Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации



Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации
Производное гиалуроновой кислоты, способ его получения и способ его модификации

 


Владельцы патента RU 2550602:

КОНТИПРО ФАРМА А.С. (CZ)

Изобретение относится к способам получения и модификации производного гиалуронана, содержащего альдегидную группу в положении (6) глюкозаминного полисахаридного фрагмента. Предложено производное гиалуроновой кислоты. Производное окислено по положению 6 глюкозаминного фрагмента до альдегида (формула X). Его гидратированную форму называют геминальным диолом (формула Y). Способ получения этого производного гиалуроновой кислоты предусматривает взаимодействие гиалуроновой кислоты с периодинаном Десса-Мартина (DMP) в полярном апротонном растворителе. Предпочтительно в качестве полярного апротонного растворителя используют диметилсульфоксид. Также предложен способ модификации полученного производного гиалуроновой кислоты. Окисленное производное гиалуроновой кислоты подвергают взаимодействию с амином общей формулы H2N-R или с гиалуронаном, замещенным группой -R-NH2, где R - алкил с линейной или разветвленной цепью C130 и необязательно содержит ароматические и гетероароматические группы. Изобретение позволяет получить производное гиалуроновой кислоты с различными возможностями дальнейшей модификации за счет альдегидной группы. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 14 пр.

,

 

Область техники

Изобретение относится к способу получения нового производного гиалуроновой кислоты, содержащего альдегидную группу -СН=O вместо первичной гидроксигруппы -СН2-ОН. Окисление можно осуществлять под воздействием периодинана Десса-Мартина (DMP) в полярных апротонных растворителях,

DMP - периодинан Десса-Мартина,

где растворителем может служить, например, диметилсульфоксид.

Предпосылки создания изобретения

Гиалуроновая кислота представляет собой важный полисахарид, состоящий из двух повторяющихся звеньев - (1,3)-D-глюкуроновой кислоты и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозамина. Его молярная масса находится в интервале 5,104-5,106 г-моль-1, в зависимости от исходного материала и от способа выделения продукта. Гиалуроновая кислота или ее натриевая соль - гиалуронан - важный компонент соединительной ткани и синовиальной жидкости суставов, она играет важную роль в таких биологических процессах, как гидратация, организация протеогликанов, а также клеточная дифференциация, пролиферация и ангиогенез. Гиалуроновая кислота - достаточно гидрофильный полисахарид, растворимый в воде в виде солей во всем интервале рН.

Окисление гиалуроновой кислоты

Окисление полисахаридов - процесс, сопровождающийся изменением степени окисления функциональных групп полисахарида. Как правило, образуются карбоновые кислоты или альдегиды, что может привести к резкому изменению свойств полисахарида. В большинстве случаев в реакции используют реагенты, содержащие атомы в высших степенях окисления.

Окисление проводили согласно способу селективного окисления сахаридов по первичной гидроксильной группе, описанному в работе Angelino, European Journal of Organic Chemistry, 2006, 19, 4323-4326, с помощью системы 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиноксильного радикала TEMPO и трихлоризоциануровой кислоты ТСС в ДМФА при температуре 0°С, при этом в качестве основного продукта был получен соответствующий альдегид.

Окисление циклодекстрина до моноальдегида описано в работе Comwell, Tetrahedron Letters 1995, 36 (46), 8371-8374. Окисление проводили прибавлением окислителя - периодинана Десса-Мартина (DMP) в ДМСО или ДМФА при температуре 20°С.

Окисление первичной гидроксигруппы гиалуронана до карбоновой кислоты под воздействием 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидиноксильного радикала (TEMPO) и NaOCl проводили при рН 10,2 и при температуре 0°С (схема 2) (Carbohydr Res 2000,327 (4), 455-61).

Аналогично другим полисахаридам, наблюдались высокая региоселективность и незначительное разложение полимера. При повышении концентрации соли (NaBr, NaCl, Na2SO4) в растворе скорость окисления несколько снижалась.

Окисление гиалуронана под воздействием системы TEMPO/NaClO было описано в патентной заявке WO 02/18448 А2. Авторы также исследовали взаимодействие полностью карбоксилированных полисахаридов при образовании биологических комплексов.

Скорость окисления ГК и других полисахаридов под воздействием периодата натрия исследована в работе Scott et al. (схема 3) (Histochemie 1969, 19 (2), 155-61). Изучалось количественное влияние таких факторов, как длина цепи, природа заместителей, конфигурация полимера и температура. Применение NaIO4 для окисления гиалуронана раскрыто также в патентах №№US 6 683 064 и US 6 953 784.

