Применение фосфолипид-содержащей композиции для удаления подкожных скоплений жира посредством подкожного липолиза
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изготовления лекарственного средства для удаления подкожных скоплений жира. Для этого осуществляют применение композиции, включающей: по меньшей мере один фосфолипид, по меньшей мере одну глицирризиновую кислоту или соль глицирризиновой кислоты, и в которой общее содержание фосфолипидов и глицирризиновой кислоты или ее солей составляет 2-80 мас.% и соотношение между фосфолипидами и глицирризиновой кислотой или ее солями по весу составляет от 30:1 до 0,5:1. При этом композиция дополнительно может содержать вспомогательные вещества. В качестве фосфолипида композиция содержит фосфатидилхолин животного или растительного происхождения. Композиция также может содержать глицирризиновую кислоту либо калиевую, натриевую, аммониевую или магниевую соль глицирризиновой кислоты. В качестве вспомогательного вещества композиция содержит сахар, в частности глюкозу, или мальтозу, и/или их производные, маннитол, сорбитол или лактозу. Композиция содержит фосфатидилхолин в общем количестве от 15 до 98 мас.%, предпочтительно от 30 до 98 мас.%, более предпочтительно от 50 до 98 мас.%, особенно предпочтительно от 75 до 98 мас.% и наиболее предпочтительно от 75 до 90 мас.% от общего содержания фосфолипидов. Композиция используется в сухом виде, предпочтительно в виде лиофилизата, полученного при замораживании-высушивании, или в виде раствора. Композиция может содержать физиологически подходящие растворители, включая воду, физиологический раствор, раствор глюкозы, такие одноатомные спирты, как этанол, 2-пропанол, н-пропанол, такие многоатомные спирты, как глицерин и/или пропандиол, такие полигликоли, как полиэтиленгликоль и/или Miglyol, глицерин, формал, диметилизосорбитол, натуральные и синтетические масла и/или эфиры. Заболевания подкожной жировой ткани, в частности, могут быть связанны с местным нарушением распределения жира. Используются также для разложения и уменьшения опухолей жировой ткани. Лекарство имеет вид крема, мази, геля, гидрогеля, лосьона, пасты, порошка или раствора. При этом нежелательными нарушениями распределения жира, имеющими эстетический характер или патологическую природу, являются жировой отек, липомы, липоматоз живота, целлюлит, псевдогинекомастия, "бычий горб" у ВИЧ-пациентов, панникулит или неспецифические подкожные отложения жира. Введение препарата осуществляется путем подкожной, внутрибрюшинной, внутримышечной или внутривенной инъекции. Для введения применяется метод, выбранный из группы, состоящей из ионофореза, электропорации и фонофореза. Описанное изобретение успешно используется для указанных целей. 16 з.п. ф-лы, 11 пр., 7 табл., 11 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение касается применения композиции на основе фосфолипидов и по меньшей мере одной глицирризиновой кислоты или соли глицирризиновой кислоты и ее применяемых в медицине форм для лечения подкожных жировых отложений при различных фенотипах, таких как нарушения подкожного распределения жира, и для уменьшения устойчивых к диете скоплений жира.
Уровень техники
До сих пор в данной области применялись хирургические способы для лечения подкожного скопления жира или аномального роста жировых клеток типа липомы или жирового отека. Такое лечение приводит к известным осложнениям или рискам в связи с анестезией, местными реакциями и возможными инфекциями. Зачастую в таких случаях пациенты вынуждены оставаться в стационаре. Чтобы избежать таких операций, нужно искать нехирургические альтернативы для удаления подкожных скоплений жира.
Уже разработаны различные фосфолипидные соединения, которые вводятся пациентам путем инъекции. Водные препараты, содержащие по меньшей мере один фосфолипид, известны для различных применений. Эти системы применятся, к примеру, в косметике или при производстве фармацевтических препаратов. Зачастую такие системы образуют мицеллы или липосомы, содержащие внутри себя водную фазу.
В US 2005/143347 A1 и связанном с ним по приоритету документе DE 10361067 A1 раскрыта водная композиция, содержащая по меньшей мере один фосфолипид и/или по меньшей мере одну желчную кислоту и компонент, поддерживающий разложение жира типа рибофлавина и воды, которая пригодна для изготовления лекарств для удаления подкожных скоплений жира и для уменьшения жировых тел. При этом в качестве коммерчески доступных препаратов указаны Essentiale® N i.v. (Red List, March 2003)HLipostabil® Ni.v.
Essentiale® N i.v. описан в EP 0615746 A1 как водный препарат, содержащий фосфолипиды из соевых бобов, желчную кислоту, рибофлавин, α-токоферол, этанол и воду. Композиция обрабатывается в мицеллярной системе, при этом мицеллы имеют диаметр от 30 нм до 100 нм. В EP 0615746 A1 не описано применение глицирризиновой кислоты. Этот препарат вводится внутривенно, в частности, для лечения жирового перерождения печени, которое представляет собой чрезмерное содержание жира в паренхиме печени (жировые отложения в виде капель).
В DE 10361067 A1 раскрыта водная лекарственная форма препарата Essentiale® N i.v., содержащая по меньшей мере один фосфолипид и/или по меньшей мере одну желчную кислоту и компонент, поддерживающий разложение жира, а также воду для изготовления лекарств для удаления подкожного скопления жира. При этом также в препарат не добавляется глицирризиновая кислота.
Lipostabil® N i.v. содержит фосфолипиды из соевых бобов, DL-α-токоферол, 7-дезоксихолевую кислоту, спирты, другие вспомогательные вещества и воду. Однако активная субстанция композиции этого соединения не содержит глицирризиновую кислоту. При подкожном введении Lipostabil® N i.v. удаляются скопления жира, которые появляются под глазами, на животе или бедрах у людей с избыточным весом.
Есть и другие препараты на основе фосфолипидов, которые применяются при подкожном введении с целью липолиза скоплений жира, которые описаны в WO 2008/113421, DE 102007015701, US 2005/143347 A1 и US 2005/0089555 A1.
Недостатки вышеприведенных препаратов предшествующего уровня техники для подкожного липолиза включают, среди прочего, отеки, гематомы (синяки), боли в зоне обработки и дискомфорт типа жжения и зуда в месте инъекции после обработки, но в особенности гибель клеток при повреждении клеточной структуры и целостности мембран (некроз клеток).
Раскрытие изобретения
При поиске активных соединений для нехирургического удаления подкожных скоплений жира, лишенных указанных выше недостатков, неожиданно оказалось, что композиция, раскрытая в RU 2133122 C1 для внутривенного и перорального лечения острых и хронических заболеваний печени, а также нарушения метаболизма липидов при атеросклерозе и сопутствующих заболеваниях, пригодна для подкожного липолиза, также называемого адипоцитолизом.
При применении в соответствии с настоящим изобретением этой композиции, содержащей по меньшей мере один фосфолипид, предпочтительно фосфатидилхолин, и одну глицирризиновую кислоту или ее соль, ранее описанные недостатки предыдущих препаратов, применявшихся для подкожного липолиза, уменьшаются и/или полностью устраняются.
Особенное преимущество применения заявленной композиции для подкожного липолиза скоплений жира по настоящему изобретению состоит в значительном уменьшении вплоть до полного предотвращения повреждений клеточной структуры и целостности мембран клеток жировой ткани (адипоцитов). При лечении по изобретению подкожных нарушений жировой ткани с помощью заявленной композиции значительно уменьшается или полностью предотвращается возникновение некроза.
При применении по изобретению отложения жира в основной массе жировых тканей при лечении разлагаются посредством липолиза, не вызывая разрушения клеточной мембраны.
Наблюдается значительно меньше побочных эффектов вплоть до полного отсутствия жалоб на отеки, покраснение, жжение, зуд и боли вообще и гиперчувствительности.
Композиция, применяемая по изобретению, включает в качестве основных компонентов один фосфолипид, глицирризиновую кислоту или ее соль и, при необходимости, по меньшей мере еще одно вспомогательное вещество.
Глицирризиновая кислота, которую получают из экстрактов растений рода Glycyrrhiza - солодки (напр., Glycyrrhiza glabra), или ее соли, в частности глицирризинат натрия или аммония, описаны на предыдущем уровне техники как усилители всасывания для транспорта, напр., пептидных гормонов через слизистые оболочки, в EP 0327756 A. Также в US 5238917 A описано усиление всасывания полипептидов глицирризиновой кислотой в трансвагинальных препаратах.
Кроме того, глицирризиновая кислота известна как антибактериальное и противовоспалительное средство и как эмульгатор на предшествующем уровне техники из US 2004-076652 A, US 2009-169588 A, US 2007-053852 A, WO 08/046791 A, WO 08/046795 A, WO 05/037239 A, EP 1676561 A и JP 2006/137 670.
Специфическая функция глицирризиновой кислоты в транспорте молекул через клеточную мембрану подтверждает особенное преимущество быстрого способа действия при применении по изобретению заявленной композиции. Благодаря глицирризиновой кислоте фосфолипид может проникать в клетки жировой ткани подкожного слоя особенно хорошо и быстро, при этом вышеприведенные недостатки типа некроза уменьшаются или совсем не встречаются. Описанные отеки, гематомы, боли и дискомфорт после применения препаратов предшествующего уровня техники, в частности тех, что включают желчные кислоты или их соли, смягчаются или совсем не встречаются в комбинации с глицирризиновой кислотой. Такое улучшение переносимости поддерживается противовоспалительными и антибактериальными свойствами глицирризиновой кислоты.
Следовательно, настоящее изобретение характеризуется тем, что заявленная комбинация из по меньшей мере одного фосфолипида, предпочтительно фосфатидилхолина, и одной глицирризиновой кислоты или ее соли, проявляет гораздо меньше или вообще не проявляет цитотоксических эффектов и лучше переносится по сравнению с композициями препаратов Essentiale® и Lipostabil® из предшествующего уровня техники.
Изобретение касается применения композиции, включающей:
a) по меньшей мере один фосфолипид;
b) по меньшей мере одну глицирризиновую кислоту или
c) соль глицирризиновой кислоты; и
d) необязательно вспомогательные вещества; при этом:
- общее содержание фосфолипидов и глицирризиновой кислоты или ее солей составляет 2-80 мас.% и
- соотношение между фосфолипидами и глицирризиновой кислотой или ее солями по весу составляет от 30:1 до 0,5:1,
для изготовления лекарственного средства для удаления подкожных скоплений жира.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат фосфатидилхолин в качестве фосфолипида.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат фосфатадилхолин животного или растительного происхождения.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат натриевую, калиевую, аммониевую или магниевую соль или другие подходящие соли глицирризиновой кислоты.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат в качестве потенциального наполнителя сахар, в частности мальтозу и/или ее производные, сорбитол или лактозу.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат фосфатидилхолин в общем количестве от 15 до 98 мас.%, предпочтительно от 30 до 98 мас.%, более предпочтительно от 50 до 98 мас.%, особенно предпочтительно от 75 до 90 мас.% и наиболее предпочтительно от 75 до 98 мас.%
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые растворяются в сухом виде в подходящем растворителе.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые применяются в сухом виде, предпочтительно в виде лиофилизата, полученного при замораживании-высушивании.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые применяются в виде раствора.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые содержат физиологически подходящие растворители, включая воду, физиологический солевой раствор, раствор глюкозы, такие одноатомные спирты, как этанол, 2-пропанол, н-пропанол, такие многоатомные спирты, как глицерин и/или пропандиол, такие полигликоли, как полиэтиленгликоль и/или Miglyol, глицерин, формал, диметилизосорбитол, натуральные и синтетические масла и/или эфиры.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые применяются для изготовления лекарств для лечения подкожных скоплений жира, заболеваний подкожной жировой ткани, в частности, связанных с местным нарушением распределения жира.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которые применяются для изготовления лекарств для разложения и уменьшения (регрессии) опухолей жировой ткани.
