Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе. Изобретение заключается в разработке способа консервации иммунопероксидазного конъюгата с применением в качестве стабилизирующей среды высушивания раствора белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей. Изобретение позволяет сохранять стабильность физических и иммунохимических показателей иммунопероксидазных конъюгатов в течение длительного срока. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК), используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА).

Конъюгаты на основе иммуноглобулинов G (IgG) и пероксидазы хрена (ПХ) - это специфические белковые биополимеры, имеющие слабожесткую структуру, обладающие способностью связываться с антигенами и ускорять химические реакции. В процессе хранения при температуре 4°C они подвергаются отрицательному влиянию продуктов метаболизма микроорганизмов, буферных изменений, концентрации водородных ионов и других факторов, которые по нашим наблюдениям ограничивают срок их годности от нескольких дней до двух недель.

Известен способ консервации ИПК, заключающийся в том, что после приготовления его хранят при минус 20°C в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА) концентрацией 10 мг/мл [1].

Недостатками данного способа являются необходимость хранения готового продукта отдельно от остальных ингредиентов для постановки ТИФА и создание особых условий при транспортировке по «холодовой цепи».

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ консервации ИПК, включающий добавление к нему БСА из расчета 10 мг/мл и лиофилизацию с последующим хранением при 4°C [2].

Недостатком способа является то, что использование БСА в качестве стабилизирующей среды при лиофилизации препарата ограничивает срок годности иммуноферментного конъюгата 12 месяцами [3, 4].

Целью изобретения является разработка способа консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, которая может служить альтернативой БСА при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей на более продолжительный срок.

Технический результат изобретения достигается тем, что при консервации ИПК в качестве стабилизирующей среды высушивания используют белковый стабилизатор (БС), приготовленный на основе водной эмульсии белка куриного яйца, обладающий регулируемым составом белковых биополимеров с инертными поверхностными свойствами. Во время лиофильного высушивания молекулы ИПК оказываются между мономерами белков стабилизатора, благодаря чему активные центры фермента и иммуноглобулинов защищены от потери специфической активности под воздействием факторов окружающей среды во время высушивания и последующего хранения.

Стабилизирующая среда высушивания ИПК должна обладать рядом необходимых свойств: не препятствовать связыванию иммуноглобулинов с антигеном; обеспечивать возможность проникновения субстрата к активному центру ПХ; оставаться инертной по отношению к химическим характеристикам продукта, способствуя сохранению его биологической активности как в жидком, так и в высушенном состоянии; удерживать в процессе лиофилизации высушиваемый продукт внутри ампулы, предотвращая его улетучивание с сублимированными водяными парами; обеспечивать высокий уровень активности препарата в течение срока хранения [5].

Принимая во внимание выше перечисленные факторы, и учитывая свойства биополимеров водной эмульсии белка куриного яйца, очевиден вывод, что наиболее подходящей стабилизирующей средой высушивания для ИПК является БС, приготовленный из белка куриного яйца по ранее разработанному и запатентованному методу [6].

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по методу P.K. Nacane, A. Kawaoi [1]. Для конъюгации IgG использовали фермент ПХ - тип VI-A, RZ-3 (Sigma, США). ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двухуглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия и инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре в течение 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок, что является признаком образования активной формы ПХ. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. Активированную пероксидазу хрена диализировали против 1 л 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

К активированной ПХ добавляли 5 мг IgG против возбудителя туляремии в 1 мл 0,01 M раствора КББ (специфическая активность в реакции иммунодиффузии (РИД) не менее 1:16-1:32). Инкубацию реакционной смеси проводили при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. По истечении времени добавляли 5 мг боргидрида натрия и оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. БС использовали в различных разведениях (от нативного до 1:2) с 0,1 M раствором стерильного ФСБ и добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C.

Физические свойства (растворимость, цветность, прозрачность, потеря в массе при высушивании) и иммунохимические (специфическая активность, чувствительность) контролировали после лиофилизации ИПК в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) и после разведения. Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Приготовленные серии препарата соответствовали основным требованиям нормативных документов.

