Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства



Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства
Основанные на амидах пролекарства пептидов глюкагонового надсемейства

 


Владельцы патента RU 2550696:

ИНДИАНА ЮНИВЕРСИТИ РИСЕРЧ ЭНД ТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЕЙШН (US)

Изобретение относится к пролекарственным препаратам пептидов глюкагонового надсемейства, в которых пептид глюкагонового надсемейства модифицирован связыванием дипептида с пептидом глюкагонового надсемейства амидной связью. Пролекарства, раскрытые в настоящем изобретении, имеют увеличенное время полужизни и превращаются в активную форму в физиологических условиях в результате неферментативной реакции, вызываемой химической нестабильностью. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 табл., 16 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной патентной заявке США № 61/139210, поданной 19 декабря 2008, предварительной патентной заявке США № 61/144271, поданной 13 января 2009, и предварительной патентной заявке США № 61/187556, поданной 16 июня 2009. Описание каждой заявки специально включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Предшествующий уровень техники

Основанные на пептидах лекарственные средства являются высокоэффективными лекарственными средствами с относительно короткой продолжительностью действия и непостоянным терапевтическим индексом. Настоящее изобретение относится к основанным на пептидах пролекарствам, где пролекарственное производное предназначено для задержки начала действия и удлинения времени полужизни лекарственного средства. Задержка начала действия имеет преимущество, которое заключается в том, что она обеспечивает возможность системного распределения пролекарства перед его активацией. Соответственно, введение пролекарств исключает осложнения, вызываемые максимальными активностями при введении, и повышает терапевтический индекс исходного лекарственного средства.

Распознавание рецептором и последующий процессинг пептидных и белковых агонистов является основным путем разложения многих лекарственных средств, основанных на пептидах и белках. Таким образом, связывание пептидного лекарственного средства с его рецептором будет приводить к биологической стимуляции, но также будет инициировать последующую дезактивацию индуцированных фармакологических свойств пептида/белка путем ферментативного расщепления пептида или белка. Согласно настоящему изобретению пролекарства могут быть получены для того, чтобы продлить биологическое время полужизни пептида или белка, на основании методики ингибирования распознавания пролекарства соответствующим рецептором.

Пролекарства, раскрытые в настоящем изобретении, в конечном счете, будут химически превращаться в структуры, которые могут распознаваться рецептором, где скорость такого химического превращения будет определять время начала и продолжительность биологического действия in vivo. Конструкция молекулы, описанная в настоящем описании, основана на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов.

Препроглюкагон является полипептидом-предшественником длиной 158 аминокислот, который процессируется в разных тканях с образованием нескольких различных происходящих из проглюкагона пептидов, включая глюкагон (SEQ ID NO:701), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1; аминокислоты 7-36, представленные SEQ ID NO:703 и SEQ ID NO:704), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2; SEQ ID NO:708) и оксинтомодулин (OXM; SEQ ID NO:706), которые вовлечены в широкое множество физиологических функций, включая гомеостаз глюкозы, секрецию инсулина, опорожнение желудка и рост кишечника, а также регуляцию потребления пищи.

Глюкагон представляет собой 29-аминокислотный пептид (который соответствует аминокислотам 33-61 препроглюкагона), тогда как GLP-1 продуцируется в виде 37-аминокислотного пептида, который соответствует аминокислотам 72-108 препроглюкагона. GLP-1(7-36)-амид (SEQ ID NO:704; на C-конце находится амид аргинина) или GLP-1(7-37)-кислота (SEQ ID NO:703; на C-конце находится глицин) являются биологически эффективными формами GLP-1, которые проявляют по существу эквивалентную активность в отношении рецептора GLP-1.

Глюкагон является жизненно важным лекарственным средством, которое применяют при остром лечении тяжелой гипогликемии. Сообщалось, что оксинтомодулин обладает фармакологической способностью подавлять аппетит и снижать массу тела. Клинические исследования агонистов рецептора GLP-1 или стабилизированных аналогов GLP-1 подтвердили, что указанное семейство пептидов является эффективным при лечении диабета типа II. Кроме того, в действительности, они могут быть безопаснее, чем инсулиновая терапия, благодаря их зависимого от глюкозы действия, что исключает случаи гипогликемии. Исследования взаимосвязи структура-активность показали, что N-концевой гистидин каждого из трех указанных пептидов (глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина) особенно важен для полного воздействия, и что удлиненные на N-конце формы сильно снижают биологическую эффективность.

Известны дополнительные пептиды, которые сходны с глюкагоном и GLP-1 по структуре и обладают сходными активностями. Например, эксендин-4 представляет собой пептид, присутствующий в слюне ящерицы-ядозуба, который сходен с GLP-1 по структуре и подобно глюкагону и GLP-1 увеличивает высвобождение инсулина.

Кроме того, желудочный ингибирующий полипептид (GIP) также известен как зависимый от глюкозы инсулинотропный пептид и является представителем секретинового семейства гормонов. GIP образуется из 153-аминокислотного пробелка, кодируемого геном GIP, и циркулирует в виде биологически активного 42-аминокислотного пептида (SEQ ID NO:707). Ген GIP экспрессируется в тонком кишечнике, а также слюнных железах и является слабым ингибитором секреции кислоты в желудке. Кроме ингибирующего действия в желудке в присутствии глюкозы GIP усиливает высвобождение инсулина островковыми бета-клетками в поджелудочной железе при введении в физиологических дозах. Полагают, что GIP функционирует в качестве кишечного фактора, который стимулирует высвобождение инсулина поджелудочной железой и играет физиологическую роль в поддержании гомеостаза глюкозы.

Остеокальцин (SEQ ID NO:709) является неколлагеновым белком, встречающимся в костях и дентине. Он секретируется остеобластами и, как полагают, играет роль в минерализации и гомеостазе ионов кальция. Также сообщалось, что остеокальцин функционирует в качестве гормона в организме, вынуждая бета-клетки в поджелудочной железе высвобождать больше инсулина, и в то же время, приводя к тому, что жировые клетки высвобождают гормон адипонектин, который увеличивает чувствительность к инсулину.

Одним из недостатков, ассоциированных с терапевтическим применением биологически активных пептидов, таких как остеокальцин, GIP, глюкагон, GLP-1 и оксинтомодулин, является их экстремально короткое время полужизни (примерно две минуты для глюкагона и GLP-1) в плазме. Соответственно, чтобы обеспечить приемлемый контроль, нативные родственные глюкагону пептиды необходимо вводить непрерывно в течение длительного периода времени. Короткое время полужизни пептидов, родственных глюкагону и GLP-1, обусловлено быстрым расщеплением дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), которая расщепляет между второй и третьей аминокислотами. Такое расщепление не только инактивирует нативные пептиды, но в случае глюкагона и GLP-1 укороченные формы могут быть функциональными антагонистами соответствующих рецепторов. Соответственно, существует необходимость в более длительно действующих вариантах GIP, глюкагона, GLP-1 и оксинтомодулина и родственных пептидов, чтобы реализовать полные терапевтические возможности таких механизмов действия лекарственных средств.

Сущность изобретения

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пролекарственное производное биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из глюкагона, эксендина-4, GLP-1, GLP-2, GIP, вазоактивного интестинального пептида (VIP), полипептида 27, активирующего аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27), пептид-гистидин-метионина (PHM), оксинтомодулина, секретина, остеокальцина, соматотропин-рилизинг-гормона, а также аналогов, производных и конъюгатов указанных выше пептидов. Пролекарственное производное содержит дипептидный элемент пролекарства, ковалентно связанный с активным участком биологически активного полипептида амидной связью. В некоторых вариантах осуществления дипептид ковалентно связан с биологически активным полипептидом в положении, которое препятствует способности биологически активного полипептида взаимодействовать с соответствующим ему рецептором или кофактором. В некоторых вариантах осуществления дипептидный элемент пролекарства связан с амино-концом биологически активного пептида. Последующее удаление дипептида в физиологических условиях и в отсутствие ферментативной активности восстанавливает полную активность полипептида.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q. В данном варианте осуществления Q означает биологически активный пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также аналоги, производные и конъюгаты вышеуказанного; и A-B означает дипептидное пролекарство, связанное с биологически активным пептидом амидной связью. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту, связанную с Q через образование амидной связи между карбоксилом B (в A-B) и амином Q. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления A, B или аминокислота в Q, с которой связан A-B, является некодируемой аминокислотой, и химическое отщепление A-B от Q осуществляется по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В другом варианте осуществления химическое отщепление A-B от Q завершается по меньшей мере примерно на 50% в течение примерно 1 часа или примерно 1 недели в PBS в физиологических условиях.

В некоторых вариантах осуществления A и B выбирают так, чтобы ингибировать ферментативное отщепление дипептида A-B от Q ферментами, имеющимися в сыворотке млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления A и/или B выбраны так, чтобы время полуотщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях не превышало двукратного времени полуотщепления A-B от Q в растворе, содержащем DPP-IV-протеазу (т.е. отщепление A-B от Q происходит не более чем в 2 раза быстрее в присутствии DPP-IV-протеазы и в физиологических условиях по сравнению с идентичными условиями в отсутствие фермента). В некоторых вариантах осуществления A и/или B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в L-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в L-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления A означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации, и B означает аминокислоту в D-стереоизомерной конфигурации.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный элемент пролекарства (A-B) содержит соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где

R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкила, где W1 означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

В другом варианте осуществления дипептидный элемент пролекарства (A-B) содержит соединение, имеющее общую структуру формулы I:

где

R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкила, где W1 означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил; или R4 и R8 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Как описано выше, в некоторых аспектах предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства (например, родственный глюкагону пептид, соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивный интестинальный пептид (VIP; SEQ ID NO:720), полипептид 27, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-метионин (PHM; SEQ ID NO:722) или секретин (SEQ ID NO:723) и/или их аналоги, производные и конъюгаты). Пептиды глюкагонового надсемейства могут иметь общие структурные признаки, включая, но без ограничения, гомологи в пределах N-концевых аминокислот и/или альфа-спиральную структуру в C-концевой части. Полагают, что C-конец обычно функционирует в связывании рецептора, и N-конец обычно функционирует в передаче сигнала рецептора. Несколько аминокислот в N-концевой части и C-концевой части высоко консервативны среди представителей глюкагонового надсемейства, например, His1, Gly4, Phe6, Phe22, Val23, Trp25 и Leu26, где аминокислоты в указанных положениях проявляют идентичность, имеют консервативные замены или сходство боковых цепей аминокислот. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид, например глюкагон (SEQ ID NO:701), оксинтомодулин (SEQ ID NO:706), эксендин-4 (SEQ ID NO:718), глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные SEQ ID NO:703 и 707), глюкагон-подобный пептид-2 (GLP-2) (SEQ ID NO:708), GIP (SEQ ID NO:707) или их аналоги, производные и конъюгаты. В некоторых вариантах осуществления Q в качестве родственного глюкагону пептида содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична соответствующей последовательности нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP по всей длине нативного пептида (или в положениях, которые соответствуют глюкагону, см., например, фиг.10). В других вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства (Q) содержит аминокислотную последовательность нативного глюкагона, нативного эксендин-4, нативного (7-37)GLP-1, нативного GLP-2, нативного GHRH, нативного VIP, нативного PACAP-27, нативного PHM, нативного оксинтомодулина, нативного секретина или нативного GIP с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотными модификациями. В следующих вариантах осуществления Q содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой химеру двух или более последовательностей нативных родственных глюкагону пептидов. В некоторых вариантах осуществления Q содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 50% идентичную нативному глюкагону (SEQ ID NO:701), которая сохраняет альфа-спиральную конформацию аминокислот, соответствующих аминокислотам 12-29 SEQ ID NO:701.

Q может быть любым из пептидов глюкагонового надсемейства, которые известны в данной области, включая, например, любые родственные глюкагону пептиды, которые известны в данной области, некоторые из которых описаны в настоящем описании в качестве неограничивающих примеров. В данной области известно множество аналогов GLP-1 и представляют собой родственный глюкагону пептид согласно настоящему изобретению, см., например, WO 2008023050, WO 2007030519, WO 2005058954, WO 2003011892, WO 2007046834, WO 2006134340, WO 2006124529, WO 2004022004, WO 2003018516, WO 2007124461, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте для каждого описания последовательностей или формул аналогов или производных GLP-1. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид класса 1, 2, 3, 4 или 5, который подробно описан в настоящем описании. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, Q означает любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-742, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Хотя дипептидное пролекарство, например A-B, может быть связано с Q в любом положении, которое препятствует активности Q, варианты осуществления, описанные в настоящем описании, иллюстрируют примеры положений, которые подходят для связывания A-B. Когда в настоящем описании указываются номера положений со ссылкой на положение нативной последовательности глюкагона (SEQ ID NO:701), соответствующее положение в аналогах глюкагона или в других пептидах глюкагонового надсемейства могут быть определены с помощью выравнивания. См., например, фиг.10, на которой показано выравнивание некоторых пептидов глюкагонового надсемейства. Например, положение 24 на основании нативного глюкагона соответствует положению 24 (7-37) GLP-1.

В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства может содержать C-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включая, но без ограничения: COOH, CONH2, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710), GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO:711), удлинение карбоксильного конца оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO:714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713). Дополнительные C-концевые аминокислотные последовательности пептидов глюкагонового надсемейства дополнительно описаны ниже.

В других аспектах Q содержит остеокальцин (SEQ ID NO:709) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична нативному остеокальцину по длине нативного пептида. Q может содержать аналог остеокальцина, имеющий до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модификаций аминокислот по сравнению с нативным остеокальцином. В следующих аспектах Q содержит соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH) (SEQ ID NO:719) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична нативному GHRH по длине нативного пептида. Q может содержать аналог GHRH, имеющий до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модификаций аминокислот по сравнению с нативным GHRH. В некоторых вариантах осуществления Q может представлять собой любой аналог остеокальцина или GHRH, известный в данной области.

В следующих вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства остеокальцин или его аналог, производное или конъюгат, и A-B содержит общую структуру:

где R1 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H и C1-C8алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

При условии, что когда R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо, оба R1 и R2 отличны от H.

В других вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее общую структуру A-B-Q, где Q означает пептид глюкагонового надсемейства остеокальцин или его аналог, производное или конъюгат, и A-B содержит общую структуру:

где

R1 и R8 независимо означают H или C1-C8алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и CH2(C3-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH, галогена, при условии, что когда R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо, оба R1 и R2 не являются H.

В некоторых вариантах осуществления Q означает пептид, выбранный из группы, состоящей из соматотропин-рилизинг-гормона (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивного интестинального пептида (VIP; SEQ ID NO:720), полипептида 27, активирующего аденилатциклазу гипофиза, (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-метионина (PHM; SEQ ID NO:722) или секретина (SEQ ID NO:723), глюкагона (SEQ ID NO:701), эксендина-4 (SEQ ID NO:718), глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1) (аминокислоты 7-37, представленные SEQ ID NO:703 и 704), глюкагон-подобного пептида-2 (GLP-2) (SEQ ID NO:708), GIP (SEQ ID NO:707) или их аналогов, производных и конъюгатов. В некоторых вариантах осуществления Q означает родственный глюкагону пептид.

В другом варианте осуществления предлагается аналог пролекарства пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина или его аналога, производного или конъюгата, в котором пролекарственный фрагмент (A-B) ковалентно связан с Q в одном или нескольких внутренних аминокислотных остатках в последовательности Q, например, в положении Q, соответствующем положению 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 нативного глюкагона (SEQ ID NO:701). Например, в некоторых вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с замещенным Lys в положении 20 в Q. В таких вариантах осуществления Q может содержать в положении 20 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона) замещение, имеющее структуру:

В других вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с замещенным амино-Phe в положении 22. В таких вариантах осуществления Q может содержать в положении 22 (по сравнению с нативной последовательностью глюкагона), замещение, имеющее структуру:

Альтернативно или дополнительно, пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с амино-концом Q, где A-B содержит структуру:

где R1 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H и C1-C8алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH,

при условии, что каждый из R1 и R2 отличен от H, когда R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В других вариантах осуществления пролекарственный фрагмент (A-B) связан непосредственно или через линкер с амино-концом Q, где A-B содержит структуру:

где

R1 и R8 независимо означаю H или C1-C8алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и CH2(C3-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)SH, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH, галогена, при условии, что оба R1 и R2 не являются H, когда R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления только один пролекарственный фрагмент связан с Q. Например, в таких вариантах осуществления, когда пролекарственный фрагмент (A-B) связан с Q на N-конце, нет пролекарственных фрагментов (A-B), связанных с внутренним аминокислотным остатком в последовательности Q, и наоборот. В некоторых вариантах осуществления два или три пролекарственных фрагмента связаны с Q, например, на N-конце и в одном или нескольких внутренних участках.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, показывающий изменение массы тела у мышей с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO), которым внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 15 или 70 нмоль/кг аналога глюкагона. Мышей ежедневно взвешивали (N=8) после начальной инъекции следующих средств: только наполнителя ▼, пептида A глюкагонового надсемейства («пептида A») в дозе 15 нмоль/кг или 70 нмоль/кг или пролекарственного производного пептида A, в котором дипептид связан с N-концом пептида A амидной связью, где дипептид представляет собой Aib-1Pro0 (вводимый в дозе 15 нмоль/кг (○) или 70 нмоль/кг (●), Aib-1dPro0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг , Lys-1Sar0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (♦), dAla-1Pro0 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг или Ac-Aib-1Pro-1 (вводимый в дозе 70 нмоль/кг (■).

Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменение массы тела у мышей с индуцированным потреблением пищи ожирением (DIO), которым внутрибрюшинно инъецировали однократную недельную дозу 0,5, 3, 15 или 70 нмоль/кг либо только наполнителя (♦), либо пептида A (в дозе 0,5 ▲, 3 , 15 ▼ или 70 нмоль/кг/сутки), либо Lys-1Sar0-пептида A (в дозе 0,5 , 3 , 15 или 70 нмоль/кг/сутки).

Фиг.3 является графиком уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым инъецировали сначала родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам во временной точке -60 минут внутрибрюшинно инъецировали только наполнитель (▲) или дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки),

(B) Lys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) dLys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.4 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо только наполнитель (▲), либо дозу 2 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys-1Sar0-пептид A (■),

(B) Lys-1(X),Sar0-пептид A (▲) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

(C) Lys-1(Y),Sar0-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys),

(D) dLys-1Sar0-пептид A .

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.5 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -15 минут инъецировали либо наполнитель (▼), либо дозу 20 нмоль/кг dLys-1Sar0-пептида A , либо дозу 0,67 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) Lys-1Sar0-пептид A (■),

(B) Lys-1(X),Sar0-пептид A (▼) (X означает цепь ПЭГ 1 кДа, связанную с боковой цепью Lys),

C) Lys-1(Y),Sar0-пептид A (♦) (Y означает трет-бутилглицин, связанный с боковой цепью Lys).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут. Уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -15, 0, 15, 30, 60 и 120 минут.

Фиг.6 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым сначала инъецировали родственный глюкагону пептид, а затем раствор глюкозы. Мышам внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 или 70 ■ нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа (см. фиг.7). Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках -60, 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента первого введения раствора глюкозы (т.е. с временной точкой 0 минут).

Фиг.7 представляет собой график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно во временной точке -60 минут инъецировали либо только наполнитель (▼), либо дозу 15 или 70 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептид A (в дозе 15 или 70 ▲ нмоль/кг/сутки),

(B) dLys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 или 70 нмоль/кг/сутки), или

(C) Lys-1Sar0-пептид A (в дозе 15 ♦ или 70 ■ нмоль/кг/сутки).

Физиологический раствор, содержащий 25% (об./об.) глюкозы, инъецировали в дозе 1,5 г/кг массы тела во временной точке 0 минут и спустя 24 часа (см. фиг.7). Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента введения второго раствора глюкозы через 24 часа.

На фиг.8 представлены данные, показывающие потерю массы у мышей DIO (N=8), которым внутрибрюшинно инъецировали указанные соединения в дозе либо 15, либо 70 нмоль/кг. Указанные массы тела определяли через 7 суток после введения соединений.

На фиг.9A-B представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у мышей DIO (n=8). Мышам внутрибрюшинно инъецировали только наполнитель или пролекарственный пептид в точках 24, 8, 4 или 1 час до стимуляции (как указано на фигуре) с использованием инъекции 25% глюкозы в физиологическом растворе в дозе 1,5 г/кг массы тела. Указанные уровни глюкозы в крови измеряли во временных точках 0, 15, 30, 60 и 120 минут от момента стимуляции раствором глюкозы. На фиг.9A показаны уровни глюкозы в крови после введения Lys-1Sar0-пептида A (т.е. содержащего пролекарственный элемент Lys-1Sar0). На фиг.9B показаны уровни глюкозы в крови после введения dLys-1Sar0-пептида A (т.е. содержащего пролекарственный элемент D-Lys-1-Sar0).

На фиг.10 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей различных пептидов глюкагонового надсемейства или их соответствующих фрагментов. Представлены аминокислотные последовательности GHRH (SEQ ID NO:719), PHI (SEQ ID NO:722), VIP (SEQ ID NO:720), PACAP-27 (SEQ ID NO:721), эксендина-4 (SEQ ID NO:718), GLP-1 (SEQ ID NO:703), глюкагона (SEQ ID NO:701), оксинтомодулина (SEQ ID NO:706), GIP (SEQ ID NO:707), GLP-2 (SEQ ID NO:708) и секретина (SEQ ID NO:724).

На фиг.11 представлен график уровней глюкозы в крови (мг/дл) у мышей DIO (девять групп по восемь мышей), которым подкожно инъецировали однократную дозу либо только наполнителя, либо 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептида C глюкагонового надсемейства («пептида C»),

(B) dK-Sar-пептида C,

(C) dK-Gly(N-гексил)пептида B глюкагонового надсемейства («пептида B») или

(D) dK-F(N-Me)-пептида C.

Возраст мышей составлял 5,5 месяцев, и они получали корм с высоким содержанием жира в течение примерно 2 месяцев. Уровни глюкозы в крови определяли через 0, 2, 4, 24 и 72 часа после инъекции.

На фиг.12 представлен график изменения массы тела у мышей DIO (девять групп по восемь мышей), которым подкожно инъецировали однократную дозу либо только наполнителя, либо 10 нмоль/кг одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dK-Sar-пептида C,

(C) dK-Gly(N-гексил)пептида B или

(D) dK-F(N-Me)пептида C.

Возраст мышей составлял 5,5 месяцев, и они получали корм с высоким содержанием жира в течение примерно 2 месяцев. Потребление пищи и массу жира контролировали в течение недельного исследования.

На фиг.13A и 13B представлена активность при связывании рецептора dK-Gly(N-гексил)пептида B (фиг.13A) и dK-Sar-пептида C (фиг.13B) в 20% плазме человека, которую определяли, используя люциферазный анализ GLP-рецептора.

На фиг.14 представлен график изменения массы тела у мышей DIO (n=8), которым подкожно инъецировали однократную дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг либо только наполнителя, либо одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dLys-1Sar0-пептида C или

(C) dLys-1Gly(N-гексил)0-пептида B.

Массы тела определяли в 1, 3, 5 и 7 дни исследования. Возраст мышей составлял 5 месяцев с начальной средней массой тела 31,2 г, и мыши получали стандартный сухой корм в течение примерно 5 месяцев.

На фиг.15A-C представлены графики уровней глюкозы в крови (BG) (мг/дл) у мышей DIO (n=8), которым подкожно инъецировали однократную дозу 3, 10 или 30 нмоль/кг только наполнителя или одного из следующих соединений:

(A) пептида C,

(B) dLys-1Sar0-пептида C или

(C) dLys-1Gly(N-гексил)0-пептида B.

Указанные уровни глюкозы в крови определяли в образцах, взятых внутрибрюшинно в 1 день (фиг.15A), 3 день (фиг.15B) и 5 день (фиг.15C). Возраст мышей составлял 5 месяцев, и они получали стандартный сухой корм в течение примерно 5 месяцев.

Подробное описание

Определения

В описании и в формуле изобретения будет использована следующая терминология в соответствии с определениями, приведенными ниже.

Как используется в настоящем описании, термин «пролекарство» определяют как любое соединение, которое подвергается химической модификации перед проявлением его полных фармакологических эффектов.

Как используется в настоящем описании, термин «аминокислота» охватывает любые молекулы, содержащие как амино, так и карбоксильные функциональные группы, где аминогруппы и карбоксилатные группы связаны с одним и тем же атомом углерода (альфа-атомом углерода). Альфа-атом углерода необязательно может иметь один или два дополнительных органических заместителя. Аминокислота может быть обозначена трехбуквенным кодом, однобуквенным кодом или в некоторых случаях названием ее боковой цепи. Например, неприродную аминокислоту, содержащую группу циклогексана, связанную с альфа-атомом углерода, называют «циклогексан» или «циклогексил». Для целей настоящего изобретения подразумевается, что обозначение аминокислоты без конкретного приведения ее стереохимии охватывает либо L-форму, либо D-форму данной аминокислоты, либо рацемическую смесь. Однако в случае, когда аминокислота обозначена трехбуквенным кодом и имеет надстрочное число (т.е. Lys-1), подразумевается, что обозначение конкретно указывает нативную L-форму аминокислоты, тогда как D-форма конкретно будет обозначена с помощью включения строчной буквой d перед трехбуквенным кодом и надстрочным числом (т.е. dLys-1).

Как используется в настоящем описании, термин «гидроксикислота» относится к аминокислоте, которая была модифицирована, чтобы заменить аминогруппу при альфа-атоме углерода гидроксильной группой.

Как используется в настоящем описании, термин «некодируемая аминокислота» включает любую аминокислоту, которая не является L-изомером любой из следующих 20 аминокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.

«Дипептид» является результатом связывания α-аминокислоты или α-гидроксикислоты с другой аминокислотой через пептидную связь.

Как используется в настоящем описании, термин «химическое расщепление» без любого дополнительного обозначения включает неферментативную реакцию, которая приводит к разрыву ковалентной химической связи.

«Биологически активный полипептид» относится к полипептидам, которые способны оказывать биологическое воздействие in vitro и/или in vivo.

Как используется в настоящем описании, «ацилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую ацильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте, независимо от способов, которыми она получена. Примеры способов получения ацилированных аминокислот и ацилированных пептидов известны в данной области и включают ацилирование аминокислоты до включения в пептид или синтез пептида с последующим химическим ацилированием пептида. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа приводит к пептиду, обладающему одним или несколькими из следующих свойств: (i) пролонгированное время полужизни в кровообращении, (ii) задержку начала действия, (iii) увеличенную продолжительность действия, (iv) повышенную устойчивость к протеазам, таким как DPP-IV, и (v) повышенную эффективность в отношении рецепторов пептидов глюкагонового надсемейства и/или пептидов остеокальцина.

Как используется в настоящем описании, «алкилированная» аминокислота означает аминокислоту, содержащую алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте, независимо от способов, которыми она получена. Примеры способов получения алкилированных аминокислот и алкилированных пептидов известны в данной области и включают алкилирование аминокислоты до включения в пептид или синтез пептида с последующим химическим алкилированием пептида. Не придерживаясь какой-либо конкретной теории, полагают, что алкилирование пептидов будет приводить к сходным, если не одним и тем же, эффектам, что и ацилирование пептидов, например, пролонгированному времени полужизни в кровообращении, задержке начала действия, увеличенной продолжительности действия, повышенной устойчивости к протеазам, таким как DPP-IV, и повышенной эффективности в отношении рецепторов пептидов глюкагонового надсемейства и/или пептидов остеокальцина.