Препараты по изобретению применяются в виде кремов, мазей, гелей, гидрогелей, лосьонов, паст, лиофилизатов и растворов. Предпочтительной лекарственной формой является водная в виде различных растворов.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, при этом нежелательными нарушениями распределения жира, имеющими эстетический характер или патологическую природу, являются жировой отек, липомы, липоматоз живота, целлюлит (cellulite, деформация подкожной клетчатки), псевдогинекомастия, "бычий горб" у ВИЧ-пациентов, панникулит (cellulitis, гнойное воспаление подкожной клетчатки) или неспецифические подкожные отложения жира.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которое отличается тем, что препарат вводится путем подкожной, внутрибрюшинной, внутримышечной или внутривенной инъекции.
Изобретение также касается применения препаратов, содержащих вышеуказанную композицию, которое отличается тем, что для введения применяется метод, выбранный из группы, состоящей из ионофореза, электропорации, микропорации и фонофореза.
Следующим объектом изобретения является применение композиции для изготовления лекарств для лечения жировой ткани в подкожном слое (нижнем слое дермиса), в частности, при местном нарушении распределения жира.
Следующим объектом изобретения является применение композиции для изготовления лекарств для регрессии и инволюции опухолей жировой ткани.
Следующим объектом изобретения является применение композиции для изготовления лекарств для лечения нежелательных нарушений распределения жира эстетического характера или патологической природы, к примеру, жировых отеков, липомы, липоматоза живота, целлюлита (cellulite, деформация подкожной клетчатки), псевдогинекомастии, "бычьего горба" у ВИЧ-пациентов, панникулита (cellulitis, гнойное воспаление подкожной клетчатки) или неспецифических подкожных жировых отложений.
При применении композиции по изобретению можно избежать вышеуказанных рисков и побочных эффектов хирургического лечения или подкожного лечения препаратами предшествующего уровня техники, в частности содержащими дезоксихолевую кислоту и ее соли. Кроме того, амбулаторное лечение является более удобным для пациентов и менее дорогостоящим по сравнению с хирургическим лечением.
Вышеописанная высокая терапевтическая эффективность, о которой свидетельствует быстрое разложение жировой ткани под действием композиции, связана с синергическим эффектом взаимодействия комбинации по изобретению из одного фосфолипида и/или одной глициризиновой кислоты или ее соли. Применение по настоящему изобретению заявленной композиции отличается значительным снижением побочных эффектов или частично отсутствием некоторых из ранее описанных побочных эффектов.
Осуществление изобретения
Нарушения подкожного распределения жира - это изменения, возникающие в жировой ткани организма человека и млекопитающих как запасы жира генетической или диетической природы в виде локализованных отложений жира, которые могут рассматриваться как эстетически раздражающие критические зоны, в частности живот, ягодицы, бедра, колени, голени, ляжки, плечи, подбородок, щеки. При этом можно иметь дело с доброкачественным ростом жировых клеток типа липомы (дистопическая пролиферация).
Заболевания жировой ткани в контексте настоящего изобретения включают, к примеру, следующие заболевания: липома (опухоли жировой ткани), которая представляет собой доброкачественные, медленно растущие, обычно сферические, возможно стебельковые (=L.pendulum) или даже ветвистые (=L.arborescens, как-то синовиальные) мезенхимные опухоли из увеличенных клеток жировой ткани, предпочтительно в подкожной ткани, возможно оссифицированные в центре (=L.ossificans), заложенные мокротой (=L.myxomatodes) или кальцинированные (=L.petrificans), а также с усиленным образованием соединительной ткани и капсул (=L.fibrosum), образованием кровеносных сосудов (=L.telangiectodes), редко со злокачественным перерождением (=L.sarcomatodes, липосаркома). Их можно классифицировать как патологические, потому что они растут и их соединительнотканная оболочка сама по себе может быть болезненной, а пережатие ими кровеносных сосудов может вызывать нервные боли. Сюда же относится множественный липоматоз, который приводит к возникновению скоплений липом у пациентов.
Болезнь Деркума, которую называют болезненным липоматозом, представляет собой особую формой гипертрофированной пролиферации жировой ткани, которая находится между фасцией кожного жира (жировая фасция Кампа) и нижней частью дермиса. Действие гормонов приводит к повышению водосвязывающей способности у таких жировых клеток, что, в свою очередь, под действием давления вызывает закупорку лимфатического тракта в районе отхождения дендритообразных лимфатических сосудов, тем самым оказывая дополнительное сжатие и раздражающее действие на периферические чувствительные нервы, поэтому у таких пациентов возникает чрезвычайно болезненная чувствительность к прикосновению. На протяжении нескольких лет или десятилетий образуются жировые узелки неправильной формы, которые местами заходят под кожу, которая становится тоньше вследствие старения, при этом местами возникает болезненность и сильная дизестезия.
Диффузный липоматоз шеи Маделунга (синдром Lanois-Bensaude) представляет собой пролиферативное воспаление жировой ткани, которое наряду с образованием дистрофической опухоли жировой ткани также вызывает рубцовое сжатие соединительной ткани в подкожном пространстве. В таких случаях хирургические процедуры только частично бывают успешными, поскольку в этом процессе задействованы важные анатомические структуры и заболевания в основном проявляется в районе головы, шеи и плеч.
Жировой отек представляет собой болезненное опухание жировой ткани, которое возникает особенно в нижней части ног у женщин и прогрессирует с возрастом.
Регрессия липолиза означает гидролитическое расщепление жировой ткани и инволюцию путем мобилизации накопившегося жира.
Ксантелазма представляет собой желтоватое скопление жира под глазами.
У ВИЧ-пациентов часто бывают нарушения отложения жира в тканях, которые возникают из-за существующих лекарств, как-то "бычий горб" или "бычья шея" у этой группы пациентов. Пациенты с ослабленным иммунитетом вообще не должны подвергаться хирургическим операциям, так что у них остаются жировые отложения, которые становятся для них клеймом.
При вышеуказанных заболеваниях жировой ткани, в отличие от связанной с питанием липогипертрофии (которая тоже приводит к отложению жира в смысле нарушения распределения жира), проявляются отчетливые патологические изменения тканей или образования, которые характеризуются гистологическими параметрами рубцевания и воспаления, а также инкапсуляцией соединительных тканей и изменениями самой гистологической морфологии жировой ткани.
Следующим объектом изобретения является применение композиции для изготовления лекарств для лечения целлюлита. Целлюлит является специфической формой гипертрофической пролиферации жировой ткани, находящейся между фасцией кожного жира (жировая фасция Кампа) и нижней частью дермиса. Действие гормонов приводит к повышению водосвязывающей способности у таких жировых клеток, что, в свою очередь, под действием давления вызывает закупорку лимфатического тракта в районе отхождения дендритообразных лимфатических сосудов. На протяжении нескольких лет или десятков лет образуются жировые узелки неправильной формы, которые местами заходят под кожу, которая становится тоньше вследствие старения, при этом местами возникает болезненность и сильная дизестезия.
Следующим объектом изобретения является применение композиции для изготовления лекарств для лечения псевдогенекомастии и липомастии. Псевдогинекомастия представляет собой накопление жира у мужчин вокруг сосков на груди, что приводит к увеличению груди и проявляется прежде всего эстетически. Липомастия является одной из форм псевдогинекомастии без увеличения тела молочных желез.
Фосфолипиды, которые содержатся в описанной здесь фармацевтической композиции, могут быть получены из любых животных или растительных продуктов, в частности из куриных яиц, масличных семян и фруктов, таких как сушеный кокос, пальмовые семена, арахис, семена рапса, семена подсолнечника, льняного, пальмового и/или оливкового масла. Больше всего подходят фосфолипиды, получаемые из соевых бобов согласно процедурам, описанным в EP 0054770 B1 и EP 0054769 B1.
Этот фосфолипид подвергается хорошей очистке и содержит от 15 до 98 мас.%, предпочтительно от 30 до 98%, более предпочтительно от 50 до 98%, особенно предпочтительно от 75 до 98% и наиболее предпочтительно от 75 до 90 мас.% фосфатидилхолина. Такие высокоочищенные фосфолипиды могут содержать и другие компоненты фосфолипидов, в частности до 15 мас.%, более предпочтительно до 12% фосфатидилэтаноламина, до 8% фосфатидной кислоты, до 10% фосфатидилинозитола, до 6% лизофосфатидилхолина или лизофосфатидилэтаноламина, следовые количества фосфатидилсерина, а также другие липиды в небольших количествах.
Изобретение также касается применения одной глицирризиновой кислоты или нескольких глицирризиновых кислот, при этом глицирризиновая кислота находится в виде физиологически приемлемой соли. В качестве солей глицирризиновой кислоты применяются физиологически приемлемые соли, в частности моно-, ди- или тринатриевые соли либо калиевые соли, соли магния или аммония. Предпочтительны моно-, ди- или тринатриевые соли либо калиевые соли и соли аммония, более предпочтительны моно-, ди- или тринатриевые соли либо калиевые соли.
Отношение масс фосфолипида и глицирризиновой кислоты составляет от 30:1 до 0,5:1, предпочтительно от 15:1 до 0,5:1, более предпочтительно от 4:1 до 1:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 2:1.
Концентрация фосфолипидов в композиции составляет от 0,5% до 30 мас.%, предпочтительно от 5% до 25 мас.%
Рекомендуется, чтобы общее содержание фосфолипидов и глицерризиновой кислоты или ее соли составляло 2-80 мас.% При этом весовое соотношение между фосфолипидами и глицерризиновой кислотой или ее солью предпочтительно составляет 3:1 или 4:1. При весовом соотношении между фосфолипидами и глицерризиновой кислотой или ее солью от 2:1 до 3:1 предпочтительно содержание фосфолипидов и глицерризиновой кислоты или ее соли составляет 2-45 мас.%
Значение pH медицинских препаратов находится в пределах от pH 6,0 до pH 9,0, предпочтительно от рН 7,5 до pH 8,5, более предпочтительно от pH 6,5 до рН 7,5 и в особенности от pH 6,5 до pH 7,0.
При необходимости добавляются подходящие вспомогательные вещества. В качестве фармакологически приемлемых вспомогательных веществ служат сахара, в частности мальтоза, глюкоза, лактоза, сорбитол и маннитол и их производные, коллоидная кремниевая кислота и ее производные, силикагель, тальк, лактоза, крахмал, желатин, вода, спирты с одной или несколькими гидроксильными группами, в частности этанол, глицерин и пропиленгликоль, натуральные или синтетические масла, в частности минеральное масло, вазелиновое масло, арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло и эфиры. Кроме того, подходящими вспомогательными веществами являются целлюлоза, сахароза, солод, рис, фтор, кальций, стеарат магния, стерат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия и сухое обезжиренное молоко. Предпочтительными вспомогательными веществами, особенно для подкожного липолиза, являются вода, спирт, в частности этанол, физиологический раствор, мальтоза и водная декстроза.
Описанная здесь фармацевтическая композиция может применяться в сухом или жидком виде.
Жидкие формы включают капли, растворы, суспензии, эмульсии, суспензии для инъекций или эмульсии для инъекций и липосомно-мицеллярные системы, а также липосомно-мицеллярно-водные системы.
Предпочтительными являются жидкие препараты в виде растворов, суспензий, эмульсий, суспензий для инъекций или эмульсий для инъекций. В частности, предпочтительными являются суспензии для инъекций или эмульсии для инъекций.
В частности, для инъекций удобно применять такие жидкие препараты, как растворы, суспензии, эмульсии, суспензии для инъекций или эмульсии для инъекций из указанных выше ингредиентов, вспомогательных веществ или твердых веществ, которые немедленно становятся жидкими после добавления воды, другого растворителя или подходящего буфера типа трис-буфера. Предпочтительно в качестве основы для получения жидкого препарата применяются лиофилизаты.
При применении описанных здесь фармацевтических препаратов для инъекций рекомендуется использовать подходящий растворитель, не обладающий нежелательными побочными эффектами, напр., воду, физраствор, глюкозу, такие одноатомные спирты, как этанол, 2-пропанол, н-пропанол, такие многоатомные спирты, как глицерин и/или пропандиол, такие полигликоли, как полиэтиленгликоль и/или Miglyol, глицерин, формал, диметилизосорбитол, натуральные и синтетические масла и/или эфиры, каждый по отдельности или в комбинации, тогда как для инъекций рекомендуется применять липосомно-мицеллярные системы.