В таблице 1 представлены результаты изучения физических и иммунохимических свойств туляремийного ИПК, лиофильно высушенного в присутствии БС, подлежащего хранению в течение 18 месяцев (срок наблюдения).

При использовании в качестве стабилизирующей среды высушивания БС в различных разведениях с 0,1 M раствором стерильного ФСБ наилучшие результаты специфической активности ИПК и его чувствительности, а также стабильность характеристик в процессе хранения получены с разведением 1:1,5 (серия 3).

Таким образом, в результате проведенных исследований отработан способ консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, обеспечивающей стабильность физических и иммунохимических показателей лиофилизированного и растворенного препарата.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии нативного БС.

Получение ИПК. ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двууглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия, инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. После диализировали против 1 л 0,01 M раствора КББ pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

Раствор активированной ПХ переносили из диализного мешка во флакон и добавляли IgG против возбудителя туляремии в концентрации 5 мг/мл в 1 мл 0,01 M КББ со специфической активностью в РИД не менее 1:16-1:32, содержимое перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. Добавляли 5 мг боргидрида натрия, оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M раствора ФСБ pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. К готовому ИПК добавляли БС в нативном состоянии в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C (серия 1).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения). Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Специфическая активность и чувствительность препарата не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 2. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:1 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 2).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность ИПК не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 3. Получение ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного в 1:1,5 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1,5 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 3).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 4. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:2 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:2 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 4).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Чувствительность - снизилась в 2 раза после 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата, используемого для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе, отличающийся тем, что к иммунопероксидазному конъюгату добавляют раствор белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца в 0,1 M растворе фосфатно-солевого буфера (1:1,5) в объемном соотношении 1:1, после чего препарат разливают по 0,2 мл в ампулы, замораживают, лиофилизируют и хранят при температуре 4-6°C в течение 18 месяцев.



 

Похожие патенты:
Группа изобретений относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики цитомегаловирусной инфекции методом иммунного блоттинга, который является референтным, наиболее высокочувствительным, высокоспецифичным, подтверждающим (или исключающим) диагноз при подозрении на инфицирование в случае получения положительных или сомнительных (неопределенных) результатов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.
Изобретение относится к медицине, в частности к вопросу изучения антиадгезивной активности противохолерных иммуноглобулинов и усиления ее для совершенствования специфической профилактики холеры.
Изобретение относится к медицине и касается способа получения референс-панели образцов сывороток, предназначенной для оценки специфичности результатов серологической диагностики социально значимых заболеваний, включающего: исследование образцов доноров и пациентов на наличие инфекционного материала, отбор для отрицательной части референс-панели образцов, не содержащих антитела к вирусу гепатита С (ВГС), поверхностного антигена HBsAg вируса гепатита В (ВГВ), раннего белка р24 и антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также антитела к Treponema pallidum, отбор для положительной части референс-панели образцов, содержащих антитела к ВИЧ, ВГС, HBsAg и Treponema pallidum и введение в отобранные образцы стабилизирующего состава.

Группа изобретений относится к медицине и касается калликреина, его варианта или фрагмента, имеющих общие эпитопы, распознаваемые антителами, с калликреином дикого типа, использующегося для получения диагностической композиции для in vitro диагностики аллергии I типа, где калликреин получен у собаки; способа получения композиции аллергенов, включающего стадию добавления калликреина собаки, или его варианта или фрагмента; способа выделения калликреина из мочи собаки.

Изобретение относится к области:- медицины, а именно к диагностике нарушений функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и мониторингу эффективности проводимой терапии; - иммуно-диагностики, а именно к определению уровня содержания натуральных антител в сыворотке крови; - пептидной химии, а именно к конструированию и модификации синтетических пептидных фрагментов для использования в качестве антигена для определения натуральных антител к природным белкам человеческого организма, в частности для определения натуральных антител к белку S100 человека.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП). .

