериохлорины чисто синтетического происхождения весьма труднодоступны - получаются многостадийными синтезами, как правило, нестабильны при хранении или неустойчивы фотохимически в результате протекающих окислительных процессов.

Задачей предлагаемого изобретения является изыскание ФС, который характеризовался бы поглощением в ближнем инфракрасном диапазоне спектра, высокой фотоиндуцированной активностью, высокой тропностью к опухолевой ткани, уменьшением побочных эффектов за счет сокращения времени циркуляции в организме, что позволило бы значительно повысить эффективность лечения.

Для решения поставленной задачи в качестве ФС для ФДТ предлагается использование весьма доступного чисто синтетического бактериохлорина - мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина (H2Py4BC) следующей формулы:

Данное соединение описано в качестве полупродукта при синтезе мезо-тетра[1-(4′-бромбутил)-3-пиридил]бактериохлорина тетрабромида (Патент РФ №2479585, C07D 487/22, 2013). H2Py4BC получен двухстадийным синтезом исходя из пиррола и 3-пиридинальдегида. Для его солюбилизации в водных растворах использован разрешенный к медицинскому применению неионогенный ПАВ Cremophor EL (4%-ный раствор).

Изобретение иллюстрируется следующими рисунками:

Фиг.1 - Спектр поглощения раствора 0,41 мг/мл H2Py4BC в 4%-ом Cremophor EL.

Фиг.2 - Спектры флуоресценции раствора H2Py4BC в 0,9% растворе NaCl (A) и содержащей 10% ЭТС среде Игла MEM (Б) при инкубации в темновых условиях (1-ex tempore, 2 - через месяц).

Фиг.3 - Спектры флуоресценции H2Py4BC в 0,9% растворе NaCl (А) и содержащей 10% ЭТС среде Игла MEM (Б) при облучении (1-ex tempore, 2-5 Дж/см2, 3-10 Дж/см2).

Фиг.4 - Фотоиндуцированная активность H2Py4BC в отношении клеток HEp2 (сплошная линия) и EJ (пунктирная линия).

Фиг.5 - Фотоиндуцированная противоопухолевая активность H2Py4BC у мышей с опухолью S37 в зависимости от дозы и интервала между введением и облучением (1 - 2,5 мг/кг, 30 мин; 2 - 2,5 мг/кг, 2 ч; 3 - 1,0 мг/кг, 30 мин; 4 - 1,0 мг/кг, 2 ч; 5 - 0,5 мг/кг, 30 мин).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. мезо-Тетра(3-пиридил)бактериохлорин синтезирован по ранее описанной методике (Патент РФ №2479585, C07D 487/22, 2013) восстановлением мезо-тетра(3-пиридил)порфирина диимидом, генерируемым в условиях реакции из n-толуолсульфонилгидразида, в присутствии сухого поташа в сухом пиридине. λмакс, нм (lgε), хлороформ: 747 (5,05), 683 (3,78), 521 (4,71), 491 (3,78), 380 (5,08), 367 (4,95), 357 (5,00).

Исходный мезо-тетра(3-пиридил)порфирин получен конденсацией эквимолярных количеств пиррола с 3-пиридинальдегидом в кипящей пропионовой кислоте в присутствии воздуха.

Пример 2. Приготовление раствора H2Py4BC в 4%-ном Cremophor EL

Навески H2Py4BC (4,1 мг) и неионогенного ПАВ Cremophor EL (0,4 г) растворяли в 20 мл хлороформа. Перемешивали раствор в круглодонной колбе объемом 1 л магнитной мешалкой, нагревая до 40-55°C для интенсификации процесса растворения. Затем упаривали растворитель на роторном испарителе в вакууме при температуре водяной бани 30-40°С. Образовавшуюся пленку досушивали в вакууме, после чего гидратировали добавлением 10 мл фосфатного буферного раствора (PBS) с pH=7,34. Перемешивание осуществляли до полного растворения пленки; полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр (Millipore, Type GS) с размером пор 0,22 мкм. Все стадии приготовления раствора проводили при минимальном воздействии внешнего освещения.