Остающийся после концентрирования объем спиртов должен составлять от 0% до 20 об.%, предпочтительно от 0% до 10 об.%.
Наиболее подходящей формой применения описанного здесь препарата является смесь активных субстанций, содержащая один фосфолипид и глицирризиновую кислоту или ее соль в виде липосомно-мицеллярно-водной системы. Такая липосомно-мицеллярно-водная система, предназначенная для инъекций, предпочтительно имеет значение pH от 6,0 до 7,5.
Сухие формы описанного здесь фармацевтического препарата включают лиофилизаты, таблетки, в частности покрытые оболочкой таблетки и пилюли, порошки, капсулы, гранулы и драже. Предпочтительными являются лиофилизаты.
Если композиция выпускается в виде лиофилизата, то добавление воды или трис-буфера приводит к образованию водно-липосомной системы, которую может применяться для введения.
Водно-липосомные системы также подвергаются стерилизации фильтрованием и содержат липосомы и мицеллы в высокой концентрации с относительно небольшим размером частиц от 30 нм до 180 нм, предпочтительно от 30 до 130 нм, особенно предпочтительно от 30 до 90 нм. Эти липосомы можно подвергать стерилизации фильтрованием с помощью фильтра с диаметром пор 0,2 мкм.
Описанный здесь препарат, который получают в виде водного раствора, предпочтительно в виде липосомно-мицеллярной системы, обладающей высокой прозрачностью, имеет очень длительный срок хранения и может подвергаться стерилизации фильтрованием. Система может быть высушена, к примеру, путем лиофилизации, при этом получается стабильная лиофилизированная смесь.
Если описанный здесь фармацевтический препарат применяется в виде раствора для инъекций, то особенно рекомендуется применение таких комбинаций активных субстанций, которые содержат фосфолипиды и тринатриевую соль глицирризиновой кислоты в весовом соотношении между фосфатидилхолином и тринатриевой солью глицирризиновой кислоты от 1:1 до 4:1, предпочтительно от 2:1 до 3:1.
Производство препаратов изобретения осуществляется, к примеру, растворением или диспергированием по меньшей мере одного фосфолипида и по меньшей мере одной глицирризиновой кислоты в указанном выше соотношении друг к другу в подходящем растворителе. После этого раствор или дисперсию концентрируют, а затем добавляют воду.
Способы изготовления препаратов также описаны в Европейских патентных заявках EP 0470437 A и EP 0615746 A.
При необходимости в препараты, применяемые согласно изобретению, можно добавлять соответствующие антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, кислый сульфит натрия или пиросульфит натрия, альфа-токоферол, такие консерванты, как бензиловый спирт или n-гидроксибензоаты или суспендирующие средства типа натриевой карбоксиметилцеллюлозы.
Препараты также могут необязательно содержать коллоидные структуры типа мицелл или смешанных мицелл. Эти структуры имеют диаметр частиц от 10 до 500 A. Они состоят из глицирризиновой кислоты и фосфолипида. Соотношение масс между глицирризиновой кислотой и фосфолипидом составляет от 0,1:2 до 2:1, предпочтительно 1:2. Концентрация фосфолипида в коллоидных структурах в лекарственном препарате составляет от 5% до 15%, предпочтительно 10 мас.% Получение коллоидных структур осуществляется, к примеру, растворением глицирризиновой кислоты в воде, при этом раствор становится слегка щелочным. Затем в нем диспергируют фосфолипид. A в конце его фильтруют.
Введение препарата, применяемого согласно изобретению, и соответствующих дозовых форм осуществляется подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно или внутривенно. Предпочтительным является подкожное введение.
Кроме того, заявлено и чрескожное введение в различных средах-носителях и с помощью различных приборов типа ионофореза.
Равномерное введение препаратов и дозовых форм, применяемых согласно изобретению, в некоторых случаях может осуществляться и методом возбуждения (tumescence), в котором для того, чтобы обеспечить равномерное распределение, используется гидростатическое давление.
Кроме того, становится возможным чрескожное введение, которое может осуществляться в различных средах-носителях, таких как кремы, мази, гели, гидрогели, лосьоны или пасты, и с помощью различных приборов, в частности ионофореза, микропорации, электропорации или фонофореза.
Подходящими препаратами и дозовыми формами являются, напр., суспензии, эмульсии или растворы для инъекций, а также препараты с пролонгированным высвобождением активной субстанции, при изготовлении которых используются обычные инструменты. Препараты также могут иметь вид концентрата, сухого вещества или лиофилизата, к примеру, для повышения стабильности.
Предпочтительно фармацевтические препараты производятся и вводятся в дозовых единицах, при этом каждая единица в качестве действующего начала содержит определенную дозу препарата. Для растворов для инъекций в ампулах эта доза может составлять на 1 мл от 10 мг до 2000 мг, предпочтительно от 50 мг до 2000 мг, более предпочтительно от 250 мг до 500 мг в пересчете на фосфолипид.
Для лечения взрослых пациентов, в зависимости от размера подлежащей лечению жировой ткани, при введении растворов для инъекций необходимы суточные дозы в пересчете на фосфолипид от 5 мг до 2500 мг, предпочтительно от 250 мг до 2500 мг на курс инъекций из макс. 200 инъекций. Растворы для инъекций можно еще больше разводить перед введением, предпочтительно с помощью физраствора. В некоторых случаях, однако, могут потребоваться большие или меньшие суточные дозы. Доза также зависит от размера скоплений жира, для небольших липом вполне достаточно от 125 мг до 500 мг, предпочтительно от 250 мг до 500 мг на липому в пересчете на фосфолипид.
Введение суточной дозы может осуществляться либо в виде однократного введения, либо в виде нескольких более мелких дозовых единиц, а также путем многократного введения дробных доз через определенные промежутки времени.
Изобретение раскрывается более подробно на примерах.
Примеры
Пример 1. Приготовление раствора для подкожных инъекций
Раствор: 0,2 г (8%) тринатриевой соли глицирризиновой кислоты, 1,8 г (72%) мальтозы и 4,5 мл воды тщательно смешивали с дисперсией 0,5 г (20%) фосфолипида из сои и 0,5 мл (20%) 96%-го этанола в атмосфере инертного газа.
Общее содержание фосфолипида и соли глицирризиновой кислоты составило 28%. Соотношение между фосфолипидом и солью глицирризиновой кислоты составило 2,5:1.
Эмульсию диспергировали путем обработки ультразвуком (дезинтегратор MSE Soniprep 150, Англия) при 4°C в течение 30 с с перерывом в одну минуту. Примерно через 10 мин образовывалась суспензия липосом.
Суспензию липосом фильтровали через фильтр на 0,2 мкм, а затем подвергали лиофилизации.
Суспензию липосом (5,0 мл) подвергали замораживанию-высушиванию в течение 5 часов (лиофилизировали). При этом получали около 2,5 г рыхлого, слегка желтоватого порошка.
Для получения раствора для подкожных инъекций по 2,5 г препарата в ампулах растворяли в 9,0 мл растворителя (воды или трис-буфера).
Пример 2. Получение липосомно-водной системы для подкожного применения
Готовили раствор из 50 г очищенного фосфолипида из сои (82,5% фосфолипида+3,5% фосфатидилхолина, до 10% фосфатидилэтаноламина, 0,6% лизофосфатидилхолина и максимум 10% других липидов) и 0,25 г натриевой соли фосфатидилглицерина в 250 мл этанола. Полученный раствор упаривали под вакуумом.
Полученную смесь фосфолипидов (ок. 20%) диспергировали в потоке инертного газа смешиванием с 500 мл воды, которая уже содержала 20,0 г (7,99%) тринатриевой соли глицирризиновой кислоты и 180,0 г (71,92%) изомальтозы.
Общее содержание фосфолипида и соли глицирризиновой кислоты составляло 28,07%. Соотношение между фосфолипидом и солью глицирризиновой кислоты было 2,5:1.
Эту дисперсию пять раз подвергали гомогенизации при высоком давлении в 600 бар. Полученную липосомную систему фильтровали через фильтр на 0,2 мкм и заполняли в ампулы по 10,0 мл в атмосфере инертного газа. Продукт имел следующие характеристики:
внешний вид: прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость,
значение pH: 6,5,
прозрачность (660 нм): 85%,
средний размер частиц (лазерное светорассеяние): 75 нм,
стерильность: в соответствии с требованиями,
микроскопические свойства (криофиксация): в основном однослойные липосомы размером 30-90 нм, единичные двуслойные липосомы.
Прозрачность препарата, заполненного в ампулы, тестировали после 2, 6, 9 и 12 месяцев хранения. Не было отличий от исходной прозрачности препарата 1.
Пример 3. Исследование повреждающего мембраны действия фосфатидилхолина на клетках 3T3-L1
Для того чтобы проверить in vitro эффекты фосфатидилхолина на целостность и стабильность мембран, дифференцированные клетки 3T3-L1 инкубировали при различных концентрациях фосфатидилхолина в течение 4 и 24 часов, а затем анализировали методом световой микроскопии.
В качестве модельной системы для исследования использовали клеточную линию преадипоцитов 3T3-L1 мыши. Клетки 3T3-L1 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза (кортикостерон, изобутилметилксантин, индометацин, инсулин) и подвергали дифференцировке еще в течение 8 дней в зрелые адипоциты.
Зрелые адипоциты из клеток 3T3-L1 обрабатывали при различных концентрациях фосфатидилхолина.
Сначала готовили маточный раствор фосфатидилхолина: 500 мг/мл фосфатидилхолина растворяли в 70% этаноле.
Рабочие концентрации фосфатидилхолина: 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл.
На фиг.1а представлены снимки методом световой микроскопии клеток 3T3-L1 после 24-часовой обработки 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл и 20 мг/мл фосфатидилхолина, а на фиг.1b представлены детальные снимки методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) при 63-кратном увеличении клеток 3T3-L1, обработанных фосфатидилхолином. На фиг.1с представлены окрашенные йодидом пропидия (PI) клетки 3T3-L1 после обработки фосфатидилхолином.
Фигура 1а. Фазово-контрастные снимки обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1 в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки
(b) 1 мг/мл фосфатидилхолина через 24 часа
(c) 5 мг/мл фосфатидилхолина через 24 часа
(d) 10 мг/мл фосфатидилхолина через 24 часа
(e) 15 мг/мл фосфатидилхолина через 24 часа
(f) 20 мг/мл фосфатидилхолина через 24 часа.
Отметка масштаба=100 мкм.
Фигура 1b. Фазово-контрастные снимки методом CLSM при 63-кратном увеличении обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1 в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) 1 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа
(c) 5 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа
(d) 10 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа.
Отметка масштаба=20 мкм.
Фигура 1c. Фазово-контрастные (PC) снимки методом CLSM при 63-кратном увеличении обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1 в 2D клеточной культуре после окрашивания PI. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в этаноле
(b) положительный контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки+1% тритона
(c) 5 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа
(d) 10 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа
(e) 15 мг/мл фосфатидилхолина через 4 часа.
После инкубации (4 часа) адипоциты окрашивали с помощью 5 мкг/мл PI и анализировали методом CLSM. В верхнем ряду PI представлены (a-e) флуоресцентные снимки окрашенных PI клеток. В нижнем ряду PC представлены (a-e) соответствующие фазово-контрастные снимки с наложением на них флуоресцентных снимков. Отметка масштаба=20 мкм.
У обработанных фосфатидилхолином клеток (фиг.1а и 1b) не видно никаких морфологических отличий от необработанного контроля. Следовательно, фосфатидилхолин не обладает цитотоксическим действием. Сравнимые концентрации (20 мг/мл) Na-дезоксихолата вызывали явное разрушение клеточной мембраны, чего не было при используемых концентрациях фосфатидилхолина.
То, что фосфатидилхолин не обладает цитотоксическим действием, подтвердилось при окрашивании PI обработанных клеток.