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа получения антигена из сетарий. .
Изобретение относится к медицине, а именно к малоинвазивным методам в хирургической эндокринологии, и касается дифференциальной диагностики образований шеи. Способ включает ультразвук-контролируемую тонкоигольную аспирационную пункционную биопсию, которую выполняют однократно одной иглой через один прокол. Полученный материал выдавливают из иглы для выполнения цитологического исследования. После этого проводят смыв из аспирационной иглы оставшегося материала для определения уровня паратиреоидного гормона и тиреоглобулина. Смыв из иглы при этом осуществляют предварительно подготовленной сывороткой, в качестве которой используют смесь сывороток от здоровых доноров с заведомо известным уровнем паратиреоидного гормона и уровнем тиреоглобулина. Способ уменьшает травматичность диагностических манипуляций, сокращает время для уточнения диагноза при планировании объема оперативного лечения, экономичен и прост в выполнении, применим в стационарных и амбулаторных условиях, без обезболивания. 2 пр.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов. При осуществлении предлагаемого способа получения сыворотки для диагностики алеутской болезни норок (АБН) получают высокоочищенный вирусный антиген путем гомогенизации органов инфицированных АБН норок с последующим трехкратным замораживанием/размораживанием гомогената, дезинтеграции клеточного гомогената трехкратной ультразвуковой обработкой, осаждением неразрушенных клеток двукратным низкоскоростным центрифугированием, последующим осаждением иммунных комплексов, уплотнением осадка низкоскоростным центрифугированием, экстрагированием иммунных комплексов (ИК) минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратной экстракции на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, осаждением ИК высокоскоростным центрифугированием из объединенных экстрактов при 30000 об/мин в течение 2,5 часов, извлечением ИК из осадка минимальными количествами ТНЭ буфера путем трехкратного экстрагирования на холоду в течение 1-2 часов с последующим низкоскоростным центрифугированием, диссоциацией иммунных комплексов в кислой среде в течение 1 часа на холоду, отделением вируса АБН-Ф от антител высокоскоростным ультрацентрифугированием, растворением осадка в минимальном количестве карбонатного буфера, отделением ферритина от вирусных частиц на колонке с сефарозой 6B в системе карбонатного буфера. После чего проводят иммунизацию кроликов микроколичествами очищенного антигена в пять этапов с получением сыворотки с высоким титром антител к вирусу АБН - 1/16384. Технический результат: получение диагностической сыворотки с высоким титром, позволяющей тестировать вирус АБН в различных биологических жидкостях. 3 з.п. ф-лы, 2 пр., 4 ил.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения эритроцитарного сибиреязвенного антигена для набора определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы. Для этого способ включает предварительное получение фильтрата, помещение его в диализный мешочек, хранение в висячем положении в холодильнике при температуре +4°С до концентрации от первоначального объема, подготовку 2,5%-ной суспензии фомалинизированных эритроцитов. Предварительно проводят отбор крови интактных баранов во флаконы со стеклянными шарами, перемешивание в течение 15 минут, разведение 1:1 фосфатно-буферным раствором рН 6,4, добавление смеси из расчета 100 мл разведенной крови на 20 мл нейтрального формалина и 20 мл фосфатно-буферного раствора рН 7,2, помещение в термостат на 2 часа при температуре +37°С с постоянным перемешиванием. Последующее центрифугирование со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут, 4-кратное отмывание осевших эритроцитов и суспендирование в 400-500 мл фосфатно-буферном растворе рН 7,2, помещение эритроцитарной взвеси в холодильник при температуре +4°С. Проводят удаление через 48 часов надосадочной жидкости, 4-кратное отмывание осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, разведение полученного осадка фосфатно-буферным раствором рН 6,4, приготовление 2,5% суспензии, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации. Далее 3-кратное отмывание 2,5%-ной полученной суспензии фосфатно-буферным раствором рН 7,2 на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут на каждое с последующим смешиванием в равных объемах с танином, 20-минутной выдержкой в водяной бане при температуре +37°С и 3-кратным отмыванием на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждый. Дальнейшее удаление надосадочной жидкости и залив осадка фосфатно-буферным раствором рН 7,2, а после окончания отмывания разбавление осевших эритроцитов фосфатно-буферным раствором рН 6,4 из расчета получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов, консервирование