Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, а также в торакальной хирургии для создания биоинженерного органа в качестве трансплантата. Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте включает введение крысе антикоагулянта, выделение органа, очищение его от окружающей жировой ткани, канюлирование аорты, осуществление децеллюляризации путем перфузии в биореакторе, а также контроль качества полученного каркаса на биосовместимость и жизнеспособность. При этом антикоагулянт гепарин вводят крысе интраперитонеально в дозе 100 ЕД перед забором органокомплекса сердце-легкие. Аорту канюлируют выше уровня отхождения левой подключичной артерии с последующим лигированием ветвей дуги аорты. Осуществляют лигирование устья полых вен, отсекают легкие. Перфузию для децеллюляризации осуществляют в течение 28 часов через аорту при атмосферном давлении и скорости потока реагентов через орган 2,4-3,6 мл/минуту. При этом перфузию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина и деионизированной водой проводят по 1,5 часа. Затем используют 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА в течение 3,5 часов. Фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина используют в течение 1 часа, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД /200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - в течение 2,5 часов. Завершают децеллюляризацию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина со сменой раствора каждые 6 часов. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Способ позволяет сократить время экспозиции перфузионных растворов, снизить вероятность бактериальной контаминации, повысить качество получаемого каркаса в сравнении с другими способами того же назначения, оценить биосовместимость и жизнеспособность клеток, засеянных на каркас. 6 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, торакальной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного органа в качестве трансплантата.

Сердечно-сосудистые заболевания - основная причина инвалидизации и преждевременной смерти жителей экономически развитых стран [ВОЗ. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/]. Рост заболеваемости, поражение людей все более молодого возраста делают эти болезни важнейшей медико-социальной проблемой здравоохранения [ВОЗ. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics]. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) - одно из самых частых осложнений заболеваний сердечно-сосудистой системы. Количество больных, которые достигают терминальной стадии ХСН, постоянно растет. Трансплантация сердца - хирургический способ лечения терминальной стадии ХСН. Каждый год в мире проводят более 5400 операций по пересадке сердца [ВОЗ. http://www.who.int/transplantation/gkt/statistics/en/]. В настоящее время, основные проблемы трансплантологии связаны с острой нехваткой донорских органов, сложностью их доставки, трудностью поиска иммунологически совместимых органов и пожизненным назначением иммуносупрессивной терапии [Fuchs J.R et al., 2001]. Поэтому одной из наиболее перспективных задач можно считать развитие тканевой инженерии, как одного из направлений регенеративной медицины [Murphy S.V. et al., 2012, Taylor D.A. 2009].

В развитии современной тканевой инженерии приоритетным направлением является разработка биоинженерных каркасов и биоматериалов, применение которых позволило бы решать как этические, так и иммунологические проблемы трансплантологии. Для создания органов и тканей будут использоваться каркасы или матриксы (биологические или искусственные), клетки (ауто-, алло-, ксеногенные), биореакторы и биоактивные молекулы [Fuchs J.R et al., 2001, McIntire L.V. et al. 2002., Langer R. et al. 1993., Skalak R. Et al. 1988., Amulya S. 2005., Atala A. 2005].

Децеллюляризация - это способ получения биологических каркасов, который направлен на удаление клеток с сохранением внеклеточного матрикса (ВКМ) и трехмерности структуры органа [Badylak S.F. et al. 2011]. Межклеточное вещество рыхлой волокнистой соединительной ткани состоит из волокон и аморфного вещества. Оно является продуктом деятельности клеток этой ткани, в первую очередь фибробластов. Архитектоника и состав ВКМ в каждой ткани являются уникальными, определяют функциональность этой ткани. Тем не менее, структура и состав каждого конкретного белка ВКМ остаются неизменными у различных видов [Exposito J.Y. et al. 1992., Bernard M.P. et al. 1983., Bernard M.P. et al. 1983]. Это способствуют тому, что ВКМ одних видов не вызывает иммунного отторжения у других. При правильном удалении клеточных антигенов, которые вызывают иммунное отторжение без повреждения ВКМ, полученный каркас может служить мощным источником сигналов и содействовать конструктивному ремоделированию тканей после повреждения. «Конструктивное ремоделирование» означает, что каркас ВКМ содействует формированию участка соответствующей ткани в месте имплантации, вместо образования рубцовой ткани [Badylak S.F. 2007]. Для создания соответствующего требованиям каркаса биоинженерного органа требуется: во-первых, воссоздать структуру, сходную с нативной; во-вторых, развитая сосудистая сеть, способная обеспечить адекватную перфузию тканей; в-третьих, необходимо, чтобы клетки, используемые при рецеллюляризации, были способны к дифференцировке во все паренхиматозные и сосудистые структуры органа; в-четвертых, иметь возможность управления микроокружением клеток для воздействия на их физиологию и функции; в-пятых, должна существовать возможность управления дифференцировкой и созреванием клеток in vitro [Taylor D., 2009].