Для этого дифференцированные клетки 3T3-L1 обрабатывали 5 мг/мл, 10 мг/мл и 15 мг/мл фосфатидилхолина в течение 4 часов. После этого в среду на 5 минут добавляли 5 мг/мл PI и анализировали клетки методом CLSM (фиг.1с).
В контроль (фиг.1c, (a)) добавляли этанол с тем, чтобы его концентрация была такой же, как в растворах для обработки клеток. Из фиг 1c (a) видно, что клетки не окрашиваются PI. Следовательно, при используемых концентрациях этанол не обладает цитотоксическим действием.
В положительном контроле с 1% тритона на фиг.1c (b) видны многочисленные клетки, окрашенные PI в красный цвет. Это указывает на повреждение клеточной мембраны. При этом нарушена стабильность мембран и целостность клеток.
Напротив, среди обработанных клеток не видно окрашенных в красный цвет (фиг.1c от (c) до (e)). Следовательно, у этих клеток нет нарушения стабильности и целостности мембран. Следовательно, фосфатидилхолин не оказывает разрушающего действия на дифференцированные клетки 3T3-L1.
Этот результат хорошо согласуется с данными метода световой микроскопии (см. фиг.1а и 1b), при которой также не наблюдалось повреждающего действия фосфатидилхолина на клетки.
Пример 4. Выделение "происходящих из жировой ткани стволовых клеток" (ADSC) из подкожной жировой ткани человека
Для того чтобы приблизиться к клиническому применению, в следующих экспериментах использовали другую модельную систему со стволовыми клетками из мезенхимы человека.
Подкожная жировая ткань человека может служить потенциальным источником зрелых стволовых клеток. Эти так называемые "происходящие из жировой ткани стволовые клетки" (ADSC) являются мультипотентными и при соответствующих стимулах могут подвергаться дифференцировке в различные типы клеток, напр., остеобласты, хондроциты, адипоциты. Выделение ADSCs из подкожной жировой ткани человека, которая удаляется при пластической восстановительной хирургии, представлено схематически на фиг.2.
Сначала жир промывали буфером для удаления гематопоэтических клеток, а затем дробили. Полученные кусочки жировой ткани расщепляли коллагеназой. При центрифугировании расщепленной ткани отделяли стромально-сосудистую фракцию и отбрасывали плавающие зрелые адипоциты. Стромально-сосудистая фракция в осадке состоит из гетерогенной популяции клеток: клеток крови, фибробластов, перицитов, эндотелиальных клеток и преадипоцитов.
Эту популяцию клеток переносили в культуральный сосуд со средой, при этом часть клеток прикреплялась. При добавлении подходящего коктейля, состоящего из инсулина, дексаметазона, индометацина и изобутилметилксантина или состоящего из инсулина, кортизола, троглитазона, трийодтиронина и изобутилметилксантина, клетки подвергались стимуляции для адипогенеза и происходило улучшение адипогенной дифференцировки.
Пример 5. Исследование повреждающего мембраны действия фосфатидилхолина и дезоксихолата натрия на ADSCs
Na-дезоксихолат (Na-DC)
Клетки ADSCs из примера 4 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза (инсулин, кортизол, троглитразон, трийодтиронин и изобутилметилксантин), а затем подвергали дифференцировке еще в течение 21 дня в зрелые адипоциты.
За этим следовала обработка дезоксихолатом натрия. Для этого использовали следующие концентрации: 0,01 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,075 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs. Продолжительность инкубации составляла 4 часа.
Этот диапазон концентраций еще раньше оказался эффективным на 3T3-L1. После инкубации в течение 4 часов дифференцированные обработанные клетки исследовали под световым микроскопом (фиг.3a).
Кроме того, обработанные дезоксихолатом натрия ADSCs исследовали методом CLSM. Дифференцированные, зрелые адипоциты обрабатывали 0,01 мг/мл, 0,05 мг/мл и 0,1 мг/мл дезоксихолата натрия в течение 4 часов. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs. После этого проводили анализ методом микроскопии CLSM при 63-кратном увеличении (фиг.3b).
Дальнейший анализ повреждающего действия дезоксизолата натрия на клетки ADSCs проводили путем окрашивания обработанных клеток PI и последующего анализа методом CLSM. Дифференцированные, зрелые адипоциты обрабатывали 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл дезоксихолата натрия в течение 4 часов. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs.
Затем клетки инкубировали в течение 5 минут в среде, содержащей 5 г/мл йодида пропидия. После этого проводили анализ методом микроскопии CLSM при 63-кратном увеличении (фиг.3c).
Фигура 3a. Снимки методом световой микроскопии дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях дезоксихолата натрия (Na-DC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) 0,01 мг/мл Na-DC через 4 часа
(c) 0,05 мг/мл Na-DC через 4 часа
(d) 0,075 мг/мл Na-DC через 4 часа
(e) 0,1 мг/мл Na-DC через 4 часа
(f) 0,5 мг/мл Na-DC через 4 часа.
Черными стрелками указаны клетки с поврежденной мембраной или фрагменты клеток. Белыми стрелками указаны капельки свободных липидов. Отметка масштаба=100 мкм.
Фигура 3b. Снимки методом CLSM дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях дезоксихолата натрия (Na-DC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) 0,01 мг/мл Na-DC через 4 часа
(c) 0,05 мг/мл Na-DC через 4 часа
(d) 0,1 мг/мл Na-DC через 4 часа.
Черными стрелками указаны клетки с поврежденной мембраной или фрагменты клеток. Белыми стрелками указаны капельки свободных липидов. Отметка масштаба=20 мкм.
Фигура 3c. Снимки методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях дезоксихолата натрия (Na-DC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) положительный контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки+1% тритона
(c) 0,05 мг/мл Na-DC через 4 часа
(d) 0,1 мг/мл Na-DC через 4 часа
(e) 0,5 мг/мл Na-DC через 4 часа.
После инкубации (4 часа) адипоциты окрашивали с помощью 5 мкг/мл PI и анализировали методом CLSM. В верхнем ряду PI представлены (a-e) флуоресцентные снимки окрашенных PI клеток. В нижнем ряду PC представлены (a-e) соответствующие фазово-контрастные снимки с наложением на них флуоресцентных снимков. Отметка масштаба=20 мкм.
Очень низкие концентрации дезоксихолата натрия в 0,01 мг/мл не оказывали влияния на клетки (фиг.3a(b)). Не наблюдалось отличий от контрольной группы (фиг.3a(a)). Адипоциты были живыми и обладали целостной клеточной мембраной. Увеличение концентрации с 0,05 мг/мл уже приводило к небольшому повреждению клеточной мембраны (фиг.3a(c)). Оно усиливалось при следующей более высокой концентрации (фиг.3a(d, е)). Самая высокая доза в 0,5 мг/мл оказывала значительное токсическое действие на клетки (фиг.3a(f)). Адипоциты погибали, клеточная мембрана полностью разрушалась так, что в основном присутствовали только капельки свободных липидов и фрагменты клеток. Действие дезоксихолата натрия на ADSCs не отличалось от его действия на клетки 3T3-L1. Проявлялись идентичные зависимости доза-эффект. В обеих модельных системах при 0,05 мг/мл дезоксихолата натрия возникали разрушающие мембрану эффекты, а концентрация в 0,5 мг/мл оказалась сильно токсической.
При более подробном исследовании обработанных клеток методом конфокальной микроскопии подтверждались сделанные ранее наблюдения. В то время, как низкая концентрация в 0,01 мг/мл дезоксихолата натрия (фиг.3b(b)) не оказывала цитотоксического действия на клетки, концентрация в 0,1 мг/мл (фиг.3b(d)) вызывала сильное повреждение мембраны. Это свидетельствует о явном повреждающем мембраны действии Na-дезоксихолата.
Этот эффект опять же подтверждался при окрашивании клеток ADSCs йодидом пропидия после обработки дезоксихолатом натрия.
В положительном контроле с 1% тритона четко видны клетки, окрашенные PI в красный цвет, что указывает на клетки с поврежденной мембраной (фиг.3c(b)).
После обработки 0,05 мг/мл дезоксихолата натрия окрашенных в красный цвет клеток не было, так что не оказалось клеток с нарушением стабильности и целостности мембран (фиг.3c(c)). После обработки 0,1 мг/мл дезоксихолатом натрия появлялись отдельные окрашенные в красный цвет клетки, так что появилось небольшое количество клеток с нарушением целостности и стабильности мембран (фиг.3d(d)). После обработки 0,5 мг/мл дехзоксихолата натрия выявлялось много четко окрашенных в красный цвет клеток, так что выявлялось много клеток с нарушением целостности и стабильности мембран (фиг.3c(e)).
Это четко свидетельствует о повреждающем мембраны действии дезоксихолата натрия при концентрации в 0,5 мг/мл на ADSCs. Фосфатидилхолин (PC)
Аналогично экспериментам с Na-дезоксихолатом также исследовали фосфатидилхолин на предмет повреждающего мембраны действия.
Для этого, аналогично экспериментам с Na-дезоксихолатом, использовали клетки ADSC из примера 4 и подвергали их дифференцировке с помощью гормонного коктейля (инсулин, кортизол, троглитазон, трийодтиронин и изобутилметилксантин) в зрелые адипоциты.
Затем проводили обработку фосфатидилхолином. Для этого использовали следующие концентрации: 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл и 20 мг/мл. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs. Продолжительность инкубации составляла 4 часа.
Этот диапазон концентраций еще раньше оказался эффективным на 3T3-L1. После инкубации в течение 4 часов дифференцированные обработанные клетки исследовали под световым микроскопом (фиг.4а).
Кроме того, обработанные фосфатидилхолином клетки ADSCs исследовали методом CLSM. Дифференцированные, зрелые адипоциты обрабатывали 1 мг/мл, 5 мг/мл и 15 мг/мл фосфатидилхолина в течение 4 часов. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs. После этого проводили анализ методом микроскопии CLSM при 63-кратном увеличении (фиг.4b).
Дальнейший анализ повреждающего действия фосфатидилхолина на клетки ADSCs проводили путем окрашивания обработанных клеток PI и последующего анализа методом CLSM. Дифференцированные, зрелые адипоциты обрабатывали 5 мг/мл, 10 мг/мл и 15 мг/мл фосфатидилхолина в течение 4 часов. В качестве контроля использовали необработанные ADSCs. Затем клетки инкубировали в течение 5 минут в среде, содержащей 5 г/мл йодида пропидия. После этого проводили анализ методом микроскопии CLSM при 63-кратном увеличении (фиг.4с).
Фигура 4а. Снимки методом световой микроскопии дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях фосфатидилхолина (PC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) 1 мг/мл PC через 4 часа
(c) 5 мг/мл PC через 4 часа
(d) 10 мг/мл PC через 4 часа
(e) 15 мг/мл PC через 4 часа
(f) 20 мг/мл PC через 4 часа.
Отметка масштаба=100 мкм.
Фигура 4b. Снимки методом CLSM дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях фосфатидилхолина (PC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) 1 мг/мл PC через 4 часа
(c) 5 мг/мл PC через 4 часа
(d) 15 мг/мл PC через 4 часа.
Отметка масштаба=20 мкм.
Фигура 4. Снимки методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии дифференцированных клеток ADSC после обработки при различных концентрациях фосфатидилхолина (PC) в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки через 4 часа
(b) положительный контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки+1% тритона
(c) 5 мг/мл PC через 4 часа
(d) 10 мг/мл PC через 4 часа
(e) 15 мг/мл PC через 4 часа.
После инкубации (4 часа) адипоциты окрашивали с помощью 5 мкг/мл PI и анализировали методом CLSM. В верхнем ряду PI представлены (a-e) флуоресцентные снимки окрашенных PI клеток. В нижнем ряду PC представлены (a-e) соответствующие фазово-контрастные снимки с наложением на них флуоресцентных снимков. Отметка масштаба=20 мкм.
В соответствии с наблюдениями на клетках 3T3-L1 (пример 3), на клеточной модели ADSC не было установлено никакого цитотоксического действия фосфатидилхолина (фиг.4а). Независимо от концентрации PC клетки были живыми и не проявляли морфологических изменений.