Как используется в настоящем описании, подразумевается, что общая ссылка на пептид охватывает пептиды, которые имеют модифицированный амино- и карбокси-конец. Например, подразумевается, что аминокислотная последовательность, состоящая из стандартных аминокислот, включает стандартные аминокислоты на N- и C-конце, а также соответствующую гидроксикислоту на N-конце и/или соответствующую C-концевую аминокислоту, модифицированную так, чтобы она содержала амидную группу вместо концевой группы карбоновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые стандартные фармацевтические носители, такие как забуференный фосфатом солевой раствор, вода, эмульсии, такие как масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажнителей. Термин также охватывает любое из средств, одобренных регулирующим органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопеи США для применения на животных, включая человека.

Как используется в настоящем описании, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и которые не являются биологически или в других отношениях нежелательными. Многие из соединений, описанных в настоящем описании, способны образовывать соли кислот и/или оснований благодаря присутствию аминогрупп и/или карбоксильных групп или групп, сходных с ними.

Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, но только в качестве примера, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. Соли, полученные из органических оснований, включают, но без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов.

Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть получены из неорганических и органических кислот. Соли, полученные из неорганических кислот, включают соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и подобных. Соли, полученные из органических кислот, включают соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и подобных.

Как используется в настоящем описании, термин «лечение» включает профилактику конкретного расстройства или состояния или ослабление симптомов, ассоциированных с конкретным расстройством или состоянием, и/или предотвращение или устранение указанных симптомов. Например, как используется в настоящем описании, термин «лечение диабета» в основном будет относиться к поддержанию уровней глюкозы в крови около нормальных уровней и может включать повышение или снижение уровней глюкозы в крови в зависимости от данной ситуации.

Как используется в настоящем описании, «эффективное» количество или «терапевтически эффективное количество» пролекарства относится к нетоксичному, но достаточному количеству пролекарства для обеспечения требуемого эффекта. Например, одним из требуемых эффектов может быть профилактика или лечение гипергликемии. Количество, которое является «эффективным» будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья пациента, способа введения и подобного. Таким образом, не всегда можно конкретно указать точное «эффективное количество». Однако подходящее «эффективное» количество в любом отдельном случае может определить специалист в данной области, используя обычное экспериментирование.

Термин «парентеральный» означает не через пищеварительный тракт, а некоторым иным путем, таким как подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный.

Термин «идентичность», как используется в настоящем описании, относится к сходству между двумя или более последовательностями. Идентичность измеряют делением количества идентичных остатков на общее количество остатков и умножением полученного результата на 100, получая идентичность в процентах. Таким образом, две копии, имеющие в точности одну и ту же последовательность, имеют 100% идентичность, тогда как две последовательности, которые имеют делеции, добавления или замены аминокислот по сравнению друг с другом, имеют более низкую степень идентичности. Специалистам в данной области будет понятно, что имеется несколько компьютерных программ, таких как программы, в которых используются такие алгоритмы, как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410) для определения идентичности последовательностей.

Термин «родственный глюкагону пептид» относится к таким пептидам, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP и содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична (например, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) по меньшей мере с одной из последовательностей нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP. Если не указано иное, любая ссылка на положение аминокислоты в родственном глюкагону пептиде (например, для связывания пролекарственного фрагмента, конъюгируемого фрагмента, гидрофильного полимера, ацилирования или алкилирования) относится к положению относительно аминокислотной последовательности нативного глюкагона (SEQ ID NO:701).

Термин «пептид глюкагонового надсемейства» относится к группе пептидов, родственных по структуре в их N-концевых и C-концевых областях (см., например, Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)). Представители такой группы включают все родственные глюкагону пептиды, а также соматотропин-рилизинг-гормон (GHRH; SEQ ID NO:719), вазоактивный интестинальный пептид (VIP; SEQ ID NO:720), полипептид 27, активирующий аденилатциклазу гипофиза (PACAP-27; SEQ ID NO:721), пептид-гистидин-изолейцин (PHI), пептид-гистидин-метионин (PHM; SEQ ID NO:722), секретин (SEQ ID NO:723) и аналоги, производные или конъюгаты, имеющие до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных модификаций по сравнению с нативным пептидом. Такие пептиды предпочтительно сохраняют способность взаимодействовать (как агонисты или антагонисты) с рецепторами надсемейства рецепторов глюкагона. Если не указано иное, любая ссылка на положение аминокислоты в пептиде глюкагонового надсемейства (например, для связывания пролекарственного фрагмента, конъюгируемого фрагмента, гидрофильного полимера, ацилирования или алкилирования) относится к положению относительно аминокислотной последовательности нативного глюкагона (SEQ ID NO:701), см. фиг.10 в отношении выравнивания репрезентативных пептидов глюкагонового надсемейства.

Термин «агонист GLP-1» относится к соединению, которое стимулирует активность рецептора GLP-1, измеренную по продуцированию цАМФ с использованием подтвержденного анализа на модели in vitro, такого как анализ, описанный в примере 13 опубликованной международной заявки № WO 2007/056362, которая опубликована 18 мая 2007, описание которой, таким образом, специально включено в настоящее описание посредством ссылки.

Как используется в настоящем описании, термин «нативный GLP-1» является родовым термином, который означает GLP-1(7-36)амид (состоящий из последовательности SEQ ID NO:704), GLP-1(7-37)кислоту (состоящую из последовательности SEQ ID NO:703) или смесь указанных двух соединений. Как используется в настоящем описании, подразумевается, что общее указание «GLP-1» в отсутствие любого дополнительного обозначения означает нативный GLP-1.

Как используется в настоящем описании, термин «глюкагоновый пептид» является родовым термином, который обозначает природный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:701, а также модифицированные производные, имеющие одну или несколько аминокислотных модификаций по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, необязательно включая, но без ограничения, замены в положениях аминокислот 1, 2, 5, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 24, 28 и 29. Обычно все обозначения конкретного положения аминокислоты номером (например, положение 28) относятся к аминокислоте в указанном положении в нативном глюкагоне (SEQ ID NO:701) или соответствующему положению аминокислоты в любом его аналоге. Например, обозначение «положение 28» будет указывать на соответствующее положение 27 в случае аналога глюкагона, в котором первая аминокислота в SEQ ID NO:701 была делетирована. Подобным образом, обозначение «положение 28» будет указывать на соответствующее положение 29 в случае аналога глюкагона, в котором одна аминокислота была добавлена перед N-концом последовательности SEQ ID NO:701.

Как используется в настоящем описании, термин «пептид GLP-1» является родовым термином, который означает нативный GLP-1, а также модифицированные производные, имеющие одну или несколько модификаций аминокислот по сравнению с нативной последовательностью GLP-1.

Как используется в настоящем описании, «модификация» аминокислоты относится к замене, добавлению или делеции аминокислоты и включает замену или добавление любой из 20 аминокислот, обычно встречающихся в белках человека, а также необычных или не встречающихся в природе аминокислот. Коммерческие источники необычных аминокислот включают Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) и Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Необычные аминокислоты можно приобрести у коммерческих поставщиков, синтезировать de novo или можно химически модифицировать или дериватизировать встречающиеся в природе аминокислоты. Модификации аминокислот включают связывание аминокислоты с конъюгируемым фрагментом, таким как гидрофильный полимер, ацилирование, алкилирование и/или другую химическую дериватизацию аминокислоты.

Как используется в настоящем описании, «замена» аминокислоты относится к замене одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.

Как используется в настоящем описании, термин «консервативная аминокислотная замена» определяют как замену в пределах одной из следующих пяти групп:

I. малые алифатические, неполярные или слабо полярные остатки:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды:

Asp, Asn, Glu, Gln;

III. полярные, положительно заряженные остатки:

His, Arg, Lys; орнитин (Orn);

IV. крупные алифатические неполярные остатки:

Met, Leu, He, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин;

V. крупные ароматические остатки:

Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин.

Как используется в настоящем описании, термин «химера 2» относится к глюкагоновому пептиду, в котором аминокислотная последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) содержит следующие модификации: Gln в положении 17, Ala в положении 18, Lys в положении 20, Glu в положении 21, Ile в положении 23 и Ala в положении 24 и C-концевой амид.

Как используется в настоящем описании, общий термин «цепь полиэтиленгликоля» или «цепь ПЭГ» относится к смесям конденсированных полимеров этиленоксида и воды с разветвленной или неразветвленной цепью, представленных общей формулой H(OCH2CH2)kOH, где k равно по меньшей мере 9. В отсутствии какой-либо дополнительной характеристики подразумевают, что термин включает полимеры этиленгликоля со средней молекулярной массой, выбранной из диапазона от 500 до 80000 дальтон. «Цепь полиэтиленгликоля» или «цепь ПЭГ» используют в сочетании с числовым подстрочным индексом, который указывает примерную среднюю молекулярную массу. Например, ПЭГ-5000 (ПЭГ 5 кДа) относится к цепи полиэтиленгликоля, имеющей общую среднюю молекулярную массу примерно 5000 дальтон.

Как используется в настоящем описании, термин «пегилированный» и подобные термины относятся к соединению, которое было модифицировано по сравнению с его нативным состоянием путем связывания цепи полиэтиленгликоля с соединением. «Пегилированный полипептид» представляет собой полипептид, который имеет цепь ПЭГ, ковалентно связанную с полипептидом.

Как используется в настоящем описании, «линкер» означает связь, молекулу или группу молекул, которые связывают два отдельных объекта друг с другом. Линкеры могут обеспечивать оптимальное расположение двух объектов или могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, которая обеспечивает отделение двух объектов друг от друга. Лабильные связи включают фотоотщепляемые группы, кислотолабильные фрагменты, щелочелабильные фрагменты и отщепляемые ферментами группы.

Как используется в настоящем описании, «димер» означает комплекс, содержащий две субъединицы, ковалентно связанные друг с другом линкером. Термин димер при использовании в отсутствие какого-либо уточняющего пояснения охватывает как гомодимеры, так и гетеродимеры. Гомодимер содержит две идентичные субъединицы, тогда как гетеродимер содержит две субъединицы, которые являются хотя разными, но в значительной степени сходными друг с другом субъединицами.

Термин «C1-Cnалкил», где n может быть равен от 1 до 6, как используется в настоящем описании, означает разветвленную или неразветвленную алкильную группу, имеющую от одного до указанного количества атомов углерода. Конкретные C1-C6алкильные группы включают, но без ограничения, метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил и подобные.

Термин «C2-Cnалкенил», где n может быть равен от 2 до 6, как используется в настоящем описании, означает олефиновую ненасыщенную разветвленную или неразветвленную группу, имеющую от 2 до указанного количества атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Примеры таких групп включают, но без ограничения, 1-пропенил, 2-пропенил (-CH2-CH=CH2), 1,3-бутадиенил, (-CH=CHCH=CH2), 1-бутенил (-CH=CHCH2CH3), гексенил, пентенил и подобные.

Термин «C2-Cnалкинил», где n может быть равен от 2 до 6, относится к ненасыщенной разветвленной или неразветвленной группе, имеющей от 2 до n атомов углерода и по меньшей мере одну тройную связь. Примеры таких групп включают, но без ограничения, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил и подобные.

Как используется в настоящем описании, термин «арил» относится к моно или бициклической карбоциклической кольцевой системе, имеющей один или два ароматических кольца, включая, но без ограничения, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, инденил и подобные. Размер арильного кольца и наличие заместителей или связывающих групп указаны путем обозначения количества присутствующих атомов углерода. Например, термин «(C1-C3алкил)(C6-C10арил)» относится к 6-10-членному арилу, который связан с исходным остатком одно-трехчленной алкильной цепью.

Термин «гетероарил», как используется в настоящем описании, относится к моно или бициклической кольцевой системе, содержащей одно или два ароматических кольца и содержащей по меньшей мере один атом азота, кислорода или серы в ароматическом кольце. Размер гетероарильного кольца и наличие заместителей или связывающих групп указывают, обозначая количество присутствующих атомов углерода. Например, термин «(C1-Cnалкил)(C5-C6гетероарил)» относится к 5 или 6-членному гетероарилу, который связан с исходным остатком одно-n-членной алкильной цепью.

Как используется в настоящем описании, термин «гетероалкил» относится к неразветвленному или разветвленному углеводороду, содержащему указанное количество атомов углерода и по меньшей мере один гетероатом в остове структуры. Подходящие гетероатомы для целей настоящего изобретения включают, но без ограничения, N, S и O.

Как используется в настоящем описании, термин «галоген» относится к одному или нескольким представителям группы, состоящей из фтора, хлора, брома и йода.

Как используется в настоящем описании, термин «заряженная аминокислота» относится к аминокислоте, которая содержит боковую цепь, которая отрицательно заряжена (т.е. депротонирована) или положительно заряжена (т.е. протонирована) в водном растворе при физиологическом pH. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, цистеиновую кислоту, гомоцистеиновую кислоту и гомоглутаминовую кислоту, тогда как положительно заряженные аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Заряженные аминокислоты включают заряженные аминокислоты из 20 аминокислот, обычно встречающихся в белках человека, а также нетипичные или не встречающиеся в природе аминокислоты.

Как используется в настоящем описании, термин «кислая аминокислота» относится к аминокислоте, которая содержит второй остаток кислоты (т.е. остаток, отличный от α-карбоксильной группы, которую имеют все аминокислоты), включая, например, группу карбоновой кислоты или сульфоновой кислоты.

Как используется в настоящем описании, подразумевается, что термин «пациент» без дополнительного определения охватывает любое теплокровное позвоночное домашнее животное (включая, например, но без ограничения, крупный рогатый скот, лошадей, кошек, собак и других комнатных животных), млекопитающих и человека.

Варианты осуществления изобретения

В настоящем описании раскрыт препарат пролекарственных производных биологически активных полипептидов, полезных при лечении заболевания, например, диабета, ожирения. Более конкретно, пролекарства, описанные в настоящем описании, составляют в композиции для того, чтобы увеличить время полужизни исходного биологически активного пептида или белка, обеспечивая при этом возможность для последующей активации пролекарства посредством механизма неферментативного расщепления. Идеальное пролекарство должно быть растворимым в воде в физиологических условиях (например, при pH 7,2 и 37°C), и оно должно быть стабильным в форме порошка при длительном хранении. Также оно должно быть иммунологически бессимптомным и проявлять низкую активность по сравнению с исходным лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления пролекарство будет проявлять не более чем 10% активность от исходного лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления пролекарство проявляет менее чем примерно 10%, менее чем примерно 5%, примерно 1% или менее чем примерно 1% активность по сравнению с исходным лекарственным средством. Кроме того, пролекарство при инъекции в организм должно количественно превращаться в активное лекарственное средство в течение определенного периода времени. Как указано в настоящем описании, авторы изобретения предложили общий способ получения пролекарств известного биологически активного полипептида, выбранного из группы, состоящей из пептидов глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, и остеокальцин, и аналоги, производные и конъюгаты таких полипептидов, которые соответствуют каждой из указанных целей.

Более конкретно, предлагается химически обратимое пролекарство, содержащее последовательность пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, или его аналог, производное или конъюгат, модифицированный таким образом, чтобы он содержал дипептидный пролекарственный элемент, ковалентно связанный с пептидом амидной связью. Ковалентное связывание дипептидного пролекарственного элемента с активным участком пептида глюкагонового надсемейства ингибирует активность полипептида вплоть до отщепления дипептидного пролекарственного элемента. В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее «время неферментативной полуактивации» (t1/2) примерно от 1 до примерно 720 часов в физиологических условиях. Подразумевается, что физиологические условия, описанные в настоящем описании, включают температуру примерно от 35 до 40°C и pH примерно от 7,0 до примерно 7,4, и, как правило, включают pH от 7,2 до 7,4 и температуру от 36 до 38°C.

Преимущественно скорость расщепления и, следовательно, активации пролекарства зависит от структуры и стереохимии дипептидного пролекарственного элемента. Пролекарства, предлагаемые в изобретении, в конечном счете, химически превращаются в структуры, которые распознаются нативным рецептором лекарственного средства, где скорость такого химического превращения определяет время начала и продолжительность биологического действия in vivo. Структура молекул, раскрытых в настоящем изобретении, основана на внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов. Скорость превращения регулируется химической природой дипептидного заместителя и его отщеплением в физиологических условиях. Так как физиологическое значение pH и температура строго регулируются в сильно ограниченном диапазоне, скорость превращения из пролекарства в лекарственное средство будет в высокой степени воспроизводима у пациента и между пациентами.

Как описано в настоящем описании, предлагаются пролекарства, которые имеют увеличенное время полужизни благодаря существованию в пролекарственной форме, составляющее по меньшей мере примерно 1 час и в некоторых вариантах осуществления больше примерно 20 часов. В некоторых вариантах осуществления время полужизни пролекарств составляет примерно 1, 6, 8, 12, 20, 24, 48 или 72 часов. В некоторых вариантах осуществления время полужизни пролекарства составляет примерно 100 часов или больше, включая время полужизни вплоть до примерно 168, 336, 504, 672 или 720 часов, и пролекарства превращаются в активную форму в физиологических условиях в результате неферментативной реакции, стимулируемой свойственной им химической нестабильностью. В некоторых вариантах осуществления время t1/2 неферментативной активации пролекарства составляет 1-100 часов, и, как правило, от 12 до 72 часов, например, от 12 до 48 часов и от 48 до 72 часов, и в некоторых вариантах осуществления t1/2 составляет 24-48 часов согласно измерению посредством инкубации пролекарства в забуференном фосфатом растворе (например, PBS) при 37°C и pH 7,2. В другом варианте осуществления время t1/2 неферментативной активации пролекарства составляет от 1 до 6 часов, например примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов или примерно 6 часов. В другом варианте осуществления время t1/2 неферментативной активации пролекарства составляет от 6 до 24 часов. Время полужизни различных пролекарств вычисляют, используя формулу t1/2=0,693/k, где «k» означает константу скорости первого порядка разложения пролекарства. В некоторых вариантах осуществления активация пролекарства осуществляется после отщепления связанного амидной связью дипептида, образования дикетопиперазина или дикетоморфолина и высвобождения активного полипептидного лекарственного средства. Были идентифицированы конкретные дипептиды, состоящие из природных, некодируемых и/или синтетических аминокислот, которые способствуют внутримолекулярному разложению в физиологических условиях с высвобождением активных полипептидов.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается пролекарство пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина, или его аналога, производного или конъюгата, имеющее структуру A-B-Q. В данном варианте осуществления Q означает пептид, A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом. A и B вместе представляют собой дипептидный пролекарственный элемент, который связан с Q в результате образования амидной связи между A-B и амином Q. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из аминокислот A, B или аминокислоты Q, с которой связан A-B, представляет собой некодируемую аминокислоту. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент выбирают таким образом, чтобы химическое отщепление A-B от Q завершалось по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В следующем варианте осуществления аминокислоты дипептида выбирают таким образом, чтобы время полуотщепления A-B от Q в PBS в физиологических условиях было не больше, чем двух-пяти-кратное время полуотщепления A-B от Q в растворе, содержащем протеазу DPP-IV (включая, например, сыворотку человека).

Согласно некоторым вариантам осуществления аминогруппу алифатического соединения Q (например, первичный амин), включая, например, N-концевой амин или аминогруппу боковой цепи аминокислоты, модифицируют ковалентным связыванием дипептидного пролекарственного элемента амидной связью. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связывают с аминогруппой боковой цепи аминокислоты, присутствующей в Q, либо непосредственно, либо через связывающий остаток. В некоторых вариантах осуществления связывающий остаток содержит амин, несущий ацильную группу или алкильную группу. В некоторых вариантах осуществления предлагается пептид глюкагонового надсемейства, например, родственный глюкагону пептид, содержащий ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 или 20 пептида глюкагонового надсемейства, где ацильная группа или алкильная группа дополнительно содержит дипептидный пролекарственный элемент, связанный с ацильной группой или алкильной группой амидной связью. Например, данный вариант осуществления предусматривает, что пролекарство связано с аминогруппой Q либо непосредственно, либо через линкерную группу, и ацильная или алкильная связана с пролекарством либо непосредственно, либо через линкерный остаток.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан непосредственно с боковой цепью аминокислоты, где аминокислота имеет общую структуру:

где n означает целое число от 1 до 4.

Альтернативно, дипептидный пролекарственный элемент может быть связан с амино-заместителем, присутствующим на арильном кольце ароматической аминокислоты, включая, например, ароматическую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из амино-Phe, аминонафитилаланина, аминотриптофана, аминофенилглицина, аминогомо-Phe и аминотирозина. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с аминогруппой ароматической аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m означает целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с 4-аминогруппой аминокислоты, имеющей общую структуру:

где m означает целое число от 0 до 3. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с аминогруппой боковой цепи аминокислоты лизина или аминогруппой ароматического соединения 4-аминофенилаланина (которым заменен остаток нативного фенилаланина или тирозина биологически активного пептида). В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с первичным амином, присутствующим на внутренней аминокислоте пептида глюкагонового надсемейства, включая родственный глюкагону пептид или остеокальцин, или его аналог, производные или конъюгат.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру A-B, где A означает аминокислоту или гидроксикислоту, и B означает N-алкилированную аминокислоту, которая может быть связана амидной связью с первичной аминогруппой такого пептида с получением соответствующего пролекарства пептида. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В некоторых вариантах осуществления A и B выбраны так, чтобы в случае, когда дипептид A-B связан с первичным амином такого пептида амидной связью, химическое отщепление A-B от пептида завешалось по меньшей мере примерно на 90% в пределах примерно от 1 до примерно 720 часов в PBS в физиологических условиях. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты A и/или B являются аминокислотами в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации, а аминокислота B является аминокислотой в L-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в L-стереоизомерной конфигурации, а аминокислота B является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота A является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации, и аминокислота B является аминокислотой в D-стереоизомерной конфигурации.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент может быть дополнительно модифицирован так, чтобы он содержал гидрофильный остаток. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток представляет собой цепь полиэтиленгликоля. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40 кДа или выше ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты A или B дипептидного пролекарственного элемента. В другом варианте осуществления дипептидный пролекарственный элемент, дополнительно или альтернативно, ацилирован или алкилирован жирной кислотой или желчной кислотой или ее солью, например, C4-C30-жирной кислотой, C8-C24-жирной кислотой, холевой кислотой, C4-C30алкилом, C8-C24алкилом или алкилсодержащим стероидным остатком желчной кислоты. Альтернативно, дипептидный пролекарственный элемент может быть связан с депонируемым белком, таким как декстран, или крупной молекулой ПЭГ (с молекулярной массой больше или равной 80000 дальтон), которые служат для депонирования пролекарства в месте инъекции вплоть до того, как при отщеплении дипептида высвобождается биологически активный пептид. Дополнительные модификации дипептидных пролекарств описаны ниже в разделе, касающемся родственных глюкагону пептидов.

Дипептидный пролекарственный элемент создан так, чтобы он отщеплялся на основе внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления структуру дипептида выбирают так, чтобы она была устойчивой к отщеплению пептидазами, имеющимися в сыворотке млекопитающих, включая, например, дипептидилпептидазу IV (DPP-IV). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления скорость отщепления дипептидного пролекарственного элемента от биологически активного пептида по существу не увеличена (например, больше чем в 2 раза) в случае, когда реакция осуществляется с использованием физиологических условий в присутствии сывороточных протеаз по сравнению с осуществлением реакции в отсутствии протеаз. Таким образом, время полуотщепления A-B от биологически активного пептида в PBS в физиологических условиях не превышает более чем в два, три, четыре или пять раз время полуотщепления A-B от биологически активного белка в растворе, содержащем протеазу DPP-IV. В некоторых вариантах осуществления раствором, содержащим протеазу DPP-IV, является сыворотка, более конкретно сыворотка млекопитающих, включая сыворотку человека.

Согласно некоторым вариантам осуществления A или B дипептидного пролекарственного элемента или аминокислота пептида глюкагонового надсемейства, с которой связан A-B, является некодируемой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления аминокислота «B» является N-алкилированной, но не является пролином. В некоторых вариантах осуществления N-алкилирующей группой аминокислоты B является C1-C18алкил и, в некоторых вариантах осуществления, C1-C6алкил.

Согласно некоторым вариантам осуществления пролекарственное производное пептида глюкагонового надсемейства, содержащее дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, можно вводить совместно с ингибитором протеаз, включая специфический ингибитор DPP-IV (например, Januvia®, Merck & Co, Inc), в качестве средства замедления активации пролекарства. В данном варианте осуществления аминокислоты пролекарственного элемента выбирают таким образом, чтобы дипептид был приемлемым субстратом для расщепления DPP-IV. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. Ингибитор протеаз можно вводить в отдельной композиции или пролекарство и ингибитор протеаз можно вводить в виде одной композиции. При введении виде отдельных композиций ингибитор протеаз обычно вводят за 1-5 часов, 1-2 часов, 30 минут или 10 минут до введения пролекарства. В некоторых вариантах осуществления две отдельных композиции вводят сразу один за другим.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру формулы I:

где

R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила) и C1-C12алкил(A)(W1)C1-C12алкила, где W1 означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил; или R4 и R8 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH.

В других вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет общую структуру формулы I:

где

R1, R2, R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила) и C1-C12алкил(W1)C1-C12алкила, где W1 означает гетероатом, выбранный из группы, состоящей из N, S и O, или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил; или R4 и R8 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах осуществления R8 означает H, и R5 означает NHR6.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру формулы I, где

R1 и R8 независимо означают H или C1-C8алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и CH2(C3-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил или арил;

R5 означает NHR6; и

R6 означает H или C1-C8алкил.

В других вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру формулы I, где

R1 и R8 независимо означают H или C1-C8алкил;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и CH2(C3-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C12циклоалкил;

R3 означает C1-C18алкил;

R5 означает NHR6;

R6 означает H или C1-C8алкил; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Время полужизни пролекарства, образованного согласно настоящему изобретению, определяется заместителями дипептидного пролекарственного элемента, их положением и аминокислотой, с которой он связан. Например, пролекарство может содержать пептид глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент связан через альфа-аминогруппу N-концевой аминокислоты белка глюкагонового надсемейства. В данном варианте осуществления пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно 1 час, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R1 и R2 независимо означают C1-C18алкил или арил; или R1 и R2 связаны через -(CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород; и

R5 означает амин.

В других вариантах осуществления пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно 1 час, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R1 и R2 независимо означают C1-C18алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7; или R1 и R2 связаны через -(CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород;

R5 означает NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t1/2, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и арила, или R1 и R2 связаны через (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и арила; и R5 означает амин;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, и при условии, что один из R4 или R8 означают водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2 и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R2 связаны через (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 означает NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R4 или R8 означают водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C1-C4алкил)NH2, или R1 и R2 связаны через (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C8алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 выбран из группы, состоящей из водорода и C1-C8алкила; и

R5 означает NH2;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В других вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C1-C4алкил)NH2;

R3 означает C1-C6алкил;

R4 означает водород; и

R5 означает NH2;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющие t1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где

R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода и C1-C8алкила, (C1-C4алкил)NH2, или R1 и R2 связаны через (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C8алкил;

R4 означает (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 означает NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C0-C4алкил)OH;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом.

В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В любом из указанных вариантов осуществления пептид глюкагонового надсемейства имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Кроме того, предлагается пролекарство, имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с N-концевой альфа-аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, и имеющее t1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и арила;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород; и

R5 означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если R1 означает алкил или арил, то R1 и R5 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что если R1 означает алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, то R1 и R5 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства представляет собой родственный глюкагону пептид.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с амином боковой цепи внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства. В данном варианте осуществления пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно 1 час, имеют структуру:

где

R1 и R2 независимо означают C1-C8алкил или арил; или R1 и R2 связаны через (CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород; и R5 означает амин.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно 1 час, имеют структуру:

где

R1 и R2 независимо означают C1-C8алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7; или R1 и R2 связаны через -(CH2)p-, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород;

R5 означает NH2; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, и имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и арила, или R1 и R2 связаны через -(CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо означают C1-C18алкил или арил; и

R5 означает амин или N-замещенный амин;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, и при условии, что один из R4 или R8 означает водород.