С учетом высокой смертности от хронических заболеваний сердечнососудистой системы, весьма актуальной является разработка способа моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе.

В частности, известен способ децеллюляризации сердца свиньи [Wainwright J.M., Czajka С.А., Patel U.B. et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue engineering: Part C; 2010; 16(3): 525-532]. Протокол включает в себя заморозку сердца свиньи при -80°C, с последующей перфузией через аорту очищенной водой, фосфатно-буферным солевым раствором, детергентами и ферментами: растворами, содержащими 0,02% трипсина, 0,05% ЭДТА, 0,05% NaN3, 3% тритона Х-100, 4% дезоксихолата натрия, а также дезинфекцию каркаса перфузией раствора, содержащего 0,1% надуксусной кислоты и 4% этанола и отмывку каркаса фосфатно-буферным солевым раствором и очищенной водой с общей продолжительностью 25 часов. Контроль качества полученного каркаса определяют гистологическими методами, путем сканирующей электронной микроскопии, количественного определения остаточного уровня ДНК, гликозаминогликанов, а также изучением механических свойств.

Основными недостатками данного способа являются использование больших объемов дорогостоящих реагентов для проведения децеллюляризации, а также необходимость длительного размораживания нативного сердца после извлечения из морозильной камеры, повышающая риск бактериальной контаминации. Способ предусматривает контроль получаемого биоинженерного каркаса сердца только по данным гистологического исследования, по оценке механических и эластических свойств каркаса. Также в данном протоколе децеллюляризацию проводят на модели сердца свиньи, что, в связи с физиологическими отличиями животных, не может транслироваться на модель сердца крысы без изменений и дополнений.

За ближайший аналог принят способ проведения децеллюляризации сердца крысы [Ott Н.С, Matthiesen T.S, Goh S.K. et al. Perfusion decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 2008; 14:213-21], заключающийся в выделении сердца крысы, очищении его от окружающей жировой клетчатки, канюлировании аорты до уровня отхождения плечеголовного ствола, проведении ретроградной перфузии сердца через аорту фосфатным буфером (PBS) с добавлением антикоагулянта гепарина, аденозина и антибиотика-антимикотика, деионизированной водой и растворами детергентов: 1% додецилсульфата натрия и 1% тритона Х-100 в течение ~137 часов. Контроль качества децеллюляризации проводился путем гистологического исследования, анализа морфологической структуры, количественного определения уровня ДНК и механических свойств полученного каркаса.

Основным недостатком данного способа является длительность проведения децеллюляризации, создающая угрозу бактериальной контаминации каркаса, нарушения структуры каркаса в связи с длительностью воздействия детергентов и их высокой концентрацией.

Задачи: максимальное сохранение гистологической структуры внеклеточного матрикса сердца, обеспечение щадящего режима обработки биологического материала, снижение концентрации детергентов, времени экспозиции растворов и вероятности бактериальной контаминации получаемого каркаса, т.е. повышение качества получаемого биоинженерного материала и обеспечение контроля его качества.

Сущностью предлагаемого способа моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе является то, что антикоагулянт гепарин вводят крысе интраперитонеально в дозе 100 ЕД перед забором органокомплекса сердце-легкие, аорту канюлируют выше уровня отхождения левой подключичной артерии с последующим лигированием ветвей дуги аорты, осуществляют лигирование устья полых вен, отсекают легкие, перфузию для децеллюляризации осуществляют в течение 28 часов через аорту при атмосферном давлении и скорости потока реагентов через орган 2,4-3,6 мл/минуту, при этом перфузию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина и деионизированной водой проводят по 1,5 часа, затем используют 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА в течение 3,5 часов, фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина - в течение 1 часа, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 2,5 часов и завершают децеллюляризацию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина со сменой раствора каждые 6 часов, причем жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.