Изучены модельные реакции низкомолекулярных аналогов ГК в физиологическом буфере (Carbohydr Res 1999, 321, (3-4), 228-34). Продукты окисления глюкуронового и глюкозаминного фрагментов анализировали методом хромато-масс-спектрометрии. Результаты также позволяют предположить, что окисление идет в основном по глюкуроновому фрагменту, причем в качестве основного продукта образуется мезовинная кислота, которая может служить биомаркером окисления гиалуронана.

3.4.2. Применение окисленной ГК в реакциях сшивки

Применение окисленной ГК для получения сетчатых гидрогелей описано в работе Weng et al. (схема 4), J Biomed Mater Res A 2008, 85 (2), 352-65. В данном случае в реакцию вводили два исходных реагента - частично окисленный гиалуронан и желатин:

Физико-химические свойства полученных гидрогелей исследовали инструментальными методами - Фурье-ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и реометрии. При повышении степени замещения в гиалуронане наблюдалось соответствующее увеличение совместимости гидрогелей и снижение водопоглощающей способности. Исследование взаимодействия гидрогеля с клетками проводили с дермальными фибробластами. По данным анализа долгосрочной жизнеспособности клеток, как гидрогели, так и продукты их деградации были биосовместимы. При культивировании с клетками гидрогель разлагался в течение 4 недель с очевидной потерей целостности. Хорошая биосовместимость и биоразлагаемость были далее подтверждены в опытах на мышах при подкожной имплантации. Наконец, депонирование внеклеточного матрикса в гидрогелях in vitro и in vivo было показано методом СЭМ.

Способ получения сшитой ГК из окисленного гиалуронана и желатина методом обратной эмульсии, при котором трехмерный гидрогель получался в отсутствие добавок сшивающего агента, был описан в работе Weng et al., Biomaterials 2008, 29, (31), 4149-56. В указанной публикации методом ВЭЖХ изучали включение модельных лекарственных препаратов в структуру гидрогеля (инкапсулирование) и их высвобождение под воздействием макрофагов.

Получение эластичных гидрогелей сочетанием ГК, окисленной до ГК-альдегида под воздействием периодата натрия, и ГК, модифицированной дигидразидом адипиновой кислоты, было описано в работе Sahiner et al. (схема 5), J. Biomater. Sci. Polym. Ed 2008, 19 (2), 223-43.

По данным МТТ-теста, полученные производные не оказывали видимого воздействия на пролиферацию культивированных фибробластов.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к способу селективного окисления первичной гидроксигруппы гиалуроновой кислоты в положении 6 глюкозаминного фрагмента полисахарида до альдегидной группы. Реакцию проводят в апротонной среде под воздействием окислителя - периодинана Десса-Мартина (DMP). Предлагаемая методика отличается тем, что альдегидная группа при этом вводится в положение 6 глюкозаминного фрагмента гиалуронана (схема 6, структура 3). В ранее опубликованных методах вводилась либо альдегидная группа в положения 2 и 3 глюкуронового фрагмента гиалуронана с раскрытием сахаридного цикла (схема 6, структура 2), либо карбоксильная группа в положение 6 глюкозаминного фрагмента гиалуронана (схема 6, структура 1).

Преимущество способа согласно настоящему изобретению состоит в том, что в соответствующем продукте окисления (структура 3, схема 6) сохраняется строение сопряженных циклов сахаридов. Раскрытие цикла в продукте окисления до диальдегида (структура 2, схема 6) приводит к нарушению линейности цепи и, следовательно, к существенному изменению трехмерной структуры полисахарида по сравнению с немодифицированным гиалуронаном. Несмотря на то что в продукте окисления до карбоновой кислоты (структура 1, схема 6) разрыва линейности цепи не происходит, карбоксильная группа не обеспечивает столь разнообразных возможностей дальнейшей модификации (связывания), как альдегидная группа. Так как карбоксильная группа уже имеется в составе немодифицированного полисахарида, окисление до структуры 1 (схема 6) приводит только к повышению полярности полисахарида, а не придает ему новое свойство, применимое для связывание новых заместителей.

Известно, что альдегидная группа, связанная с алкильной группой, находится в воде в форме так называемого геминального диола ГК-СН(ОН)2, который взаимодействует с нуклеофилами аналогично альдегидам. По данным ЯМР спектроскопии, более 95% гиалуронана, окисленного по положению 6 глюкозаминного фрагмента (продукт 3, схема 6), в водных растворах представляет собой геминальный диол.