Для сравнения, уже при концентрации Na-DC в 0,05 мг/мл отмечались повреждения, а при концентрации в 0,5 мг/мл клетки ADSC были мертвыми (фиг.3c).
Исследование клеток ADSC после обработки фосфатидилхолином методом CLSM подтвердило, что в клетках никаких повреждений (4b). В необработанном контроле, также как и в ADSCs, обработанных при 15 мг/мл, проявлялась целостная морфология. Следовательно, фосфатидилхолин не обладает цитотоксическим действием.
Окрашивание PI клеток ADSCs, обработанных фосфатидилхолином, подтвердило, что фосфатидилхолин не оказывает цитотоксического действия in vitro.
В положительном контроле с 1% тритона четко проявлялись красные клетки, окрашенные PI, указывая на клетки с поврежденными мембранами (фиг.4c(b)).
После обработки при 5, 10 и 15 мг/мл фосфатидилхолина и после каждого окрашивания PI не наблюдалось окрашенных в красный цвет клеток, так что клетки с нарушением целостности и стабильности мембран не выявлялись (фиг.4c от (c) до (e)).
Это четко свидетельствует о том, что обработка фосфатидилхолином не оказывает повреждающего мембраны действия на ADSCs.
Напротив, целостность мембран и стабильность ADSCs существенно нарушались Na-дезоксихолатом (фиг.3c(d, e)).
Эксперименты с Na-дезоксихолатом и фосфатидилхолином показали, что цитотоксическим действием обладает только Na-дезоксихолат, но не фосфатидилхолин. Фосфатидилхолин не вызывает повреждения клеточных мембран или клеток. Эти наблюдения подтвердись при помощи нескольких методов, таких как световая микроскопия, окрашивание йодидом пропидия и последующая флуоресцентная микроскопия.
Действие субстанций не изменялось во времени на протяжении исследования: уже 2-часовая инкубация показала те же самые эффекты, что и 24-часовая инкубация. Эксперименты с Na-дезоксихолатом показали, что эта желчная соль дестабилизирует мембраны и вызывает некроз. После оценки требуемых доз in vitro стало ясно, что используемые in vivo количества Na-дезоксихолата могут быть цитотоксическими.
В отношении фосфатидилхолина не было выявлено никаких цитотоксических эффектов in vitro, что должно быть верным и in vivo. Этот фосфолипид не является цитотоксическим.
Пример 6. Исследование комбинации фосфатидилхолина, глицирризината и мальтозы
Исследовали действие новой комбинации субстанций. Эта комбинация состоит из 50 мг/мл фосфатидилхолина (PC), 20 мг/мл тринатриевого глицирризината и 180 мг/мл мальтозы.
Сначала определяли зависимость доза-эффект в отношении повреждения мембран и цитотоксических эффектов, а также проводили тесты на липолитическую активность.
В качестве модельной системы для исследований использовали клеточную линию преадипоцитов мыши 3T3-L1. Клетки 3T3-L1 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза (кортикостерон, изобутилметилксантин, индометацин, инсулин) и подвергали дифференцировке еще в течение 8 дней в зрелые адипоциты.
Зрелые клетки адипоцитов 3T3-L1 инкубировали при различных концентрациях фосфатидилхолина от 0,1 мг/мл до 50 мг/мл. Фосфатидилхолин комбинировали с 2-20 мг/мл глицирризината и 18-180 мг/мл мальтозы.
Инкубацию зрелых 3T3-L1 клеток с комбинацией субстанций проводили в течение 4 часов.
Затем обработанные клетки исследовали методом световой микроскопии при 63-кратном увеличении на предмет дестабилизирующих мембраны и цитотоксических эффектов.
Результаты представлены на фиг.5 и 6.
Фигура 5. Фазово-контрастные снимки методом CLSM обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1 в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки
(b) 5 мг/мл PC+2 мг/мл глицирризината+18 мг/мл мальтозы
(c) 10 мг/мл PC+4 мг/мл глицирризината+36 мг/мл мальтозы
(d) 20 мг/мл PC+8 мг/мл глицирризината+72 мг/мл мальтозы
(e) 30 мг/мл PC+12 мг/мл глицирризината+108 мг/мл мальтозы
(f) 50 мг/мл PC+20 мг/мл глицирризината+180 мг/мл мальтозы.
Отметка масштаба=20 мкм.
Фигура 6. Снимки методом CLSM обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1 в 2D клеточной культуре. Обработка:
(a) отрицательный контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки
(b) положительный контроль=необработанные клетки в среде дифференцировки+1% тритона X
(c) 20 мг/мл PC+8 мг/мл глицирризината+72 мг/мл мальтозы
(d) 30 мг/мл PC+12 мг/мл глицирризината+108 мг/мл мальтозы
(e) 50 мг/мл PC+20 мг/мл глицирризината+180 мг/мл мальтозы.
После инкубации (4 часа) адипоциты окрашивали с помощью 5 мкг/мл PI и анализировали методом CLSM. В левом ряду PI представлены (a-e) флуоресцентные снимки окрашенных PI клеток. В правом ряду PC представлены (a-e) соответствующие фазово-контрастные снимки с наложением на них флуоресцентных снимков. Отметка масштаба=20 мкм.
При обработке адипоцитов комбинацией субстанций они не отличались от контрольных клеток (контроль, фиг.5а). Под световым микроскопом они проявляли такую же морфологию, как и клетки в контроле: они были живые и имели целостную клеточную мембрану. Комбинация субстанций не оказывала заметных повреждающих мембрану эффектов на клетки независимо от концентрации (фиг.5).
Для того чтобы проверить целостность мембран, проводили окрашивание PI клеток 3T3-L1 и контроля. Для этого использовали комбинации субстанций при следующих концентрациях:
20 мг/мл, 30 мг/мл и 50 мг/мл фосфатидилхолина;
8 мг/мл, 12 мг/мл и 20 мг/мл глицирризината; и
72 мг/мл, 108 мг/мл и 180 мг/мл мальтозы.
Продолжительность инкубации составляла 4 часа. Затем обработанные клетки и два контроля инкубировали с 5 мкг/мл PI в течение 5 минут. Анализ проводили методом CLSM (фиг.6).
Обработка клеток тритоном X приводила к нарушению целостности мембран. Поэтому йодид пропидия проникал в клетки и окрашивал клетки с дестабилизированной мембраной. В положительном контроле (фиг.6b), как и ожидалось, проявляется окрашивание клеток, пермеабилизованных тритоном X. Необработанные клетки в отрицательном контроле (фиг.6а) не окрашивались PL. Это означает, что мембраны этих клеток остались целыми.
Клетки, обработанные 20 мг/мл PC (фиг.6c) и 30 мг/мл PC (фиг.6d), не окрашивались PL Следовательно, в этих клетках нет повреждения мембран и использовавшиеся комбинации субстанций не обладают цитотоксическим действием (фиг.6c, d).
Клетки, обработанные 50 мг/мл PC (фиг.6е), проявляли слабую красную окраску (фиг.6е). Эти клетки обрабатывали высокими дозами комбинации субстанций. При этом среда полностью вычерпывалась из клеток и возникала нехватка питательных веществ, что вызывало повреждение клеток при длительной инкубации. Поэтому небольшое окрашивание обработанных 50 мг/мл PC клеток может быть связано с нехваткой питательных веществ, а не с повреждением клеток фосфатидилхолином.
Комбинация субстанций из фосфатидилхолина, глицирризината и мальтозы в проводившихся in vitro экспериментах не проявляла повреждающего мембраны действия. Следует отметить, что для выявления возможного повреждения мембран использовались очень высокие концентрации комбинации субстанций по изобретению, которые были значительно выше, чем используемые терапевтически концентрации in vivo.
Соотношение между эффектами in vivo и in vitro известно как корреляция in vivo/in vitro. Определение корреляции in vivo/in vitro является непростой задачей и проявляется по-разному в различных условиях. Во многих случаях можно принять, что корреляция in vivo/in vitro составляет ок. 100. Это означает, что для достижения близкого эффекта используемые in vitro концентрации будут примерно на два порядка меньше, чем дозы, используемые in vivo. На этом основании следует ожидать, к примеру, для Lipostabil® N при инъекционном липолизе те концентрации in vitro, которые приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Используемая in vivo концентрация соединения [мг/мл] | Ожидаемая концентрация in vitro (×100) [мг/мл] | Концентрация, вызывающая повреждение клеток in vitro | |
| Na-дезоксихолат | 12,65 мг/мл | 0,1265 | от 0,05 мг/мл |
| Фосфатидилхолин | 25 мг/мл | 0,25 | нет |
| Na-DC, PC из Lipostabil | 12,65 мг/мл Na-DC | 0,1265 | от 0,05 мг/мл Na-DC |
| 25 мг/мл PC | 0,25 | от 0,1 мг/мл PC |
В случае Na-дезоксихолата как в виде отдельного вещества, так и субстанции в Lipostabil®, ожидаемая концентрация in vitro по расчетам соответствует тем концентрациям, которые были установлены в экспериментах (таблица 1). Отсюда можно сделать вывод, что эта субстанция с большой вероятностью обладает повреждающим клетки действием при концентрации, используемой при инъекционном липолизе.
Следовательно, крайне маловероятно, что концентрации комбинации субстанций по изобретению, используемые для терапии vivo, будут вызывать такое же повреждение мембран клеток (и последующий некроз), как концентрации из предшествующего уровня техники. Поэтому можно принять такие же коэффициенты пересчета и для комбинации фосфатидилхолина и глицирризиновой кислоты.
Пример 7. Исследование воспалительной реакции у обработанных клеток мышей
Поскольку воспаление является триггером для миграции происходящих из жировой ткани стволовых клеток (ADSC), то мышам BALB/c в правую подкожную жировую ткань вводили либо смесь (фиг.8d-f), содержащую фосфатидилхолин (PC), глицирризиновую кислоту (GR) и мальтозу (MAL) (25 мг/мл PC, 10 мг/мл GR, 90 мг/мл MAL), либо буфер PBS (фиг.8g-i), либо клетки Е.coli (фиг.8a-c). Инкубация продолжалась 5 дней.
После этого проводили окрашивание на CD4, CD8, CD19 и CD20 для изучения воспалительной реакции клеток.
Кроме того, происходящие из жировой ткани стволовые клетки (ADSC) метили лентивирусным вектором, экспрессирующим eGFP/люциферазу, и вводили через 48 часов после первоначальной инъекции в противоположную жировую ткань мышей BALB/c.
Миграцию клеток ADSC наблюдали по биолюминесценции. Результаты из примера 7 представлены на фиг.8.
Фигура 8. Биолюминесцентные снимки помеченных люциферазой клеток после подкожного введения ADSC в правую жировую ткань мышей Balb/c вместе с: (a-c) клетками Е.coli(d-f) смесью фосфатидилхолин+мальтоза+глицирризинат (РМС) (g-i) буфером PBS.
Через 48 часов помеченные люциферазой клетки ADSC вводили внутрибрюшинно в каждом случае и наблюдали миграцию клеток ADSC по биолюминесценции. У мышей (d-i) клетки ADSC мигрировали в печень и селезенку. У мышей (a-c) клетки ADSC мигрировали в зону, инфицированную при введении Е.coli, и скапливались здесь.
У мышей с PBS (фиг.8g-1) и мышей со смесью, содержащей PC (фиг.8d-f), не наблюдалось отличий по миграции клеток ADSC. Напротив, у мышей, которым вводили Е.coli, наблюдалась миграция и скопление клеток ADSC в зоне, инфицированной при введении Е.coli.
Таким образом, при помощи помеченных люциферазой стволовых клеток, происходящих из жировой ткани (ADSC), было показано, что введение in vivo смеси, содержащей фосфатидилхолин (PC), тринатриевый глицирризинат и мальтозу, не вызывает воспалительных реакций. Об этом свидетельствует тот факт, что помеченные люциферазой клетки ADSC не мигрировали и не накапливались в подкожной жировой ткани, в которую вводилась смесь.
Эти результаты подтверждают, что фосфатидилхолин может использоваться в качестве липолитически активной субстанции, не вызывающей тяжелых воспалительных реакций в комбинации с глицирризиновой кислотой.