В некоторых вариантах осуществления пролекарства, имеющие t1/2, например, примерно от 12 до примерно 72 часов, или в некоторых вариантах осуществления примерно от 12 до примерно 48 часов, и имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты, содержат дипептидный пролекарственный элемент, имеющий структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R2 связаны через -(CH2)p-, где p равен 2-9;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо означают водород, C1-C18алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 означает NHR6;

R6 означает H или C1-C8алкил, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена;

при условии, что оба R1 и R2 не являются водородом, и при условии, что по меньшей мере один из R4 или R8 является водородом. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом.

Кроме того, предлагается пролекарство, имеющее t1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов и имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и арила;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород; и

R5 означает амин или N-замещенный амин или гидроксил;

при условии, что если оба R1 и R2 независимо означают алкил или арил, то либо R1, либо R2 связаны через (CH2)p с R5, где p равно 2-9.

В некоторых вариантах осуществления предлагается пролекарство, имеющее t1/2, например, примерно от 72 до примерно 168 часов и имеющее дипептидный пролекарственный элемент, связанный с боковой цепью внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где дипептидный пролекарственный элемент имеет структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 означает C1-C18алкил;

R4 и R8 каждый означают водород;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H или C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4 алкил)OH и галогена;

при условии, что если оба R1 и R2 независимо означают алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, то либо R1, либо R2 связан через (CH2)p с R5, где p равно 2-9. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид. В любом из указанных вариантов пептид глюкагонового надсемейства имеет любых из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с амином боковой цепи внутренней аминокислоты пептида глюкагонового надсемейства, где внутренняя аминокислота содержит структуру формулы II:

где

n означает целое число, выбранное из 1-4. В некоторых вариантах осуществления n равно 3 или 4, и в некоторых вариантах осуществления внутренней аминокислотой является лизин. В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с первичным амином боковой цепи аминокислоты, находящейся в положении 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 пептида глюкагонового надсемейства. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 12, 16, 17, 18, 20, 28 или 29 содержит структуру формулы II:

где n означает целое число, выбранное из 1-4, и дипептидный пролекарственный элемент связан с боковой цепью аминокислоты амидной связью. В некоторых вариантах осуществления n равно 4, и аминокислота находится в положении 20. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид.

В следующем варианте осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства посредством амина, присутствующего на арильной группе ароматической аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления ароматическая аминокислота является внутренней аминокислотой пептида глюкагонового надсемейства, однако ароматическая аминокислота также может представлять собой N-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства является родственным глюкагону пептидом. В некоторых вариантах осуществления ароматическая аминокислота выбрана из группы, состоящей из амино-Phe, аминонафтилаланина, аминотриптофана, аминофенилглицина, амино-гомо-Phe и аминотирозина. В некоторых вариантах осуществления первичный амин, который образует амидную связь с дипептидным пролекарственным элементом, находится в параположении арильной группы. В некоторых вариантах осуществления ароматический амин имеет структуру формулы III:

где m равно целому числу от 1 до 3.

В случае таких вариантов осуществления, в которых дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства через амин, присутствующий в арильной группе ароматической аминокислоты, пролекарства, имеющие t1/2, например, составляющее примерно 1 час, имеют структуру дипептида:

где R1 и R2 независимо означают C1-C18алкил или арил;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и арила; и R5 означает амин или гидроксил.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с пептидом глюкагонового надсемейства через амин, присутствующий в арильной группе ароматической аминокислоты, где пролекарства, имеющие t1/2, составляющее, например, примерно 1 час, имеют структуру дипептида:

где R1 и R2 независимо означают C1-C18алкил или (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-12-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 означает NH2 или OH; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена. В некоторых вариантах осуществления пептидом глюкагонового надсемейства является родственный глюкагону пептид.

Кроме того, предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, который связан через ароматическую аминокислоту, и имеющие t1/2, составляющее, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, где дипептид содержит структуру:

где

R1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и арила, или R1 и R2 связаны через -(CH2)p, где p равно 2-9;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и арила; и R5 означает амин или N-замещенный амин.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный через ароматическую аминокислоту, и имеющие t1/2, составляющее, например, примерно от 6 до примерно 24 часов, где дипептид содержит структуру:

где

R1 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C4алкил)NH2 и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7;

R5 означает NHR6;

R6 означает H, C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

Кроме того, предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, который связан через ароматическую аминокислоту, и имеющие t1/2, составляющее, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептид содержит структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила и арила;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 и R8 каждый означают водорода; и

R5 выбран из группы, состоящей из амина, N-замещенного амина и гидроксила.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарства, имеющие дипептидный пролекарственный элемент, связанный через ароматическую аминокислоту, и имеющие t1/2, составляющее, например, примерно от 72 до примерно 168 часов, где дипептид содержит структуру:

где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, C1-C8алкила, (C1-C4алкил)COOH и (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, или R1 и R5 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-11-членное гетероциклическое кольцо;

R3 означает C1-C18алкил, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4-6-членное гетероциклическое кольцо;

R4 означает водород или образует 4-6-членное гетероциклическое кольцо с R3;

R8 означает водород;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H или C1-C8алкил, или R6 и R1 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 4, 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена.

В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с ароматической аминокислотой через первичный амин, присутствующий в арильном заместителе ароматической аминокислоты, где ароматическая аминокислота находится в положении 10, 13, 22 или 25 пептида глюкагонового надсемейства (на основе нумерации для глюкагона, см., например, фиг.10). В некоторых вариантах осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с ароматической аминокислотой, находящейся в положении 22 пептида глюкагонового надсемейства.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с N-концевым амином пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где дипептидный пролекарственный элемент содержит структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из H и C1-C8алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из H и OH. В некоторых вариантах осуществления R1 означает H или C1-C8алкил, R2 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, CH2OH, (C1-C4алкил)NH2, (C3-C6циклоалкила) и CH2(C6арил)R7, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, R3 означает C1-C6алкил, и R4 выбран из группы, состоящей из H, C1-C4алкила, (C3-C6)циклоалкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH и (C0-C4алкил)(C6арил)R7, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В следующем варианте осуществления R3 означает CH3, R5 означает NHR6, и в следующем альтернативном варианте осуществления R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, и R5 означает NHR6.

Согласно другому варианту осуществления дипептидный пролекарственный элемент связан с N-концевым амином пептида глюкагонового надсемейства, включая, например, родственный глюкагону пептид или остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, где дипептидный пролекарственный элемент содержит структуру:

где R1 выбран из группы, состоящей из H и C1-C8алкила;

R2 и R4 независимо выбраны из группы, состоящей из H, C1-C8алкила, C2-C8алкенила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH, (C2-C3алкил)SCH3, (C1-C4алкил)CONH2, (C1-C4алкил)COOH, (C1-C4алкил)NH2, (C1-C4алкил)NHC(NH2+)NH2, (C0-C4алкил)(C3-C6циклоалкила), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7, CH2(C5-C9гетероарила), или R1 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют C3-C6циклоалкил;

R3 выбран из группы, состоящей из C1-C8алкила, (C3-C6)циклоалкила, или R4 и R3 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо;

R5 означает NHR6 или OH;

R6 означает H, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5 или 6-членное гетероциклическое кольцо; и

R7 выбран из группы, состоящей из водорода, C1-C18алкила, C2-C18алкенила, (C0-C4алкил)CONH2, (C0-C4алкил)COOH, (C0-C4алкил)NH2, (C0-C4алкил)OH и галогена. В некоторых вариантах осуществления R1 означает H или C1-C8алкил, R2 выбран из группы, состоящей из H, C1-C6алкила, CH2OH, (C1-C4алкил)NH2, (C3-C6циклоалкила) и CH2(C6арил)R7, или R6 и R2 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, R3 означает C1-C6алкил, и R4 выбран из группы, состоящей из H, C1-C4алкила, (C3-C6)циклоалкила, (C1-C4алкил)OH, (C1-C4алкил)SH и (C0-C4алкил)(C6арил)R7, или R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо. В следующем варианте осуществления R3 означает CH3, R5 означает NHR6, и в следующем альтернативном варианте осуществления R3 и R4 вместе с атомами, с которыми они связаны, образуют 5-членное гетероциклическое кольцо, и R5 означает NHR6.

В некоторых вариантах осуществления Q имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Родственные глюкагону пептиды

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к родственным глюкагону пептидам (в виде части группы, обозначенной «Q»). Термин «родственный глюкагону пептид» относится к таким пептидам, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона, GLP-1, GLP-2 и GIP и содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40% идентичность последовательности (например, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) по меньшей мере с одной из последовательностей нативного глюкагона, нативного оксинтомодулина, нативного эксендина-4, нативного GLP-1, нативного GLP-2 или нативного GIP. Следует понимать, что рассматриваются все возможные подгруппы активностей родственных глюкагону пептидов, например, пептиды, которые обладают биологической активностью (как агонисты или антагонисты) в отношении любого одного или нескольких рецепторов глюкагона или GLP-1, или GIP, наряду со всеми возможными подгруппами идентичности последовательностей с каждым из перечисленных нативных пептидов, например, пептиды содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичность последовательности с последовательностью нативного глюкагона по длине нативного глюкагона. В некоторых вариантах осуществления изобретения родственным глюкагону пептидом является пептид, обладающий активностью агониста рецептора глюкагона, активностью агониста рецептора GIP, коагонистической активностью в отношении рецептора глюкагона/рецептора GLP-1, активностью антагониста рецептора глюкагона или активностью антагониста рецептора глюкагона и активностью агониста рецептора GLP-1. В некоторых вариантах осуществления пептид сохраняет альфа-спиральную конформацию в C-концевой половине молекулы. В некоторых вариантах осуществления пептид сохраняет положения, вовлеченные во взаимодействие с рецептором или передачу сигнала, например положение 3 глюкагона или положение 7, 10, 12, 13, 15 или 17 (1-37)GLP-1. Соответственно, родственный глюкагону пептид может представлять собой пептид класса 1, класса 2, класса 3, класса 4 и/или класса 5, каждый из которых дополнительно описан в настоящем описании.

Согласно некоторым вариантам осуществления дипептидный пролекарственный элемент может быть связан амидной связью с любыми биологически активными соединениями, ранее описанными в международных заявках № PCT/US2008/08608 (поданной 3 января, 2008), PCT/US2008/053857 (поданной 13 февраля 2008), PCT/US2009/47437 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2009/47438 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2009/47447 (поданной 16 июня 2009), PCT/US2008/080973 (поданной 23 октября 2008) и PCT/US2008/081333 (поданной 27 октября 2008), описания которых, таким образом, специально включены в настоящее описание посредством ссылки. Дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, в некоторых примерах вариантов осуществления может быть связан с биологически активными пептидами, описанными в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438, PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333, либо через N-концевой амин, либо с аминогруппой боковой цепи лизина в положении 20, либо с аминогруппой ароматической аминокислоты 4-аминофенилаланина, которым заменена аминокислота в положении 22 любого из описанных биологически активных пептидов. В некоторых примерах вариантов осуществления дипептидный пролекарственный элемент, описанный в настоящем описании, связан амидной связью с N-концевым амином биологически активного пептида, описанного в PCT/US2008/08608, PCT/US2008/053857, PCT/US2009/47437, PCT/US2009/47438 и PCT/US2009/47447, PCT/US2008/08097 и PCT/US2008/081333. В некоторых вариантах осуществления пептид глюкагонового надсемейства имеет любую из последовательностей SEQ ID NO:1-684, 701-731, 801-919, 1001-1262, 1301-1371, 1401-1518, 1701-1776 и 1801-1921.

Модификации

Родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) с модификациями. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид может содержать всего 1, до 2, до 3, до 4, до 5, до 6, до 7, до 8, до 9 или до 10 модификаций аминокислот, по сравнению с нативной последовательностью глюкагона, например, консервативных или неконсервативных замен. Модификации и замены, описанные в настоящем описании, в некоторых аспектах осуществляют в конкретных положениях в родственном глюкагону пептиде, где нумерация положения соответствует нумерации глюкагона (SEQ ID NO:701). В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4 или 5 неконсервативные замены осуществляют в любом из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, и осуществляют до 5 дополнительных консервативных замен в любом из указанных положений. В некоторых вариантах осуществления осуществляют 1, 2 или 3 модификации аминокислот среди аминокислот в положениях 1-16, и осуществляют 1, 2 или 3 модификации аминокислот среди аминокислот в положениях 17-26. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды сохраняют по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 встречающихся в природе аминокислот в соответствующих положениях нативного глюкагона (например, имеют 1-7, 1-5 или 1-3 модификации по сравнению с встречающимся в природе глюкагоне).

Устойчивость к DPP-IV

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид содержит модификацию в положении 1 или 2, чтобы снизить чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления положение 1 родственного глюкагону пептида (например, выбранного из пептидов, указанных на фиг.10) заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-гистидина, альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA), N-метилгистидина, альфа-метилгистидина, имидазолуксусной кислоты, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления положение 2 родственного глюкагону пептида заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, валина, глицина, N-метилсерина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 родственного глюкагону пептида не является D-серином.

Гидрофильные остатки

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственные глюкагону пептиды класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) связан (ковалентно связан) с гидрофильным остатком. Гидрофильные остатки могут быть связаны с родственным глюкагону пептидом в любых подходящих условиях, используемых для взаимодействия белка с активированной полимерной молекулой. Можно использовать любые способы, известные в данной области, включая ацилирование, восстановительное алкилирование, реакцию Михаэля, алкилирование тиолов или другие способы хемоселективного конъюгирования/лигирования посредством реакционноспособной группы остатка ПЭГ (например, альдегидной группы, аминогруппы, сложноэфирной, тиольной, α-галогенацетильной, малеимидной или гидразиновой группы) с реакционноспособной группой соединения-мишени (например, альдегидной группой, аминогруппой, сложноэфирной, тиольной, α-галогенацетильной, малеимидной или гидразиновой группой). Активирующие группы, которые можно использовать для связывания растворимого в воде полимера с одним или несколькими белками, включают, но без ограничения, сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифторметансульфонат, трезилат, азидирин, оксиран и 5-пиридил. В случае связывания с пептидом посредством восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь один химически активный альдегид для того, чтобы контролировать степень полимеризации. См., например, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); и Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).

Что касается родственных глюкагону пептидов классов 1-3, то дополнительные активирующие группы, которые можно использовать для связывания растворимого в воде полимера с одним или несколькими белками, включают альфа-галогенированную ацильную группу (например, альфа-йодуксусную кислоту, альфа-бромуксусную кислоту, альфа-хлоруксусную кислоту). В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислоту, содержащую тиол, модифицируют активированным малеимидом ПЭГ в реакции присоединения Михаэля, получая пегилированный пептид, содержащий тиоэфирную связь, показанную ниже:

.

В других вариантах осуществления тиол аминокислоты родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют активированным галогенацетилом ПЭГ в реакции нуклеофильного замещения, получая пегилированный пептид, содержащий тиоэфирную связь, показанную ниже:

.

Подходящие гидрофильные остатки включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль, полиоксиэтилированные полиолы (например, POG), полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерин (POG), полиоксиалкилены, пропиональдегид полиэтиленгликоля, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, моно(C1-C10)алкокси или арилоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, полиацетали, поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-l,3,6-триоксалан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, поли(бета-аминокислоты) (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля (PPG) и другие полиалкиленоксиды, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, колановые кислоты или другие полисахаридные полимеры, фиколл или декстран и их смеси. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из субъединиц глюкозы, преимущественно связанных 1-6 α-связями. Декстраны существуют в нескольких диапазонах по молекулярной массе, например, примерно от 1 кДа до примерно 100 кДа, или примерно от 5, 10, 15 или 20 кДа до примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 кДа.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другого водорастворимого полимера, которая ковалентно связана с боковой цепью аминокислотного остатка в одном или нескольких положениях 16, 17, 21, 24, 29, 40 указанного родственного глюкагону пептида, в C-концевом удлинении или с C-концевой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления нативную аминокислоту в данном положении заменяют аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, чтобы облегчить связывание гидрофильного остатка с пептидом. Примеры аминокислот включают Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или ацетилфенилаланин (Ac-Phe). В других вариантах осуществления к пептиду на C-конце добавляют аминокислоту, модифицированную таким образом, чтобы она содержала гидрофильную группу.

Гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, согласно некоторым вариантам осуществления имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон или примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, имеет молекулярную массу примерно от 10000 до примерно 20000 дальтон. В следующих примерах вариантов осуществления гидрофильный остаток, например цепь полиэтиленгликоля, имеет молекулярную массу примерно от 20000 до примерно 40000 дальтон.

Предусмотрены неразветвленные или разветвленные гидрофильные полимеры. Полученные препараты конъюгатов могут быть по существу монодисперсными или полидисперсными, и могут иметь примерно 0,5, 0,7, 1, 1,2, 1,5 или 2 полимерных остатка на пептид.

Ацилирование

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 3, родственные глюкагону пептиды класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) модифицируют, чтобы они содержали ацильную группу. Например, родственный глюкагону пептид может быть родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3 и может содержать ацильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацилирование может быть осуществлено в любом положении в родственном глюкагону пептиде, включая любое из положений 1-29, положение в пределах C-концевого удлинения или C-концевую аминокислоту, при условии, что активность, проявляемая неацилированным родственным глюкагону пептидом, сохраняется после ацилирования. Например, если неацилированный пептид обладает активностью агониста глюкагона, то ацилированный пептид сохраняет активность агониста глюкагона. Также, например, если неацилированный пептид обладает активностью антагониста глюкагона, то ацилированный пептид сохраняет активность антагониста глюкагона. Например, если неацилированный пептид обладает агонистической активностью GLP-1, то ацилированный пептид сохраняет агонистическую активность GLP-1. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то ацилирование может быть осуществлено в любом из положений 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Ацильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, или опосредованно с аминокислотой родственного глюкагону пептида через спейсер, где спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и ацильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть ацилированы в том же положении аминокислоты, в котором связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) и пегилирование в одном или нескольких положениях в C-концевой части глюкагонового пептида, например, в положении 24, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в пределах C-концевого удлинения или на C-конце (например, в результате присоединения C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, прямым ацилированием амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид непосредственно ацилируют через амин, гидроксил или тиол боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления ацилирование осуществляют в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В связи с этим, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована до получения любой аминокислоты, содержащей амин, гидроксил или тиол боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения прямое ацилирование родственного глюкагону пептида происходит по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы I:

где n=1-4

[формула I]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы I представляет собой аминокислоту, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах осуществления аминокислота, содержащая гидроксил в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы II:

где n=1-4

[формула II]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислотой формулы II является аминокислота, где n равно 1 (Ser).

В следующих вариантах осуществления аминокислота, содержащая тиол в боковой цепи, представляет собой аминокислоту формулы III:

где n=1-4

[формула III]

В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы III представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Cys).

В следующих вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, является дизамещенной аминокислотой, имеющей такую же структуру формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что водород, связанный с альфа-атомом углерода аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III, заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ацилированный родственный глюкагону пептид содержит спейсер между пептидом и ацильной группой. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который ковалентно связан с ацильной группой. В некоторых примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, ацилированием амина, гидроксила или тиола спейсера, и такой спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) или с C-концевой аминокислотой родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH2, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). Также, что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то подходящей является аминокислота (например, моно или ди-α-замещенная аминокислота), содержащая -NH2, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована в любую аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или карбоксилат в боковой цепи.

В некоторых вариантах осуществления спейсером является аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, имеющую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный спейсер не является аминокислотой γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не может быть γ-Glu-γ-Glu.

Когда происходит ацилирование группы амина аминокислоты спейсера, ацилирование может осуществляться по альфа-амину аминокислоты или амину боковой цепи. В случае, когда ацилирован альфа-амин, спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть, например, гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминокапроновая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислый остаток, например, Asp и Glu. В случае, когда ацилирован амин боковой цепи спейсерной аминокислоты, спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В этом случае могут быть ацилированы как альфа-амин, так и амин боковой цепи ацилируемой спейсерной аминокислоты, так что глюкагоновый пептид является диацилированным. Варианты осуществления изобретения включают такие диацилированные молекулы.

Когда ацилирование происходит по гидроксильной группе аминокислоты спейсера, аминокислота или одна из аминокислот дипептида или трипептида может представлять собой аминокислоту формулы II. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Ser.

Когда ацилирование происходит по тиольной группе аминокислоты спейсера, аминокислота или одна из аминокислот дипептида или трипептида может представлять собой аминокислоту формулы III. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим, спейсер может содержать, например, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m равно любому целому числу от 1 до 6, и n равно любому целому числу от 2 до 12, такую как, например, 8-амино-3,6-диоксакаприловая кислота, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах осуществления, относящихся только к родственным глюкагону пептидам класса 1, класса 2 и класса 3, спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амин, гидроксил, тиол и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. Гидрофобные бифункциональные спейсеры известны в данной области. См., например, публикацию Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амин, гидроксил, тиол и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области и включают, например, 8-гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.

В некоторых вариантах осуществления бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, не является дикарбоновой кислотой, содержащей неразветвленный алкилен из 1-7 атомов углерода между карбоксилатными группами. В некоторых вариантах осуществления бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, является дикарбоновой кислотой, содержащей неразветвленный алкилен из 1-7 атомов углерода между карбоксилатными группами.

Cпейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) в конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов, (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов). В более конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет длину примерно от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов), и ацильной группой является C12-C18ацильная группа жирной кислоты, например, C14ацильная группа жирной кислоты, C16ацильная группа жирной кислоты, так что общая длина спейсера и ацильной группы составляет от 14 до 28 атомов, например примерно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и ацильной группы составляет от 17 до 28 (например, от 19 до 26, от 19 до 21) атомов.

Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или встречающуюся в природе аминокислоту (включая, но без ограничения, любую из аминокислот, описанных в настоящем описании), содержащую остов аминокислоты, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов длиной от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов). Каждая аминокислота дипептидного или трипептидного спейсера, связанного с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может быть такой же или отличной от другой аминокислоты (аминокислот) дипептида или трипептида и может быть независимо выбрана из группы, состоящей из: встречающихся в природе и/или не встречающихся в природе аминокислот, включая, например, любой из D или L-изомеров встречающихся в природе аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) или любой из D или L-изомеров не встречающихся в природе аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: β-аланина (β-Ala), N-α-метилаланина (Me-Ala), аминомасляной кислоты (Abu), γ-аминомасляной кислоты (γ-Abu), аминокапроновой кислоты (ε-Ahx), аминоизомасляной кислоты (Aib), аминометилпирролкарбоновой кислоты, аминопиперидинкарбоновой кислоты, аминосерина (Ams), аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, N-метокси-N-метиламида аргинина, β-аспарагиновой кислоты (β-Asp), азетидинкарбоновой кислоты, 3-(2-бензотиазолил)аланина, α-трет-бутилглицина, 2-амино-5-уреидо-н-валериановой кислоты (цитруллина, Cit), β-циклогексилаланина (Cha), ацетамидометилцистеина, диаминомасляной кислоты (Dab), диаминопропионовой кислоты (Dpr), дигидроксифенилаланина (DOPA), диметилтиазолидина (DMTA), γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu), гомосерина (Hse), гидроксипролина (Hyp), N-метокси-N-метиламида изолейцина, метилизолейцина (MeIle), изонипекотиновой кислоты (Isn), метиллейцина (MeLeu), метиллизина, диметиллизина, триметиллизина, метанопролина, метионинсульфоксида (Met(O)), метионинсульфона (Met(O2)), норлейцина (Nle), метилнорлейцина (Me-Nle), норвалина (Nva), орнитина (Orn), парааминобензойной кислоты (PABA), пеницилламина (Pen), метилфенилаланина (MePhe), 4-хлорфенилаланина (Phe(4-Cl)), 4-фторфенилаланина (Phe(4-F)), 4-нитрофенилаланина (Phe(4-NO2)), 4-цианофенилаланина ((Phe(4-CN)), фенилглицина (Phg), пиперидинилаланина, пиперидинилглицина, 3,4-дегидропролина, пирролидинилаланина, саркозина (Sar), селеноцистеина (Sec), O-бензилфосфосерина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты (Sta), 4-амино-5-циклогексил-3-гидроксипентановой кислоты (ACHPA), 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты (AHPPA), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислоты (Tic), тетрагидропиранглицина, тиенилаланина (Thi), O-бензилфосфотирозина, O-фосфотирозина, метокситирозина, этокситирозина, O-(бис-диметиламинофосфоно)тирозина, тирозинсульфата тетрабутиламина, метилвалина (MeVal), 1-амино-1-циклогексанкарбоновой кислоты (Acx), аминовалериановой кислоты, бета-циклопропилаланина (Cpa), пропаргилглицина (Prg), аллилглицина (Alg), 2-амино-2-циклогексилпропановой кислоты (2-Cha), трет-бутилглицина (Tbg), винилглицина (Vg), 1-амино-1-циклопропанкарбоновой кислоты (Acp), 1-амино-1-циклопентанкарбоновой кислоты (Acpe) и алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет суммарный отрицательный заряд, например содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептид не является любым из дипептидов с общей структурой A-B, где A выбран из группы, состоящей из Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe и Pro, где B выбран из группы, состоящей из Lys, His, Trp. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из: Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γ-аминомасляная кислота и γ-Glu-γ-Glu.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, путем ацилирования длинноцепочечного алкана родственным глюкагону пептидом. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол), которая взаимодействует с карбоксильной группой или ее активированной формой родственного глюкагону пептида. Карбоксильная группа или ее активированная форма родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может быть частью боковой цепи аминокислоты (например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты) родственного глюкагону пептида или может быть частью остова пептида.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют, чтобы он содержал ацильную группу, путем ацилирования длинноцепочечного алкана спейсером, который связан с глюкагоновым пептидом. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу, которые взаимодействуют с карбоксильной группой или ее активированной формой спейсера. Подходящие спейсеры, содержащие карбоксильную группу или ее активированную форму, описаны в настоящем описании и включают, например, бифункциональные спейсеры, например аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры.

Как используется в настоящем описании, термин «активированная форма карбоксильной группы» относится к карбоксильной группе общей формулы R(C=O)X, где X означает уходящую группу, и R означает родственный глюкагону пептид или спейсер. Например, активированные формы карбоксильных групп могут включать, но без ограничения, ацилхлориды, ангидриды и сложные эфиры. В некоторых вариантах осуществления активированная карбоксильная группа представляет собой сложный эфир с уходящей группой N-гидроксисукцинимида (NHS).

Что касается указанных аспектов изобретения, в которых длинноцепочечный алкан ацилируют родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3 или спейсером, то длинноцепочечный алкан может быть любого размера и может иметь любую длину углеродной цепи. Длинноцепочечный алкан может быть неразветвленным или разветвленным. В некоторых аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан является C4-C30алканом. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой из алканов: C4алкан, C6алкан, C8алкан, C10алкан, C12алкан, C14алкан, C16алкан, C18алкан, C20алкан, C22алкан, C24алкан, C26алкан, C28алкан или C30алкан. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан включает C8-C20алкан, например, C14алкан, C16алкан или C18алкан.

Также в некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, амин, гидроксил или тиольная группа родственного глюкагону пептида ацилирированы холестериновой кислотой. В конкретном варианте осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 связан с холестериновой кислотой через алкилированный дезамино-Cys-спейсер, т.е. спейсер на основе алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты.