Согласно способу настоящего изобретения, гиалуроновую кислоту растворяют в полярных апротонных растворителях, например в ДМСО, затем прибавляют окислитель и далее реакционную смесь перемешивают при температуре от 10 до 50°С, предпочтительно при 20°С, в течение не менее 5 минут, предпочтительно от 1 до 150 часов, более предпочтительно хотя бы 10 часов.

Полученный окисленный гиалуронан может вступать в реакции связывания с другими веществами, например, содержащими аминогруппу. Связывание может приводить к образованию либо иминной формы, либо - после восстановления - аминной формы (восстановительное аминирование) (схема 7):

Обе части указанной модификации проводят в водном растворе, восстановление идет под воздействием NaBF3CN. Обе реакции, приведенные на схеме 7, можно провести в одну стадию.

Модификация производного гиалуроновой кислоты осуществляется при реакции окисленного производного с амином общей формулы H2N-R либо с гиалуронаном, замещенным группой -R-NH2, в которой R - алкил с линейной или разветвленной цепью C130, не обязательно содержащий ароматические или гетероароматические группы. Данный амин может представлять собой алкиламин, например бутиламин или гександиамин, аминокислоту, пептид или полисахарид, содержащий свободную аминогруппу. В случае применения диамина или соединений, содержащих три или более аминогруппы, возможно получение сетчатых производных гиалуронана. Сетчатые производные образуются также при взаимодействии альдегида с гиалуронаном, замещенным аминоалкильной группой ГК-алкил-NH2.

Подробное описание изобретения

DS=степень замещения = 100% × число молей введенного заместителя/число молей димеров полисахарида.

Термин «эквивалент (экв.)» в настоящем документе относится к димеру гиалуроновой кислоты, если не указано иное. Процентные доли в настоящем документе соответствуют массовым процентам, если не указано иное.

Молекулярную массу исходного гиалуронана (источник: CPN spol. s r.o., Dolni Dobrouc, CZ) определяли методом SEC-MALLS.

Пример 1 - Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием DMP

К 1%-ному раствору гиалуроновой кислоты (0,1 г, 20 кДа) в ДМСО прибавляли раствор DMP (0,2 экв.) в ДМСО (1 мл). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки).

Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР)

Спектр ПМР (D2O) δ 5,26 м.д. (с, 1Н, полимер-CH(ОН)2)
HSQC (D2O) кросс-пик 5,26 м.д. (1Н) - 90 м.д. (13С) (полимер-CH(ОН)2)
Фурье-ИК-спектр (KBr) 1740 см-1 -СН=O

Пример 2 - Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием DMP

К 0,5%-ному раствору натриевой соли гиалуроновой кислоты (0,1 г, 600 кДа) в ДМСО прибавляли раствор DMP (0,2 экв.) в ДМСО (1 мл). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 3 - Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием DMP

К 1%-ному раствору гиалуроновой кислоты (0,1 г, 20 кДа) в ДМСО прибавляли раствор DMP (1 экв.) в ДМСО (1 мл). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки), и против дистиллированной воды, 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 50% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 4 - Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием DMP.

К 1%-ному раствору гиалуроновой кислоты (0,1 г, 20 кДа) в ДМСО прибавляли раствор DMP (1 экв.) в ДМСО (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки).

Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 30% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 5 - Окисление гиалуроновой кислоты под воздействием DMP

К 1%-ному раствору гиалуроновой кислоты (0,1 г, 20 кДа) в ДМСО прибавляли раствор DMP (0,2 экв.) в ДМСО (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре 50°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1 NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 10% (по данным спектроскопии ЯМР, более подробно см. в Примере 1).

Пример 6 - Реакция окисленного гиалуронана с амином

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=30%, Пример 4) смешивали с бутиламином (0,4 экв.). Смесь перемешивали 24 часа при температуре 20°С. Осаждали двукратным количеством ацетона и 0,1 мл насыщенного водного раствора NaCl; отфильтровывали и сушили в вакууме.

Полученное желтое вещество анализировали.