Растворы хранили при температуре 6-10°C в защищенном от света месте. Спектр поглощения раствора 0,41 мг/мл H2Py4BC в 4%-ном Cremophor EL приведен на Фиг.1 (регистрировали относительно 4%-ого раствора Cremophor EL в кювете l=0,02 см).

Пример 3. Оценка стабильности H2Py4BC.

Оценку стабильности ФС проводили с помощью флуоресцентного метода анализа. Растворы для проведения исследований готовили ex tempore, достигая выбранной концентрации (5 мкг/мл) путем последовательных разведений исходного раствора. Концентрация исходного раствора составляла 0,41 мг/мл. В качестве растворителя использовали среду Игла, содержащую 10% ЭТС, и 0,9% раствор NaCl. Регистрацию флуоресценции растворов проводили в динамике контактным способом на лазерном спектральном анализаторе для флуоресцентной диагностики опухолей «ЛЭСА-6» (ТОО «БиоСпек», Россия). Флуоресценцию возбуждали He-Ne лазером при длине волны генерации 632,8 нм, спектральный диапазон от 600 до 950 нм.

На Фиг.2 представлены спектры флуоресценции раствора H2Py4BC в 0,9% растворе NaCl (А) и содержащей 10% ЭТС среде Игла MEM (Б) при инкубации в темновых условиях. Отсутствие изменений в профиле спектра и интенсивности флуоресценции свидетельствует о его стабильности в выбранном временном диапазоне.

Пример 4. Оценка фотостабильности H2Py4BC в бесклеточной среде.

Оценку фотовыцветания проводили в 0,9% растворе хлористого натрия и в среде Игла MEM, содержащей 10% ЭТС, при облучении полихроматическим светом. В качестве источника света использовали галогеновую лампу мощностью 500 Вт с широкополосным фильтром КС-13 (λ≥680 нм) и водным фильтром толщиной 5 см. Световая доза составляла 5 и 10 Дж/см2 при плотности мощности 32,0±1,0 мВт/см2. Измерения флуоресценции проводили контактным способом на лазерном спектральном анализаторе «ЛЭСА-06» в спектральном диапазоне 600-950 нм. Спектры флуоресценции регистрировали сразу после приготовления раствора и после воздействия светом.

При облучении ФС (Фиг.3) в 0,9% растворе NaCl (А) и в среде Игла MEM (Б) наблюдалось лишь незначительное снижение (не более 18-20%) интенсивности флуоресценции (λmax=745±2 нм) без изменений профиля спектра, что свидетельствовало о его фотоустойчивости.

Пример 5. Фотоиндуцированная активность и темновая цитотоксичность H2Py4BC в отношении культуры клеток человека HEp2 и EJ.

Исследования проводили на опухолевых клетках человека. Культуры клеток эпидермоидная карцинома гортаноглотки (HEp2) и карцинома мочевого пузыря (EJ) получены из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, которые культивировались при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2 (стандартные условия).

Клетки рассевали в лунки плоскодонного 96-луночного микропланшета. Тестируемые соединения вносили в лунки через 24 часа после посева, варьируя концентрацию от 13 до 3200 нМ. Для оценки фототоксичности через 0,5, 2, 4 и 6 часов инкубации с фотосенсибилизатором клетки облучали галогеновой лампой через широкополосный фильтр КС-13 (λ≥680 нм). Плотность мощности составляла 32,0±1,0 мВт/см2, расчетная световая доза - 10 Дж/см2. Также исследования проводили как с удалением ФС из среды перед облучением, так и без удаления.

После облучения клетки инкубировали в течение суток в стандартных условиях. Для оценки цитотоксической активности плашки помещали в затемненные условия на 24 часа. Оценку выживаемости определяли визуально и колориметрическим методом с использованием МТТ-теста. Биологически значимым эффектом считали ингибирование роста клеток в культуре более чем на 50%. Данную величину рассчитывали как среднюю по результатам трех независимых тестов.