Подходящие способы ацилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области. См., например, Miller, Biochem. Biophys. Res. Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int. J. Pept. Protein Res. 19: 54-62 (1982); и Previero et al., Biochim. Biophys. Acta 263: 7-13 (1972) (в отношении способов ацилирования по гидроксилу); и San and Silvius, J. Pept. Res. 66: 169-180 (2005) (в отношении способов ацилирования по тиолу); Bioconjugate Chem. «Chemical Modifications of Proteins: History and Applications» p. 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. «Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity» Vol. 6, NO:2 pp.171-176 (1989).

Ацильная группа ацилированного родственного глюкагону пептида может быть любого размера, например, с любой длиной углеродной цепи, и может быть неразветвленной или разветвленной. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения ацильная группа может быть представлена C4-C30 жирной кислотой. Например, ацильная группа может быть представлена любой из кислот: C4 жирной кислотой, C6 жирной кислотой, C8 жирной кислотой, C10 жирной кислотой, C12 жирной кислотой, C14 жирной кислотой, C16 жирной кислотой, C18 жирной кислотой, C20 жирной кислотой, C22 жирной кислотой, C24 жирной кислотой, C26 жирной кислотой, C28 жирной кислотой или C30 жирной кислотой. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представлена C8-C20 жирной кислотой, например, C14 жирной кислотой или C16 жирной кислотой.

В альтернативном варианте осуществления ацильная группа представлена желчной кислотой. Желчной кислотой может быть любая желчная кислота, включая, но без ограничения, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и холестериновую кислоту.

Ацилированные родственные глюкагону пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы дополнительно содержать гидрофильный остаток. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный остаток может содержать цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ). Включение гидрофильного остатка можно осуществить любыми подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем описании. В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать последовательность SEQ ID NO:701, содержащую любую из модификаций, описанных в настоящем описании, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положении 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) содержит ацильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положении 16, 17, 21, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в положении в пределах C-концевого удлинения или C-концевая аминокислота модифицированы до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным остатком (например, ПЭГ). В некоторых вариантах осуществления ацильная группа связана в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно через спейсер, содержащий Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и гидрофильный остаток включен по остатку Cys в положении 24.

Альтернативно, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где спейсер является как ацилированным, так и модифицированным таким образом, чтобы содержать гидрофильный остаток. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Алкилирование

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид, например родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, глюкагоновый пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5, модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, которая связана с родственным глюкагону пептид эфирной, тиоэфирной или амидной связью в целях увеличения времени полужизни в циркуляции и/или задержки начала и/или увеличения продолжительности действия и/или повышения устойчивости к протеазам, таким как DPP-IV. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид содержит алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающимся в природе аминокислотам.

Алкилирование можно осуществлять в любом положении родственного глюкагону пептида, включая любое из положений 1-29, положение в пределах C-концевого удлинения или C-концевую аминокислоту, при условии, что сохраняется агонистическая или антагонистическая активность родственного глюкагону пептида в отношении рецептора глюкагона, GLP-1 или другого родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает активностью агониста глюкагона, то алкилированный пептид сохраняет активность агониста глюкагона. В других вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает активностью антагониста глюкагона, то алкилированный пептид сохраняет активность антагониста глюкагона. В некоторых вариантах осуществления, если неалкилированный пептид обладает агонистической активностью GLP-1, то алкилированный пептид сохраняет агонистическую активность GLP-1. Неограничивающие примеры включают алкилирование в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то алкилирование может быть осуществлено в положениях 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 29, 30, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). Алкильная группа может быть ковалентно связана непосредственно с аминокислотой родственного глюкагону пептида, или опосредованно с аминокислотой родственного глюкагону пептида через спейсер, где спейсер расположен между аминокислотой родственного глюкагону пептида и алкильной группой. Родственные глюкагону пептиды могут быть алкилированы в том же положении аминокислоты, с которым связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты. Неограничивающие примеры включают алкилирование в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) и пегилирование в одном или нескольких положениях в C-концевой части родственного глюкагону пептида, например, в положении 24, 28 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), в пределах C-концевого удлинения или на C-конце (например, путем добавления C-концевого Cys).

В конкретном аспекте изобретения родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, прямым алкилированием амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты родственного глюкагону пептида. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид непосредственно алкилируют по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления алкилирование осуществляют в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В связи с этим, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована до любой аминокислоты, содержащей амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения прямое алкилирование родственного глюкагону пептида осуществляют по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В некоторых вариантах осуществления аминокислотой, содержащей амин в боковой цепи, является аминокислота формулы I. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы I представляет собой аминокислоту, где n равно 4 (Lys) или n равно 3 (Orn).

В других вариантах осуществления аминокислотой, содержащей гидроксил в боковой цепи, является аминокислота формулы II. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы II представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Ser).

В еще других вариантах осуществления аминокислотой, содержащей тиол в боковой цепи, является аминокислота формулы III. В некоторых примерах вариантов осуществления аминокислота формулы II представляет собой аминокислоту, где n равно 1 (Cys).

В следующих вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, представляет собой дизамещенную аминокислоту, имеющую такую же структуру формулы I, формулы II или формулы III, за исключением того, что водород, связанный с альфа-атомом углерода аминокислоты формулы I, формулы II или формулы III заменен второй боковой цепью.

В некоторых вариантах осуществления изобретения алкилированный родственный глюкагону пептид содержит спейсер между пептидом и алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид ковалентно связан со спейсером, который ковалентно связан с алкильной группой. В некоторых примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, алкилированием амина, гидроксила или тиола спейсера, где такой спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10, 20, 24 или 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) родственного глюкагону пептида. Аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота, содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то аминокислотой, с которой связан спейсер, может быть любая аминокислота (например, одно-α-замещенная аминокислота или α,α-дизамещенная аминокислота), содержащая остаток, который обеспечивает возможность связывания со спейсером. Например, подходящей является аминокислота, содержащая -NH2, -OH или -COOH в боковой цепи (например, Lys, Orn, Ser, Asp или Glu). В этой связи, ацилированный родственный глюкагону пептид может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, где по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 10, 20, 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) модифицирована в любую аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или карбоксилат в боковой цепи.

В некоторых вариантах осуществления спейсером является аминокислота, содержащая амин, гидроксил или тиол в боковой цепи, или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, имеющую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный спейсер не является аминокислотой γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не может быть γ-Glu-γ-Glu.

Когда происходит алкилирование группы амина аминокислоты спейсера, такое алкилирование может быть осуществлено по альфа-амину аминокислоты или амину боковой цепи. В случае, когда алкилирован альфа-амин, спейсерной аминокислотой может быть любая аминокислота. Например, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr. Альтернативно, спейсерной аминокислотой может быть кислый остаток, например, Asp и Glu. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, спейсерной аминокислотой может быть гидрофобная аминокислота, например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-аминокапроновая кислота, 5-аминовалериановая кислота, 7-аминогептановая кислота, 8-аминооктановая кислота. Альтернативно, спейсерной аминокислотой, связанной с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может быть кислый остаток, например, Asp и Glu, при условии, что алкилирование происходит по альфа-амину кислого остатка. В случае, когда алкилирован амин боковой цепи спейсерной аминокислоты, спейсерной аминокислотой является аминокислота, содержащая амин в боковой цепи, например, аминокислота формулы I (например, Lys или Orn). В таком случае, возможно алкилирование как альфа-амина, так и амина боковой цепи спейсерной аминокислоты, так что глюкагоновый пептид оказывается диалкилированным. Варианты осуществления изобретения включают такие диалкилированные молекулы.

Когда алкилирование происходит по гидроксильной группе аминокислоты спейсера, аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы II. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Ser.

Когда алкилирование происходит по тиольной группе аминокислоты спейсера, аминокислотой или одной из аминокислот спейсера может быть аминокислота формулы III. В конкретном примере варианта осуществления аминокислотой является Cys.

В некоторых вариантах осуществления спейсер включает гидрофильный бифункциональный спейсер. В конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим, спейсер может содержать, например, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m означает любое целое число от 1 до 6, и n означает любое целое число от 2 до 12, такую как, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY).

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер представляет собой гидрофильный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, амино, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат.

В некоторых вариантах осуществления спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит две или несколько реакционноспособных групп, например, аминную, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, содержит тиольную группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобные бифункциональные спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области и включают, например, 8-гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.

Спейсер (например, аминокислота, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный спейсер или гидрофобный бифункциональный спейсер) в конкретных вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-10 атомов, (например, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов)). В более конкретных вариантах осуществления спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, имеет длину примерно от 3 до 10 атомов (например, 6-10 атомов), и алкил представляет собой C12-C18алкильную группу, например, C14алкильную группу, C16алкильную группу, так что общая длина спейсера и алкильной группы составляет 14-28 атомов, например примерно 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 атомов. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длина спейсера и алкила составляет 17-28 (например, 19-26, 19-21) атомов.

Согласно некоторым приведенным выше вариантам осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или не встречающуюся в природе аминокислоту, имеющую аминокислотный остов, длина которого составляет 3-10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). Альтернативно, спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов, длина которого составляет 3-10 атомов (например, 6-10 атомов). Дипептидный или трипептидный спейсер, связанный с родственным глюкагону пептидом класса 1, класса 2 или класса 3, может состоять из встречающихся в природе и/или не встречающихся в природе аминокислот, включая, например, любую из аминокислот, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер имеет суммарный отрицательный заряд, например содержит одну или две отрицательно заряженных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, дипептидный спейсер выбран из группы, состоящей из: Ala-Ala, β-Ala-β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γ-аминомасляная кислота и γ-Glu-γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером является γ-Glu-γ-Glu.

Подходящие способы алкилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области. Например, можно использовать простой эфирный синтез Вильямсона для образования простой эфирной связи между родственным глюкагону пептидом и алкильной группой. Также, реакция нуклеофильного замещения пептида с алкилгалогенидом может приводить к образованию любой из эфирной, тиоэфирной или амидной связи.

Алкильная группа алкилированного родственного глюкагону пептида может иметь любой размер, например, любую длину углеродной цепи, и может быть неразветвленной или разветвленной. В некоторых вариантах осуществления изобретения алкильная группа представляет собой C4-C30алкил. Например, алкильная группа может представлять собой любую из алкильных групп: C4алкил, C6алкил, C8алкил, C10алкил, C12алкил, C14алкил, C16алкил, C18алкил, C20алкил, C22алкил, C24алкил, C26алкил, C28алкил или C30алкил. В некоторых вариантах осуществления алкильная группа представляет собой C8-C20алкил, например, C14алкил или C16алкил.

В некоторых конкретных вариантах осуществления алкильная группа содержит стероидный остаток желчной кислоты, например, холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, литохолевой кислоты, таурохолевой кислоты, гликохолевой кислоты и холестериновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, родственный глюкагону пептид модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, путем взаимодействия нуклеофильного длинноцепочечного алкана с родственным глюкагону пептидом, где родственный глюкагону пептид содержит уходящую группу, подходящую для нуклеофильного замещения. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, нуклеофильная группа длинноцепочечного алкана содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу (например, октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол). Уходящая группа родственного глюкагону пептида класса 1, класса 2 или класса 3 может быть частью боковой цепи аминокислоты или может быть частью пептидного остова. Подходящие уходящие группы включают, например, N-гидроксисукцинимид, галогены и сложные сульфонатные эфиры.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3 модифицируют, чтобы он содержал алкильную группу, путем взаимодействия нуклеофильного длинноцепочечного алкана со спейсером, который связан с родственным глюкагону пептидом, где спейсер содержит уходящую группу. В конкретных аспектах, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан содержит аминную, гидроксильную или тиольную группу. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, спейсер, содержащий уходящую группу, может представлять собой любой спейсер, обсуждаемый в настоящем описании, например, аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры, дополнительно содержащие подходящую уходящую группу.

Что касается указанных аспектов изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, и в которых длинноцепочечный алкан алкилирован родственным глюкагону пептидом или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может иметь углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть неразветвленным или разветвленным. В некоторых аспектах длинноцепочечный алкан представляет собой C4-C30алкан. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой из алканов: C4алкан, C6алкан, C8алкан, C10алкан, C12алкан, C14алкан, C16алкан, C18алкан, C20алкан, C22алкан, C24алкан, C26алкан, C28алкан или C30алкан. В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, длинноцепочечный алкан представляет собой C8-C20алкан, например, C14алкан, C16алкан или C18алкан.

Также в некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, алкилирование может происходить между родственным глюкагону пептидом и остатком холестерина. Например, гидроксильная группа холестерина может заменять уходящую группу на длинноцепочечном алкане с образованием продукта холестерин-глюкагоновый пептид.

Алкилированные родственные глюкагону пептиды, описанные в настоящем описании, могут быть дополнительно модифицированы, чтобы они содержали гидрофильный остаток. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный остаток может содержать цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ). Введение гидрофильного остатка можно осуществить подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем описании. В связи с этим, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать последовательность SEQ ID NO:701 или модифицированную аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положении 10, 20 24 и 29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа) содержит алкильную группу, и по меньшей мере одна из аминокислот в положении 16, 17, 21, 24 и 29, в положении в пределах C-концевого удлинения или C-концевая аминокислота модифицирована до Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным остатком (например, ПЭГ). В некоторых вариантах осуществления алкильная группа связана в положении 10 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), необязательно через спейсер, содержащий Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и гидрофильный остаток введен по остатку Cys в положении 24.

Альтернативно, алкилированный родственный глюкагону пептид может содержать спейсер, где спейсер является как алкилированным, так и модифицированным, чтобы содержать гидрофильный остаток. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

В некоторых вариантах осуществления формируют внутримолекулярный мостик между боковыми цепями двух аминокислот, стабилизируя трехмерную структуру части, находящейся на карбоксильном конце (например, аминокислоты 12-29 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа)) родственного глюкагону пептида. Две боковых цепи аминокислот могут быть связаны друг с другом через водородные связи, ионное взаимодействие, такое как образование солевых мостиков, или ковалентные связи.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга 3 аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях i и i+4, где i означает любое целое число от 12 до 25 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. Более конкретно, боковые цепи пар аминокислот 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28 (пары аминокислот, в которых i равно 12, 16, 20 или 24) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа связаны друг с другом и таким образом стабилизируют альфа-спираль глюкагона. Альтернативно, i может быть равно 17.

В некоторых конкретных вариантах осуществления, в которых аминокислоты в положениях i и i+4 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 8 атомов или примерно 7-9 атомов.

В других вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образован между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга двумя аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях j и j+3, где j означает любое целое число от 12 до 26 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 и 26) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах осуществления j равно 17.

В некоторых конкретных вариантах осуществления, в которых аминокислоты в положениях j и j+3 связаны внутримолекулярным мостиком, размер линкера составляет примерно 6 атомов или примерно от 5 до 7 атомов.

В следующих вариантах осуществления внутримолекулярный мостик образуется между двумя аминокислотами, которые отделены друг от друга 6 аминокислотами, например, между аминокислотами в положениях k и k+7, где k означает любое целое число от 12 до 22 (например, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 22) согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа. В некоторых конкретных вариантах осуществления k равно 12, 13 или 17. В примере варианта осуществления k равно 17.

Примерами пар аминокислот, которые способны к ковалентному связыванию с образованием шестиатомного связывающего мостика, являются Orn и Asp, Glu и аминокислота формулы I, где n равно 2, и гомоглутаминовая кислота и аминокислота формулы I, где n равно 1, где формула I представляет собой:

где n=1-4

[Формула I]

Примерами пар аминокислот, которые способны к ковалентному связыванию с образованием семиатомного связывающего мостика, являются Orn-Glu (лактамовое кольцо), Lys-Asp (лактам) или гомо-Ser-гомо-Glu (лактон). Примерами пар аминокислот, которые могут образовывать восьмиатомный линкер, являются Lys-Glu (лактам), гомо-Lys-Asp (лактам), Orn-гомо-Glu (лактам), 4-аминоPhe-Asp (лактам) или Tyr-Asp (лактон). Примерами пар аминокислот, которые могут образовывать девятиатомный линкер, являются гомо-Lys-Glu (лактам), Lys-гомо-Glu (лактам), 4-аминоPhe-Glu (лактам) или Tyr-Glu (лактон). Любые боковые цепи таких аминокислот могут быть дополнительно замещены дополнительными химическими группами, при условии, что трехмерная структура альфа-спирали не нарушается. Специалист в данной области может предложить альтернативные пары или альтернативные аналоги аминокислот, включая химически модифицированные производные, которые могут создавать стабилизирующую структуру, имеющую сходный размер и оказывающую требуемое влияние. Например, дисульфидный мостик гомоцистеин-гомоцистеин имеет длину 6 атомов и может быть дополнительно модифицирован для получения требуемого эффекта. Даже при отсутствии ковалентного связывания пары аминокислот, описанные выше, или сходные пары, которые может предоставить специалист в данной области, также могут обеспечить дополнительную стабильность альфа-спирали благодаря нековалентным связям, например, в результате образования солевых мостиков или образования водородных связей.

Размер лактамового кольца может варьировать в зависимости от длины боковых цепей аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления лактам образуется в результате связывания боковых цепей аминокислоты лизина с боковой цепью глутаминовой кислоты. Дополнительные иллюстративные варианты (в соответствии с нумерацией аминокислот глюкагона дикого типа) включают следующие пары, необязательно с лактамовым мостиком: Glu в положении 12 с Lys в положении 16; нативный Lys в положении 12 с Glu в положении 16; Glu в положении 16 с Lys в положении 20; Lys в положении 16 с Glu в положении 20; Glu в положении 20 с Lys в положении 24; Lys в положении 20 с Glu в положении 24; Glu в положении 24 с Lys в положении 28; Lys в положении 24 с Glu в положении 28. Альтернативно, порядок амидной связи в кольце лактама может быть обратным (например, лактамовое кольцо может быть образовано между боковыми цепями Lys12 и Glu16 или, альтернативно, между Glu 12 и Lys 16).

Можно использовать другие внутримолекулярные мостики, отличные от лактамового мостика, чтобы стабилизировать альфа-спираль родственных глюкагону пептидов. В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик является гидрофобным мостиком. В данном случае, внутримолекулярный мостик необязательно находится между боковыми цепями двух аминокислот, которые представляют собой часть гидрофобной внешней поверхности альфа-спирали родственного глюкагону пептида. Например, одной из аминокислот, связанной гидрофобным мостиком, может быть аминокислота в положении 10, 14 и 18 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа).

В одном конкретном аспекте используют метатезис олефинов для перекрестного сшивания одного или двух поворотов альфа-спирали родственного глюкагону пептида, используя полностью углеводородную систему поперечного сшивания. В этом случае, родственный глюкагону пептид может содержать α-метилированные аминокислоты, несущие олефиновые боковые цепи разной длины и имеющие либо R-, либо S-стереохимическую конфигурацию по положениям i и i+4 или i+7. Например, олефиновая боковая цепь может содержать (CH2)n, где n означает любое целое число от 1 до 6. В некоторых вариантах осуществления n равно 3 в случае длины поперечной сшивки из 8 атомов. Подходящие способы образования таких внутримолекулярных мостиков описаны в данной области. См., например, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) и Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004). Альтернативно, глюкагоновый пептид может содержать остатки O-аллил-Ser, расположенные на соседних поворотах спирали, которые связаны вместе мостиком в результате катализируемого рутением метатезиса с замыканием кольца. Такие способы поперечного сшивания описаны, например, Blackwell et al., в Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998).

В другом конкретном аспекте неприродную тиодиаланиновую аминокислоту, лантионин, широко используемую в качестве пептидомиметика цистеина, используют для поперечного сшивания одного витка альфа-спирали. Подходящие способы, основанные на лантионине циклизации, известны в данной области. См., например, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); и Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).

В некоторых вариантах осуществления α,ω-диаминоалкановые связки, например, 1,4-диаминопропановые и 1,5-диаминопентановые, между двумя остатками Glu в положениях i и i+7 используют для стабилизации альфа-спирали глюкагонового пептида. Такие связки приводят к образованию мостика длиной 9 атомов или больше, в зависимости от длины диаминоалкановой связки. Подходящие способы получения пептидов, поперечно сшитых такими связками, описаны в данной области. См., например, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).

В еще одном варианте осуществления изобретения используют дисульфидный мостик для поперечного сшивания одного или двух витков альфа-спирали родственного глюкагону пептида. Альтернативно, используют модифицированный дисульфидный мостик, в котором один или два атома серы заменены группой метилена, приводящей к изостерической макроциклизации, чтобы стабилизировать альфа-спираль родственного глюкагону пептида. Подходящие способы модификации пептидов дисульфидными мостиками или основанной на сере циклизации описаны, например, в Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) и Rudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).

В еще одном варианте осуществления альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют, используя связывание атома металла двумя остатками His или парой His и Cys, находящимися в положениях i и i+4. Атомом металла может быть, например, Ru(III), Cu(II), Zn(II) или Cd(II). Такие способы основанной на связывании металла стабилизации альфа-спирали известны в данной области. См., например, Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); и Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).

Альфа-спираль родственного глюкагону пептида, альтернативно, может быть стабилизирована другими способами циклизации пептидов, и обзор таких способов приведен у Davies, в J. Peptide Sci. 9: 471-501 (2003). Альфа-спираль может быть стабилизирована в результате образования амидной связи, простого тиоэфирного мостика, сложного тиоэфирного мостика, мочевинного мостика, карбаматного мостика, сульфонамидного мостика и подобных. Например, сложный тиоэфирный мостик может быть образован между C-концом и боковой цепью остатка Cys. Альтернативно, простой тиоэфир может быть образован благодаря боковым цепям аминокислот, имеющих тиол (Cys) и остаток карбоновой кислоты (например, Asp, Glu). В другом способе поперечно сшивающий агент, такой как дикарбоновая кислота, например субериновая кислота (октандиовая кислота) и т.д., может вводить связь между двумя функциональными группами боковой цепи аминокислоты, такими как свободная аминогруппа, гидроксильная, тиольная группа и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления альфа-спираль родственного глюкагону пептида стабилизируют путем введения гидрофобной аминокислоты в положения i и i+4. Например, i может представлять собой Tyr, и i+4 может быть либо Val, либо Leu; i может представлять собой Phe, и i+4 может быть Cys или Met; i может представлять собой Cys, и i+4 может быть Met; или i может быть Phe, и i+4 может быть Ile. Следует понимать, что для целей настоящего изобретения указанные выше пары аминокислот могут быть обратными, так что указанная аминокислота в положении I, альтернативно, может находиться в положении i+4, тогда как аминокислота i+4 может находиться в положении i.

Согласно другим вариантам осуществления изобретения, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой пептид, обладающий активностью агониста глюкагона, активностью агониста GIP, активностью антагониста глюкагона и активностью GLP-1, альфа-спираль стабилизируют путем введения (либо посредством замены аминокислоты, либо посредством инсерции аминокислоты) одной или несколько стабилизирующих альфа-спираль аминокислот в C-коневую часть родственного глюкагону пептида (вблизи аминокислот 12-29, согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа). В конкретном варианте осуществления стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой является α,α-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, любую из аминокислот: аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или замещенную циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновая кислота). В некоторых вариантах осуществления в одном, двух, трех, четырех или больше положениях 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24 или 29 родственного глюкагону пептида имеется замена α,α-дизамещенной аминокислотой. В конкретном варианте осуществления в одном, двух, трех или во всех положениях 16, 20, 21 и 24 имеется замена аминокислотой AIB.

Конъюгаты

Настоящее изобретение также относится к конъюгатам, в которых родственный глюкагону пептид (например, родственный глюкагону пептид класса 1, родственный глюкагону пептид класса 2, родственный глюкагону пептид класса 3, родственный глюкагону пептид класса 4 или родственный глюкагону пептид класса 5) связывают, необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер, с конъюгируемым остатком. Связывание можно осуществлять с использованием ковалентных химических связей, физических сил, таких как электростатические, водородные, ионные, Ван-дер-Ваальса или гидрофобные или гидрофильные взаимодействия. Можно использовать множество систем нековалентного связывания, включая системы биотин-авидин, лиганд/рецептор, фермент/субстрат, нуклеиновая кислота/связывающий нуклеиновую кислоту белок, липид/связывающий липид белок, молекулярные партнеры при клеточной адгезии; или любые связывающиеся партнеры или их фрагменты, которые обладают аффинностью в отношении друг к другу.

Родственный глюкагону пептид может быть связан с конъюгируемым остатком благодаря прямому ковалентному связыванию в результате взаимодействия целевых аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками таких целевых аминокислот. Реакционноспособными группами пептида или конъюгируемого остатка являются, например, альдегидная группа, аминогруппа, сложноэфирная, тиольная, α-галогенацетильная, малеимидная или гидразиновая группа. Дериватизирующие агенты включают, например, малеимидобензилсульфосукцинимидный сложный эфир (конъюгирование через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глутаральдегид, янтарный ангидрид или другие агенты, известные в данной области. Альтернативно, конъюгируемые остатки могут быть связаны с пептидом непосредственно через промежуточные носители, такие как полисахаридные или полипептидные носители. Примеры полисахаридных носителей включают аминодекстран. Примеры подходящих полипептидных носителей включают полилизин, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, их сополимеры и смешанные полимеры таких аминокислот и других аминокислот, например, серина, чтобы придать требуемые свойства растворимости полученному в результате нагруженному носителю.

Остатки цистеинила, как правило, взаимодействуют с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с образованием карбоксиметил или карбоксиамидометил-производных. Остатки цистеинила также дериватизируют взаимодействием с бромтрифторацетоном, альфа-бром-β-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлоррутьбензоатом, 2-хлорруть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.

Остатки гистидила дериватизируют взаимодействием с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, так как указанный агент сравнительно специфичен по отношению к боковой цепи гистидила. Также может быть использован пара-бромфенацилбромид; реакцию предпочтительно осуществляют в 0,1М какодилате натрия при pH 6,0.

Остатки лизинила и амино-концевые остатки подвергают взаимодействию с янтарным или другими ангидридами карбоновых кислот. Эффект дериватизации такими агентами заключается в смене заряда остатков лизинила на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-аминосодержащих остатков включают сложные имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборогидрид, тринитробензолсульфоновую кислоту, O-метилизомочевину, 2,4-пентандион и катализируемое трансаминазой взаимодействие с гликосилатом.

Остатки аргинила модифицируют взаимодействием с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует, чтобы реакция проходила в щелочных условиях из-за высокого значения pKa функциональной группы гуанидина. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.

Конкретная модификация остатков тирозинила в случае, когда особый интерес представляет введение спектральных меток в остатки тирозинила, может быть осуществлена путем взаимодействия с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометана. Наиболее широко используют N-ацетилимидизол и тетранитрометан для образования формы O-ацетилтирозинила и 3-нитро-производных, соответственно.

Боковые карбоксильные группы (аспартил или глутамил) избирательно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (R-N=C=N-R'), где R и R' означают различные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила превращаются в остатки аспарагинила и глутаминила при взаимодействии с ионами аммония.

Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), дезамидирование аспарагина или глутамина, ацетилирование N-концевого амина и/или амидирование или этерификацию C-концевых карбоксильных групп.