формалином до его 1%-ной концентрации и дальнейшего 3-кратного отмывания на центрифуге со скоростью 1500 об/мин по 10 минут каждое фосфатно-буферным раствором рН 7,2. Добавляют к полученным из расчета 100 мл отмытым формалинизированным эритроцитам 5 мл фильтрата, проводят сенсибилизацию в течение 2 часов на водяной бане при температуре +37°С в присутствии 0,2%-ного глютарового альдегида с дальнейшим отмыванием и добавлением 0,5%-ной инактивированной нормальной лошадиной сыворотки и приготовлением из осадка 2,5% взвеси эритроцитов. После чего полученный эритроцитарный сибиреязвенный антиген консервируют 1% формалином, расфасовывают по флаконам и хранят в холодильнике при температуре +4°С. Группа изобретений относится также к набору определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы. Использование данной группы изобретений позволяет получить чувствительный и достоверный метод определения антител в сыворотке крови животных, вакцинированных против сибирской язвы, в РНГА для контроля напряженности поствакцинального иммунитета, выявить животных с низким титром антител и толерантных, своевременно принять меры по профилактике заболевания. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 пр., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано в технологии изготовления референс-панели сывороток, содержащих антигены и антитела к тестируемому вирусу, для контроля чувствительности, специфичности тест-систем иммуноферментных, иммунохемилюминесцентных и иммуноблотов. Способ получения референс-панели сывороток для контроля качества тест-систем и иммуноблотов, используемых для серологической диагностики маркеров ВИЧ-1, включает отбор иммуноспецифических сывороток, содержащих антитела ко всем основным антигенам вируса и имеющих разную концентрацию этих антител, а также отбор нативных донорских сывороток с нулевым титром. Отбор сывороток для панелей производят по результатам их исследования методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на наличие инфекционного материала и титрования в подтверждающем анализе, тестируют вирусную нагрузку в реактивных сыворотках и в качестве иммуноспецифических сывороток выбирают только те сыворотки, которые в процессе титрования закономерно уменьшают величину оптической плотности (ОП) в ИФА и величину аналитического сигнала в ОТ ПЦР, которые затем аттестуют на количественное содержание в них РНК ВИЧ-1. В качестве донорских сывороток с нулевым титром выбирают только те, которые имеют отрицательный результат в ОТ-ПЦР и в ИФА - значение ОП<ОПкр для всех серологических маркеров. Отобранные реактивные сыворотки развитой стадии ВИЧ-1 инфекции разводят разводящим раствором (РР), не содержащим антитела к тестируемому вирусу, с получением разной концентрации антител ВИЧ-1. Для формирования референс-панели отбирают также 6 сывороток с нулевым титром для контроля специфичности тестов, 12 сывороток с различным титром р24 и 12 сывороток развитой стадии ВИЧ-1 инфекции с титром меньше 1:200, причем часть иммуноспецифических образцов содержат маркеры коинфекции ВИЧ с гепатитами В и С и туберкулеза при общем количестве сывороток в референс-панели не менее 30. Изобретение обеспечивает достоверную оценку качества молекулярных и серологических анализов на стадиях до и в начале сероконверсии в области низких значений оптической плотности, близких к ОПкр, и в присутствии серологических маркеров коинфекции (гепатитов С и В и туберкулеза). 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения диагностикума для определения концентрации лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями. Для этого получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом от 2,5 до 3 кг с помощью введения препарата «Альтевир» в дозе 100 мкг по белку в паховый лимфатический узел в количестве 3-х инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител; выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора, помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор, перемешивают, вливают метанольную воду, при этом понижая температуру до -5°С, после стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 мин, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин; готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,2±0,1 мкм, которые окрашивают сафранином, после этого носитель отмывают дистиллированной водой при 100°С и обрабатывают танином; проводят иммобилизацию сенситина на носитель, для этого суспензию микросфер в количестве 100 мг помещают в центрифужный стакан, суспензируют в 5 мл забуферного физиологического раствора и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С, отмытый носитель суспендируют в 2 мл забуференного физиологического раствора и при постоянном перемешивании соединяют с сенситином в количестве 1,2 мг белка, оставляют для контакта в течение 2-х ч при комнатной