Пример 8. Исследование липолитического действия комбинации субстанций in vitro
Клетки 3T3-L1 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза и подвергали дифференцировке еще в течение 8 дней в зрелые адипоциты. За этим следовала 4-часовая инкубация клеток с 10 мг/мл, 25 мг/мл и 50 мг/мл фосфатидилхолина и 4 мг/мл, 10 мг/мл и 20 мг/мл глицирризината и 36 мг/мл, 90 мг/мл и 180 мг/мл мальтозы. Липолитическую активность измеряли методом определения липолиза, как описано ниже.
Метод определения липолиза
Расщепление триглицеридов на глицерин и три жирные кислоты известно как липолиз. Этот процесс катализируется главным образом гормон-чувствительной липазой и триглицеридлипазой жировой ткани. Методом определения липолиза можно детектировать липолитическую активность клеток. Этот метод основан на измерении глицерина, образующегося при липолизе, который секретируется клетками в среду. Глицерин подвергается метаболизму при энзиматических реакциях в глицерин-1-фосфат, а затем в дигидроксиацетонфосфат. При этом вырабатывается перекись водорода, которая определяется количественно фотометрически по реакции окрашивания пероксидазой. Для того чтобы судить о липолитическом действии веществ, их сравнивают с базовой активностью липолиза в клетках и с липолизом при стимуляции бета-адренергических рецепторов. Такая стимуляция вызывается изопротеренолом. Результаты из примера 8 представлены на фиг.7.
Фигура 7. Графическое представление метода определения липолиза (мкг глицерина/мкг ДНК) на обработанных дифференцированных клетках 3T3-L1. Клетки ЗТ3-L1 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза, а затем подвергали дифференцировке в течение 8 дней. Обработку зрелых адипоцитов проводили в течение 4 часов соответственно в 3% BSA/PBS с:
10 мкМ изопротеренола (положительный контроль на стимуляцию липолиза)
10 мг/мл фосфатидилхолина+4 мг/мл глицирризината+36 мг/мл мальтозы
25 мг/мл фосфатидилхолина+10 мг/мл глицирризината+90 мг/мл мальтозы
50 мг/мл фосфатидилхолина+20 мг/мл глицирризината+180 мг/мл мальтозы.
В качестве контроля на базовую активность липолиза использовали необработанные клетки в 3% BSA/PBS. Полоски означают стандартное отклонение при n=3. Эксперимент проводился дважды. PC=фосфатидилхолин.
Из первого столбика на фиг.7 видно, что базовая активность липолиза необработанных клеток в 3% BSA/PBS составляет 8 мкг глицерина/мкг ДНК. Исходя из этого базового уровня определяли активность липолиза в других образцах. В положительном контроле (фиг.7) индуцировали стимуляцию липолиза с помощью 10 мкМ агониста Р-адренорецепторов изопротеринола. В положительном контроле проявляется липолитическая активность, которая возрастает в восемь раз от базового уровня. Все клетки, обработанные комбинацией субстанций (10 мг/мл, 25 мг/мл и 50 мг/мл PC), проявляли повышение липолитической активности по сравнению с базовым уровнем (фиг.7). Обработка клеток комбинацией субстанций, содержащей 10 или 25 мг/мл PC, приводила к 5-кратному повышению липолитической активности по сравнению с базовым уровнем. Обработка клеток комбинацией субстанций, содержащей 50 мг/мл PC, приводила к 3-кратному повышению липолитической активности по сравнению с базовым уровнем (фиг.7). Снижение липолитической активности при самой высокой концентрации, вероятно, как уже говорилось, происходит в связи с тем, что клеткам не хватает питательных веществ из-за исчерпания среды, которая необходима им для выживания или для поддержания нормальных функций, таких как липолитическая активность.
Комбинация субстанций по изобретению проявляет заметное липолитическое действие in vitro.
Сравнительный пример 1. Препарат Lipostabil®, содержащий фосфатидилхолин и дезоксихолат натрия
Использовали Na-дезоксихолат в концентрации 0,005-0,5 мг/мл (действует так же, как и отдельное вещество, начиная с 0,05 мг/мл) и фосфатидилхолин в концентрации 0,01-1 мг/мл (не действует так, как отдельное вещество).
Процедура была аналогична примеру 8.
Результаты сравнительного примера представлены на фиг.9.
Фигура 9. Фазово-контрастные снимки обработанных дифференцированных клеток 3T3-L1. Клетки 3T3-L1 стимулировали с помощью гормонного коктейля для адипогенеза, а затем подвергали дифференцировке в течение 8 дней. Зрелые адипоциты обрабатывали в течение 24 часов фосфатидилхолином и дезоксизолатом натрия из Lipostabil при следующих концентрациях:
(a) необработанные клетки в среде дифференцировки,
(b) 0,01 мг/мл фосфатидилхолина+0,005 мг/мл Na-дезоксихолата,
(c) 0,1 мг/мл фосфатидилхолина+0,05 мг/мл Na-дезоксихолата,
(d) 0,25 мг/мл фосфатидилхолина+0,125 мг/мл Na-дезоксихолата,
(e) 0,5 мг/мл фосфатидилхолина+0,25 мг/мл Na-дезоксихолата,
(f) 1 мг/мл фосфатидилхолина+0,5 мг/мл Na-дезоксихолата.
Проводили анализ под световым микроскопом. Клетки с поврежденной мембраной или клеточные фрагменты отмечены типичными черными стрелками, а капельки свободных липидов указаны белыми стрелками.
В то время, как самая низкая концентрация фосфатидилхолина и дезоксихолата натрия еще не проявляла эффекта (фиг.9b), при следующей более высокой концентрации отмечалось небольшое повреждение клеток (фиг.5c), которое усиливалось с повышением концентрации. На фиг.5е клеточные мембраны сильно поражены, указывая на то, что Lipostabil® при концентрации 0,5 мг/мл фосфатидилхолина вместе с 0,25 мг/мл дезоксихолата натрия сильно повреждает клетки и вызывает гибель клеток путем некроза. Природа эффекта Lipostabil® была более всего сравнима с детергентным действием Na-дезоксихолата (типичное повреждение клеточной мембраны), действие которого явно преобладает. Такое типичное повреждающее мембрану действие не выявлялось у фосфатидилхолина как отдельного вещества, свидетельствуя, что цитотоксическое действие Lipostabil® главным образом исходит от Na-дезоксихолата. Сравнение эффективного диапазона концентраций Lipostabil® с таковым у отдельных субстанций подтверждает этот вывод насчет преобладающего действия дезоксихолата. В то время, как фосфатадилхолин в виде отдельного вещества не был эффективен, Lipostabil® уже при концентрации 0,1 мг/мл фосфатидилхолина дает небольшой эффект (при этой концентрации нет эффекта у PC в виде отдельного вещества). Однако Na-дезоксихолат при однократном введении в концентрации от 0,05 мг/мл уже вызывал первоначальное повреждение мембран, которое также происходило с Lipostabil® при этой концентрации.
Пример 9. Введение Phosphogliv® и Lipostabil® испытуемым женщинам и определение эффективности подкожного липолиза
Препарат Phosphogliv® i.v., применявшийся до сих пор при заболеваниях печени, вместо DC (как в Lipostabil® N i.v.) содержит глицирризиновую кислоту. Первые экспериментальные результаты и исследования на двух испытуемых показали такую же эффективность препарата, как у Lipostabil® Ni.v., при значительно лучшей переносимости.
В описанных здесь экспериментах продемонстрирован сравнимый с Lipostabil® эффект Phosphogliv® при лучшей переносимости у Phosphogliv®.
В проспективном контролируемом исследовании шести испытуемым женщинам вводили Phosphogliv® в левое плечо и Lipostabil® в правое плечо.
Использовали ампулы, которые содержали 0,5 г РРС, 0,2 г глицирризината и 1,8 г мальтозы в виде лиофилизата, который растворяли в 10 мл воды на укол. В зависимости от размера обрабатываемой зоны делали до 60 подкожных уколов в каждое плечо, по 0,5 мл на расстоянии в 1,5 см, соответственно.
Исследование продолжительности действия препарата
Обработка продолжалась 16 недель. Обследование проводили за 1 день до начала обработки (t=-1), в день первой обработки (t=0), через 8 недель после начала обработки (t=8) и через 16 недель после начала обработки (t=16).
Определение эффекта
Для выявления эффекта у испытуемых измеряли окружность плеча. Окружность плеча [см] измеряли с помощью кронциркуля (caliper) и рулетки (myo-tape) перед обработкой и через 8 и 16 недель.
Кроме того, в крови определяли липиды, общий холестерин, LDL-холестерин и HDL-холестерин в мг/дл и атерогенный индекс - отношение ЕОЕ-холестерин/НОЕ-холестерин.
Представление результатов
По измеренным величинам определяли их изменения в виде разности от исходного уровня и изменения в процентах от исходного уровня, средние значения и стандартные отклонения.
| Таблица 2 | |||||||||||
| Исходные данные | |||||||||||
| Препарат | P | L | Р | L | |||||||
| Испытуемое лицо | Время [t] | Calli [см] | Cal re [см] | Myo li [см] | Myo re [см] | Общий холестерин [мг/дл] | LDL-холестерин [мг/дл] | HDL-холестерин [мг/дл] | Клиническое улучшение | Примечания | |
| № | иниц. | ||||||||||
| 6 | I.B. | -1 | 3,1 | 3,1 | 35,0 | 35,0 | 269,0 | 169,0 | 53,8 | ||
| I.B. | 0 | 3,1 | 3,1 | 35,0 | 35,0 | ||||||
| I.B. | 8 | 2,6 | 2,7 | 32,5 | 33,0 | 159,0 | 112,0 | 58,9 | DeI/DelP | Вероятен прием эзетрола | |
| I.B. | 16 | 2,5 | 2,5 | 32,0 | 32,0 | 172,0 | 127,0 | 58,3 | DeI/DelP | ||
| 2 | Ch.K. | -1 | 2,9 | 2,9 | 30,5 | 30,5 | 237,0 | 136,0 | 75,4 | ||
| Ch.K. | 0 | 2,9 | 2,9 | 30,5 | 30,5 | ||||||
| Ch.K. | 8 | 2,2 | 2,2 | 28,2 | 29,0 | 222,0 | 129,0 | 78,0 | DrI/DrIP | ||
| Ch.K. | 16 | 2,0 | 2,0 | 28,0 | 28,5 | 218,0 | 128,0 | 79,0 | DrI/DrIP | ||
| 7 | S.A. | -1 | 3,2 | 3,3 | 31,0 | 32,0 | 212,0 | 104,0 | 88,4 | ||
| S.A. | 0 | 3,2 | 3,3 | 31,0 | 32,0 | ||||||
| S.A. | 8 | 2,8 | 2,9 | 27,0 | 28,5 | 214,0 | 103,0 | 89,1 | DrI/DrIP | ||
| S.A. | 16 | 2,7 | 2,8 | 26,0 | 27,0 | DrI/DrIP | |||||
| 1 | G.E. | -1 | 3,8 | 3,8 | 33,0 | 33,0 | 143,0 | 53,0 | 67,0 | ||
| G.E. | 0 | 3,8 | 3,8 | 33,0 | 33,0 | ||||||
| G.E. | 8 | 3,2 | 3,2 | 31,8 | 31,8 | 141,0 | 51,0 | 68,0 | DeI/DelP | ||
| G.E. | 16 | 2,8 | 2,8 | 30,5 | 30,5 | 142,0 | 49,0 | 54,0 | DeI/DelP | ||
| M.St. | -1 | 2,9 | 3,0 | 35,0 | 36,0 | 198,0 | 120,2 | 62,8 | |||
| M.St. | 0 | 2,9 | 3,0 | 35,0 | 36,0 | ||||||
| M.St. | 8 | 2,6 | 2,7 | 33,0 | 32,5 | 182,0 | 110,0 | 60,3 | DeI/DelP | ||
| M.St. | 16 | 2,5 | 2,6 | 32,0 | 32,0 | 182,0 | 110,9 | 60,8 | DeI/DelP | ||
| 4 | E.K. | -1 | 2,2 | 2,3 | 28,5 | 29,0 | 187,0 | 99,0 | 68,7 | ||
| E.K. | 0 | 2,2 | 2,3 | 28,5 | 29,0 | ||||||
| E.K. | 8 | 1,4 | 1,5 | 26,0 | 27,0 | 177,0 | 92,0 | 69,3 | DrI/DrIP | ||
| E.K. | 16 | ||||||||||
| Cal li=циркуль, левое; Cal re=улучшение по эффективности улучшение по эффективности и =циркуль, правое; Myo li=рулетка, левое; Myo re=рулетка, правое; P=Phosphogliv®; L=Lipostabil®; DeI=явное и совместимости (врач); DeIP=явное улучшение по эффективности и совместимости (пациент); DrI=сильное совместимости (врач); DrIP=сильное улучшение по эффективности и совместимости (пациент). |
Окружность плеча у испытуемых лиц отличалась в зависимости от выбранного метода измерения: кронциркулем или рулеткой. Независимо от метода, в каждом случае отмечалось уменьшение окружности плеча. Не было отличий между действием Phosphogliv и Lipostabil®. Оба препарата вызывали уменьшение окружности плеча в одинаковой степени (см. таблицу 3-1 и 3-2).