Техническим результатом способа является сокращение времени экспозиции перфузионных растворов. Ранее использовавшиеся протоколы повреждали каркас сердца и несли высокий риск развития бактериальной контаминации, что крайне неблагоприятно сказывалось на качестве полученного каркаса сердца и возможности последующего создания биоинженерного органа. Применение дезоксихолата натрия, снижение времени воздействия децеллюляризирующих растворов полностью нивелирует негативные эффекты известных способов того же назначения. Кроме того, способ предусматривает оценку биосовместимости и жизнеспособности клеток, засеянных на каркас, по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (МТТ-тест).

Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе осуществляют следующим образом: для децеллюляризации используют предварительно гепаринизированных крыс (интраперитонеально вводят 100 ЕД антикоагулянта гепарина). Выделяют органокомплекс сердце-легкие. Очищают от окружающей жировой ткани. Аорту канюлируют на расстоянии 3-3,5 см от сердца выше уровня отхождения левой подключичной артерии. Ветви дуги аорты: плечеголовной ствол, левую общую сонную и левую подключичную артерии лигируют. Переднюю и заднюю полые вены отсекают. Устья полых вен лигируют. Отсекают легкие. Для проведения децеллюляризации сердце помещают в биореактор и начинают ретроградную перфузию жидкости через аорту в течение 28 часов при атмосферном давлении и скорости потока реагентов 2,4-3,6 мл/мин. Этапы децеллюляризации: фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина - 1,5 часа, деионизированная вода - 1,5 часа, дезоксихолат натрия 4% в комбинации с 0,002М Na2 - ЭДТА - 3,5 часа, фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина - 1 час, свиная панкреатическая ДНКаза-I 2000 ЕД /200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 2,5 часа, фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина - 18 часов, со сменой раствора каждые 6 часов. Все растворы должны быть стерильными.

Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами гистологического исследования (окрашивание гематоксилином и эозином, по Ван Гизон, трихромом по Массону, флуорофором DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндолом)), сканирующей электронной микроскопии для подтверждения сохранности архитектоники внеклеточного матрикса сердца и отсутствия клеточных элементов на сердечном каркасе, количественного определения уровня оставшейся ДНК [Badylak S.F. et al., 2011], а также путем определения предельных биомеханических параметров на растяжение каркаса на универсальных испытательных машинах фирмы Инстрон модель 5965 (датчик 50 Н) и на Lloyd LRX (100 N load cell) [Witzenburg С. et al., 2012]. Сохранность белков внеклеточного матрикса и отсутствие внутриклеточных белков определяют при помощи иммуногистохимического исследования [Ott Н.С.et al., 2008]. Проходимость сосудистого русла определяют перфузией через аорту 0,4% раствора трипанового синего. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют путем колориметрического анализа с использованием МТТ-реагента по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде, в целях установления цитотоксичности полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации. Колориметрический анализ проводят согласно рекомендациям в инструкции производителя (инструкция прилагается). Также для определения цитотоксичности каркаса проводят дифференциальное окрашивание живых и мертвых клеток с применением флуоресцентных красителей - кальцеина AM (окрашивает живые клетки) и гомодимера этидия (окрашивает мертвые клетки).

Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (сердце) экспериментальных животных (крысы). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получены естественные каркасы органов, с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур.

Данный способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе использован в эксперименте на 50 крысах-самцах линии Lewis. Выполнены забор и фиксация в биореакторе сердца с последующей децеллюляризацией по предлагаемому способу.