ЭСП 328 нм, переход n→n* -CH=N-

Пример 7 - Реакция окисленного гиалуронана с бутиламином и последующее восстановление

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=50%, Пример 3) смешивали с бутиламином (0,4 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH3CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 35% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр 1H NMR(D2O) δ 3,05 (м, 2Н, полимер-СН2-NH-CH2-), 1,60 (м, 2Н, полимер-СН2-NH-СН2-CH2-), 1,35 (м, 2Н, полимер-СН2-NH-СН2-СН2-CH2-), 0,85 (м, 3Н, -СН2-CH3)

DOSY ЯМР (D2O) IgD (0,85 м.д., -СН2-СН3) ~ -10,3 м2

IgD (1,35 м.д., полимер-СН2-NH-СН2-СН2-СН2-) ~ -10,3 м2

IgD (1,60 м.д., полимер-СН2-NH-СН2-CH2-) ~ -10,3 м2

IgD (3,05 м.д., полимер-СН2-NH-CH2-) ~ -10,3 м2

IgD (2,03 м.д., CH3-СО-МН-полимер) ~ -10,3 м2

IgD H2O) ~ -8,6 м2/c

Пример 8 - Реакция окисленного гиалуронана с диамином и последующее восстановление

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=50%, Пример 3) смешивали с гександиамином (0,4 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBHaCN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Полученный раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 35% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр 1Н ПМР (D2O) δ 3,12 (м, 2Н, полимер-CH2-NH-CH2-), 3,02 (м, 2Н, -CH2-NH2), 1,7 (м, 4Н, -NH-СН2-CH2-СН2-СН2-CH2-), 1,45 (м, 4Н, -NH-СН2-СН2-CH2-CH2-СН2-)

ЯМР (D2O) DOSY IgD (1,45 м.д., -NH-СН2-СН2-CH2-CH2-СН2-) ~ -10,5 м2

IgD (1,7 м.д., -NH-СН2-CH2-СН2-СН2-CH2-) ~ -10,5 м2

IgD (3,02 м.д., -CH2-NH2) ~ -10,5 м2

IgD (2,03 м.д., CH3-СО-NH-полимер) ~ -10,5 м2

lgD(H2O) ~ -8,7 м2/c

Пример 9 - Реакция окисленного гиалуронана с аминогиалуронаном

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 g, степень замещения:

DS=30%, Пример 4) смешивали с 1%-ным водным раствором производного гиалуронана, замещенного гександиамином (1 экв., DS=35%, Пример 8) при температуре 20°С. Нерастворимый плотный смолистый осадок, образовавшийся через несколько минут, механически измельчали, мелкие фрагменты отделяли фильтрованием и сушили при пониженном давлении.

Фурье-ИК-спектр (KB г) 1700 см-1.

Пример 10 - Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием лизина

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=30%, Пример 4) смешивали с лизином (0,3 экв.). Смесь перемешивали 24 часа при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с раствором NaBH3CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали 24 часа при температуре 20°С. Полученный раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 25% (по данным спектроскопии ЯМР).

Спектр 1Н ПМР (HSQC, DOSY, 2%NaOD/D20):

δ 1,33 (м, 2Н, -СН-СН2-CH2-), 1,48 (м, 2Н, -СН-СН2-CH2-CH2-), 1,55 (м, 1Н, -СН-CHH-), 1,63 (м, 1Н, -CH- CHH-), 2,62 (м, 2Н, -CH-CH2-СН2-СН2-CH2-), 2,65 (м, 1 Н, полимер -CHH-NH-), 2,99 (м, 1Н, полимер- CHJ-NH-), 3,16 (м, 1Н, -CH-СН2).

Пример 11 - Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием лизина

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=30%, Пример 4) смешивали с лизином (20 экв.). Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH3CN (10 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали 24 часа при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 28% (по данным спектроскопии ЯМР, Пример 10)

Пример 12 - Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием серина

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=30%, Пример 4) смешивали с серином (0,3 экв.). Смесь перемешивали 1 мин при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH3CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали. DS 26% (по данным спектроскопии ЯМР).

1Н ПМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D2O), δ: 2,74 (м, 1Н, полимер-CHH-NH-), 3,08 (м, 1Н, полимер-CHH-NH-), 3,21 (м, 1Н, -CH-СН2-ОН), 3,72 (м, 1Н, -СН-CHH-ОН), 3,78 (м, 1Н, -СН-CHH-ОН).

Пример 13 - Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием аргинина

Водный раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения:

DS=30%, Пример 4) смешивали с аргинином (0,3 экв.). Смесь перемешивали в течение 100 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH3CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% NaHCO3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 23% (по данным спектроскопии ЯМР).

1Н ПМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D2O), δ: 1,61 (м, 2Н, -СН-СН2-CH2-), 1,63 (м, 1Н, -СН-CHH-), 1,70 (м, 1Н, -СН-CHH-), 2,65 (м, 1Н, полимер-CHH-NH-), 3,01 (м, 1Н, полимер -CHH-NH-), 3,13 (м, 1Н, -CH-СН2-), 3,21 (м, 2Н, -СН-СН2-СН2-СН2-).