| Таблица 3-1 | |||||||||
| Окружность плеча при измерении кронциркулем [см] | |||||||||
| Испытуемое лицо | Время после начала обработки препаратом (недели) | ||||||||
| № | инициалы | Phosphogliv® (левое) | Lipostabil® (правое) | ||||||
| -1 | 0 | 8 | 16 | -1 | 0 | 8 | 16 | ||
| 6 | I.B. | 3,1 | 3,1 | 2,6 | 2,5 | 3,1 | 3,1 | 2,7 | 2,5 |
| 2 | Ch.K. | 2,9 | 2,9 | 2,2 | 2,0 | 2,9 | 2,9 | 2,2 | 2,0 |
| 7 | S.A. | 3,2 | 3,2 | 2,8 | 2,7 | 3,3 | 3,3 | 2,9 | 2,8 |
| 1 | G.E. | 3,8 | 3,8 | 3,2 | 2,8 | 3,8 | 3,8 | 3,2 | 2,8 |
| 3 | M.St. | 2,9 | 2,9 | 2,6 | 2,5 | 3,0 | 3,0 | 2,7 | 2,6 |
| 4 | Е.К. | 2,2 | 2,2 | 1,4 | 2,3 | 2,3 | 1,5 | ||
| Среднее | 3,02 | 3,02 | 2,47 | 2,50 | 3,07 | 3,07 | 2,53 | 2,54 | |
| Станд. отклонение | 0,52 | 0,52 | 0,62 | 0,31 | 0,49 | 0,49 | 0,60 | 0,33 | |
| N | 6 | 6 | 6 | 5 | 6 | 6 | 6 | 5 |
| Таблица 3-2 | |||||||||
| Изменения окружности плеча при измерении кронциркулем в см в виде абсолютной и относительной разности по сравнению с неделей 0 | |||||||||
| Испытуемое лицо | Время после начала обработки препаратом (недели) | ||||||||
| № | инициалы | Phosphogliv®® (левое) | Lipostabil® (правое) | ||||||
| 8 | 16 | 8 | 16 | ||||||
| см | % | см | % | см | % | см | % | ||
| 6 | I.B. | -0,5 | -16,1 | -0,6 | -19,4 | -0,4 | -12,9 | -0,6 | -19,4 |
| 2 | Ch.K. | -0,7 | -24,1 | -0,9 | -31,0 | -0,7 | -24,1 | -0,9 | -31,0 |
| 7 | S.A. | -0,4 | -12,5 | -0,5 | -15,6 | -0,4 | -12,1 | -0,5 | -15,2 |
| 1 | G.E. | -0,6 | -15,8 | -1,0 | -26,3 | -0,6 | -15,8 | -1,0 | -26,3 |
| 3 | M.St. | -0,3 | -10,3 | -0,4 | -13,8 | -0,3 | -10,0 | -0,4 | -13,3 |
| 4 | Е.К. | -0,8 | -36,4 | -0,8 | -34,8 | ||||
| Среднее | -0,55 | -19,21 | -0,68 | -21,22 | -0,53 | -18,29 | -0,68 | -21,04 | |
| Станд. отклонение | 0,19 | 9,63 | 0,26 | 7,28 | 0,20 | 9,47 | 0,26 | 7,49 | |
| N | 6 | 6 | 5 | 5 | 6 | 6 | 5 | 5 |
Из таблицы 3-2 видно, что при измерении кронциркулем препараты Lipostabil® и Phosphogliv® через 8 недель вызывали уменьшение окружности плеча на 19,21% и 18,29%. Через 16 недель окружность плеча уменьшалась на 21,22% и 21,04% при измерении кронциркулем. Следовательно, оба препарата, Phosphogliv® и Lipostabil®, обладают равной эффективностью.
| Таблица 4-1 | |||||||||
| Окружность плеча при измерении рулеткой [см] | |||||||||
| Испытуемое лицо | Время после начала обработки препаратом (недели) | ||||||||
| № | инициалы | Phosphogliv® (левое) | Lipostabil® (правое) | ||||||
| -1 | 0 | 8 | 16 | -1 | 0 | 8 | 16 | ||
| 6 | I.B. | 35,0 | 35,0 | 32,5 | 32,0 | 35,0 | 35,0 | 33,0 | 32,0 |
| 2 | Ch.K. | 30,5 | 30,5 | 28,2 | 28,0 | 30,5 | 30,5 | 29,0 | 28,5 |
| 7 | S.A. | 31,0 | 31,0 | 27,0 | 26,0 | 32,0 | 32,0 | 28,5 | 27,0 |
| 1 | G.E. | 33,0 | 33,0 | 31,8 | 30,5 | 33,0 | 33,0 | 31,8 | 30,5 |
| 3 | M.St. | 35,0 | 35,0 | 33,0 | 32,0 | 36,0 | 36,0 | 32,5 | 32,0 |
| 4 | E.K. | 28,5 | 28,5 | 26,0 | 29,0 | 29,0 | 27,0 | ||
| Среднее | 32,17 | 32,17 | 29,75 | 29,70 | 32,58 | 32,58 | 30,30 | 30,00 | |
| Станд. отклонение | 2,62 | 2,62 | 3,04 | 2,64 | 2,65 | 2,65 | 2,46 | 2,21 | |
| N | 6 | 6 | 6 | 5 | 6 | 6 | 6 | 5 |
| Таблица 4-2 | |||||||||
| Изменения окружности плеча при измерении рулеткой в см в виде абсолютной и относительной разности по сравнению с неделей 0 | |||||||||
| Испытуемое лицо | Время после начала обработки препаратом (недели) | ||||||||
| № | инициалы | Phosphogliv® (левое) | Lipostabil® (правое) | ||||||
| 8 | 16 | 8 | 16 | ||||||
| см | % | см | % | см | % | см | % | ||
| 6 | I.B. | -2,5 | -7,1 | -3,0 | -8,6 | -2,0 | -5,7 | -3,0 | -8,6 |
| 2 | Ch.K. | -2,3 | -7,5 | -2,5 | -8,2 | -1,5 | -4,9 | -2,0 | -6,6 |
| 7 | S.A. | -4,0 | -12,9 | -5,0 | -16,1 | -3,5 | -10,9 | -5,0 | -15,6 |
| 1 | G.E. | -1,2 | -3,6 | -2,5 | -7,6 | -1,2 | -3,6 | -2,5 | -7,6 |
| 3 | M.St. | -2,0 | -5,7 | -3,0 | -8,6 | -3,5 | -9,7 | -4,0 | -11,1 |
| 4 | E.K. | -2,5 | -8,8 | -2,0 | -6,9 | ||||
| Среднее | -2,42 | -7,62 | -3,20 | -9,81 | -2,28 | -6,97 | -3,30 | -9,89 | |
| Станд. отклонение | 0,92 | 3,13 | 1,04 | 3,56 | 0,99 | 2,84 | 1,20 | 3,63 | |
| N | 6 | 6 | 5 | 5 | 6 | 6 | 5 | 5 |
Из таблицы 4-2 видно, что препараты Lipostabil и Phosphogliv через 8 недель вызывали уменьшение окружности плеча на 7,62% и 6,97% при измерении рулеткой. Через 16 недель окружность плеча уменьшилась на 9,81% и 9,89% при измерении рулеткой. Следовательно, оба препарата, Phosphogliv® и Lipostabil®, обладают равной эффективностью.
Несмотря на то, что два метода - кронциркулем и рулеткой - показывают различное уменьшение под действием препаратов, степень эффективности у препаратов Lipostabil® и Phosphogliv® одинакова.
Пример 10. Оценка побочных эффектов при применении Lipostabil® и Phosphogliv®
Для этого проводили обработку испытуемых женщин, как описано в примере 9, и определяли эффективность. Для того чтобы документировать побочные эффекты, делали снимки плеча у испытуемых женщин до и после обработки Phosphogliv® и Lipostabil® (фиг.10 и 11).
Через 3 минуты отмечалось заметное покраснение и опухание правого у плеча у испытуемой №1, которая получала Lipostabil®. По сравнению с этим на левом плече, которое обрабатывали Phosphogliv®, отмечалось лишь небольшое покраснение и опухание. Это наблюдение подтверждает результаты экспериментов с фосфатидилхолином in vitro, который не обладает повреждающим мембраны действием на клетки (пример 5, фиг.4a-c). На снимках у испытуемой №02 на фиг.11 проявляются такие же различия между левым (Phosphogliv®) и правым (Lipostabil®) плечом.
Фигура 10. Фотографические снимки после обработки левого (Phosphogliv®) и правого (Lipostabil®) плеча у испытуемой №01. Снимки делали через 3 минуты после введения препаратов Lipostabil® и Phosphogliv®.
Фигура 11. Фотографические снимки после обработки левого (Phosphogliv®) и правого (Lipostabil®) плеча у испытуемой №02. Снимки делали через 3 минуты после введения препаратов Lipostabil® и Phosphogliv®.
Кроме того, ниже в таблице 5 приведена сводка по побочным эффектам.
| Таблица 5 | ||||||
| Побочные эффекты при применении Phosphogliv и Lipostabil | ||||||
| Испыт. лицо | t=0 | t=8 | t=16 | |||
| Р | L | Р | L | Р | L | |
| №1 | только кратковрем. боль, почти нет опухания | значит, опухание и боль почти 3 дня | почти нет боли | опухание, покраснение вплоть до 4 дня | ||
| №2 | менее сильное опухание и покраснение | более сильное покраснение и опухание | почти нет боли | боль в теч. 1 недели | ||
| №3 | совсем ничего | жжение и зуд 5 мин, легкая боль 2 недели | пустяки, боли нет совсем | легкая боль в первые 2 недели | неожид. реакций нет, жалоб меньше | неожид. реакций нет, жалоб больше |
| №4 | боль в районе уколов всего лишь 3 мин, опухание и покрасн. в теч. 3 дней, после этого нет боли и опухания | более сильная боль, опухание в первые 3 дня почти такое же, как при Phosphogliv, опухание и покрасн. 12 дней. Чувствительность оставалась почти все 8 недель | ||||
| №6 | почти нет боли | жалоб нет | покрасн. и опухание почти 3 дня | |||
| №7 | почти нет боли | боли и опухание на обоих плечах легко переносятся | ||||
| P=Phosphogliv®; L=Lipostabil® |
И врач, и испытуемые лица после первой и второй обработки во всех случаях одинаково отметили явное или сильное улучшение - уменьшение скоплений жира на плечах при обоих препаратах, а также значительно лучшую переносимость Phosphogliv. Во всех случаях упругость кожи была хорошей после обработки.