Выявлено, что ФС проявил максимальную фотоиндуцированную активность относительно клеток культур HEp2 и EJ при 4-часовой инкубации, ИК50 составляла 32±2 нМ и 35±3 нМ соответственно, с увеличением времени инкубации до 6 часов величина ИК50 не изменялась (Фиг.4). Инкубация клеток с красителем в концентрациях до 3200 нМ в отсутствие светового воздействия в течение 24 часов не влияла на рост клеточных культур.

Удаление ФС из культуральной среды перед воздействием светом незначительно снижало эффективность фотодинамического воздействия (на 15-20%), что свидетельствует о реализации фотоиндуцированной активность преимущественно за счет активации внутриклеточного ФС.

Таким образом, результаты, полученные in vitro, показали, что H2Py4BC накапливается в клетках и обладает высокой фотоиндуцированной активностью.

Пример 6. Распределение H2Py4BC в опухоли S37 и флуоресцентная контрастность относительно окружающей ткани.

Оценку распределения ФС в опухолевой и окружающих тканях проводили у мышей с саркомой S37 в интервале от 5 минут до 48 часов методом локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС). Фотосенсибилизатор вводили внутривенно в дозе 2,5 мг/кг. Флуоресценцию регистрировали контактным способом на лазерном спектральном анализаторе для флуоресцентной диагностики опухолей и контроля за ФДТ «ЛЭСА-06».

В опухолевой ткани нормированная флуоресценция ФС достигала максимального значения (2,1±0,7 усл. ед.) через 5 минут и сохранялась на высоком уровне в течение 1 часа после введения, а затем к 48 часам снижалась на 95% от максимального значения. Наиболее высокие уровни нормированной флуоресценции в коже (1,8±0,6 усл. ед.) наблюдались через 4 часа после введения ФС, в мышце (3,3±0,3 усл. ед.) - через 5 минут - 2 часа. Максимальная флуоресцентная контрастность ФС относительно окружающих нормальных тканей кожи регистрировалась через 5 минут после введения и составляла 2,3±0,4 усл. ед., а относительно мышцы - 0,9±0,1 усл. ед. через 5 минут и 24 часа после введения.

Пример 7. Фотоиндуцированная противоопухолевая активность H2Py4BC у животных с саркомой S37, привитой подкожно с внешней стороны правого бедра мышам BDF1.

Исследование эффективности фотодинамической терапии проводили на 7 сутки после инокуляции опухоли. ФС вводили животным однократно внутривенно в дозах 0,5, 1,0 и 2,5 мг/кг. Облучение проводили через 0,5 и 2 часа после введения красителя. Для облучения использовали светодиодный источник (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК») с длиной волны 754±14 нм и плотностью мощности 150 мВт/см2 (световая доза 150 Дж/см2). Контрольная группа животных без воздействия.

Эффективность ФДТ оценивали, используя общепринятые в экспериментальной онкологии критерии:

- торможение роста опухоли ТРО=[(Vк-Vоп)/Vк]·100%, где Vоп и Vк - объем опухоли в опытной и контрольной группах соответственно;

- увеличение продолжительности жизни УПЖ=[(СПЖоп-СПЖк)/СПЖк]·100%, где СПЖоп и СПЖк - средняя продолжительность жизни в опытной и контрольной группах соответственно;

- критерий излеченности КИ=[Nи/No]·100%, где Nи и Nо - количество излеченных животных и общее количество животных в опытной группе соответственно.

Объем опухоли рассчитывали по формуле: V=d1·d2·d3, где d1, d2 и d3 - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли.

Измерение объема опухоли проводили в течение 21 суток после проведенного облучения с помощью электронного цифрового кронциркуля STORMtm 3C301 «Central». За животными наблюдали 120 суток.

В опытных группах в течение суток после облучения у животных формировался интенсивный отек в зоне воздействия, который сохранялся до 5-15 суток. Биологически значимый противоопухолевый эффект был получен при использовании ФС в дозах 1,0 и 2,5 мг/кг при облучении через 30 минут и 2 часа после введения и достигал 70-100% ТРО (Фиг.5), 25-100% излеченности животных; продолжительность жизни животных увеличивалась на 80-131%. Наиболее высокий противоопухолевый эффект (100% ТРО и 100% КИ) при минимальном повреждающем действии получен при использовании ФС в дозе 2,5 мг/кг и облучении через 2 часа после введения.