Пример: после проведения эвтаназии передозировкой наркотических средств в соответствии с этическими требованиями и интраперитонеального введения 100 ЕД гепарина произвели забор органокомплекса сердце-легкие у крысы-самца линии Lewis весом 200 г. Органокомплекс очистили от окружающей жировой ткани, лигировали устья полых вен, плечеголовной ствол, левую общую сонную артерию, левую подключичную артерию, отсекли легкие, канулировали аорту и фиксировали в биореакторе. Начали децеллюляризацию сердца путем перфузии сердца через аорту децеллюляризирующими растворами: фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина в течение 1,5 часов, деионизированной водой - 1,5 часа, 4% водным раствором дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА 3,5 часа, фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина в течение 1 часа, свиной панкреатической ДНКазой I (2000 ЕД растворили в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 2,5 часа, фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина в течение 18 часов со сменой раствора каждые 6 часов. Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляли методами гистологического исследования (окрашиванием гематоксилином и эозином, по Ван Гизон, трихромом по Массону, флуорофором DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндолом)), путем применения сканирующей электронной микроскопии для подтверждения сохранности архитектоники внеклеточного матрикса сердца и отсутствия клеточных элементов на сердечном каркасе, количественно определили уровень оставшейся ДНК, установили предельные биомеханические параметры на растяжение каркаса на универсальных испытательных машинах фирмы Инстрон модель 5965 (датчик 50 Н) и на Lloyd LRX (100 N load cell). Сохранность белков внеклеточного матрикса (коллагена I, III и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина) и отсутствие внутриклеточных белков (актина, тропомиозина, фактора Виллебранда) определили при помощи иммуногистохимического исследования, по наличию либо отсутствию специфичной реакции с антителами против данных белков. Проходимость сосудистого русла выявили перфузией через аорту 0,4% раствора трипанового синего, которая показала проходимость коронарных артерий и позволила визуализировать сосуды вплоть до артерий третьего-четвертого порядка. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяли путем колориметрического анализа с использованием МТТ-реагента по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (МТТ-тест) в целях установления цитотоксичности полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации. Также для определения цитотоксичности каркаса провели дифференциальное окрашивание живых и мертвых клеток с применением флуоресцентных красителей - кальцеина AM (окрашивал живые клетки) и гомодимера этидия (окрашивал мертвые клетки).

В результате экспериментов по децеллюляризации получен каркас сердца с сохранением гистологической архитектоники и белков внеклеточного матрикса. Результаты рецеллюляризации показывают, что полученный каркас не является токсичным для клеток.

Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе, включающий введение крысе антикоагулянта, выделение органа, очищение его от окружающей жировой ткани, канюлирование аорты, осуществление децеллюляризации путем перфузии в биореакторе, а также контроль качества полученного каркаса на биосовместимость и жизнеспособность, отличающийся тем, что антикоагулянт гепарин вводят крысе интраперитонеально в дозе 100 ЕД перед забором органокомплекса сердце-легкие, аорту канюлируют выше уровня отхождения левой подключичной артерии с последующим лигированием ветвей дуги аорты, осуществляют лигирование устья полых вен, отсекают легкие, перфузию для децеллюляризации осуществляют в течение 28 часов через аорту при атмосферном давлении и скорости потока реагентов через орган 2,4-3,6 мл/минуту, при этом перфузию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина и деионизированной водой проводят по 1,5 часа, затем используют 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА в течение 3,5 часов, фосфатный буфер с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина - в течение 1 часа, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 2,5 часов и завершают децеллюляризацию фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина со сменой раствора каждые 6 часов, причем жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в патологической и сравнительной анатомии человека и животных. Для изготовления сухого анатомического препарата сердца используют эвисцерированное невскрытое сердце, отпрепарированное путем удаления эпикарда и субэпикардиальной клетчатки.

Изобретение относится к медицине и может быть применимо для освоения техники сухожильного шва. Тренажер состоит из опорной платформы, на которой закреплен, по меньшей мере, один стержень, имитирующий сухожилие, опорная платформа выполнена из пластика, при этом каждый из стержней, имитирующих сухожилие, выполнен из прозрачного силикона, его длина не превышает наибольший размер опорной платформы в соответствующем направлении, кроме того, стержни, имитирующие сухожилие, закрепляют на опорной платформе с небольшим натяжением по концам и возможностью замены указанных стержней.

Изобретение относится к области медицины, а именно к нормальной, патологической анатомии и судебной медицине. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к анатомии, патологической анатомии и топографической анатомии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к анатомии и патологической анатомии. .
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для изучения патогенеза варикозного расширения вен пищевода и желудка при портальной гипертензии.

Изобретение относится к устройствам для испытания средств индивидуальной защиты человека, в частности, к испытательным стендам для оценки защитных свойств шлемов от воздействия высокоскоростных поражающих элементов и вторичных осколков.

Изобретение относится к устройствам для испытания средств индивидуальной защиты человека, в частности к испытательным стендам для оценки защитных свойств шлемов от воздействия высокоскоростных поражающих элементов и вторичных осколков.
Наверх