Другой тип ковалентной модификации заключается в химическом или ферментативном связывании гликозидов с пептидом. Сахар (сахара) может быть связан с (a) аргинином и гистидином, (b) свободными карбоксильными группами, (c) свободными сульфгидрильными группами, такими как группы цистеина, (d) свободными гидроксильными группами, такими как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (e) ароматическими остатками, такими как ароматические остатки тирозина или триптофана, или (f) амидной группой глутамина. Такие способы описаны в WO87/05330, опубликованной 11 сентября 1987, и в Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

Примерами конъюгируемых остатков, которые могут быть связаны с любым из родственных глюкагону пептидов, описанных в настоящем описании, являются, но без ограничения, гетерологичный пептид или полипептид (включая например, белок плазмы), целенаправленное средство, иммуноглобулин или его часть (например, вариабельная область, CDR или Fc-область), диагностическая метка, такая как радиоактивный изотоп, флюорофор или ферментативная метка, полимер, включая водорастворимые полимеры, или другие терапевтические или диагностические средства. В некоторых вариантах осуществления предлагается конъюгат, содержащий родственный глюкагону пептид согласно настоящему изобретению и белок плазмы, где белок плазмы выбран из группы, состоящей из альбумина, трансферина, фибриногена и глобулинов. В некоторых вариантах осуществления белком плазмы в качестве компонента конъюгата является альбумин или трансферин. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит цепь атомов длиной, включающей от 1 до примерно 60 или от 1 до 30 атомов, или более длинную цепь, от 2 до 5 атомов, от 2 до 10 атомов, от 5 до 10 атомов или от 10 до 20 атомов. В некоторых вариантах осуществления все атомы в цепи являются атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления атомы в цепи в остове линкера выбраны из группы, состоящей из C, O, N и S. Атомы в цепи и линкеры могут быть выбраны в соответствии с их ожидаемой растворимостью (гидрофильностью), для того чтобы получить более растворимый конъюгат. В некоторых вариантах осуществления линкер обеспечивает функциональную группу, которая подвергается отщеплению ферментом или другим катализатором или в гидролитических условиях, встречающихся в ткани или органе, или клетке-мишени. В некоторых вариантах осуществления длина линкера является достаточно длинной, чтобы уменьшить возможные стерические помехи. Если линкер представляет собой ковалентную связь или пептидную связь, и конъюгат представляет собой полипептид, то полный конъюгат может представлять собой слитый белок. Такие пептидильные линкеры могут быть любой длины. Примеры линкеров составляют в длину примерно от 1 до 50 аминокислот, от 5 до 50, от 3 до 5, от 5 до 10, от 5 до 15 или от 10 до 30 аминокислот. Такие слитые белки, альтернативно, могут быть получены генно-инженерными рекомбинантными способами, известными специалисту в данной области.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды конъюгируют, например, сливают с иммуноглобулином или его частью (например, вариабельной областью, CDR или Fc-областью). Известные типы иммуноглобулинов (Ig) включают IgG, IgA, IgE, IgD или IgM. Fc-область представляет собой C-концевую область тяжелой цепи Ig, которая ответственна за связывание с Fc-рецепторами, которые обладают такой активностью, как рециклинг (что приводит к пролонгированному времени полужизни), зависимая от антитела опосредованная клетками цитотоксичность (ADCC) и зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC).

Например, согласно некоторым определениям, Fc-область тяжелой цепи IgG человека простирается от Cys226 до C-конца тяжелой цепи. «Шарнирная область» обычно простирается от Glu216 до Pro230 IgG1 человека (шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 посредством выравнивания цистеинов, вовлеченных в связывание цистеина). Fc-область IgG включает два константных домена, CH2 и CH3. Домен CH2 Fc-области IgG человека обычно простирается от аминокислоты 231 до аминокислоты 341. Домен CH3 Fc-области IgG человека обычно простирается от аминокислоты 342 до аминокислоты 447. Все указания номеров аминокислот иммуноглобулинов или фрагментов или областей иммуноглобулинов основаны на нумерации, представленной в публикации Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. В родственном варианте осуществления Fc-область может содержать одну или несколько нативных или модифицированных константных областей из тяжелой цепи иммуноглобулина, отличных от CH1, например, области CH2 и CH3 IgG и IgA, или области CH3 и CH4 IgE.

Подходящие конъюгируемые остатки включают части последовательностей иммуноглобулинов, которые содержат участок связывания FcRn. FcRn, рецептор спасения, ответственен за рециклинг иммуноглобулинов и возвращение их в кровообращение. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, описана на основе данных рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Главная область контакта Fc с FcRn расположена вблизи места соединения доменов CH2 и CH3. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одной тяжелой цепи Ig. Главные участки контакта включают остатки аминокислот 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена CH2 и остатки аминокислот 385-387, 428 и 433-436 домена CH3.

Некоторые конъюгируемые остатки могут включать или не включать участок (участки) связывания FcγR. FcγR ответственны за ADCC и CDC. Примерами положений в пределах Fc-области, которые осуществляют прямой контакт с FcγR, являются аминокислоты 234-239 (нижняя шарнирная область), аминокислоты 265-269 (петля B/C), аминокислоты 297-299 (петля C'/E) и аминокислоты 327-332 (петля F/G) (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). Нижняя шарнирная область IgE также вовлечена в связывание FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Остатки, вовлеченные в связывание рецептора IgA, описаны Lewis et al. (J. Immunol. 175: 6694-701, 2005). Остатки аминокислот, вовлеченные в связывание рецептора IgE, описаны Sayers с соавторами (J. Biol. Chem. 279(34): 35320-5, 2004).

Модификации аминокислот могут быть осуществлены в Fc-области иммуноглобулина. Такие варианты Fc-области содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в домене CH3 Fc-области (остатки 342-447) и/или по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в домене CH2 Fc-области (остатки 231-341). Мутации, которые, как полагают, придают повышенную аффинность в отношении FcRn, включают T256A, T307A, E380A и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276: 6591). Другие мутации могут снижать связывание Fc-области с FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA без существенного уменьшения аффинности в отношении FcRn. Например, замена Asn в положении 297 Fc-области Ala или другой аминокислотой удаляет высоко консервативный сайт N-гликозилирования и может приводить к пониженной иммуногенности и сопутствующему пролонгированному времени полужизни Fc-области, а также сниженному связыванию с FcγR (Routledge et al. 1995, Transplantation 60: 847; Friend et al. 1999, Transplantation 68: 1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276: 6591). Были осуществлены модификации аминокислот в положениях 233-236 IgG1, которые уменьшают связывание с FcγR (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2: 77 и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2613). Некоторые примеры аминокислотных замен описаны в патентах США 7355008 и 7381408, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

рПЭГ

В некоторых вариантах осуществления конъюгат согласно изобретению содержит пептид глюкагонового надсемейства, включая родственные глюкагону пептиды, остеокальцин, а также их аналоги, производные и конъюгаты, слитый со вспомогательным пептидом, который способен образовывать расширенную конформацию, сходную с химическим соединением ПЭГ (например, молекулой рекомбинантного ПЭГ (рПЭГ)), таким как пептиды, описанные в публикации международной патентной заявки No. WO2009/023270 и публикации патентной заявки США № US2008/0286808. Молекула рПЭГ не является полиэтиленгликолем. Молекула рПЭГ в некоторых аспектах представляет собой полипептид, содержащий одну или несколько из следующих аминокислот: глицин, серин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аланин или пролин. В некоторых аспектах рПЭГ представляет собой гомополимер, например, полиглицин, полисерин, полиглутаминовую кислоту, полиаспарагиновую кислоту, полиаланин или полипролин. В других вариантах осуществления рПЭГ содержит два типа повторяющихся аминокислот, например поли(Gly-Ser), поли(Gly-Glu), поли(Gly-Ala), поли(Gly-Asp), поли(Gly-Pro), поли(Ser-Glu) и т.д. В некоторых аспектах рПЭГ содержит три разных типа аминокислот, например поли(Gly-Ser-Glu). В конкретных аспектах рПЭГ увеличивает время полужизни пептида глюкагонового надсемейства или остеокальцина. В некоторых аспектах рПЭГ имеет общий положительный или общий отрицательный заряд. рПЭГ в некоторых аспектах не имеет вторичной структуры. В некоторых вариантах осуществления рПЭГ имеет длину равную или больше 10 аминокислот и в некоторых вариантах осуществления имеет длину примерно от 40 до примерно 50 аминокислот. Вспомогательный пептид в некоторых аспектах слит с N- или C-концом пептида настоящего изобретения посредством пептидной связи или через сайт расщепления протеиназой или встроен в петли пептида настоящего изобретения. рПЭГ в некоторых аспектах содержит аффинную метку или связан с ПЭГ молекулярной массы больше 5 кДа. В некоторых вариантах осуществления рПЭГ увеличивает гидродинамический радиус пептида настоящего изобретения, время полужизни в сыворотке, устойчивость к протеазам или растворимость, и в некоторых аспектах придает пептиду пониженную иммуногенность.

Слитые пептиды - C-концевое удлинение

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид может содержать C-конец или C-концевую аминокислотную последовательность, включающую, но без ограничения: COOH, CONH2, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:710), GPSSGAPPPS-CONH2 (SEQ ID NO:711), удлинение карбоксильного конца оксинтомодулина, KRNRNNIA (SEQ ID NO:714) или KGKKNDWKHNITQ (SEQ ID NO:713). Например, десять концевых аминокислот эксендина-4 (т.е. последовательность SEQ ID NO:710 (GPSSGAPPPS)) связывают с карбоксильным концом родственного глюкагону пептида класса 1, родственного глюкагону пептида класса 2, родственного глюкагону пептида класса 3, родственного глюкагону пептида класса 4 или родственного глюкагону пептида класса 5 согласно настоящему изобретению.

Другим соединением, которое индуцирует потерю массы, является оксинтомодулин, встречающийся в природе пищеварительный гормон, найденный в тонком кишечнике (см. Diabetes 2005; 54: 2390-2395). Оксинтомодулин представляет собой пептид длиной 37 аминокислот (SEQ ID NO:706), который содержит 29 аминокислотную последовательность глюкагона, за которой следует состоящее из 8 аминокислот удлинение карбоксильного конца SEQ ID NO:714 (KRNRNNIA). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предлагаются пролекарственные производные родственных глюкагону пептидов, которые дополнительно содержат на карбоксильном конце удлинение с последовательностью SEQ ID NO:714 или состоящее из четырех аминокислот удлинение, имеющее последовательность KRNR.

Модификация глюкагона в положении 3

Родственные глюкагону пептиды классов 1-3, описанные в настоящем описании, могут быть модифицированы в положении 3 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), чтобы сохранить или повысить активность в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, поддержанная или повышенная активность в отношении рецептора глюкагона может быть достигнута путем модификации Gln в положении 3 до аналога глутамина. Например, родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, может проявлять примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 50% или примерно 85% или большую активность нативного глюкагона (SEQ ID NO:701) в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, может проявлять примерно 20%, примерно 50%, примерно 75%, примерно 100%, примерно 200% или примерно 500% или большую активность соответствующего глюкагонового пептида, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пептида, содержащего аналог глутамина, за исключением модифицированной аминокислоты в положении 3, в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, содержащий аналог глутамина в положении 3, проявляет повышенную активность в отношении рецептора глюкагона, но повышенная активность не превышает 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности нативного глюкагона или соответствующего родственного глюкагону пептида, имеющего такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пептида, содержащего аналог глутамина, за исключением модифицированной аминокислоты в положении 3.

В некоторых вариантах осуществления аналог глутамина представляет собой встречающуюся в природе или не встречающуюся в природе аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

структура I

структура II

структура III

где R1 означает C0-3алкил или C0-3гетероалкил; R2 означает NHR4 или C1-3алкил; R3 означает C1-3алкил; R4 означает H или C1-3алкил; X означает NH, O или S; и Y означает NHR4, SR3 или OR3. В некоторых вариантах осуществления X означает NH или Y означает NHR4. В некоторых вариантах осуществления R1 означает C0-2алкил или C1-гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления R2 означает NHR4 или C1алкил. В некоторых вариантах осуществления R4 означает H или C1алкил. В примерах вариантов осуществления, в которых родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, класса 2 или класса 3, предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры I, где R1 означает CH2-S, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R1 означает CH2, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетилдиаминомасляная кислота, Dab(Ac)); R1 означает C0алкил, X означает NH, R2 означает NHR4, и R4 означает H (карбамоилдиаминопропановая кислота, Dap(мочевина)); или R1 означает CH2-CH2, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетилорнитин, Om(Ac)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры II, где R1 означает CH2, Y означает NHR4, и R4 означает CH3 (метилглутамин, Q(Me)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры III, где R1 означает CH2, и R4 означает H (метионинсульфоксид, M(O)). В конкретных вариантах осуществления аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac).

Димеры

Что касается родственных глюкагону пептидов класса 1, класса 2 и класса 3, то родственный глюкагону пептид может быть частью димера, тримера или полимера более высокого порядка, содержащего по меньшей мере два, три или более пептидов, связанных линкером, где по меньшей мере один или оба пептида представляют собой родственные глюкагону пептиды. Димер может быть гомодимером или гетеродимером. В некоторых вариантах осуществления линкер выбран из группы, состоящей из бифункционального основанного на тиоле поперечно сшивающего агента и бифункционального основанного на амине поперечно сшивающего агента. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой ПЭГ, например, ПЭГ 5 кДа, ПЭГ 20 кДа. В некоторых вариантах осуществления линкером является дисульфидная связь. Например, каждый мономер димера может содержать остаток Cys (например, расположенный на конце или внутри Cys), и атом серы каждого остатка Cys принимает участие в образовании дисульфидной связи. В некоторых аспектах согласно изобретению мономеры связаны через концевые аминокислоты (например, N-концевую или C-концевую), через внутренние аминокислоты или концевые аминокислоты по меньшей мере одного мономера и внутреннюю аминокислоту по меньшей мере одного другого мономера. В конкретных аспектах мономеры не связаны через N-концевые аминокислоты. В некоторых аспектах мономеры полимеров связаны вместе в ориентации «хвост к хвосту», в случае которой C-концевые аминокислоты каждого мономера связаны вместе. Конъюгируемый остаток может быть ковалентно связан с любым из родственных глюкагону пептидов, описанных в настоящем описании, включая димер, тример или полимер более высокого порядка.

Способы получения родственных глюкагону пептидов

Родственные глюкагону пептиды (и пролекарства) согласно настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами синтеза, с использованием методики рекомбинантной ДНК или любыми другими способами получения пептидов и слитых белков. Хотя некоторые не встречающиеся в природе аминокислоты не могут быть экспрессированы с использованием стандартной методики рекомбинантной ДНК, способы их получения известны в данной области. Соединения настоящего изобретения, которые включают непептидные части, могут быть синтезированы с использованием стандартных реакций органической химии в дополнение к стандартным реакциям химии пептидов в случае, когда это приемлемо.

Классы родственных глюкагону пептидов описаны более подробно ниже. Что касается каждого из разделов описания, относящихся к модификациям родственных глюкагону пептидов класса 1, 2, 3, 4 и 5, то их описание относится к части родственного глюкагону пептида (Q) пролекарственного соединения, подробно описанного выше. Таким образом, структурные элементы, описанные для класса родственных глюкагону пептидов, являются структурными элементами Q, которые затем дополнительно модифицируют, чтобы создать пролекарственное соединение, как описано выше.

Родственные глюкагону пептиды класса 1

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 1, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT US2009/47437 (поданной 16 июня 2009), публикации международной патентной заявки № WO 2008/086086, опубликованной 17 июля 2008, и в предварительной патентной заявке США № 61/090415, содержание которых включено посредством ссылки во всей своей полноте.

Биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:801-915), относящемся к родственным глюкагону пептидам класса 1, соответствуют последовательностям SEQ ID NO:1-115 в международной патентной заявке № PCT US2009/47437.

Активность

Глюкагоновые пептиды класса 1 сохраняют активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоновым пептидом (SEQ ID NO:801). Например, глюкагоновый пептид может сохранять по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% от активности, 80% от активности, 85% от активности или 90% от активности нативного глюкагона (вычисляемой в виде обратного отношения EC50 для глюкагонового пептида к EC50 для глюкагона, например, измеряемого по продуцированию цАМФ с использованием анализа, в общем описанного в примере 5). В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 обладают такой же или более высокой активностью (термин используется в настоящем описании как синоним термина «эффективность»), чем глюкагон. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем примерно 100%, 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активности по сравнению с активностью нативного глюкагонового пептида.

Любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может иметь EC50 в отношении рецептора глюкагона человека примерно 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ или менее при тестировании на индукцию цАМФ в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих рецептор глюкагона, например, с использованием анализа, описанного в примере 5. Обычно пегилированные пептиды будут иметь более высокую EC50 по сравнению с непегилированным пептидом. Например, родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, в случае, когда они являются непегилированными, могут проявлять активность в отношении рецептора глюкагона, которая составляет по меньшей мере 20% (например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, 100%, 150%, 200%, 400%, 500% или больше) от активности нативного глюкагона (SEQ ID NO:801) в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, проявляют указанную в % активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона в случае отсутствия гидрофильного остатка, но проявляют пониженную активность в % по сравнению с нативным глюкагоном в отношении рецептора глюкагона в случае, когда он содержит гидрофильный остаток. Например, родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, в случае, когда они являются пегилированными, могут проявлять активность в отношении рецептора глюкагона, которая составляет по меньшей мере 2% (например, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9% или по меньшей мере 10%) от активности нативного глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, могут проявлять любую из указанных выше активностей, но составляющую не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 проявляют активность, составляющую менее чем примерно 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1 и/или больше чем примерно 5-кратную, 10-кратную или 15-кратную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1. Например, в некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 проявляют активность, составляющую менее 5% от активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1 и проявляют более чем 5-кратную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1.

Повышенная растворимость

Нативный глюкагон имеет плохую растворимость в водном растворе, особенно при физиологическом pH, и имеет тенденцию к агрегации и преципитации с течением времени. Напротив, родственные глюкагону пептиды класса 1 в некоторых вариантах осуществления проявляют по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную или еще более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при pH от 6 до 8, или от 6 до 9, например, при pH 7 через 24 часа при 25°C.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 модифицирован по сравнению с пептидом дикого типа His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO:801), чтобы повысить растворимость пептида в водных растворах, особенно в диапазоне pH примерно от 5,5 до примерно 8,0, сохраняя биологическую активность нативного пептида.

Например, растворимость любого из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно повышена путем связывания гидрофильного остатка с пептидом. Введение таких групп также увеличивает продолжительность действия, например, как показано при измерении увеличенного времени полужизни в кровообращении. Гидрофильные остатки дополнительно описаны в настоящем описании.

Модификация заряженных остатков

В некоторых вариантах осуществления растворимость повышают добавлением заряда к родственному глюкагону пептиду класса 1 при замене нативных незаряженных аминокислот заряженными аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из лизина, аргинина, гистидина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, или добавлением заряженных аминокислот к амино или карбоксильному концу пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 имеет повышенную растворимость вследствие того факта, что пептид модифицирован заменами и/или добавлениями аминокислот, которые вводят заряженную аминокислоту в C-концевую часть пептида, и в некоторых вариантах осуществления в положение, находящееся на C-конце от положения 27 последовательности SEQ ID NO:801. Необязательно одна, две или три заряженных аминокислоты могут быть введены в C-концевую часть и в некоторых вариантах осуществления со стороны C-конца от положения 27. Согласно некоторым вариантам осуществления нативная аминокислота(ты) в положениях 28 и/или 29 заменена заряженной аминокислотой, и/или от одной до трех заряженных аминокислот добавляют к C-концу пептида, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты заряжены отрицательно. В других вариантах осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты заряжены положительно.

В конкретных примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать любую одну или две из следующих модификаций: замену N28 на E; замену N28 на D; замену T29 на D; замену T29 на E; инсерцию E после положения 27, 28 или 29; инсерцию D после положения 27, 28 или 29. Например, D28E29, E28E29, E29E30, E28E30, D28E30.

Согласно одному иллюстративному варианту осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:811 или ее аналог, который содержит 1-3 дополнительные модификации аминокислот (описанные в настоящем описании при описании агонистов глюкагона) по сравнению с нативным глюкагоном или его аналогом, являющимся агонистом глюкагона. Последовательность SEQ ID NO:811 представляет собой модифицированный родственный глюкагону пептид класса 1, где остаток аспарагина в положении 28 нативного белка заменен аспарагиновой кислотой. В другом примере варианта осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:838, в которой остаток аспарагина в положении 28 нативного белка заменен глутаминовой кислотой. Другие иллюстративные варианты включают родственные глюкагону пептиды класса 1 с последовательностями SEQ ID NO:824, 825, 826, 833, 835, 836 и 837.

Замена встречающейся в природе аминокислоты в положении 28 и/или 29 заряженными аминокислотами и/или добавление от одной до двух заряженных аминокислот на карбоксильном конце родственного глюкагона пептида класса 1 повышает растворимость и стабильность глюкагоновых пептидов в водных растворах при физиологически соответствующих значениях pH (т.е. pH составляет примерно от 6,5 до примерно 7,5) по меньшей мере в 5 раз и вплоть до 30 раз. Соответственно, глюкагоновые пептиды класса 1 в некоторых вариантах осуществления сохраняют глюкагоновую активность и имеют по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную, 10-кратную, 15-кратную, 25-кратную, 30-кратную или более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при данном значении pH примерно от 5,5 до 8, например, pH 7, при измерении через 24 часов при 25°C.

В родственном глюкагону пептиде могут быть осуществлены дополнительные модификации, например, консервативные замены, которые дополнительно описаны в настоящем описании, и которые позволяют сохранить глюкагоновую активность.

Повышенная стабильность

Любой из глюкагоновых пептидов класса 1 может дополнительно иметь повышенную стабильность и/или пониженное разложение, например, по меньшей мере 95% от исходного пептида сохраняется через 24 часа при 25°C. Любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может дополнительно иметь повышенную стабильность при pH в диапазоне от 5,5 до 8, например, сохраняется по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от исходного пептида через 24 часа при 25°C. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 1 согласно изобретению имеют повышенную стабильность, так что по меньшей мере 75% (например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, более чем 95%, до 100%) концентрации пептида или менее чем примерно 25% (например, меньше 20%, меньше 15%, меньше 10%, меньше 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, до 0%) разрушенного пептида регистрируют при 280 нм, используя ультрафиолетовый (УФ) детектор (UV), примерно через 1 или несколько недель (например, примерно 2 недели, примерно 4 недели, примерно 1 месяц, примерно два месяца, примерно четыре месяца, примерно шесть месяцев, примерно восемь месяцев, примерно десять месяцев, примерно двенадцать месяцев) в растворе при температуре по меньшей мере 20°C (например, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, по меньшей мере 27,5°C, по меньшей мере 30°C, по меньшей мере 35°C, по меньшей мере 40°C, по меньшей мере 50°C) и меньше чем 100°C, меньше чем 85°C, меньше чем 75°C или меньше чем 70°C. Родственные глюкагону пептиды класса 1 могут содержать дополнительные модификации, которые изменяют его фармацевтические свойства, например, придают повышенную эффективность, пролонгированное время полужизни в кровообращении, увеличенный срок хранения, сниженное осаждение и агрегацию и/или сниженное разложение, например, уменьшенную частоту расщепления или химическую модификацию после хранения.

В следующих примерах вариантов осуществления любой из вышеуказанных родственных глюкагону пептидов класса 1 может быть дополнительно модифицирован, чтобы повысить стабильность, путем модификации аминокислоты в положении 15 последовательности SEQ ID NO:801, чтобы уменьшить разложение пептида с течением времени, особенно в кислых или щелочных буферах. В примерах вариантов осуществления Asp в положении 15 заменяют Glu, гомо-Glu, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой.

Альтернативно, любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности путем модификации аминокислоты в положении 16 последовательности SEQ ID NO:801. В примерах вариантов осуществления Ser в положении 16 заменяют Thr или AIB, или любыми заменами аминокислот, описанными в настоящем описании для родственных глюкагону пептидов класса 1, которые повышают эффективность в отношении рецептора глюкагона. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16.

В некоторых вариантах осуществления любой из родственных глюкагону пептидов класса 1, описанных в настоящем описании, может быть дополнительно модифицирован, чтобы уменьшить разложение в различных положениях аминокислот, путем модификации по любому одному, двум, трем или всем четырем положениям 20, 21, 24 или 27. Примеры варианты осуществления включают замену Gln в положении 20 аминокислотами Ser, Thr, Ala или AIB, замену Asp в положении 21 Glu, замену Gln в положении 24 Ala или AIB, замену Met в положении 27 Leu или Nle. Удаление или замена остатков метионина уменьшает разложение вследствие окисления метионина. Удаление или замена Gln или Asn уменьшает разложение вследствие дезаминирования Gln или Asn. Удаление или замена Asp уменьшает разложение, которое происходит вследствие дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида с последующей изомеризацией до изоаспартата.

Повышенная эффективность

Согласно другому варианту осуществления предлагаются родственные глюкагону пептиды класса 1, которые имеют повышенную эффективность в отношении рецептора глюкагона, где пептиды содержат модификацию аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:801). В качестве неограничивающего примера такая повышенная эффективность может быть получена благодаря замене встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и имеющей боковую цепь длиной примерно 4 (или 3-5) атома. Замена серина в положении 16 глутаминовой кислотой повышает глюкагоновую активность по меньшей мере в 2 раза, 4 раза, 5 раз и до 10 раз в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 сохраняет селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецепторами GLP-1, например, по меньшей мере 5-кратную, 10-кратную или 15-кратную селективность.

Устойчивость к DPP-IV

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, дополнительно модифицированы в положении 1 или 2, чтобы снизить чувствительность к расщеплению дипептидилпептидазой IV. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 1 и/или положении 2 родственного глюкагону пептида заменяют устойчивой к DPP-IV аминокислотой(ами), описанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминоизомасляной кислотой. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, D-аланина, глицина, N-метилсерина и ε-аминомасляной кислоты. В другом варианте осуществления аминокислоту в положении 2 родственного глюкагону пептида класса 1 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, глицина и аминоизомасляной кислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 2 не является D-серином.

Снижение глюкагоновой активности после модификации аминокислот в положении 1 и/или положении 2 глюкагонового пептида может быть восстановлено стабилизацией альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагонового пептида (вблизи аминокислот 12-29). Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, путем образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика (например, лактамового мостика между боковыми цепями аминокислот в положениях «i» и «i+4», где i означает целое число от 12 до 25), в результате замены и/или инсерции аминокислот вблизи положений 12-29 с использованием стабилизирующей альфа-спираль аминокислоты (например, α,α-дизамещенной аминокислоты), которая дополнительно описана в настоящем описании.

Модификации в положении 3

Активность рецептора глюкагона может быть снижена путем модификации аминокислоты в положении 3 (согласно нумерации аминокислот глюкагона дикого типа), например, заменой встречающегося в природе глутамина в положении 3 кислой, основной или гидрофобной аминокислотой. Например, замена в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином в значительной степени снижает или устраняет активность рецептора глюкагона.

Поддержание или усиление активности в отношении рецептора глюкагона может быть достигнуто с использованием модификации Gln в положении 3 с получением аналога глутамина, как описано в настоящем описании. Например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:863, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:870, SEQ ID NO:871, SEQ ID NO:872, SEQ ID NO:873 и SEQ ID NO:874.

Усиление активности GLP-1 C-концевыми амидами и сложными эфирами

Повышенную активность рецептора GLP-1 обеспечивают заменой карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты нейтральной группой, такой как амид или сложный эфир. Наоборот, сохранение нативной карбоновой кислоты на C-конце пептида сохраняет относительно более высокую селективность родственного глюкагону пептида класса 1 в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1 (например, большую примерно в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 раз).

Дополнительные модификации и комбинации

Могут быть осуществлены дополнительные модификации родственного глюкагону пептида класса 1, которые могут дополнительно повышать растворимость и/или стабильность, и/или глюкагоновую активность. Родственный глюкагону пептид класса 1 может, альтернативно, содержать другие модификации, которые по существу не влияют на растворимость или стабильность, и которые по существу не снижают глюкагоновую активность. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 может содержать, в общем, до 11 или до 12, или до 13, или до 14 модификаций аминокислот по сравнению с нативной последовательностью глюкагона. Например, консервативные или неконсервативные замены, добавления или делеции могут быть осуществлены в любом из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29.