Пример 8. Фармакокинетика H2Py4BC у интактных мышей.

Фармакокинетику H2Py4BC изучали методом ЛФС в органах и тканях интактных мышей в дозе 2,5 мг/кг по нормированной флуоресценции (ФН).

Максимум спектра флуоресценции ФС в тканях животных регистрировали при 744±2 нм. Флуоресцирующая форма красителя быстро (в течение 5-30 минут) поступала во внутренние органы и ткани организма, преимущественно в печень, затем ФН снижалась с различной скоростью. Максимальная флуоресценция в крови определялась сразу после внутривенного введения и в течение 4-х часов снижалась на 95% от максимального значения и через сутки уже не регистрировалась.

Во внутренних органах через 24 часа уровень нормированной флуоресценции снижался в печени на 87%, почках - на 90%, селезенке - на 92% от максимального значения. Флуоресцирующая форма ФС в дозе 2,5 мг/кг определялась в почках и селезенке до 2 суток, а в печени остаточное количество определялось до 7 суток.

В коже максимальное значение флуоресценции регистрировалось через 4 часа после введения ФС, затем его нормированная флуоресценция снижалась и через 24 часа составляла 50% от максимального значения и через 5 суток не определялась. Это свидетельствует о быстром элиминировании ФС из кожи. В мышце через 24 часа уровень нормированной флуоресценции также снижался на 82%, а в жировой ткани - на 20%. Флуоресцирующая форма ФС определялась в мышце до 5 суток, а в жировой ткани остаточное количество (26%) регистрировалось более 7 суток.

Полученные данные свидетельствуют о быстрой циркуляции H2Py4BC в организме млекопитающих и его выведении преимущественно через печень с желчью.

Таким образом, тетра-(3-пиридил)бактериохлорин является высокоактивным ФС нового поколения, поглощающим в ближней ИК области спектра (λmax=745±2 нм); является стабильным при хранении и обладает высокой фотостабильностью, проявляет высокую фотоиндуцированную противоопухолевую активность в системах in vitro (при 4-часовой инкубации культур HEp2 и EJ ИК50 составляла 32±2 нМ и 35±3 нМ соответственно) и in vivo (100% ТРО и 100% КИ при применении ФС в дозе 2,5 мг/кг и облучении через 2 часа). ФС обладает быстрым выведением из организма животных (через 24 часа содержание во внутренних органах уменьшается на 87-92% от максимального значения, остаточное количество наблюдается до 7 суток).

Применение мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина структурной формулы

в качестве фотосенсибилизатора ближней ИК области спектра для фотодинамической терапии.



 

Похожие патенты:

Предложенное изобретение относится к области иммунологии. Раскрыты варианты димерного соединения для образования мультимера, способного к воспроизведению эффекторной функции агрегированного IgG с идентичными мономерами.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для защиты животных от стресса, стимуляции роста и регуляции обмена веществ у молодняка сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, в том числе ветеринарной медицины, а именно к способу получения средства для стимуляции клеток организма.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения радиационно-термического поражения организма. Для этого применяют однократное подкожное введение облученного гамма-лучами в дозе 14,0 Гр бифидумбактерина.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для профилактики повреждения химическими гемолитическими агентами биологических мембран эритроцитов.

Изобретение относится к новому усилителю противоопухолевого действия, представляющего собой производное урацила общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится к медицине, а именно к методам очищения и оздоровления организма. Для этого проводят лечебное голодание не менее 5 дней при 7-дневной программе и не менее 7 дней при 9-дневной программе.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к слитым белкам, содержащим вариант родостомина, и может быть использовано в медицине. Получают полипептид, селективный в отношении интегрина αvβ3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, конъюгированной на N-конце посредством линкерной аминокислотной последовательности, содержащей комбинацию аминокислот глицина и серина, с вариантом человеческого сывороточного альбумина (HSA) с SEQ ID NO:4.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для коррекции функционального состояния и работоспособности человека. Для этого нейропептид семакс вводят по две капли в каждый носовой ход.