Пример 14 - Восстановительное аминирование окисленного гиалуронана под воздействием пентапептида PAL-KTTKS (palmytoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)

Раствор окисленной гиалуроновой кислоты (1%) (0,1 г, степень замещения: DS=10%, Пример 1) в смеси вода/изопропиловый спирт 2:1 смешивали с 1%-ным раствором замещенного пентапептида PAL-KTTKS (0,05 экв.) в изопропиловом спирте. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Далее раствор смешивали с NaBH3CN (3 экв.) в 0,5 мл воды. Смесь перемешивали в течение 24 часов при температуре 20°С. Раствор разбавляли до концентрации 0,1% и диализовали против смеси (0,1% NaCl, 0,1% НаНСО3), 3×5 литров (один раз в сутки) и против дистиллированной воды 7×5 литров (дважды в сутки). Полученный раствор упаривали и анализировали.

DS 8% (по данным спектроскопии ЯМР).

1Н ПМР спектр (HSQC, DOSY) (2% NaOD/D2O), δ: 1,61 (м, 2Н, -СН-СН2-CH2-), 1,63 (м, 1Н, -СН-CHH-), 1,70 (м, 1Н, -СН-CHH-), 2,65 (м, 1Н, полимер -CHH-NH-), 3,01 (м, 1Н, полимер -CHH-NH-), 3,13 (м, 1Н, -CH-СН2-), 3,21 (м, 2Н, -СН-СН2-СН2-CH2-).

1. Производное гиалуроновой кислоты, окисленное по положению 6 глюкозаминного фрагмента до альдегида, имеющее формулу X, и его гидратированная форма, так называемый геминальный диол, имеющий формулу Y:

2. Способ получения производного гиалуроновой кислоты по п.1, в котором гиалуроновая кислота взаимодействует с периодинаном Десса-Мартина (DMP) в полярном апротонном растворителе, предпочтительно в диметилсульфоксиде.

3. Способ получения по п.2, отличающийся тем, что гиалуроновая кислота находится в форме свободной кислоты или соли.

4. Способ получения по любому из пп.2 или 3, отличающийся тем, что молярная масса гиалуроновой кислоты находится в интервале от 1·104 до 5·106 г-моль-1.

5. Способ получения по любому из пп.2 или 3, отличающийся тем, что реакцию гиалуроновой кислоты с периодинаном Десса-Мартина (DMP) проводят при температуре в интервале от 10 до 50°C, предпочтительно при 20°С, в течение от 5 минут до 150 часов, предпочтительно в течение не менее 10 часов.

6. Способ получения по любому из пп.2 или 3, отличающийся тем, что DMP вводят в количестве от 0,05 до 1 эквивалента по отношению к димеру гиалуроновой кислоты.

7. Способ модификации производного гиалуроновой кислоты, полученного способом по любому из пп.2-6, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с амином общей формулы H2N-R или с гиалуронаном, замещенным группой -R-NH2, где R - алкил, с линейной или разветвленной цепью C130, необязательно содержащий ароматические или гетероароматические группы.

8. Способ модификации по п.7, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с аминокислотой.

9. Способ модификации по п.7, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с пептидом.

10. Способ модификации по п.7, отличающийся тем, что окисленное производное гиалуроновой кислоты взаимодействует с полисахаридом, содержащим свободную аминогруппу.

11. Способ модификации по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что количество амина, аминокислоты, пептида или полисахарида находится в интервале от 0,05 до 10 эквивалентов по отношению к димеру гиалуронана.

12. Способ модификации по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что реакцию окисленного производного гиалуроновой кислоты с амином, аминокислотой, пептидом или полисахаридом проводят в водном или водно-органическом растворителе при температуре в интервале от 0 до 80°C, предпочтительно при 20°С, в течение от 1 минуты до 24 часов, предпочтительно в течение 1 часа.

13. Способ модификации по п.12, отличающийся тем, что реакцию окисленного производного гиалуроновой кислоты с амином, аминокислотой, пептидом или полисахаридом проводят в присутствии восстановителя NaBH3CN, который добавляют к реакционной смеси через 0-100 часов после добавления амина, аминокислоты, пептида или полисахарида.

14. Способ модификации по п.13, отличающийся тем, что количество восстановителя NaBH3CN находится в интервале от 0 до 20 молярных эквивалентов по отношению к молярному количеству альдегида или геминального диола.