Примеры модификаций родственного глюкагону пептида класса 1 включают, но без ограничения:

(a) неконсервативные замены, консервативные замены, добавления или делеции при сохранении по меньшей мере частичной активности агониста глюкагона, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, замены Tyr в положении 10 на Val или Phe, замены Lys в положении 12 на Arg, замены в одном или нескольких положениях на Ala;

(b) делецию аминокислот в положениях 29 и/или 28 и необязательно в положении 27 при сохранении по меньшей мере частичной активности агониста глюкагона;

(c) модификацию аспарагиновой кислоты в положении 15, например, путем замены глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой кислота, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой, которая может уменьшать разложение; или модификацию серина в положении 16, например, заменой треонином, AIB, глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной 4 атома, или альтернативно, одной из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, которая вероятно может уменьшать разложение вследствие расщепления связи Asp15-Ser16;

(d) добавление гидрофильного остатка, такого как водорастворимый полимер полиэтиленгликоля, как описано в настоящем описании, например, в положении 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или в C-концевой аминокислоте, которое может повышать растворимость и/или время полужизни;

(e) модификацию метионина в положении 27, например, заменой лейцином или норлейцином, чтобы уменьшить окислительное разложение;

(f) модификацию Gln в положении 20 или 24, например, заменой Ser, Thr, Ala или AIB, чтобы уменьшить разложение, которое происходит в результате дезаминирования Gln;

(g) модификацию Asp в положении 21, например, заменой аминокислотой Glu, чтобы уменьшить разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(h) модификации в положении 1 или 2, как описано в настоящем описании, которые повышают устойчивость к расщеплению DPP-IV, необязательно в сочетании с внутримолекулярным мостиком, таким как лактамовый мостик между положениями «i» и «i+4», где i означает целое число от 12 до 25, например, 12, 16, 20, 24;

(i) ацилирование или алкилирование глюкагонового пептида, как описано в настоящем описании, которое может повышать активность в отношении рецептора глюкагона и/или рецептора GLP-1, увеличивать время полужизни в кровообращении и/или увеличивать продолжительность действия и/или задерживать начало действия, необязательно в комбинации с добавлением гидрофильного остатка, дополнительно или альтернативно, необязательно в комбинации с модификацией, которая селективно снижает активность по отношению к пептиду GLP-1, например, модификацией Thr в положении 7, такой как замена Thr в положении 7 аминокислотой, у которой отсутствует гидроксильная группа, например, Abu или He; делецию аминокислоты, C-концевой относительно аминокислоты в положении 27 (например, делеция одной или обеих аминокислот в положениях 28 и 29, дающая пептид длиной 27 или 28 аминокислот);

(j) C-концевые удлинения, как описано в настоящем описании;

(k) гомодимеризацию или гетеродимеризацию, как описано в настоящем описании; и

комбинации (a)-(k).

В некоторых вариантах осуществления примеры модификаций родственного глюкагону пептида класса 1 включают по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, выбранную из группы A, и одну или несколько модификаций аминокислот, выбранных из группы B и/или группы C,

где группа A означает:

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой;

замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu;

замену в положении 28 аминокислотой Asp;

замену в положении 28 аминокислотой Glu;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой;

замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты;

замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys;

замену в положении 29 аминокислотой Glu;

инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29;

инсерцию после положения 29 Glu или Lys;

инсерцию после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys;

или их комбинацию;

где группа B означает:

замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu;

замену Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB;

и где группа C означает:

замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая снижает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая снижает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg;

замену Gln в положении 20 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu;

замену Gln в положении 24 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB;

замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle;

делецию аминокислот в положениях 27-29;

делецию аминокислот в положениях 28-29;

делецию аминокислот в положениях 29;

или их комбинацию.

В примерах вариантов осуществления Lys в положении 12 заменяют аминокислотой Arg. В других примерах вариантов осуществления аминокислоты в положениях 29 и/или 28 и необязательно в положении 27 делетированы.

В некоторых конкретных вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит (a) модификацию аминокислоты в положении 1 и/или 2, которая придает устойчивость к DPP-IV, например, замену аминокислотой DMIA в положении 1 или AIB в положении 2, (b) внутримолекулярный мостик в области положений 12-29, например, в положениях 16 и 20, или одну или несколько замен аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 α,α-дизамещенной аминокислотой, необязательно (c) связан с гидрофильным остатком, таким как ПЭГ, например, через Cys в положении 24, 29 или C-концевую аминокислоту, необязательно (d) содержит модификацию аминокислоты в положении 27, которая представляет собой замену Met, например, аминокислотой Nle, необязательно (e) модификации аминокислот в положениях 20, 21 и 24, которые уменьшают разложение, и необязательно (f) связь с последовательностью SEQ ID NO:820. Когда глюкагоновый пептид связан с последовательностью SEQ ID NO:820, аминокислота в положении 29 в некоторых вариантах осуществления представляет собой Thr или Gly. В других конкретных вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит (a) Asp28Glu29 или Glu28Glu29, или Glu29Glu30, или Glu28Glu30, или Asp28Glu30, и необязательно (b) модификацию аминокислоты в положении 16, которая представляет собой замену Ser, например, аминокислотой Thr или AIB, и необязательно (c) модификацию аминокислоты в положении 27, которая представляет собой замену Met, например, аминокислотой Nle, и необязательно (d) модификации аминокислот в положениях 20, 21 и 24, которые уменьшают разложение. В конкретном варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит T16, A20, E21, A24, Nle27, D28, E29.

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность:

Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839) с 1-3 модификациями аминокислот,

где X1 и/или X2 означает ненативную аминокислоту, которая уменьшает чувствительность (или повышает устойчивость) глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (встречающегося в природе C-концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y означает 1-2 аминокислоты, и

где внутримолекулярный мостик, предпочтительно ковалентная связь, соединяет боковые цепи аминокислоты в положении i и аминокислоты в положении i+4, где i равно 12, 16, 20 или 24.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярный мостик представляет собой лактамовый мостик. В некоторых вариантах осуществления аминокислотами в положениях i и i+4 последовательности SEQ ID NO:839 являются Lys и Glu, например, Glu16 и Lys20. В некоторых вариантах осуществления X1 выбран из группы, состоящей из: D-His, N-метил-His, альфа-метил-His, имидазолуксусной кислоты, дезамино-His, гидроксил-His, ацетил-His, гомо-His и альфа,альфа-диметилимидазолуксусной кислоты (DMIA). В других вариантах осуществления X2 выбран из группы, состоящей из: D-Ser, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, Val и альфа-аминоизомасляной кислоты (AIB). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом из положений аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой. В примерах вариантов осуществления такой гидрофильный остаток ковалентно связан с остатком Lys, Cys, Orn, гомоцистеина или ацилфенилаланина в любом из указанных положений. Примеры гидрофильных остатков включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), например, с молекулярной массой примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, или примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

В других вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 1 содержит аминокислотную последовательность:

X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z (SEQ ID NO:839),

где X1 и/или X2 означают ненативную аминокислоту, которая уменьшает чувствительность (или повышает устойчивость) глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV),

где в одно, два, три, четыре или больше положений 16, 20, 21 и 24 глюкагонового пептида заменены α,α-дизамещенной аминокислотой, и

где Z выбран из группы, состоящей из -COOH (встречающегося в природе C-концевого карбоксилата), -Asn-COOH, Asn-Thr-COOH и Y-COOH, где Y означает 1-2 аминокислоты.

Примеры дополнительных модификаций аминокислот в указанных выше родственных глюкагону пептидах класса 1 или их аналогах включают замену Thr в положении 7 аминокислотой, у которой отсутствует гидроксильная группа, например, аминомасляной кислотой (Abu), Ile, необязательно в комбинации с заменой или добавлением аминокислоты, содержащей боковую цепь, ковалентно связанную (необязательно через спейсер) с ацильной или алкильной группой, где такая ацильная или алкильная группа не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, замену Lys в положении 12 на Arg; замену Asp в положении 15 на Glu; замену Ser в положении 16 на Thr или AIB; замену Gln в положении 20 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замену Gln в положении 24 аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB; замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu; замену в положении 28 аминокислотой Asp; замену в положении 28 аминокислотой Glu; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys; замену в положении 29 аминокислотой Glu; инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29; инсерцию в положении 30 (т.е. после положения 29) Glu или Lys; необязательно с инсерцией в положении 31 Lys; добавление последовательности SEQ ID NO:820 к C-концу, необязательно, где аминокислотой в положении 29 является Thr или Gly; замену или добавление аминокислоты, ковалентно связанной с гидрофильным остатком; или их комбинацию.

Любые из модификаций, описанных выше в отношении агонистов глюкагона класса 1, которые повышают активность рецептора глюкагона, сохраняют частичную активность рецептора глюкагона, повышают растворимость, повышают стабильность или уменьшают разложение, могут быть использованы в отношении глюкагоновых пептидов класса 1 по отдельности или в комбинации. Таким образом, могут быть получены такие родственные глюкагону пептиды класса 1, которые сохраняют по меньшей мере 20% активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, и которые растворимы в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9, (например, pH 7), и необязательно позволяют сохранять по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается или расщепляется) через 24 часа при 25°C. Альтернативно, могут быть получены высокоэффективные глюкагоновые пептиды класса 1, которые проявляют по меньшей мере примерно 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% или 10-кратную или более высокую активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, и необязательно растворимы в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при pH от 6 до 8 или от 6 до 9 (например, pH 7), и необязательно обеспечивают сохранение по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается или расщепляется) через 24 часа при 25°C. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды класса 1, описанные в настоящем описании, могут обладать активностью по меньшей мере любого из указанных выше относительных уровней в отношении рецептора глюкагона, но не более 10000%, 100000% или 1000000% от активности нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона.

Примеры вариантов осуществления родственных глюкагону пептидов класса 1

Согласно некоторым вариантам осуществления нативный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:801 модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 28 и/или 29 отрицательно заряженной аминокислотой (например, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой) и необязательно добавлением отрицательно заряженной аминокислоты (например, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты) к карбоксильному концу пептида. В альтернативном варианте осуществления нативный глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:801 модифицируют заменой нативной аминокислоты в положении 29 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином, аргинином или гистидином) и необязательно добавлением одной или двух положительно заряженных аминокислот (например, лизина, аргинина или гистидина) на карбоксильном конце пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается аналог глюкагона, имеющий повышенную растворимость и стабильность, где аналог содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:834, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота в положении 28 или 29 заменена кислой аминокислотой, и/или дополнительная кислая аминокислота добавлена к карбоксильному концу последовательности SEQ ID NO:834. В некоторых вариантах осуществления кислые аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, имеющий повышенную растворимость и стабильность, где агонист содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:833, в которой по меньшей мере одна из аминокислот в положениях 27, 28 или 29 заменена остатком ненативной аминокислоты (т.е. по меньшей мере одна аминокислота, присутствующая в положении 27, 28 или 29 аналога, является кислой аминокислотой, отличной от аминокислоты, присутствующей в соответствующем положении в SEQ ID NO:801). Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий последовательность SEQ ID NO:833, при условии, что когда аминокислота в положении 28 является аспарагином и аминокислота в положении 29 является треонином, пептид дополнительно содержит одну-две аминокислоты, независимо выбранные из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, добавленные к карбоксильному концу глюкагонового пептида.

Сообщалось, что некоторые положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы с сохранением по меньшей мере некоторой активности исходного пептида. Соответственно, авторы изобретения ожидают, что одна или больше аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 пептида с последовательностью SEQ ID NO:811, могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от аминокислоты, присутствующей в нативном глюкагоновом пептиде, и при этом все еще сохраняется повышенная эффективность, стабильность при физиологическом значении pH и биологическая активность исходного глюкагоного пептида. Например, согласно некоторым вариантам осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида, связывают с лейцином или норлейцином, чтобы предотвратить окислительное разложение пептида.

В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:833, где 1-6 аминокислот, выбранных из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801. Согласно другому варианту осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:833, где 1-3 аминокислоты, выбранные из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801. В другом варианте осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:807, SEQ ID NO:808 или SEQ ID NO:834, где 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 1, 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 24 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты в SEQ ID NO:801, и в дополнительном варианте осуществления такие одна-две отличающихся аминокислоты представляют собой консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотой, присутствующей в нативной последовательности (SEQ ID NO:801). В некоторых вариантах осуществления предлагается глюкагоновый пептид с последовательностью SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где глюкагоновый пептид дополнительно содержит одну, две или три аминокислотных замены в положениях, выбранных из положений 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27 или 29. В некоторых вариантах осуществления замены в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 27 или 29 являются консервативными аминокислотными заменами.

В некоторых вариантах осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептидный аналог последовательности SEQ ID NO:801, где аналог отличается от последовательности SEQ ID NO:801 наличием другой аминокислоты, отличной от серина в положении 2 и наличием кислой аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислой аминокислоты, добавляемой к карбоксильному концу пептида с последовательностью SEQ ID NO:801. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 2. Более конкретно, аминокислоту в положении 2 пептидного аналога заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из D-серина, аланина, D-аланина, глицина, н-метилсерина и аминоизомасляной кислоты.

В другом варианте осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептидный аналог последовательности SEQ ID NO:801, где аналог отличается от последовательности SEQ ID NO:801 наличием другой аминокислоты, отличной от гистидина, в положении 1 и наличием кислой аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту в положении 28 или 29, или кислой аминокислоты, добавляемой к карбоксильному концу пептида с последовательностью SEQ ID NO:801. В некоторых вариантах осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления предлагается аналог глюкагона с последовательностью SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 1. Более конкретно, аминокислота в положении 1 пептидного аналога заменена аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из DMIA, D-гистидина, дезаминогистидина, гидроксилгистидина, ацетилгистидина и гомогистидина.

Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 и SEQ ID NO:832. В следующем варианте осуществления предлагается глюкагоновый пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, дополнительно содержащую от одной до двух аминокислот, добавленных к C-концу последовательности SEQ ID NO:809, SEQ ID NO:812, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832, где дополнительные аминокислоты независимо выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты или гомоцистеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления дополнительные аминокислоты, добавляемые к карбоксильному концу, выбраны из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp или Glu, или в следующем варианте осуществления дополнительными аминокислотами являются Asp или Glu.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:7 или аналог такой последовательности, являющийся агонистом глюкагона. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811, SEQ ID NO:812 и SEQ ID NO:813. В другом варианте осуществления пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810 и SEQ ID NO:811. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:808, SEQ ID NO:810 и SEQ ID NO:811, кроме того содержащую дополнительную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Asp и Glu, добавленную к C-концу глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, и в следующем варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность SEQ ID NO:811.

Согласно некоторым вариантам осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, состоящей из:

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:834),

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO:811) и

NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Xaa-Tyr-Leu-Glu-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asp-Thr-R (SEQ ID NO:813),

где Xaa в положении 15 означает Asp, Glu, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Xaa в положении 28 означает Asn или кислую аминокислоту, и Xaa в положении 29 означает Thr или кислую аминокислоту, и R означает кислую аминокислоту, COOH или CONH2, при условии, что остаток кислой аминокислоты присутствует в одном из положений 28, 29 или 30. В некоторых вариантах осуществления R означает COOH, и в другом варианте осуществления R означает CONH2.

Настоящее изобретение также охватывает слитые глюкагоновые пептиды, где второй пептид слит с C-концом глюкагонового пептида для повышения стабильности и растворимости глюкагонового пептида. Более конкретно, слитый глюкагоновый пептид может содержать агонистический аналог глюкагона, содержащий глюкагоновый пептид NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-R (SEQ ID NO:834), где R означает кислую аминокислоту или связь, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:833, SEQ ID NO:807 или SEQ ID NO:808, и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой на карбоксильном конце глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит SEQ ID NO:802, SEQ ID NO:803, SEQ ID NO:804, SEQ ID NO:805 и SEQ ID NO:806 или их аналог агониста глюкагона и дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый пептид дополнительно содержит цепь ПЭГ, связанную с аминокислотой в положении 16, 17, 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой, где цепь ПЭГ выбрана из диапазона от 500 до 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR) связана с аминокислотой 29 глюкагонового пептида пептидной связью. В некоторых вариантах осуществления часть, представленная глюкагоновым пептидом, слитого глюкагонового пептида содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 и SEQ ID NO:813. В некоторых вариантах осуществления часть, представленная глюкагоновым пептидом, слитого глюкагонового пептида содержит последовательность SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где цепь ПЭГ связана в положении 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или с C-концевой аминокислотой, соответственно.

В другом варианте осуществления последовательность глюкагонового пептида в слитом пептиде содержит последовательность SEQ ID NO:811, дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:820 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO:821 (KRNRNNIA) или SEQ ID NO:822 (KRNR), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида. В некоторых вариантах осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:824, SEQ ID NO:825 и SEQ ID NO:826. Как правило, слитые пептиды настоящего изобретения будут иметь C-концевую аминокислоту со стандартной группой карбоновой кислоты. Однако аналоги таких последовательностей, в которых C-концевая аминокислота имеет амид, заменяющий карбоновую кислоту, также рассматриваются в качестве вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый глюкагоновый пептид содержит агонистический аналог глюкагона, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 и SEQ ID NO:813, дополнительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:823 (GPSSGAPPPS-CONH2), связанную с аминокислотой 29 глюкагонового пептида.

Агонисты глюкагона настоящего изобретения могут быть дополнительно модифицированы, чтобы повысить растворимость и стабильность пептида в водных растворах, сохраняя при этом биологическую активность глюкагонового пептида. Согласно некоторым вариантам осуществления предполагается, что введение гидрофильных групп в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 пептида SEQ ID NO:811 или его аналога, являющегося агонистом глюкагона, повышает растворимость и стабильность устойчивого к pH аналога глюкагона. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811, SEQ ID NO:813 или SEQ ID NO:832 модифицируют, чтобы он содержал одну или несколько гидрофильных групп, ковалентно связанных с боковыми цепями аминокислот, присутствующих в положениях 21 и 24 глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:811 модифицируют, чтобы он содержал одну или несколько аминокислотных замен в положениях 16, 17, 20, 21, 24 и/или 29, где нативная аминокислота заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для поперечного сшивания с гидрофильными остатками, включая, например, ПЭГ. В нативном пептиде может быть замена встречающейся в природе аминокислотой или синтетической (не встречающейся в природе) аминокислотой. Синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты относятся к аминокислотам, которые не встречаются в природе in vivo, но которые, тем не менее, могут быть введены в пептидные структуры, описанные в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления предлагается агонист глюкагона с SEQ ID NO:810, SEQ ID NO:811 или SEQ ID NO:813, где последовательность нативного глюкагонового пептида модифицируют, чтобы она содержала встречающуюся в природе или синтетическую аминокислоту по меньшей мере в одном из положений 16, 17, 21, 24, 29, в пределах C-концевого удлинения или в положении C-концевой аминокислоты нативной последовательности, где заменяющая аминокислота дополнительно содержит гидрофильный остаток. В некоторых вариантах осуществления замена осуществлена в положении 21 или 24, и в дополнительном варианте осуществления гидрофильный остаток представляет собой цепь ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид SEQ ID NO:811 имеет замену по меньшей мере одним остатком цистеина, где боковая цепь остатка цистеина дополнительно модифицирована взаимодействующим с тиолом реагентом, включая, например, малеимидогруппу, винилсульфон, 2-пиридилтиогруппу, галогеналкил и галогенацил. Такие взаимодействующие с тиолом реагенты могут содержать карбоксильную, кето, гидроксильную и эфирную группы, а также другие гидрофильные остатки, такие как единицы полиэтиленгликоля. В альтернативном варианте осуществления нативный глюкагоновый пептид имеет замену лизином, и боковую цепь заменяющего остатка лизина дополнительно модифицируют, используя взаимодействующие в амином реагенты, такие как реакционноспособные сложные эфиры (сукцинимидо, ангидрид и т.д.) карбоновых кислот или альдегиды гидрофильных остатков, таких как полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:814, SEQ ID NO:815, SEQ ID NO:816, SEQ ID NO:817, SEQ ID NO:818 и SEQ ID NO:819.

Согласно некоторым вариантам осуществления пегилированный глюкагоновый пептид содержит две или несколько цепей полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с глюкагоновым пептидом, где общая молекулярная масса цепей глюкагона составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO:806, где цепь ПЭГ ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 1000 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид SEQ ID NO:806, где цепь ПЭГ ковалентно связана с остатком аминокислоты в положении 21 и в положении 24, и где общая молекулярная масса двух цепей ПЭГ составляет примерно от 5000 до примерно 20000 дальтон.

Цепь полиэтиленгликоля может быть в форме неразветвленной цепи или может быть разветвленной. Согласно некоторым вариантам осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет среднюю молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 40000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу, выбранную из диапазона примерно от 500 до примерно 5000 дальтон. В другом варианте осуществления цепь полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу примерно от 20000 до примерно 40000 дальтон.

Любой из глюкагоновых пептидов, описанных выше, может быть дополнительно модифицирован, чтобы он содержал ковалентный или нековалентный внутримолекулярный мостик или стабилизирующую альфа-спираль аминокислоту в C-концевой части глюкагонового пептида (положения аминокислот 12-29). Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит любую одну или несколько модификаций, обсужденных выше, в дополнение к заменам аминокислот в положениях 16, 20, 21 или 24 (или их комбинации) α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB. Согласно другому варианту осуществления глюкагоновый пептид содержит любую одну или несколько модификаций, обсужденных выше, в дополнение к внутримолекулярному мостику, например, лактаму, между боковыми цепями аминокислот в положениях 16 и 20 глюкагонового пептида.

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:877, где Xaa в положении 3 означает аминокислоту, содержащую боковую цепь структуры I, II или III:

структура I

структура II

структура III

где R1 означает C0-3алкил или C0-3гетероалкил; R2 означает NHR4 или C1-3алкил; R3 означает C1-3алкил; R4 означает H или C1-3алкил; X означает NH, O или S; и Y означает NHR4, SR3 или OR3. В некоторых вариантах осуществления X означает NH или Y означает NHR4. В некоторых вариантах осуществления R1 означает C0-2алкил или C1-гетероалкил. В некоторых вариантах осуществления R2 означает NHR4 или C1алкил. В некоторых вариантах осуществления R4 означает H или C1алкил. В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры I, где R1 означает CH2-S, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетамидометилцистеин, C(Acm)); R1 означает CH2, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетилдиаминомасляная кислота, Dab(Ac)); R1 означает C0алкил, X означает NH, R2 означает NHR4, и R4 означает H (карбамоилдиаминопропановая кислота, Dap(мочевина)); или R1 означает CH2-CH2, X означает NH, и R2 означает CH3 (ацетилорнитин, Om(Ac)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры II, где R1 означает CH2, Y означает NHR4, и R4 означает CH3 (метилглутамин, Q(Me)). В примерах вариантов осуществления предлагается аминокислота, содержащая боковую цепь структуры III, где R1 означает CH2, и R4 означает H (метионинсульфоксид, M(O)). В конкретных вариантах осуществления аминокислота в положении 3 заменена Dab(Ac). Например, агонисты глюкагона могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:863, SEQ ID NO:869, SEQ ID NO:871, SEQ ID NO:872, SEQ ID NO:873 и SEQ ID NO:874.

В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид представляет собой аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877. В конкретных аспектах аналог содержит любую из модификаций аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, но без ограничения: замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой; замену Asn в положении 28 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 28 аминокислотой Asn, Asp или Glu; замену в положении 28 аминокислотой Asp; замену в положении 28 аминокислотой Glu; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой; замену Thr в положении 29 заряженной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Lys, Arg, His, Asp, Glu, цистеиновой кислоты и гомоцистеиновой кислоты; замену в положении 29 аминокислотой Asp, Glu или Lys; замену в положении 29 аминокислотой Glu; инсерцию 1-3 заряженных аминокислот после положения 29; инсерцию после положения 29 Glu или Lys; инсерцию после положения 29 Gly-Lys или Lys-Lys; и их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877 содержит α,α-дизамещенную аминокислоту, такую как AIB, в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 и 24.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида SEQ ID NO:877 содержит одну или несколько из следующих модификаций: замену His в положении 1 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), замену Ser в положении 2 ненативной аминокислотой, которая уменьшает чувствительность глюкагонового пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP-IV), замену Thr в положении 7 аминокислотой, в которой отсутствует гидроксильная группа, например, Abu или Ile; замену Tyr в положении 10 аминокислотой Phe или Val; замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замену Asp в положении 15 аминокислотой Glu, замену Ser в положении 16 аминокислотой Thr или AIB; замену Gln в положении 20 аминокислотой Ala или AIB; замену Asp в положении 21 аминокислотой Glu; замену Gln в положении 24 аминокислотой Ala или AIB; замену Met в положении 27 аминокислотой Leu или Nle; делецию аминокислот в положениях 27-29; делецию аминокислот в положениях 28-29; делецию аминокислоты в положении 29; добавление аминокислотной последовательности SEQ ID NO:820 к C-концу, где аминокислота в положении 29 представляет собой Thr или Gly, или их комбинацию.

Согласно конкретным вариантам осуществления глюкагоновый пептид содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:862-867 и 869-874.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида, содержащий SEQ ID NO:877, содержит гидрофильный остаток, например, ПЭГ, ковалентно связанный с аминокислотой в любом из положений 16, 17, 20, 21, 24 и 29 или с C-концевой аминокислотой.

В некоторых вариантах осуществления аналог глюкагонового пептида, включающий SEQ ID NO:877, содержит аминокислоту, имеющую боковую цепь, ковалентно связанную, необязательно через спейсер, с ацильной группой или алкильной группой, где такая ацильная группа или алкильная группа является ненативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацильная группа в некоторых вариантах осуществления представляет собой жирную C4-C30-ацильную группу. В других вариантах осуществления алкильная группа представляет собой C4-C30алкил. В конкретных аспектах ацильная группа или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты в положении 10. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 7 представляет собой Ile или Abu.

Агонист глюкагона может представлять собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:801-919, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность агониста глюкагона. В некоторых вариантах осуществления агонист глюкагона содержит аминокислоты любой из SEQ ID NO:859-919.

Родственные глюкагону пептиды класса 2

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид является родственным глюкагону пептидом класса 2, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT US2009/47447 (поданной 16 июня 2009), предварительной патентной заявке США № 61/090448 и патентной заявке США № 61/151349, содержимое которых включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Биологические последовательности, указанные в следующем разделе (SEQ ID NO:1001-1262), относящиеся к родственным глюкагону пептидам класса 2, соответствуют SEQ ID NO:1-262 в международной патентной заявке № PCT US2009/47447.

