Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе. Изобретение заключается в разработке способа консервации иммунопероксидазного конъюгата с применением в качестве стабилизирующей среды высушивания раствора белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей. Изобретение позволяет сохранять стабильность физических и иммунохимических показателей иммунопероксидазных конъюгатов в течение длительного срока. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК), используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА).

Конъюгаты на основе иммуноглобулинов G (IgG) и пероксидазы хрена (ПХ) - это специфические белковые биополимеры, имеющие слабожесткую структуру, обладающие способностью связываться с антигенами и ускорять химические реакции. В процессе хранения при температуре 4°C они подвергаются отрицательному влиянию продуктов метаболизма микроорганизмов, буферных изменений, концентрации водородных ионов и других факторов, которые по нашим наблюдениям ограничивают срок их годности от нескольких дней до двух недель.

Известен способ консервации ИПК, заключающийся в том, что после приготовления его хранят при минус 20°C в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА) концентрацией 10 мг/мл [1].

Недостатками данного способа являются необходимость хранения готового продукта отдельно от остальных ингредиентов для постановки ТИФА и создание особых условий при транспортировке по «холодовой цепи».

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ консервации ИПК, включающий добавление к нему БСА из расчета 10 мг/мл и лиофилизацию с последующим хранением при 4°C [2].

Недостатком способа является то, что использование БСА в качестве стабилизирующей среды при лиофилизации препарата ограничивает срок годности иммуноферментного конъюгата 12 месяцами [3, 4].

Целью изобретения является разработка способа консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, которая может служить альтернативой БСА при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей на более продолжительный срок.

Технический результат изобретения достигается тем, что при консервации ИПК в качестве стабилизирующей среды высушивания используют белковый стабилизатор (БС), приготовленный на основе водной эмульсии белка куриного яйца, обладающий регулируемым составом белковых биополимеров с инертными поверхностными свойствами. Во время лиофильного высушивания молекулы ИПК оказываются между мономерами белков стабилизатора, благодаря чему активные центры фермента и иммуноглобулинов защищены от потери специфической активности под воздействием факторов окружающей среды во время высушивания и последующего хранения.

Стабилизирующая среда высушивания ИПК должна обладать рядом необходимых свойств: не препятствовать связыванию иммуноглобулинов с антигеном; обеспечивать возможность проникновения субстрата к активному центру ПХ; оставаться инертной по отношению к химическим характеристикам продукта, способствуя сохранению его биологической активности как в жидком, так и в высушенном состоянии; удерживать в процессе лиофилизации высушиваемый продукт внутри ампулы, предотвращая его улетучивание с сублимированными водяными парами; обеспечивать высокий уровень активности препарата в течение срока хранения [5].

Принимая во внимание выше перечисленные факторы, и учитывая свойства биополимеров водной эмульсии белка куриного яйца, очевиден вывод, что наиболее подходящей стабилизирующей средой высушивания для ИПК является БС, приготовленный из белка куриного яйца по ранее разработанному и запатентованному методу [6].

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по методу P.K. Nacane, A. Kawaoi [1]. Для конъюгации IgG использовали фермент ПХ - тип VI-A, RZ-3 (Sigma, США). ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двухуглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия и инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре в течение 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок, что является признаком образования активной формы ПХ. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. Активированную пероксидазу хрена диализировали против 1 л 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

К активированной ПХ добавляли 5 мг IgG против возбудителя туляремии в 1 мл 0,01 M раствора КББ (специфическая активность в реакции иммунодиффузии (РИД) не менее 1:16-1:32). Инкубацию реакционной смеси проводили при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. По истечении времени добавляли 5 мг боргидрида натрия и оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. БС использовали в различных разведениях (от нативного до 1:2) с 0,1 M раствором стерильного ФСБ и добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C.

Физические свойства (растворимость, цветность, прозрачность, потеря в массе при высушивании) и иммунохимические (специфическая активность, чувствительность) контролировали после лиофилизации ИПК в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) и после разведения. Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Приготовленные серии препарата соответствовали основным требованиям нормативных документов.

В таблице 1 представлены результаты изучения физических и иммунохимических свойств туляремийного ИПК, лиофильно высушенного в присутствии БС, подлежащего хранению в течение 18 месяцев (срок наблюдения).

При использовании в качестве стабилизирующей среды высушивания БС в различных разведениях с 0,1 M раствором стерильного ФСБ наилучшие результаты специфической активности ИПК и его чувствительности, а также стабильность характеристик в процессе хранения получены с разведением 1:1,5 (серия 3).

Таким образом, в результате проведенных исследований отработан способ консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, обеспечивающей стабильность физических и иммунохимических показателей лиофилизированного и растворенного препарата.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии нативного БС.

Получение ИПК. ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двууглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия, инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. После диализировали против 1 л 0,01 M раствора КББ pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

Раствор активированной ПХ переносили из диализного мешка во флакон и добавляли IgG против возбудителя туляремии в концентрации 5 мг/мл в 1 мл 0,01 M КББ со специфической активностью в РИД не менее 1:16-1:32, содержимое перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. Добавляли 5 мг боргидрида натрия, оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M раствора ФСБ pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. К готовому ИПК добавляли БС в нативном состоянии в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C (серия 1).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения). Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Специфическая активность и чувствительность препарата не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 2. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:1 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 2).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность ИПК не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 3. Получение ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного в 1:1,5 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1,5 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 3).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 4. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:2 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:2 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 4).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Чувствительность - снизилась в 2 раза после 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата, используемого для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе, отличающийся тем, что к иммунопероксидазному конъюгату добавляют раствор белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца в 0,1 M растворе фосфатно-солевого буфера (1:1,5) в объемном соотношении 1:1, после чего препарат разливают по 0,2 мл в ампулы, замораживают, лиофилизируют и хранят при температуре 4-6°C в течение 18 месяцев.



 

Похожие патенты:
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры.
Изобретение относится к медицине и касается способа получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, включающего: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала, отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к вирусу гепатита С (ВГС), поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В (ВГВ), раннего белка р24 и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также антитела к Treponema pallidum, отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава.

Группа изобретений относится к медицине и касается калликреина, его варианта или фрагмента, имеющих общие эпитопы, распознаваемые антителами, с калликреином дикого типа, использующегося для получения диагностической композиции для in vitro диагностики аллергии I типа, где калликреин получен у собаки; способа получения композиции аллергенов, включающего стадию добавления калликреина собаки, или его варианта или фрагмента; способа выделения калликреина из мочи собаки.

Изобретение относится к области:- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии; - иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови; - пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100 человека.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП). .

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий. .
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол. Полученный материал выдавливают из иглы для выполнения цитологического исследования. После этого проводят смыв из аспирационной иглы оставшегося материала для определения уровня паратиреоидного гормона и тиреоглобулина. Смыв из иглы при этом осуществляют предварительно подготовленной сывороткой, в качестве которой используют смесь сывороток от здоровых доноров с заведомо известным уровнем паратиреоидного гормона и уровнем тиреоглобулина. Способ уменьшает травматичность диагностических манипуляций, сокращает время для уточнения диагноза при планировании объема оперативного лечения, экономичен и прост в выполнении, применим в стационарных и амбулаторных условиях, без обезболивания. 2 пр.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера. После чего проводят иммунизацию кроликов микроколичествами очищенного антигена в пять этапов с получением сыворотки с высоким титром антител к вирусу АБН - 1/16384. Технический результат: получение диагностической сыворотки с высоким титром, позволяющей тестировать вирус АБН в различных биологических жидкостях. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 4 ил.
Наверх