15. Способ модификации по п.12, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, включающей смешивающиеся с водой спирты, предпочтительно изопропиловый и этиловый спирт, смешивающиеся с водой полярные апротонные растворители, предпочтительно диметилсульфоксид.

16. Способ модификации по п.12, отличающийся тем, что количество воды составляет не менее 50 об.% от объема всего раствора.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к пищевой технологии, а именно к технологии производства инулина для пищевых целей. Способ включает измельчение клубней топинамбура, экстрагирование, отделение сока.

Изобретение относится к химической промышленности и может быть использовано при комплексной переработке древесины. Способ комплексной переработки лиственницы включает дезинтеграцию измельченного древесного сырья в роторно-пульсационном аппарате (РПА) в три стадии, при этом на первой стадии исходное древесное сырье обрабатывают алифатическим спиртом при температуре 58-60°C с последующим охлаждением до 30°C и разделением полученной пульпы на жидкую и твердую фазы.

Изобретение относится к полимерной ксантановой камеди. Ксантановая камедь имеет следующие свойства в растворе: a) вязкость при низкой скорости сдвига при 3 об/мин более чем около 1600 мПа·с, когда гидратацию проводят в стандартной водопроводной воде при концентрации ксантановой камеди 0,25 вес.%, b) вязкость в морской воде более чем около 20 при концентрации 1 фунт/баррель (2,86 кг/м3), когда гидратацию проводят в синтетической морской воде, c) скорость гидратации менее чем около 3 минут в 1%-ном по весу растворе NaCl при 1%-ной по весу концентрации ксантановой камеди и d) способность по существу полностью гидратироваться в течение менее чем около 10 минут в 6%-ном по весу растворе NaCl при 1%-ной по весу концентрации ксантановой камеди.
Изобретение относится к способам получения сульфатированного арабиногалактана, используемого в химико-фармацевтической промышленности. Способ включает взаимодействие арабиноногалактана с сульфатирующим комплексом сульфаминовая кислота-мочевина в диметилсульфоксиде при непрерывном перемешивании и температуре 75-85°С в течение 2,0-3,0 часов.

Настоящее изобретение относится к получению полисахаридов. Способ предусматривает центрифугирование подвергнутого щелочной обработке экстракта морских водорослей температурой 70-80°C при 10000-14000 об/мин в течение 5-15 минут.

Изобретение относится к технологии получения пектина. Предложены варианты способа экстракции пектина.

Изобретение относится к способу получения сульфатированного арабиногалактана и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицине, фармакологии.

Изобретение относится к эффективным для лечения и профилактики инфекционных заболеваний конъюгатам олигосахарид-носителям, содержащим олигосахарид, конъюгированный с носителем через линкер формул VIIIa или VIIIb: где n больше 1, m выбран из 1-10, p выбран из 1-20 и R представляет собой H или алкил, линкер связан с атомом кислорода олигосахарида через концевую CH2 группу, и линкер связан через концевую CO группу с аминогруппой соединения носителя посредством амидной связи, олигосахарид является β-1-6 связанным глюкозамином, и носитель является пептидом, белком, полисахаридом, нуклеиновой кислотой, липидом или столбнячным анатоксином.

Изобретение относится к области биотехнологии. Модифицированный капсулярный сахарид включает линкер формулы (I).

Изобретение относится к получению водорастворимых полисахаридов из листьев подорожника большого. Способ предусматривает экстрагирование растительного сырья очищенной горячей водой, осаждение водорастворимых полисахаридов, их промывку, сушку, двукратное проведение повторного экстрагирования растительного сырья, отделение растительного материала, осаждение водорастворимых полисахаридов, фильтрование осадка, промывание и высушивание.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой α1,6-глюкан-содержащее соединение Helicobacter pylori. Настоящее изобретение также раскрывает конъюгат для индукции иммунного ответа против H.pylori, содержащий указанное соединение, конъюгированное с белком-носителем. Также настоящее изобретение раскрывает иммуногенную композицию, применение указанной композиции и способ индукции иммунного ответа против H.pylori с использованием указанной композиции. Настоящее изобретение раскрывает также иммунную антисыворотку для нейтрализации H.pylori у млекопитающего, которую получают путем иммунизации указанного млекопитающего иммуногенной композицией, содержащей указанную иммуногенную композицию. Настоящее изобретение раскрывает антитело, распознающее указанное α1,6-глюкан-содержащее соединение H.pylori, применение указанного антитела и способ индукции комплемент-опосредованного бактериолиза штаммов H.pylori, экспрессирующих α1,6-глюкан с использованием указанного антитела. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность иммуногенных композиций против H.pylori. 9 н. и 18 з.п. ф-лы, 8 ил., 21 табл., 11 пр.