Активность

Нативный глюкагон не активирует рецептор GIP и обычно проявляет примерно 1% активности нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. Модификации в последовательности нативного глюкагона, описанной в настоящем описании, дают родственные глюкагону пептиды класса 2, которые могут проявлять высокую глюкагоновую активность, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного глюкагона (SEQ ID NO:1001), высокую активность GIP, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного GIP (SEQ ID NO:1004), и/или высокую активность GLP-1, эквивалентную или более высокую, чем активность нативного GLP-1. В этом отношении родственный глюкагону пептид класса 2 может представлять собой либо глюкагоновый пептид, являющийся коагонистом глюкагона/GIP, тройным агонистом глюкагона/GIP/GLP-1, коагонистом GIP/GLP-1 или агонистом GIP, которые дополнительно описаны в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2, описанные в настоящем описании, имеют EC50 для активирующей активности рецептора GIP, составляющую примерно 100 нМ или меньше, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют EC50 для активации рецептора глюкагона, составляющую примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 имеют EC50 для активации рецептора GLP-1, составляющую примерно 100 нМ или менее, или примерно 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее. Активацию рецептора можно измерить в анализах in vitro, измеряя индукцию цАМФ в клетках HEK293, сверхэкспрессирующих рецептор, например, анализируя клетки HEK293, котрансфицированные ДНК, кодирующей рецептор и ген люциферазы, связанный с отвечающим на цАМФ элементом, как описано в примере 5.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более высокую активность в отношении рецептора GIP по сравнению с нативным GIP (активность GIP). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора GIP по сравнению с нативным GIP. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% или 500% или более высокую активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном (глюкагоновая активность). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном. В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175% или 200% или более высокую активность в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1 (активность GLP-1). В некоторых вариантах осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, проявляют не более чем 1000%, 10000%, 100000% или 1000000% активность в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1. Активность родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора по сравнению с нативным лигандом рецептора вычисляют в виде обратного отношения EC50 для родственного глюкагону пептида класса 2 к EC50 для нативного лиганда.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность как в отношении рецептора глюкагона, так и в отношении рецептора GIP («коагонисты глюкагона/GIP»). Такие родственные глюкагону пептиды класса 2 утрачивают селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GIP. В некоторых вариантах осуществления EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его EC50 в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его глюкагоновой активности. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GIP к EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 для рецептора GIP к EC50 для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к глюкагоновой активности родственного глюкагону пептида класса 2 составляет менее чем примерно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления GLP-1-активность значительно снижена или утрачена, например, путем модификации аминокислоты в положении 7, делеции аминокислоты (аминокислот), расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 27 или 28, дающей 27 или 28-аминокислотный пептид, или их комбинации.

В другом аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецепторов глюкагона, GIP и GLP-1 («тройные агонисты глюкагона/GIP/GLP-1»). Такие родственные глюкагону пептиды класса 2 утрачивают селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецептором GLP-1 и рецептором GIP. В некоторых вариантах осуществления EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его соответствующих EC50 в отношении рецепторов глюкагона и GLP-1. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его глюкагоновой активности и GLP-1-активности. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 тройного агониста для рецептора GIP к EC50 тройного агониста для рецептора GLP-1 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 для рецептора GIP к EC50 для рецептора GLP-1 составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности тройного агониста к GLP-1-активности тройного агониста составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора GLP-1 составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В родственных вариантах осуществления отношение EC50 тройного агониста для рецептора GIP к EC50 тройного агониста для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 для рецептора GIP к EC50 для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет менее чем примерно 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GIP к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 тройного агониста для рецептора GLP-1 к EC50 тройного агониста для рецептора глюкагона составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 для рецептора GLP-1 к EC50 для рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2). В некоторых вариантах осуществления отношение GLP-1-активности тройного агониста к глюкагоновой активности тройного агониста составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5. В некоторых вариантах осуществления отношение эффективности в отношении рецептора GLP-1 к эффективности в отношении рецептора глюкагона составляет примерно 1 или менее чем примерно 1 (например, примерно 0,01, 0,013, 0,0167, 0,02, 0,025, 0,03, 0,05, 0,067, 0,1, 0,2).

В следующем аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецепторов GLP-1 и GIP, но их глюкагоновая активность значительно снижена или утрачена («коагонисты GIP/GLP-1»), например, путем модификации аминокислоты в положении 3. Например, замена в данном положении кислой, основной или гидрофобной аминокислотой (глутаминовой кислотой, орнитином, норлейцином) снижает глюкагоновую активность. В некоторых вариантах осуществления EC50 глюкагонового пептида в отношении рецептора GIP менее чем примерно в 50 раз, 40 раз, 30 раз или 20 раз отличается (больше или меньше) от его EC50 в отношении рецептора GLP-1. В некоторых вариантах осуществления GIP-активность родственного глюкагону пептида класса 2 менее чем примерно в 25, 20, 15, 10 или 5 раз отличается (больше или меньше) от его GLP-1-активности. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют примерно 10% или меньшую активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или больше чем примерно 0,1%, но меньше чем примерно 10% активность. В некоторых вариантах осуществления отношение EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GIP к EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 для рецептора GLP-1 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, и не менее 1. В некоторых вариантах осуществления отношение GIP-активности родственного глюкагону пептида класса 2 к GLP-1-активности родственного глюкагону пептида класса 2 составляет менее чем примерно 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5, и не менее 1.

В следующем аспекте родственные глюкагону пептиды класса 2 проявляют активность в отношении рецептора GIP, в котором глюкагоновая активность и GLP-1-активность значительно снижена или утрачена («глюкагоновые пептиды, являющиеся агонистами GIP»), например, в результате модификаций аминокислот в положениях 3 с использованием Glu и 7 с использованием Ile. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 обладают примерно 10% или меньшей активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона, например примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или больше чем примерно 0,1%, 0,5% или 1%, но меньше чем примерно 1%, 5% или 10% активностью. В некоторых вариантах осуществления такие родственные глюкагону пептиды класса 2 также проявляют примерно 10% или меньшую активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, например, примерно 1-10% или примерно 0,1-10%, или большей чем примерно 0,1%, 0,5% или 1%, но меньшей чем примерно 1%, 5% или 10% активностью.

В некоторых вариантах осуществления, в которых родственный глюкагону пептид класса 2 не пегилирован, EC50 родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GIP составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или аналог обладает по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% активностью нативного GIP в отношении рецептора GIP. В родственных вариантах осуществления EC50 непегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GLP-1 составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 1%, 2%, 3%, 4% или 5% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. В следующих родственных вариантах осуществления EC50 непегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора глюкагона составляет примерно 4, 2, 1 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15% или 20% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления непегилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 1% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В других вариантах осуществления непегилированный родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 10%, 5% или 1% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

В вариантах осуществления, в которых родственные глюкагону пептиды класса 2 связаны с гидрофильными остатками, такими как ПЭГ, относительные значения EC50 по отношению к одному или нескольким рецепторам могут быть выше, например, примерно в 10 раз. Например, EC50 пегилированного аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее, или родственный глюкагону пептид класса 2 обладает по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% активностью нативного GIP в отношении рецептора GIP. В родственных вариантах осуществления EC50 пегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора GLP-1 составляет примерно 10 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% или 0,5% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1. В следующих родственных вариантах осуществления EC50 пегилированного родственного глюкагону пептида класса 2 для активации рецептора глюкагона составляет примерно 10 нМ или менее, или он обладает по меньшей мере примерно 0,5%, 1%, 1,5% или 2% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 1% активностью нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона. В других вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 2 обладает менее чем примерно 10%, 5% или 1% активностью нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Модификации

Модификации, описанные в настоящем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, позволяют проводить обработку глюкагона (SEQ ID NO:1001), чтобы создать глюкагоновые пептиды, которые проявляют повышенную GIP-активность, глюкагоновую активность и/или GLP-1-активность. Другие модификации, описанные в настоявшем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, продлевают время полужизни, повышают растворимость или повышают стабильность полученного в результате пептида. Другие модификации, описанные в настоящем описании со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, не влияют на активность или могут быть осуществлены без утраты требуемой активности или активностей. По отношению к родственному глюкагону пептиду класса 2 могут быть применены любые комбинации, которые служат указанной цели (например, повышению GIP-активности) отдельно или в комбинации. Любая из отдельных или из групп комбинаций по отношению к родственному глюкагону пептиду класса 2, которая придает улучшенные свойства, может быть применена отдельно или в комбинации, например, повышенную GIP и/или GLP-1 активность можно сочетать с повышенным временем полужизни. В родственных вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более модификаций аминокислот могут представлять собой неконсервативные замены, добавления или делеции. В некоторых вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более модификаций аминокислот могут представлять собой консервативные замены.

Модификации, которые влияют на активность GIP

Повышенную активность в отношении рецептора GIP обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 1. Например, His в положении 1 заменяют крупной ароматической аминокислотой, необязательно Tyr, Phe, Trp, амино-Phe, нитро-Phe, хлор-Phe, сульфо-Phe, 4-пиридил-Ala, метил-Tyr или 3-амино-Tyr. Комбинация Tyr в положении 1 со стабилизацией альфа-спирали в области, соответствующей аминокислотам 12-29, дает родственный глюкагону пептид класса 2, который активирует рецептор GIP, а также рецептор GLP-1 и рецептор глюкагона. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, в результате образования ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика или замены и/или инсерции аминокислоты вокруг положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой).

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификаций аминокислот в положениях 27 и/или 28 и необязательно в положении 29. Например, Met в положении 27 заменяют крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и Thr в положении 29 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Замены LAG в положениях 27-29 обеспечивают повышенную GIP-активность по сравнению с нативной последовательностью MNT в таких положениях.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 12. Например, аминокислоту в положении 12 заменяют крупной алифатической, неполярной аминокислотой, необязательно Ile.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP также обеспечивают путем модификации аминокислоты в положениях 17 и/или 18. Например, аминокислоту в положении 17 заменяют полярным остатком, необязательно Gln, и положение 18 заменяют малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala. Замена с использованием QA в положениях 17 и 18 дает повышенную GIP-активность по сравнению с нативной последовательностью RR в таких положениях.

Повышенную активность в отношении рецептора GIP обеспечивают путем модификаций, которые дают возможность образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями аминокислот в положениях от 12 до 29. Например, внутримолекулярный мостик может быть образован ковалентной связью между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В примерах вариантов осуществления мостик образуется между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В других вариантах осуществления нековалентные взаимодействия, такие как солевые мостики, могут быть образованы между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в указанных положениях.

Любую из модификаций, описанных выше, которая увеличивает активность рецептора GIP, можно использовать отдельно или в комбинации. Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GIP, обычно обеспечивают более высокую активность GIP, чем любая из таких модификаций отдельно.

Модификации, которые влияют на активность глюкагона

В некоторых вариантах осуществления повышенную глюкагоновую активность обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (SEQ ID NO:1001). В качестве неограничивающего примера такую повышенную активность можно получить заменой встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь с длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом, (например, N, O, S, P) и длиной боковой цепи примерно в 4 (или 3-5) атомов. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид сохраняет свою исходную селективность в отношении рецептора глюкагона по сравнению с рецепторами GLP-1.

Активность рецептора глюкагона может быть снижена путем модификации аминокислоты в положении 3, например, замены встречающегося в природе глутамина в положении 3 кислой, основной или гидрофобной аминокислотой. Например, замена в положении 3 глутаминовой кислотой, орнитином или норлейцином значительно снижает или устраняет активность рецептора глюкагона.

Поддержание или повышение активности в отношении рецептора глюкагона можно достичь путем модификации Gln в положении 3, с получением аналога глутамина, который описан в настоящем описании. Например, агонисты глюкагона могут содержать любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1243-1248, 1250, 1251 и 1253-1256.

Восстановление глюкагоновой активности, которая была снижена в результате модификаций аминокислот в положениях 1 и 2, обеспечивают путем модификаций, которые стабилизируют альфа-спиральную структуру C-концевой части (аминокислоты 12-29) глюкагонового пептида или его аналога. Например, внутримолекулярный мостик может быть образован ковалентной связью между боковыми цепями двух аминокислот в положениях i и i+4 или между положениями j и j+3, или между положениями k и k+7. В других вариантах осуществления нековалентные взаимодействия, такие как солевые мостики, могут быть образованы между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами в указанных положениях. В следующих вариантах осуществления одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот встраивают или используют для замены в такой C-концевой части (аминокислоты 12-29) в положениях, которые восстанавливают требуемую активность. Например, аминокислоты в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Модификации, которые влияют на активность GLP-1

Повышенную активность рецептора GLP-1 обеспечивают заменой остатка карбоновой кислоты C-концевой аминокислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид или сложный эфир.

Повышенную активность рецептора GLP-1 также обеспечивают путем стабилизации альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагона (в области аминокислот 12-29), например, посредством образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот или замены и/или инсерции аминокислоты в области положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой), как дополнительно описано в настоящем описании. В примерах вариантов осуществления боковые цепи пар аминокислот 12 и 16, 13 и 17, 16 и 20, 17 и 21, 20 и 24 или 24 и 28 (пары аминокислот, в которых i равно 12, 16, 20, или 24) связаны друг с другом и, таким образом, стабилизируют альфа-спираль глюкагона. В некоторых вариантах осуществления мостик или линкер имеет длину около 8 (или примерно 7-9), в частности, когда мостик находится между положениями i и i+4. В некоторых вариантах осуществления мостик или линкер имеет длину около 6 (или примерно 5-7) атомов, в частности, когда мостик находится между положениями j и j+3.

В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярные мостики образуются в результате (a) замены встречающегося в природе серина в положении 16 глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты, или заряженной аминокислоты, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, N, O, S, P), и с длиной боковой цепи примерно 4 (или 3-5) атомов, и (b) замены встречающегося в природе глутамина в положении 20 другой гидрофильной аминокислотой, имеющей боковую цепь, которая либо заряжена и обладает способностью образовывать водородную связь и имеет длину по меньшей мере примерно 5 (или примерно 4-6) атомов, например лизином, цитруллином, аргинином или орнитином. Боковые цепи таких аминокислот в положениях 16 и 20 могут образовывать солевой мостик или могут быть ковалентно связаны. В некоторых вариантах осуществления две аминокислоты связаны друг с другом с образованием лактамового кольца.

В некоторых вариантах осуществления стабилизацию альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагонового пептида достигают посредством образования другого внутримолекулярного мостика, отличного от лактамового мостика. Например, подходящие способы образования ковалентных связей включают любой один или несколько из следующих способов: метатезис олефинов, основанную на лантионине циклизацию, образование дисульфидного мостика или образование модифицированного содержащего серу мостика, использование α,ω-диаминоалкановой связки, образование мостиков на основе атомов металлов и другие способы циклизации пептидов, которые используют для стабилизации альфа-спирали.

В следующих вариантах осуществления одну или несколько α,α-дизамещенных аминокислот встраивают или используют для замены в указанной C-концевой части (аминокислоты 12-29) в положениях, которые сохраняют требуемую активность. Например, аминокислоту в одном, двух, трех или всех положениях 16, 20, 21 или 24 заменяют α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 20, как описано в настоящем описании.

Повышенную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают добавлением GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096) к C-концу. GLP-1-активность таких аналогов можно дополнительно повысить путем модификации аминокислоты в положении 18, 28 или 29, или в положении 18 и 29, как описано в настоящем описании.

Дальнейшее небольшое увеличение GLP-1-активности обеспечивают путем модификации аминокислоты в положении 10 с получением крупного ароматического аминокислотного остатка, необязательно Trp.

Пониженную активность в отношении рецептора GLP-1 обеспечивают, например, используя модификацию аминокислоты в положении 7, как описано в настоящем описании.

Эффективность в отношении рецептора GLP-1 можно дополнительно повысить аланиновой заменой нативного аргинина в положении 18.

Любые модификации, описанные выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, которые повышают активность рецептора GLP-1, можно применять по отдельности или в комбинации. Комбинации модификаций, которые повышают активность рецептора GLP-1, обычно обеспечивают более высокую активность GLP-1, чем любые такие модификации по отдельности. Например, изобретение относится к глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 16, в положении 20 и в C-концевой группе карбоновой кислоты, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 16 и в C-концевой группе карбоновой кислоты; глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положениях 16 и 20, необязательно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; и глюкагоновым пептидам, которые содержат модификации в положении 20 и в C-концевой группе карбоновой кислоты.

Модификации, которые повышают устойчивость к DPP-IV

Модификации в положении 1 и/или 2 могут повышать устойчивость пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV). Например, в положении 1 и/или положении 2 можно осуществить замену устойчивой к DPP-IV аминокислотой, которая описана в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 2 заменяют N-метилаланином.

Обнаружено, что модификации в положении 2 (например, AIB в положении 2) и в некоторых случаях модификации в положении 1 (например, DMIA в положении 1) могут уменьшать глюкагоновую активность, иногда в значительной степени; неожиданно, такое уменьшение в глюкагоновой активности может быть восстановлено стабилизацией альфа-спиральной структуры в C-концевой части глюкагона (в области аминокислот 12-29), например, посредством образования ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления ковалентная связь находится между аминокислотами в положениях «i» и «i+4», или положениях «j» и «j+3», например, между положениями 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24, 24 и 28, или 17 и 20. В примерах вариантов осуществления такая ковалентная связь представлена лактамовым мостиком между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20. В некоторых вариантах осуществления такая ковалентная связь представлена другим внутримолекулярным мостиком, отличным от лактамового мостика, как описано в настоящем описании.

Модификации, которые уменьшают разложение

В следующих примерах вариантов осуществления любой из родственных глюкагону пептидов класса 2 может быть дополнительно модифицирован для повышения стабильности, путем модификации аминокислоты в положении 15 и/или 16 последовательности SEQ ID NO:1001, чтобы уменьшить разложение пептида с течением времени, особенно в кислых или щелочных буферах. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи Asp15-Ser16. В примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 15 представляет собой делецию или замену Asp глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В других примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 16 представляет собой делецию или замену Ser аминокислотой Thr или AIB. В других примерах вариантов осуществления Ser в положении 16 заменяют глутаминовой кислотой или другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или альтернативно, любой из глутамина, гомоглутаминовой кислоты или гомоцистеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида, модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут предотвращать окислительное разложение пептида. В некоторых вариантах осуществления Met в положении 27 заменяют лейцином, изолейцином или норлейцином. В некоторых конкретных вариантах осуществления Met в положении 27 заменяют лейцином или норлейцином.

В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дезамидирования Gln. В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 заменяют аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB. В некоторых вариантах осуществления Gln в положении 20 и/или 24 заменяют Lys, Arg, Orn или цитруллином.

В некоторых вариантах осуществления Asp в положении 21 модифицируют, например, делецией или заменой. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида, с последующей изомеризацией до изоаспартата. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu.

Стабилизация альфа-спиральной структуры

Стабилизация альфа-спиральной структуры в C-концевой части родственного глюкагону пептида класса 2 (в области аминокислот 12-29) обеспечивает повышенную GLP-1 и/или GIP активность и восстанавливает глюкагоновую активность, которая была снижена при модификации аминокислот в положениях 1 и/или 2. Альфа-спиральная структура может быть стабилизирована, например, благодаря образованию ковалентного или нековалентного внутримолекулярного мостика или благодаря замене и/или инсерции аминокислоты в области положений 12-29 стабилизирующей альфа-спираль аминокислотой (например, α,α-дизамещенной аминокислотой). Стабилизацию альфа-спиральной структуры агониста GIP можно осуществить, как описано в настоящем описании.

Ацилирование и алкилирование

Согласно некоторым вариантам осуществления глюкагоновые пептиды, описанные в настоящем описании, модифицируют, чтобы они содержали ацильную группу или алкильную группу, например, ацильную или алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, которая описана в настоящем описании. Ацилирование или алкилирование может увеличивать время полужизни глюкагоновых пептидов в кровообращении. Ацилирование или алкилирование преимущественно может задерживать начало действия и/или увеличивать продолжительность действия на рецепторы глюкагона и/или GLP-1 и/или повышать устойчивость к протеазам, таким как DPP-IV, и/или повышать растворимость. Активность в отношении рецепторов глюкагона и/или GLP-1, и/или GIP глюкагонового пептида может сохраняться после ацилирования. В некоторых вариантах осуществления активность ацилированных глюкагоновых пептидов сравнима с активностью неацилированных вариантов глюкагоновых пептидов. Родственные глюкагону пептиды класса 2 могут быть ацилированы или алкилированы в том же положении аминокислоты, в котором связан гидрофильный остаток, или в другом положении аминокислоты, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к глюкагоновому пептиду, модифицированному, чтобы он содержал ацильную группу или алкильную группу, ковалентно связанную с аминокислотой в положении 10 глюкагонового пептида. Глюкагоновый пептид может дополнительно содержать спейсер между аминокислотой в положении 10 глюкагонового пептида и ацильной группой или алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представлена жирной кислотой или желчной кислотой или ее солью, например, C4-C30 жирной кислотой, C8-C24 жирной кислотой, холевой кислотой, C4-C30алкилом, C8-C24алкилом или алкилом, содержащим стероидный остаток желчной кислоты. Спейсер представляет собой любой остаток с подходящими реакционноспособными группами для связывания с ацильными или алкильными группами. В примерах вариантов осуществления спейсер содержит аминокислоту, дипептид, трипептид, гидрофильный бифункциональный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер выбран из группы, состоящей из: Trp, Glu, Asp, Cys и спейсера, содержащего NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, где m означает любое целое число от 1 до 6, и n означает любое целое число от 2 до 12. Такие ацилированные или алкилированные глюкагоновые пептиды также могут дополнительно содержать гидрофильный остаток, необязательно полиэтиленгликоль. Любой из указанных выше глюкагоновых пептидов может содержать две ацильных группы или две алкильных группы или их комбинацию.

Конъюгаты и слияния

Агонист GIP может быть связан, необязательно ковалентной связью и необязательно через линкер, с конъюгируемым остатком, как описано в настоящем описании.

В других вариантах осуществления вторым пептидом является XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X выбран из одной из 20 обычных аминокислот, например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты или глицина. В некоторых вариантах осуществления X означает аминокислоту, например Cys, которая дополнительно содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с боковой цепью данной аминокислоты. Такие C-концевые удлинения повышают растворимость, а также могут повышать GIP или GLP-1 активность. В некоторых вариантах осуществления, в которых глюкагоновый пептид дополнительно содержит удлинение карбоксильного конца, C-концевая аминокислота удлинения заканчивается амидной группой или сложноэфирной группой, а не группой карбоновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления, например, в глюкагоновых пептидах, которые содержат C-концевое удлинение, треонин в положении 29 нативного глюкагонового пептида заменяют глицином. Например, глюкагоновый пептид, имеющий замену треонина глицином в положении 29 и содержащий C-концевое удлинение GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095), в четыре раза более эффективен в отношении рецептора GLP-1, чем нативный глюкагон, модифицированный, чтобы он содержал такое же C-концевое удлинение. Такая замена T29G может быть использована вместе с другими модификациями, описанными в настоящем описании, для усиления аффинности глюкагоновых пептидов в отношении рецептора GLP-1. Например, замену T29G можно комбинировать с аминокислотными заменами S16E и N20K, необязательно с лактамовым мостиком между аминокислотами 16 и 20, и необязательно с добавлением цепи ПЭГ, как описано в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления добавляют аминокислоту к C-концу, и дополнительная аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Модификации, которые повышают растворимость

В другом варианте осуществления растворимость любого из глюкагоновых пептидов может быть повышена с использованием замен и/или добавлений аминокислот, которые вводят заряженную аминокислоту в C-концевую часть пептида, предпочтительно в положении, являющемся C-концевым по отношению к положению 27 последовательности SEQ ID NO:1001. Необязательно можно вводить одну, две или три заряженных аминокислоты в C-концевую часть, предпочтительно с C-концевой стороны от положения 27. В некоторых вариантах осуществления нативную аминокислоту (аминокислоты) в положениях 28 и/или 29 заменяют одной или двумя заряженными аминокислотами, и/или в дополнительном варианте осуществления одну-три заряженные аминокислоты также добавляют к C-концу пептида. В примерах вариантов осуществления одна, две или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженной (кислой аминокислотой) является аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота.

Дополнительные модификации, например консервативные замены, могут быть осуществлены в глюкагоновом пептиде, которые все же позволяют ему сохранить GIP активность (и необязательно GLP-1 активность и/или глюкагоновую активность).

Другие модификации

Любые модификации, описанные выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, которые повышают или понижают активность GIP, которые повышают или понижают активность рецептора глюкагона и которые повышают активность рецептора GLP-1, могут быть использованы по отдельности или в комбинации. Любую из модификаций, описанных выше со ссылкой на родственный глюкагону пептид класса 2, также можно сочетать с другими модификациями, которые придают другие требуемые свойства, такие как повышенная растворимость и/или стабильность, и/или продолжительность действия, которые описаны в настоящем описании по отношению к родственным глюкагону пептидам класса 2. Альтернативно, любую из модификаций, описанных выше со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 2, можно сочетать с другими модификациями, описанными в настоящем описании со ссылкой на родственные глюкагону пептиды класса 2, которые существенно не влияют на растворимость или стабильность, или активность. Иллюстративные модификации включают, но без ограничения:

(A) повышение растворимости, например, путем введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в C-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в положение с C-концевой стороны от положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена заменой нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29, или альтернативно, добавлением заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В примерах вариантов осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В других вариантах осуществления одна, две, три или все заряженные аминокислоты являются положительно заряженными. Такие модификации повышают растворимость, например, обеспечивают по меньшей мере 2-кратную, 5-кратную, 10-кратную, 15-кратную, 25-кратную, 30-кратную или более высокую растворимость по сравнению с нативным глюкагоном при данном значении pH, примерно от 5,5 до 8, например при pH 7, в случае измерения через 24 часа при 25°C;

(B) повышение растворимости и продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении добавлением гидрофильного остатка, такого как цепь полиэтиленгликоля, как описано в настоящем описании, например в положении 16, 17, 20, 21, 24 или 29, в C-концевом удлинении или к C-концевой аминокислоте пептида;

(C) повышение растворимости и/или продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении и/или задержку начала действия с использованием ацилирования или алкилирования глюкагонового пептида, как описано в настоящем описании;

(D) увеличение продолжительности действия или времени полужизни в кровообращении благодаря приданию устойчивости к расщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV) путем модификации аминокислоты в положении 1 или 2, как описано в настоящем описании;

(E) повышение стабильности путем модификации Asp в положении 15, например, делецией или заменой глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. Такие модификации могут уменьшать разложение или расщепление при pH в диапазоне от 5,5 до 8, например, сохраняя по меньшей мере 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, до 100% исходного пептида через 24 часа при 25°C. Такие модификации уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16;

(F) повышение стабильности путем модификации Ser в положении 16, например заменой аминокислотами Thr или AIB. Такие модификации также уменьшают расщепление пептидной связи между Asp15-Ser16;

(G) повышение стабильности путем модификации метионина в положении 27, например, замены лейцином или норлейцином. Такие модификации могут уменьшать окислительное разложение. Стабильность также может быть повышена путем модификации Gln в положении 20 или 24, например, заменой аминокислотой Ser, Thr, Ala или AIB. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дезамидирования Gln. Стабильность может быть повышена модификацией Asp в положении 21, например, заменой аминокислотой Glu. Такие модификации могут уменьшать разложение, которое происходит в результате дегидратации Asp с образованием промежуточного циклического сукцинимида с последующей изомеризацией до изоаспартата;

(H) неконсервативные или консервативные замены, добавления или делеции, которые существенно не влияют на активность, например, консервативные замены в одном или нескольких положениях 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29; замену аминокислоты в одном или нескольких таких положениях аминокислотой Ala; делецию аминокислот в одном или нескольких положениях 27, 28 или 29; или делецию аминокислоты 29 необязательно в комбинации с C-концевым амидом или сложным эфиром вместо C-концевой группы карбоновой кислоты; замену Lys в положении 12 аминокислотой Arg; замену Tyr в положении 10 аминокислотой Val или Phe.

Сохранение активности после пегилирования обеспечивают путем добавления GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) к C-концу.

Некоторые положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы при сохранении по меньшей мере некоторых из активностей исходного пептида. Соответственно, авторы настоящего изобретения ожидали, что одна или несколько аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29, могут быть заменены другой аминокислотой, отличной от той, которая присутствует в нативном глюкагоновом пептиде, и при этом все еще может быть сохранена активность в отношении рецептора глюкагона.