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии, кардиологии, а также хирургии и травматологии, а именно лекарственным средствам, обладающим цитопротекторной активностью в условиях ишемии-реперфузии, хронического окислительного стресса и химической интоксикации.

Изобретение относится к медицине - консервированию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека. Проводят вскрытие флакона криопротектора в ламинарном боксе, заправку криопротектора в специальный шприц шприцевого насоса, введение ограждающего раствора криопротектора - 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40 при температуре +4°C во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками в криопакете с концентратом и одновременное механическое перемешивание в аппарате для перемешивания, перенос системы вместе с флаконом криопротектора в ламинарный бокс, выпуск воздуха из криопакета и части взвеси, запайку и помещение его в термоусадочный пакет и осуществление программного многоэтапного замораживания, на первом этапе которого смесь взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания - выдерживают 10 мин при температуре +4°C, на втором этапе охлаждают со скоростью 1°C/мин до температуры -12°C, на третьем этапе охлаждают со скоростью 20°C/мин до температуры -60°C, на четвертом этапе нагревают образец со скоростью 10°C/мин до температуры -18°C, на пятом этапе охлаждают образец со скоростью 1°C/мин до -60°C и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью 3°C/мин до температуры -100°C, после замораживания образец помещают в карантинный дьюар с жидким азотом, до определения результатов тестов на инфекционные агенты и бактериологическую грибковую контаминацию.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкоурологии, и может быть использовано при консервативном лечении больных злокачественной опухолью предстательной железы на разных ее стадиях.

Изобретение относится к медицине, а именно к бальнеологии. Бальнеологическое средство для лечения и профилактики различных заболеваний получено путем постепенного и последовательного перемешивания при комнатной температуре желтой глины, рапы из озера Большой Тамбукан, эфирного масла шалфея, диметилсульфоксида в определенном соотношении.

Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной трансплантологии, и может быть использовано при изготовлении матриксов и тканеинженерных конструкций. Для получения тканеспецифического матрикса выполняют перфузионную отмывку паренхиматозного органа и его децеллюляризацию.

Данное изобретение относится к новым гетероциклическим соединениям, содержащим пятичленные кольца, конденсированные с другими ядрами, только с одним атомом кислорода в качестве гетероатома, а именно к производным N-((1S)-1′,2′,3′-триметокси-6,7-дигидро-1H-бензо[5′,6′:5,4]циклогепта[3,2-f]бензофуран-1-ил)ацетамида общей формулы 1, где R - заместитель, R=Ph, пиридин-2-ил, CH2OH, CH(CH3)OH, CH2CH2OH, CH2OAc, (CH2)8CO2Me или CH2N(CH2CH3)2, а также к их применению в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства.
Изобретение относится для стерилизации материалов, в частности к химическим средствам борьбы с микроорганизмами. Задачей изобретения является расширение сырьевых ресурсов для бактерицидных материалов.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и касается применения соединений, представляющих собой бензилиденфураноновые производные (+)-усниновой кислоты формулы 6-13 в качестве противоопухолевых агентов.

Изобретение относится к медицине, гигиене питания, а именно к способу создания продукта спортивного питания, предназначенного для определения эффективных доз натуральных витаминов и минеральных веществ с целью восполнения их физиологических потребностей в организме высококвалифицированных спортсменов.

Средство для стимуляции синтеза substantia Nissl в мотонейронах спинного мозга и роста отростков мотонейронов спинного мозга и способ стимуляции синтеза substantia Nissl в мотонейронах спинного мозга и роста отростков мотонейронов спинного мозга.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к психиатрии, и может быть использована для лечения или профилактики расстройств, выбранных из группы, состоящей из депрессивных аффективных и тревожных расстройств, в частности большого депрессивного расстройства.

Настоящее изобретение касается новых эффективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии в классе амидопроизводных хлорина е6. Предложенный фотосенсибилизатор 15-метиловый эфир 13,17-бис(N,N-диэтиламиноэтиламид)хлорина е6 селективно накапливается в опухолевой ткани, обладает поглощением в красной области спектра и высокой фотоиндуцированной противоопухолевой активностью, 100% торможением роста опухоли и излеченностью животных до 100%.
Наверх