Настоящее изобретение относится к олигосахаридам, активирующим рецепторы FGF, и их применению в медицине, формулы (I): где R2 представляет собой -О-алкил или моносахарид формулы (II), R представляет собой алкил, R3 - дисахарид формулы (III), R5 - дисахарид формулы (IV), R7 представляет собой ОН или дисахарид формулы (VI), R1, R4, R6 и R8 представляют собой -OSO3 - или ОН, но не являются ОН-группами одновременно, R9 представляет собой ОН, -О-алкил или дисахарид формулы (VII), R10 представляет собой -О-алкил, при условии, что R9 представляет собой ОН или -О-алкил, если R2 - моносахарид формулы (II), R7 представляет собой дисахарид формулы (VI), если R2 представляет собой -О-алкил. Предложены новые вещества, стимулирующие образование сосудов. 11 н. и 13 з.п. ф-лы, 9 пр.
Настоящее изобретение относится к способу ультраочистки альгинатов. Способ получения растворов солей альгината предусматривает добавление порошка технического альгината к солевому раствору для получения раствора альгината с концентрацией от 1,6 до 2,0% масс. и доведение pH до 7,4-7,6, фильтрование полученного раствора альгината на по меньшей мере одном гидрофильном фильтре и извлечение отфильтрованного раствора альгината. Затем отфильтрованный раствор альгината фильтруют на модифицированном зарядом гидрофобном нейлоновом фильтре и извлекают раствор альгината. Получают не подвергнутый структурной модификации конечный раствор альгината с содержанием эндотоксинов менее 20 EU/г. Изобретение позволяет получить раствор альгината с высокой степенью очистки от эндотоксинов и исключить стадию диализа при очистке. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

Изобретение предлагает способ разделения лигнинов и сахаров из экстракционного раствора. Способ предусматривает концентрирование экстрактного раствора, в частности, выпариванием с получением концентрированного раствора с концентрацией сухого вещества между 60 и 70 мас.%. После чего получают раствор смешением концентрированного раствора с водой в равных частях по массе. Причем указанное смешение проводят путем ввода концентрированного раствора в воду. Перемешивают смесь для приготовления дисперсии лигнинов в смеси и достижения стабильного суспендирования лигнинов в растворе. При этом температура раствора во время суспендирования находится между 50°С и 60°С. Фильтруют раствор, включающий суспендированные лигнины, в частности, с использованием фильтр-пресса. Изобретение позволяет отделить индивидуальные частицы лигнинов от раствора сахаров, избежать явлений агломерации лигнинов и сахаров без ухудшения качества лигнинов. 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены модифицированный капсулярный сахарид для вызова гуморального иммунного ответа, способ его получения и применение для профилактики или лечения бактериального менингита, конъюгат сахарид-белок и способы его получения, фармацевтическая композиция на основе модифицированного капсулярного сахарида и способ индуцирования гуморального иммунного ответа у млекопитающих. Модифицированный капсулярный сахарид содержит блокирующую группу в положении гидроксильной группы на по меньшей мере 80% моносахаридных единиц соответствующего нативного капсулярного сахарида. При этом блокирующая группа имеет формулу (Ia): , где X представляет собой C(O); Y представляет собой C1-6 алкил, замещенный 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из гидроксильной, сульфгидрильной и аминогруппы. Предложенный модифицированный капсулярный сахарид более устойчив к гидролизу, чем нативный сахарид. Кроме того, наличие указанной блокирующей группы обеспечивает более эффективное конъюгирование модифицированного капсулярного сахарида с молекулой носителя. 10 н. и 28 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 2 пр.
Изобретение относится к получению полимеров для средств личной гигиены или бытовой химии. Предложенный модифицированный полигалактоманнан включает катионный полигалактоманнан с водорастворимой и водонерастворимой фракциями. Причем водонерастворимая фракция составляет от 0,4 мас.% до 3 мас.% в расчете на массу полигалактоманнана. При этом указанная водонерастворимая фракция указанного модифицированного полигалактоманнана обеспечивает прозрачность 1 мас.% его водного раствора при светопропускании менее 60% при 600 нм, а в системе ПАВ обеспечивает прозрачность при светопропускании более 80% при длине волны 600 нм при концентрации указанного модифицированного полигалактоманнана, равной 0,2 мас.% в расчете на массу композиции ПАВ. Указанная системы ПАВ содержит 12 мас.% лауретсульфата натрия/2 мас.% кокамидопропилбетаина/1 мас.% хлорида натрия. Также предложены варианты способа получения указанного модифицированного полигалактоманнана и варианты композиции средств личной гигиены или бытовой химии с указанным полигалактоманнаном. Изобретение позволяет получить композиции средств личной гигиены или бытовой химии с предложенным модифицированным полигалактоманнаном, характеризующиеся улучшенными кондиционирующими свойствами, прозрачностью и эстетическим внешним видом. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 табл., 27 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения этиленово-ненасыщенного гликозида формулы (I). Проводят реакцию этиленово-ненасыщенного соединения формулы (II) с полисахаридом, содержащим от 10 до около 200000 моносахаридных звеньев, таким как крахмал, амилоза, амилопектин, целлюлоза, в присутствии гликозидазы, такой как амилаза, целлюлаза, глюкозидаза и галактозидаза, или гликозилтрансферазы, такой как цикломальтодекстрин-глюканотрансфераза. Преимуществом способа является высокая чистота продукта. 6 з.п. ф-лы, 3 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены способы получения полимера, включающего фукозу, полимер, содержащий фукозу, и его применения. Полимер получают посредством культивирования бактерии Enterobacter DSM 23139 в одном варианте при использовании в качестве источника углерода глицерина или смесей, обогащенных глицерином. В другом варианте в качестве источников углерода используют пищевые или промышленные отходы, содержащие одно или несколько таких соединений, как сахар, спирт, органическая кислота, алкан. В фазе загрузки бактерии культивируют в биореакторе с перемешиванием и аэрацией в среде, содержащей источник углерода, включающий глицерин, источник азота и неорганические соли. Затем в фазе подпитки бактерии культивируют в условиях наличия источника углерода и ограничения азота. Полученный полимер обладает флоккулирующей и эмульгирующей активностью, используют в качестве загустителя. Полимер применяют в качестве антиканцерогенного или противовоспалительного агента, в качестве увлажняющей или антивозрастной добавки, а также для получения биоразлагаемых композитных пленок и микросфер для регулируемого высвобождения лекарственных препаратов. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 4 пр.