В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 18 заменяют аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из Ala, Ser или Thr. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 20 заменяют Ser, Thr, Lys, Arg, Orn, цитруллином или AIB. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 21 заменяют Glu, гомоглутаминовой кислотой или гомоцистеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления глюкагоновый пептид содержит 1-10 модификаций аминокислот, выбранных из положений 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 и 29. В примерах вариантов осуществления модификации представляют собой одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из Gln17, Ala18, Glu21, Ile23, Ala24, Val27 и Gly29. В некоторых вариантах осуществления 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-26, отличаются от аминокислот в исходном пептиде. В других вариантах осуществления 1-2 аминокислоты, выбранные из аминокислот в положениях 17-22, отличаются от аминокислот в исходном пептиде. В следующих вариантах осуществления модификации представляют собой Gln17, Ala18, Glu21, Ile23 и Ala24.

В некоторых вариантах осуществления одну или несколько аминокислот добавляют к карбоксильному концу глюкагонового пептида. Аминокислоту обычно выбирают из 20 обычных аминокислот, и в некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет амидную группу вместо группы карбоновой кислоты нативной аминокислоты. В примерах вариантов осуществления добавляемая аминокислота выбрана из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и глицина.

Другие модификации, которые не нарушают активность, включают W10 или R20.

В некоторых вариантах осуществления родственные глюкагону пептиды класса 2, описанные в настоящем описании, модифицируют посредством укорочения C-конца на один или два аминокислотных остатка, сохраняя при этом сходную активность и эффективность в отношении рецепторов глюкагона, GLP-1 и/или GIP. В связи с этим, аминокислота в положении 29 и/или 28 может быть делетирована.

Примеры вариантов осуществления

Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит последовательность SEQ ID NO:1001 с (a) модификацией аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, (b) модификацией, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру C-концевой части (аминокислоты 12-29) аналога, и (c) необязательно 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) дополнительными модификациями аминокислот. В некоторых вариантах осуществления аналог проявляет по меньшей мере примерно 1% активности нативного GIP в отношении рецептора GIP или любой другой уровень активности в отношении рецептора GIP, описанный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления модификация, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, представляет собой модификацию, которая создает или вводит внутримолекулярный мостик, включая, например, ковалентный внутримолекулярный мостик, такой как любой из мостиков, описанных в настоящем описании. Ковалентным внутримолекулярным мостиком в некоторых вариантах осуществления является лактамовый мостик. Лактамовый мостик аналога согласно таким вариантам осуществления может представлять собой лактамовый мостик, который описан в настоящем описании. См., например, описание лактамовых мостиков в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Например, лактамовым мостиком может быть мостик, который расположен между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17. В некоторых вариантах осуществления лактамовый мостик может быть расположен между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

В альтернативных вариантах осуществления модификация, которая стабилизирует альфа-спиральную структуру, представляет собой введение одной, двух, трех или четырех α,α-дизамещенных аминокислот в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога. В некоторых вариантах осуществления α,α-дизамещенной аминокислотой является AIB. В некоторых аспектах α,α-дизамещенная аминокислота (например, AIB) находится в положении 20, и аминокислота в положении 16 заменена положительно заряженной аминокислотой, такой как, например, аминокислота формулы IV, которая описана в настоящем описании. Аминокислота формулы IV может представлять собой гомо-Lys, Lys, Orn или 2,4-диаминомасляную кислоту (Dab).

В конкретных аспектах изобретения модификация аминокислоты в положении 1 представляет собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи, например, крупной ароматической аминокислотой (например, Tyr).

В некоторых аспектах аналог глюкагона содержит модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly, или возможна комбинация двух или трех вышеуказанных модификаций. В конкретных вариантах осуществления аналог глюкагона содержит Leu в положении 27, Ala в положении 28, и Gly или Thr в положении 29.

В некоторых вариантах осуществления изобретения аналог глюкагона содержит удлинение из 1-21 аминокислоты, находящихся с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29. Удлинение может содержать, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095 или 1096. Дополнительно или альтернативно, аналог глюкагона может содержать удлинение, в котором 1-6 аминокислот удлинения являются положительно заряженными аминокислотами. Положительно заряженными аминокислотами могут быть аминокислоты формулы IV, включая, но без ограничения, Lys, гомо-Lys, Orn и Dab.

Аналог глюкагона в некоторых вариантах осуществления ацилирован или алкилирован, как описано в настоящем описании. Например, ацильная или алкильная группа может быть связана с аналогом глюкагона, спейсером или без спейсера, в положении 10 или 40 аналога, как дополнительно описано в настоящем описании. Аналог может быть, дополнительно или альтернативно, модифицирован, чтобы он содержал гидрофильный остаток, как дополнительно описано в настоящем описании. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления аналог содержит любую одну или комбинацию следующих модификаций:

(a) Ser в положении 2 заменен D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(b) Tyr в положении 10 заменен Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val:

(c) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(d) Lys в положении 12 заменен Arg или Ile;

(e) Ser в положении 16 заменен Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly или AIB;

(f) Arg в положении 17 заменен Gln;

(g) Arg в положении 18 заменен Ala, Ser, Thr или Gly;

(h) Gln в положении 20 заменен Ser, Thr, Ala, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(i) Asp в положении 21 заменен Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(j) Val в положении 23 заменен Ile;

(k) Gln в положении 24 заменен Asn, Ser, Thr, Ala или AIB;

(l) и консервативную замену в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 8, 19 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

В примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) лактамовый мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17,

(c) модификации аминокислоты в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(d) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот,

и EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

Лактамовый мостик аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой лактамовый мостик, который описан в настоящем описании. См., например, описание лактамовых мостиков в разделе «Стабилизация альфа-спиральной структуры». Например, лактамовый мостик может быть между аминокислотами в положениях 16 и 20, где одна из аминокислот в положениях 16 и 20 заменена Glu, а другая аминокислота в положениях 16 и 20 заменена Lys.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1005-1094.

В других примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой,

(c) модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(d) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, и EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

α,α-Дизамещенная аминокислота аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой любую α,α-дизамещенную аминокислоту, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления α,α-дизамещенной аминокислотой является AIB. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении 20 заменена α,α-дизамещенной аминокислотой, например, AIB.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1099-1141, 1144-1164, 1166-1169 и 1173-1178.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP, содержит следующие модификации:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) замену аминокислоты Ser в положении 16 аминокислотой формулы IV:

[Формула IV]

где n равно 1-16 или 1-10, или 1-7, или 1-6, или 2-6, каждый из R1 и R2 независимо выбран из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), где R7 означает H или OH, и боковая цепь аминокислоты формулы IV содержит свободную аминогруппу,

(c) замену аминокислоты Gln в положении 20 альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой,

(d) модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28, и

(e) 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот,

и EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

Аминокислота формулы IV аналога согласно указанным вариантам осуществления может представлять собой любую аминокислоту, такую как, например, аминокислота формулы IV, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления n равно 2, 3, 4 или 5, и в данном случае аминокислотой является Dab, Orn, Lys или гомо-Lys, соответственно.

Альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой является AIB.

Согласно указанным вариантам осуществления аналог может содержать, например, любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1099-1165.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона (SEQ ID NO:1001), обладающий активностью агониста GIP содержит:

(a) модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, и

(b) удлинение, имеющее примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты, с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, где по меньшей мере одна из аминокислот удлинения ацилирована или алкилирована,

где EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота представляет собой аминокислоту формулы I, II или III. В более конкретных вариантах осуществления аминокислотой формулы I является Dab, Orn, Lys или гомоLys. Также в некоторых вариантах осуществления удлинение, имеющее примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты, содержит аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170), или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171), или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную, или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут содержать последовательности, включающие одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностями SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

В некоторых вариантах осуществления аналог, обладающий активностью агониста GIP, дополнительно содержит модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, например, модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

В любом из указанных выше примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи. Модификация аминокислоты в положении 1, например, может представлять собой замену His крупной ароматической аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая из аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Также, в связи с указанными выше примерами вариантов осуществления, модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29 могут представлять собой любую из модификаций в таких положениях, описанных в настоящем описании. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и/или Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог, согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может дополнительно содержать 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность в отношении любого из рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность. Аналог, кроме того, может содержать, например, модификацию аминокислоты в положении 12, необязательно, замену аминокислотой Ile, и/или модификации аминокислот в положениях 17 и 18, необязательно замены аминокислотой Q в положении 17 и аминокислотой A в положении 18, и/или добавление к C-концу последовательности GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), или последовательностей, содержащих одну или несколько консервативных замен по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095 или 1096. Аналог может содержать одну или несколько из следующих модификаций:

(i) Ser в положении 2, замененный D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(ii) Tyr в положении 10, замененный Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) Lys в положении 12, замененный Arg;

(v) Ser в положении 16, замененный Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly или AIB;

(vi) Arg в положении 17, замененный Gln;

(vii) Arg в положении 18, замененный Ala, Ser, Thr или Gly;

(viii) Gln в положении 20, замененный Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(ix) Asp в положении 21, замененный Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(x) Val в положении 23, замененный Ile;

(xi) Gln в положении 24, замененный Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) консервативную замену в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинацию модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, замену аминокислоты Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, замену аминокислоты Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), где аналог обладает менее чем примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей гидрофильный остаток, чтобы гидрофильный остаток был ковалентно связан с аналогом в положении 40.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001) или может представлять собой аминокислоту, которой заменяют нативную аминокислоту в SEQ ID NO:1001. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь с гидрофильным остатком может содержать структуру

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может содержать модифицированную аминокислоту, в которой боковая цепь ковалентно связана с ацильной или алкильной группой (например, ацильной или алкильной группой, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты). Ацилированный или алкилированный аналог может соответствовать ацилированным или алкилированным пептидам, описанным в разделе «Ацилирование и алкилирование». В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкил группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20 ацильная или алкильная группа или C22ацильная или алкильная группа. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с любой аминокислотой аналога, включая, но без ограничения, аминокислоту в положении 10 или 40 или C-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей ацильную или алкильную группу, так что ацильная или алкильная группа ковалентно связана с аналогом в положении 40. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты формулы I, II или III, например, остатка Lys. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с аминокислотой, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001) или может быть связана с аминокислотой, которая добавлена к последовательности SEQ ID NO:1001 или к последовательности SEQ ID NO:1001, за которой следует последовательность SEQ ID NO:1095 (на N- или C-конце), или может быть связана с аминокислотой, заменяющей нативную аминокислоту, например Tyr в положении 10 последовательности SEQ ID NO:1001.

В указанных выше примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, аналог может быть связан с ацильной или алкильной группой через спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер может иметь длину, например, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона, обладающий активностью агониста GIP, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:1227, 1228, 1229 или 1230, которая дополнительно содержит следующие модификации:

(a) необязательно модификацию аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP,

(b) удлинение, состоящее примерно из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, где по меньшей мере одна из аминокислот удлинения ацилирована или алкилирована, и

(d) до 6 дополнительных модификаций аминокислот,

где EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В некоторых аспектах ацилированная или алкилированная аминокислота представляет собой аминокислоту формулы I, II или III. В более конкретных вариантах осуществления аминокислотой формулы I является Dab, Orn, Lys или гомоLys. Также в некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты составляют аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170), или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171), или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут составлять последовательности, содержащие одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

В любых указанных выше примерах вариантов осуществления аминокислота в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой аминокислоту, не имеющую имидазольной боковой цепи. Аминокислотой в положении 1 может быть, например, крупная ароматическая аминокислота. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая аминокислота, описанная в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Аналог согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может содержать 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность в отношении рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность.

В некоторых аспектах аналоги глюкагона, описанные в приведенном выше примере варианта осуществления, содержат дополнительные модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29. Модификации в таких положениях могут представлять собой любые модификации, описанные в настоящем описании для указанных положений. Например, что касается SEQ ID NO:1227, 1228, 1229 или 1230, то аминокислота в положении 27 может быть заменена крупной алифатической аминокислотой (например, Leu, Ile или норлейцином) или Met, аминокислота в положении 28 может быть заменена другой малой алифатической аминокислотой (например, Gly или Ala) или Asn, и/или аминокислота в положении 29 может быть заменена другой малой алифатической аминокислотой (например, Ala или Gly) или Thr. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог, кроме того, может содержать одну или несколько из следующих дополнительных модификаций:

(i) аминокислотой в положении 2 является любая аминокислота, выбранная из D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислоты;

(ii) аминокислотой в положении 10 является Tyr, Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) аминокислотой в положении 12 является Ile, Lys или Arg;

(v) аминокислотой в положении 16 является любая из Ser, Glu, Gln, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты, Thr, Gly или AIB;

(vi) аминокислотой в положении 17 является Gln или Arg;

(vii) аминокислотой в положении 18 является любая из Ala, Arg, Ser, Thr или Gly;

(viii) аминокислотой в положении 20 является любая из Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллина, Arg, Orn или AIB, или другая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота;

(ix) аминокислотой в положении 21 является любая из Glu, Asp, гомоглутаминовой кислоты, гомоцистеиновой кислоты;

(x) аминокислотой в положении 23 является Val или Ile;

(xi) аминокислотой в положении 24 является любая из Gln, Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) одна или несколько консервативных замен в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинацию модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, аминокислотную замену Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, аминокислотную замену Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), где аналог обладает примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит гидрофильный остаток, ковалентно связанный с аналогом в положении 24.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1001, 1227, 1228, 1229 или 1230, или может представлять собой заменяющую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь может содержать структуру

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может содержать модифицированную аминокислоту в С-концевом удлинении, в которой боковая цепь ковалентно связана с ацильной или алкильной группой. Ацилированный или алкилированный аналог может соответствовать ацилированным или алкилированным пептидам, описанным в разделе «Ацилирование и алкилирование». В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкильная группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20ацильная или алкильная группа или C22ацильная или алкильная группа. Ацильная или алкильная группа может быть ковалентно связана с любой аминокислотой аналога, включая, но без ограничения, аминокислоту в положении 10 или 40 или C-концевую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ацильная или алкильная группа ковалентно связана с боковой цепью аминокислоты формулы I, II или III, например, остатка Lys. Ацильная или алкильная группа ковалентно связана с аминокислотой, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1001, 1227, 1228, 1229 или 1230, или она может быть связана с заменяющей аминокислотой. Ацильная или алкильная группа ковалентно связана аминокислотой, которая является нативной для последовательности SEQ ID NO:1095, 1096, 1171 или 1172, или она может быть связана с заменяющей аминокислотой.

В указанных выше примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, аналог может быть связан с ацильной или алкильной группой через спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер может иметь длину, например, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

В некоторых очень конкретных вариантах осуществления аналог согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1099-1141, 1144-1164, 1166, 1192-1207, 1209-1221 и 1223, или выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1167-1169, 1173-1178 и 1225.

Кроме того, конкретные примеры аналогов согласно изобретению включают, но без ограничения, любые аналоги, перечисленные в таблицах 1-3.

В следующих примерах вариантов осуществления аналог глюкагона, обладающий активностью агониста GIP, содержит ацильную или алкильную группу (например, ацильную или алкильную группу, которая не является нативной по отношению к встречающейся в природе аминокислоте), где ацильная или алкильная группа связана со спейсером, и где (i) спейсер связан с боковой цепью аминокислоты в положении 10 аналога; или (ii) аналог содержит удлинение из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29, и спейсер связан с боковой цепью аминокислоты, соответствующей одному из положений 37-43 относительно последовательности SEQ ID NO:1001, где EC50 аналога для активации рецептора GIP составляет примерно 10 нМ или менее.

В таких вариантах осуществления аналог может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1001 с (i) модификацией аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, (ii) модификациями аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29, (iii) имеющую по меньшей мере один из признаков:

(A) аналог содержит лактамовый мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях i и i+4 или между боковыми цепями аминокислот в положениях j и j+3, где i равно 12, 13, 16, 17, 20 или 24, и где j равно 17;

(B) одна, две, три или все аминокислоты в положениях 16, 20, 21 и 24 аналога заменены α,α-дизамещенной аминокислотой; или

(C) аналог содержит (i) замену аминокислоты Ser в положении 16 аминокислотой формулы IV:

ФормулаIV

где n равно 1-7, где каждый из R1 и R2 независимо выбран из группы, состоящей из H, C1-C18алкила, (C1-C18алкил)OH, (C1-C18алкил)NH2, (C1-C18алкил)SH, (C0-C4алкил)(C3-C6)циклоалкила, (C0-C4алкил)(C2-C5гетероцикла), (C0-C4алкил)(C6-C10арил)R7 и (C1-C4алкил)(C3-C9гетероарила), где R7 означает H или OH, и боковая цепь аминокислоты формулы IV содержит свободную аминогруппу; и (ii) замену аминокислоты Gln в положении 20 альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой;

и (iv) до 6 дополнительных модификаций аминокислот.

Альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любая альфа,альфа-дизамещенная аминокислота, включая, но без ограничения, аминоизомасляную кислоту (AIB), аминокислоту, дизамещенную одинаковыми или различными группами, выбранными из метила, этила, пропила и н-бутила, или циклооктаном или циклогептаном (например, 1-аминоциклооктан-1-карбоновую кислоту). В некоторых вариантах осуществления альфа,альфа-дизамещенной аминокислотой является AIB.

Аминокислота формулы IV аналога согласно указанным вариантам осуществления может быть любой аминокислотой, такой как, например, аминокислота формулы IV, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления n равно 2, 3, 4 или 5, и в данном случае аминокислота представляет собой Dab, Orn, Lys или гомоLys, соответственно.

В любых указанных выше примерах вариантов осуществления модификация аминокислоты в положении 1, которая придает активность агониста GIP, может представлять собой замену His аминокислотой, не имеющей имидазольной боковой цепи. Модификация аминокислоты в положении 1 может представлять собой, например, замену His крупной ароматической аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления крупной ароматической аминокислотой является любая из аминокислот, описанных в настоящем описании, включая, например, Tyr.

Также, что касается указанных выше примеров вариантов осуществления, то модификации аминокислот в одном, двух или всех положениях 27, 28 и 29 могут быть любыми модификациями в таких положениях, описанными в настоящем описании. Например, Met в положении 27 может быть заменен крупной алифатической аминокислотой, необязательно Leu, Asn в положении 28 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Ala, и/или Thr в положении 29 может быть заменен малой алифатической аминокислотой, необязательно Gly. Альтернативно, аналог может содержать такие модификации аминокислот в положении 27 и/или 28.

Аналог согласно указанным выше примерам вариантов осуществления, кроме того, может содержать 1-9 или 1-6 дополнительных модификаций аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 дополнительных модификаций аминокислот, таких как, например, любая из модификаций, описанных в настоящем описании, которая повышает или понижает активность по отношению к любому из рецепторов GIP, GLP-1 и глюкагона, повышает растворимость, увеличивает продолжительность действия или время полужизни в кровообращении, задерживает начало действия или повышает стабильность. Аналог может дополнительно содержать, например, модификацию аминокислоты в положении 12, необязательно, замену аминокислотой Ile, и/или модификации аминокислот в положениях 17 и 18, необязательно замену аминокислотой Q в положении 17 и аминокислотой A в положении 18, и/или добавление к C-концу последовательности GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096) или последовательностей, содержащих одну или несколько консервативных замен, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO:1095 или 1096. Аналог может содержать одну или несколько из следующих модификаций:

(i) Ser в положении 2, замененный D-Ser, Ala, D-Ala, Gly, N-метил-Ser, AIB, Val или α-амино-N-масляной кислотой;

(ii) Tyr в положении 10, замененный Trp, Lys, Orn, Glu, Phe или Val;

(iii) связывание ацильной группы с Lys в положении 10;

(iv) Lys в положении 12, замененный Arg;

(v) Ser в положении 16, замененный Glu, Gln, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой, Thr, Gly, Lys или AIB;

(vi) Arg в положении 17, замененный Gln;

(vii) Arg в положении 18, замененный Ala, Ser, Thr или Gly;

(viii) Gln в положении 20, замененный Ala, Ser, Thr, Lys, цитруллином, Arg, Orn или AIB;

(ix) Asp в положении 21, замененный Glu, гомоглутаминовой кислотой, гомоцистеиновой кислотой;

(x) Val в положении 23, замененный Ile;

(xi) Gln в положении 24, замененный Asn, Ala, Ser, Thr или AIB; и

(xii) консервативные замены в любом из положений 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 и 29.

Аналог в некоторых вариантах осуществления содержит комбинации модификаций (i)-(xii). Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 3 (например, аминокислотную замену Gln на Glu), где аналог обладает менее чем 1% активностью глюкагона в отношении рецептора глюкагона. Альтернативно или дополнительно, аналог может содержать модификацию аминокислоты в положении 7 (например, аминокислотную замену Thr аминокислотой, не имеющей гидроксильной группы, например, Abu или Ile), делецию аминокислоты (аминокислот), расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 27 или 28, с получением 27 или 28-аминокислотного пептида, или их комбинацию, где аналог обладает примерно 10% активностью GLP-1 в отношении рецептора GLP-1.

Что касается примеров вариантов осуществления, то аналог может быть ковалентно связан с гидрофильным остатком. В некоторых вариантах осуществления аналог ковалентно связан с гидрофильным остатком в любом положении аминокислот 16, 17, 20, 21, 24, 29, 40 или на C-конце. В некоторых вариантах осуществления аналог содержит C-концевое удлинение (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1095) и добавление аминокислоты, содержащей гидрофильный остаток, так что гидрофильный остаток ковалентно связан с аналогом в положении 40.

В некоторых вариантах осуществления гидрофильный остаток ковалентно связан с Lys, Cys, Orn, гомоцистеином или ацетилфенилаланином аналога. Lys, Cys, Orn, гомоцистеин или ацетилфенилаланин могут представлять собой аминокислоту, которая является нативной для последовательности глюкагона (SEQ ID NO:1001), или может представлять собой аминокислоту, которой заменяют нативную аминокислоту в SEQ ID NO:1001. В некоторых вариантах осуществления, в которых гидрофильный остаток связан с Cys, связь может содержать структуру:

или .

Что касается аналогов, содержащих гидрофильный остаток, то гидрофильным остатком может быть любой из остатков, описанных в настоящем описании. См., например, описание в разделе «Связывание гидрофильных остатков». В некоторых вариантах осуществления гидрофильным остатком является полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ в некоторых вариантах осуществления имеет молекулярную массу примерно от 1000 дальтон до примерно 40000 дальтон, например примерно от 20000 дальтон до примерно 40000 дальтон.

В примерах вариантов осуществления, в которых аналог содержит ацильную или алкильную группу, которая связана с аналогом через спейсер, где спейсером может быть любой спейсер, как описано в настоящем описании. Спейсер, например, может иметь длину, равную длине 3-10 атомов, и может представлять собой, например, аминокислоту (например, 6-аминокапроновую кислоту, любую аминокислоту, описанную в настоящем описании), дипептид (например, Ala-Ala, βAla-βAla, Leu-Leu, Pro-Pro, γGlu-γGlu), трипептид или гидрофильный или гидрофобный бифункциональный спейсер. В некоторых аспектах общая длина спейсера и ацильной или алкильной группы равна длине примерно 14-28 атомов. В некоторых вариантах осуществления аминокислотным спейсером не является γ-Glu. В некоторых вариантах осуществления дипептидным спейсером не является γ-Glu-γ-Glu.

Ацильная или алкильная группа представляет собой любую ацильную или алкильную группу, как описано в настоящем описании, такую как ацильная или алкильная группа, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты. Ацильная или алкильная группа в некоторых вариантах осуществления представляет собой C4-C30 жирную ацильную группу, такую как, например, C10 жирная ацильная или алкильная группа, C12 жирная ацильная или алкильная группа, C14 жирная ацильная или алкильная группа, C16 жирная ацильная или алкильная группа, C18 жирная ацильная или алкильная группа, C20 ацильная или алкильная группа или C22 ацильная или алкильная группа, или C4-C30 алкильную группу. В конкретных вариантах осуществления ацильная группа представляет собой C12-C18 жирную ацильную группу (например, C14 или C16 жирную ацильную группу).

В некоторых вариантах осуществления удлинение примерно из 1-21 аминокислоты, расположенных с C-концевой стороны от аминокислоты в положении 29 аналога, содержит аминокислотную последовательность GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1095) или XGPSSGAPPPS (SEQ ID NO:1096), где X означает любую аминокислоту, или GPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1170) или XGPSSGAPPPK (SEQ ID NO:1171) или XGPSSGAPPPSK (SEQ ID NO:1172), где X означает Gly или малую алифатическую или неполярную или слабо полярную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления примерно от 1 до примерно 21 аминокислоты могут составлять последовательности, содержащие одну или несколько консервативных замен по сравнению с SEQ ID NO:1095, 1096, 1170, 1171 или 1172. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43 удлиненного на C-конце аналога. В некоторых вариантах осуществления ацилированная или алкилированная аминокислота находится в положении 40 удлиненного на C-конце аналога.

Агонистом GIP может быть пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, например, SEQ ID NO:1005-1094, необязательно с 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительными модификациями, которые сохраняют активность агониста GIP. В некоторых вариантах осуществления агонист GIP содержит аминокислоты любой из SEQ ID NO:1099-1262.

Родственные глюкагону пептиды класса 3

В некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид представляет собой родственный глюкагону пептид класса 3, который описан в настоящем описании и в международной патентной заявке № PCT/US2009/47438 (поданной 16 июня 2009), в публикации международной патентной заявки № WO 2008/101017, опубликованной 21 августа 2008, и в предварительной патентной заявке США № 61/090412 и патентной заявке США № 61/177476, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Некоторые из биологических последовательностей, указанных в следующем разделе (SEQ ID NO:1-656), относящиеся к родственным глюкагону пептидам класса 3, соответствуют SEQ ID NO:1-656 в международной патентной заявке № PCT/US2009/47438.

Активность

Родственным глюкагону пептидом класса 3 может быть пептид, который проявляет повышенную активность в отношении рецептора глюкагона, и в следующих вариантах осуществления проявляет повышенную биофизическую стабильность и/или растворимость в воде. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 утрачивает селективность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1 и, таким образом, представляет собой коагонист указанных двух рецепторов. Выбранные модификации аминокислот в родственном глюкагону пептиде класса 3 могут регулировать относительную активность пептида в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с рецептором глюкагона. Таким образом, родственный глюкагону пептид класса 3 может быть коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает более высокой активностью в отношении рецептора глюкагона в сравнении с рецептором GLP-1, коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает приблизительно эквивалентной активностью по отношению к обоим рецепторам, или коагонистом глюкагона/GLP-1, который обладает более высокой активностью в отношении рецептора GLP-1 в сравнении с рецептором глюкагона. Последняя категория коагониста может быть сконструирована таким образом, чтобы он проявлял небольшую или не проявлял активности в отношении рецептора глюкагона, и при этом все еще сохранял способность активировать рецептор GLP-1 с такой же или более высокой эффективностью, чем нативный GLP-1. Любой из таких коагонистов также может содержать модификации, которые придают повышенную биофизическую стабильность и/или растворимость в воде.

Могут быть осуществлены модификации родственного глюкагону пептида класса 3, чтобы получить глюкагоновый пептид, обладающий по меньшей мере примерно от 1% (включая по меньшей мере примерно 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%) до примерно 200% или более высокой активностью в отношении рецептора GLP-1 по сравнению с нативным GLP-1 и по меньшей мере примерно от 1% (включая примерно 1,5%, 2%, 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%) до примерно 500% или более высокой активностью в отношении рецептора глюкагона по сравнению с нативным глюкагоном. Аминокислотная последовательность нативного глюкагона представляет собой SEQ ID NO:1, аминокислотная последовательность GLP-1 (7-36)амида представляет собой SEQ ID NO:52, и аминокислотная последовательность GLP-1(7-37)кислоты представляет собой SEQ ID NO:50. В примерах вариантов осуществления родственный глюкагону пептид класса 3 может проявлять по меньшей мере 10% активность нативного глюкагона в отношении рецептора глюкагона и по меньшей мере 50% активность нативного GLP-1 в отношении рецептора GLP-1, или по меньш