Из данных в таблице 5 видно, что жалобы испытуемых после обработки Lipostabil® включают опухание, покраснение и боль на месте уколов. Такие побочные эффекты возникают редко или совсем не возникают при обработке Phosphogliv®. Таким образом, Phosphogliv® значительно лучше переносится испытуемыми, чем препарат Lipostabil®. Как указано выше, лучшая переносимость объясняется уменьшением или отсутствием повреждения клеток. Как показано в примере 5, фосфатидилхолин не повреждает клеточную мембрану, тогда как Lipostabil® повреждает клетки.
Пример 11. Определение уровня холестерина до и после подкожного липолиза
Для этого отслеживали липиды в крови испытуемых лиц на протяжении курса лечения. Определяли общий холестерин, LDL-холестерин (липопротеидов низкой плотности) и HDL-холестерин (липопротеидов высокой плотности). В таблице 6 приведены значения в моменты времени t=-1, t=8 недель и t=16 недель.
В среднем липиды крови за время лечения изменялись в одинаковом направлении. Только у двух испытуемых лиц (I.B. и Ch.K.) со значительно повышенным общим уровнем холестерина и LDL-холестерина эти значения уменьшались, тогда как HDL-холестерин возрастал (таблица 6). Сводка по этому исследованию представлена в таблице 7.
Другие биохимические показатели: AST, ALT, γ-GT, билирубин, креатинин и глюкоза оставались в пределах нормы, за исключением небольшого повышения уровня γ-GT у испытуемого лица S.A. перед началом обработки.
| Таблица 6 | ||||||||||
| Уровень холестерина [мг/дл] | ||||||||||
| Испытуемое лицо | Время после начала обработки (недели) | |||||||||
| № | инициалы | Общий холестерин | LDL-холестерин | HDL-холестерин | ||||||
| -1 | 8 | 16 | -1 | 8 | 16 | -1 | 8 | 16 | ||
| 6 | I.B. | 269,0 | 159,0 | 172,0 | 169,0 | 112,0 | 127,0 | 53,8 | 58,9 | 58,3 |
| 2 | Ch.K. | 237,0 | 222,0 | 218,0 | 136,0 | 129,0 | 128,0 | 75,4 | 78,0 | 79,0 |
| 7 | S.A. | 212,0 | 214,0 | 104,0 | 103,0 | 88,4 | 89,1 | |||
| 1 | G.E. | 143,0 | 141,0 | 142,0 | 53,0 | 51,0 | 49,0 | 67,0 | 68,0 | 54,0 |
| 3 | M.St. | 198,0 | 182,0 | 182,0 | 120,2 | 110,0 | 110,9 | 62,8 | 60,3 | 60,8 |
| 4 | E.K. | 187,0 | 177,0 | 99,0 | 92,0 | 68,7 | 69,3 | |||
| Среднее | 207,67 | 182,50 | 178,50 | 113,53 | 99,50 | 103,73 | 69,35 | 70,60 | 63,03 | |
| Станд. отклонение | 43,23 | 31,17 | 31,34 | 38,97 | 26,67 | 37,32 | 11,75 | 11,39 | 11,01 | |
| N | 6 | 6 | 4 | 6 | 6 | 4 | 6 | 6 | 4 | |
| LDL/HDL-холестерин: | -1 неделя | 1,64 | ||||||||
| (искомое значение<3) | 8 недель | 1,41 | ||||||||
| 16 недель | 1,65 | |||||||||
| LDL-холестерин=холестерин липопротеидов низкой плотности | ||||||||||
| HDL-холестерин=холестерин липопротеидов высокой плотности |
| Таблица 7 | ||||||||
| Сводка по результатам исследования на испытуемых | ||||||||
| Испытуемое лицо | Время | Клиническое улучшение | Примечания | |||||
| левое | правое | левое | правое | |||||
| № | иниц. | Phosphogliv | Lipostabil | Phosphogliv | Lipostabil | |||
| 6 | I.B. | отбор | 3,1 | 3,1 | 35,0 | 35,0 | *Вероятен прием эзетрола | |
| 0 | 3,1 | 3,1 | 35,0 | 35,0 | ||||
| 8 | 2,6 | 2,7 | 32,5 | 33,0 | DeI/DeIP | общий холестерин с 269,0 мг/дл до 159,0 мг/дл LDL-холестерин со 169,0 мг/дл до 112,0 мг/дл HDL-холестерин с 53,8 мг/дл до 58,9 мг/дл | ||
| 16 | 2,5 | 2,5 | 32,0 | 32,0 | DeI/DeIP | общий холестерин со 159,0 мг/дл до 172,0 мг/дл LDL-холестерин со 112,0 мг/дл до 127,0 мг/дл HDL-холестерин с 58,9 мг/дл до 58,3 мг/дл; левое - жалоб нет, правое - боли почти 3 дня; упругость кожи улучш. со средней до хорошей | ||
| 2 | Ch.K. | отбор | 2,9 | 2,9 | 30,5 | 30,5 | ||
| 0 | 2,9 | 2,9 | 30,5 | 30,5 | ||||
| 8 | 2,2 | 2,2 | 28,2 | 29,0 | DrI/DrIP | общий холестерин с 237,0 мг/дл до 222,0 мг/дл LDL-холестерин со 136,0 мг/дл до 129,0 мг/дл HDL-холестерин с 75,4 мг/дл до 78,0 мг/дл | ||
| 16 | 2,0 | 2,0 | 28,0 | 28,5 | DrI/DrIP | общий холестерин с 222,0 мг/дл до 218,0 мг/дл LDL-холестерин со 129,0 мг/дл до 128,0 мг/дл HDL-холестерин с 78,0 мг/дл до 79,0 мг/дл; левое - боли почти нет, правое - около 1 нед.; упругость кожи хорошая с самого начала | ||
| 3 | M.St. | отбор | 2,9 | 3,0 | 35,0 | 36,0 | ||
| 0 | 2,9 | 3,0 | 35,0 | 36,0 | ||||
| 8 | 2,6 | 2,7 | 33,0 | 32,5 | DeI/DeIP | общий холестерин со 198,0 мг/дл до 182,0 мг/дл LDL-холестерин со 120,2 мг/дл до 110,0 мг/дл HDL-холестерин с 62,8 мг/дл до 60,3 мг/дл | ||
| 16 | 2,5 | 2,6 | 32,0 | 32,0 | DeI/DeIP | общий холестерин со 182,0 мг/дл до 182,0 мг/дл LDL-холестерин со 110,0 мг/дл до 110,9 мг/дл HDL-холестерин с 60,3 мг/дл до 60,8 мг/дл; упругость кожи улучш. со средней до хорошей | ||
| 4 | E.K. | отбор | 2,2 | 2,3 | 28,5 | 29,0 | ||
| 0 | 2,2 | 2,3 | 28,5 | 29,0 | ||||
| 8 | 1,4 | 1,5 | 26,0 | 27,0 | DrI/DrIP | общий холестерин со 187,0 мг/дл до 177,0 мг/дл LDL-холестерин с 99,0 мг/дл до 92,0 мг/дл HDL-холестерин с 68,7 мг/дл до 69,3 мг/дл; упругость кожи хорошая с самого начала | ||
| 7 | S.A. | отбор | 3,2 | 3,3 | 31,0 | 32,0 | ||
| 0 | 3,2 | 3,3 | 31,0 | 32,0 | ||||
| 8 | 2,8 | 2,9 | 27,0 | 28,5 | DrI/DrIP | общий холестерин с 212,0 мг/дл до 214,0 мг/дл LDL-холестерин со 104,0 мг/дл до 103,0 мг/дл HDL-холестерин с 88,4 мг/дл до 89,1 мг/дл | ||
| 16 | 2,7 | 2,8 | 26,0 | 27,0 | DrI/DrIP | уровень γ-GT нормализовался упругость кожи хорошая с самого начала | ||
| 1 | G.E. | отбор | 3,8 | 3,8 | 33,0 | 33,0 | ||
| 0 | 3,8 | 3,8 | 33,0 | 33,0 | ||||
| 8 | 3,2 | 3,2 | 31,8 | 31,8 | общий холестерин со 143,0 мг/дл до 141,0 мг/дл LDL-холестерин со 53,0 мг/дл до 51,0 мг/дл HDL-холестерин с 67,0 мг/дл до 68,0 мг/дл | |||
| 16 | 2,8 | 2,8 | 30,5 | 30,5 | общий холестерин со 141,0 мг/дл до 142,0 мг/дл LDL-холестерин с 51,0 мг/дл до 49,0 мг/дл HDL-холестерин с 68,0 мг/дл до 54,0 мг/дл; упругость кожи хорошая с самого начала | |||
| Del=явное улучшение по эффективности и совместимости (врач); DeIP=явное улучшение по эффективности и совместимости (пациент); DrI=сильное улучшение по эффективности и совместимости (врач); DrIP=сильное улучшение по эффективности и совместимости (пациент). |
1. Применение композиции, включающей:
a) по меньшей мере, один фосфолипид;
b) по меньшей мере, одну глицирризиновую кислоту или
c) соль глицирризиновой кислоты; и
в которой:
- общее содержание фосфолипидов и глицирризиновой кислоты или ее солей составляет 2-80 мас.% и
- соотношение между фосфолипидами и глицирризиновой кислотой или ее солями по весу составляет от 30:1 до 0,5:1,
для изготовления лекарственного средства для удаления подкожных скоплений жира.
2. Применение по п.1, при котором композиция дополнительно содержит вспомогательные вещества.
3. Применение по п.1, при котором в качестве фосфолипида композиция содержит фосфатидилхолин.
4. Применение по пп.1-3, при котором композиция содержит фосфатидилхолин животного или растительного происхождения.
5. Применение по п.п. 1-3, при котором композиция содержит глицирризиновую кислоту либо калиевую, натриевую, аммониевую или магниевую соль глицирризиновой кислоты.
6. Применение по пп.1-3, при котором в качестве вспомогательного вещества композиция содержит сахар, в частности глюкозу или мальтозу и/или их производные, маннитол, сорбитол или лактозу.
7. Применение по пп.1-3, при котором композиция содержит фосфатидилхолин в общем количестве от 15 до 98 мас.%, предпочтительно от 30 до 98 мас.%, более предпочтительно от 50 до 98 мас.%, особенно предпочтительно от 75 до 98 мас.% и наиболее предпочтительно от 75 до 90 мас.% от общего содержания фосфолипидов.
8. Применение по пп.1-3, при котором композиция в сухом виде растворяется в подходящем растворителе.
9. Применение по пп.1-3, при котором композиция используется в сухом виде, предпочтительно в виде лиофилизата, полученного при замораживании-высушивании.
10. Применение по пп.1-3, при котором используется композиция в виде раствора.
11. Применение по пп.1-3, при котором композиция содержит физиологически подходящие растворители, включая воду, физиологический раствор, раствор глюкозы, такие одноатомные спирты, как этанол, 2-пропанол, н-пропанол, такие многоатомные спирты, как глицерин и/или пропандиол, такие полигликоли, как полиэтиленгликоль и/или Miglyol, глицерин, формал, диметилизосорбитол, натуральные и синтетические масла и/или эфиры.
12. Применение композиции по пп.1-3 для изготовления лекарства для лечения подкожных скоплений жира, заболеваний подкожной жировой ткани, в частности, связанных с местным нарушением распределения жира.
13. Применение композиции по пп.1-3 для изготовления лекарства для разложения и уменьшения опухолей жировой ткани.
14. Применение композиции по пп.1-3 для изготовления лекарства, отличающегося тем, что оно имеет вид крема, мази, геля, гидрогеля, лосьона, пасты, порошка или раствора.
15. Применение композиции по пп.1-3, при котором нежелательными нарушениями распределения жира, имеющими эстетический характер или патологическую природу, являются жировой отек, липомы, липоматоз живота, целлюлит (cellulite, деформация подкожной клетчатки), псевдогинекомастия, "бычий горб" у ВИЧ-пациентов, панникулит (cellulitis, гнойное воспаление подкожной клетчатки) или неспецифические подкожные отложения жира.
16. Применение по любому из пп.1-3, при котором введение препарата осуществляется путем подкожной, внутрибрюшинной, внутримышечной или внутривенной инъекции.
17. Применение по любому из пп.1-3, при котором для введения применяется метод, выбранный из группы, состоящей из ионофореза, электропорации и фонофореза.