температуре, при этом дальнейшую иммобилизацию осуществляют при температуре 4-5°С в течение 16-18 ч; блокируют свободные альдегидные группы путем добавления к суспензии носителя с сенситином 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе при рН 7,1, оставляют на 2 ч при помешивании на электромешалке при комнатной температуре; трижды отмывают полученный диагностикум забуференным физиологическим раствором при рН 7,1, предварительно центрифугируя при 3000 об/мин в течение 10 мин, конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе при рН 7,1; определяют чувствительность препарата, для этого в лунки планшета вносят 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл «Альтевира» с содержанием белка 60 мкл/мл и двукратно титруют до 22-й лунки включительно, причем из последней 22-й лунки удаляют 50 мкл жидкости, 23-я и 24-я лунки служат контролем на спонтанную агглютинацию диагностикума, при этом во все лунки двух рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 ч инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 19-я, дающая положительный результат - розовый агломерат, разведение которой равно 23,5 пг белка/мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а активность и специфичность жидкого антигенного препарата проверяют в реакции агломерации объемной (РАО); лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозно-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл с последующим высушиванием при комнатной температуре в течение суток. Использование данного диагностикума позволяет определить концентрацию лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями, что дает возможность оценить эффективность лечения. 2 з.п. ф-лы, 7 пр.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и санитарной эпидемиологии. Предложен способ получения имитаторов патогенных биологических агентов путем обработки суспензии клеток возбудителя опасного инфекционного заболевания СВЧ-облучением с частотой 2450 МГц, мощностью 6 Вт/см3 двукратно по 5 минут. Инактивированные бактерии стабилизировали защитной средой и высушивали в сублимационной камерной установке до остаточной влажности 2-5%. Целевой продукт состоит из сухой культуры инактивированных бактерий (91,5%), талька (8%) и аэросила (0,5%). Способ обеспечивает получение безопасного при использовании и длительно сохраняющего свои индикационные свойства имитатора патогенного биологического агента. 2 табл., 5 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано при получении эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных. Для этого получают антигенную фракцию путем культивированием производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с последующим отделением бактериальной массы и ресуспендированием 0,8-1,2% раствором дезмола до концентрации 4-10 млрд/мл микробных тел. Далее прогревают в течение 55-65 мин при температуре 93-98°C и смесь центрифугируют при 1,5-3,0 тыс. g, в течение 20-30 мин. К супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,3-0,4% и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 суток. Затем к реакционной смеси добавляют формализованные эритроциты, взятые в конечной концентрации 9-12%, а целевой продукт получают инкубированием реакционной смеси с формализованными эритроцитами при 40-46°C в течение 1,5-2 час с последующим охлаждением до их комнатной температуры и отмывкой. Использование данного способа - получение эритроцитарного антигена для диагностики некробактериоза животных - позволяет увеличить срок хранения целевого продукта при сохранении его специфической активности. 3 з.п. ф-лы, 7 пр.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. Использование заявленного изобретения обеспечивает повышение чувствительности серологического способа диагностики лейкоза с применением РИД благодаря повышению уровня вирусспецифических антител. 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. Для этого проводят экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении. Обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом с последующим диализом и выделяют О-полисахарид центрифугированием. Использование данного способа позволяет получить комплексный антиген, содержащий О-полисахаридный М- и А-антигены, при этом включение в комплекс М-компонента значительно повышает чувствительность реакции иммунодиффузии при диагностике бруцеллеза, вызываемого B. Melitensis. 1 пр.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе. Изобретение заключается в разработке способа консервации иммунопероксидазного конъюгата с применением в качестве стабилизирующей среды высушивания раствора белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей. Изобретение позволяет сохранять стабильность физических и иммунохимических показателей иммунопероксидазных конъюгатов в течение длительного срока. 1 табл., 3 пр.

Наверх