Изобретение относится к новым производным анионных полисахаридов, частично функционализированных по меньшей мере двумя вицинальными гидрофобными группами, причем указанные гидрофобные группы, являющиеся одинаковыми или разными, связаны с по меньшей мере трехвалентным радикалом или промежуточной группировкой. Изобретение относится также к способам их синтеза. Изобретение относится также к использованию полисахаридов, функционализированных по настоящему изобретению, для стабилизации протеиновых активных веществ, где активное вещество выбрано из группы, в которую входят белки, гликопротеины, пептиды и непептидные терапевтические соединения. 2 н. и 19 з.п. ф-лы,15 пр.

Предложен полисахарид или его производное. Полисахарид обладает сродством к фиколину-3 и характеризуется наличием олигосахаридного повторяющегося блока общей формулы (I). Причем в формуле (I) n является целым числом от 0 до 100, предпочтительно менее 50; PDt обозначает повторяющийся олигосахаридный блок PD1t формулы (II), повторяющийся олигосахаридный блок PD2t формулы (III) или повторяющийся олигосахаридный блок PD3t формулы (IV); PD обозначает повторяющийся олигосахаридный блок PD1 формулы (V), повторяющийся олигосахаридный блок PD2 формулы (VI) или повторяющийся олигосахаридный блок PD3 формулы (VII); [Hep]-Kdo обозначает повторяющийся олигосахаридный блок формулы (VIII). Способ получения предложенного полисахарида предусматривает культивирование штамма Н. alvei и выделение бактериального липополисахарида. Полученный липополисахарид расщепляют и отделяют полисахаридную фракцию. Выделяют полисахаридную фракцию, содержащую полисахариды, образованные из повторяющихся блоков с молекулярной массой в диапазоне от 2400 до 26000 кДа. Необязательно полученные полисахариды восстанавливают, в частности в присутствии NaBH4, и предпочтительно конъюгируют с известным белком-носителем или хроматографической средой. Изобретение позволяет получить лиганды, которые специфично связываются с фиколином-3, и тем самым определить концентрацию активных форм фиколина-3 и их активности в организме человека. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл., 13 пр. PDt-(PD)n-[Hep]-Kdo (I), , (II), , (III), , (IV), , (V), , (VI), , (VII) (VIII).
Наверх