Питательная среда для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro, включающую растворенные в дистиллированной воде витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скуга, сахарозу в количестве 20000 мг/л, агар-агар в количестве 8000 мг/л, а также регуляторы роста 6-бензиламинопурин, гибберелловую кислоту и 3-индолил уксусную кислоту, минеральный состав Woody Plant Medium, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л:

6-бензиламинопурин 0.1-0.3 кинетин 0.9-1.1 гибберелловая кислота 0.9-1.1 3-индолил уксусная кислота 0.4-0.6

Изобретение позволяет увеличить коэффициент размножения посредством активации пазушных меристем без ущерба качеству регенерантов. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для воспроизводства редких и исчезающих видов растений в целях сохранения биологического разнообразия, в частности, при клональном микроразмножении некоторых кальцефильных видов растений: Centaurea ruthenica Lam., Globularia punctata Lapeyr., Hyssopus cretaceous Dubjan., Potentilla volgarica Juz., Scrophularia sareptana Kleop.Ex Ivanina, Silene cretacea Fisch. ex Spreng., Silene hellmannii Claus.

Известно, что основой клонального микроразмножения растений является подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования in vitro для получения достаточного количества жизнеспособных регенерантов. Наиболее предпочтительными объектами для клонального размножения редких и исчезающих видов растений являются апексы и пазушные почки стебля, так как они более устойчивы к генетическим изменениям, чем дифференцированные ткани, способные образовывать адвентивные почки (Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с). Для снятия апикального доминирования и активации пазушных меристем в питательную среду, как правило, вносят регуляторы роста. Из цитокининов наиболее часто используют 6-бензиламинопурин (БАП), кинетин, зеатин и тидиазурон, из ауксинов - 3-индолил уксусную (ИУК), 3-индолил масляную (ИМК) и α-нафтил уксусную (НУК) кислоты (CN 101869064, RU 2169769, CN 102860258, CN 102577944, RU2457669, CN 101530063, CN 1631105 и др.). Для каждого нового объекта соотношение регуляторов роста подбирают индивидуально в зависимости от его биологических особенностей, однако данных по клональному микроразмножению Centaurea ruthenica, Globularia punctata, Hyssopus cretaceous,Scrophularia sareptana, Silene hellmannii в литературе не представлено. Известно, что совместное присутствие цитокининов и ауксинов в питательной среде в ряде случаев оказывает положительный эффект на регенерацию микропобегов (CN 101869064, RU 2169769, CN 102860258, CN 102577944, CN 101530063, CN 1631105). В качестве дополнительного регулятора роста иногда вводят гибберелловую кислоту (ГК) (CN 101530063, SU 1720595A1). Известно, что внесение в питательную среду нескольких цитокининов одновременно способствует повышению качества и количества регенерировавших побегов для некоторых культур (CN 101530063, Gabryszewska Е. The influence of cytokinins, thidiazuron, paclobutrazol and red light on shoot proliferation of herbaceous peony cv. Jadwiga in vitro. // J. Fruit Ornam. Plant Res., 1998. - Vol. 6. - P.157-169; Yu X.N., Wu H.J., Teixeira da Silva J.A., Shen M.M.Multiple shoot induction and rooting of Paeonia lactiflora'Da Fu Gui' //African Journal of Biotechnology, 2012. - Vol.11(41). - Р. 9776-9781). Однако совместное использование БАП и кинетина не дает существенного эффекта при клональном микроразмножении исследуемых объектов, БАП+зеатин - приводит к появлению генеративных структур у некоторых объектов через 3-4 пассажа (P. volgarica). Повышение концентрации БАП в питательной среде приводит к оводнению микропобегов, увеличение концентрации кинетина и зеатина - к вытягиванию междоузлий и хрупкости материала. Известна питательная среда для активации пазушных меристем Silene cretacea, имеющая в основе минеральный состав по прописи Мурасиге и Скуга (МС) (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures //Physiol. Plant, 1962. Vol.15. №13. P. 473-497) и включающая 0.5 мг/л БАП (Жолобова О.О. Сохранение редких и исчезающих видов растений в культуре in vitro и оценка уровня их внутривидового полиморфизма: Автореф. дис. канд. биол. наук. Белгород: Изд-во БелГУ, 2012. 23 с.). Недостатком данной питательной среды является то, что коэффициент размножения при культивировании на ней резко снижается уже на втором пассаже (с 13.50±1.85 до 3.45±1.30 микропобегов на эксплант), а после шестого - культура полностью выпадает.

Известна питательная среда Woody Plant Medium (WPM) (LloudG., McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture //Proc. Int. Plant Prop. Soc., 1980. Vol.30. P. 420-427). Известная среда, дополненная БАП 0.5 мг/л, характеризовалась увеличенным коэффициентом размножения до 7.25±3.05 микропобегов на эксплант для Silene cretacea. Однако недостатками использования БАП в качестве единственного источника цитокининов являлись образование большого количества каллуса и появление стрессовой антоциановой окраски.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является питательная среда для микроразмножения растений в культуре in vitro, содержащая минеральный состав, витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скуга (МС) в качестве основы, а также регуляторы роста - сочетание фитогормонов БАП 1 мг/л, ГК 0.5 мг/л и ИУК 0.1 мг/л (Wu H.J., Yu X.N., Teixeira da Silva J.A., Lu G.P. Direct shoot induction of Paeonia lactiflora «Zhong Sheng Fen» and rejuvenation of hyperhydric shoots //N. Zealand J. Crop. Hort. Sci., 2011. - Vol.1. - Р. 1-8). Однако использование этого сочетания и минерального состава применительно к клональному микроразмножению некоторых кальцефильных видов растений приводит к оводнению растительного материала и невозможности дальнейшей работы с ним из-за высокой концентрации БАП и неподходящего состава солей.

Технический результат заключается в увеличении коэффициента размножения Centaurea ruthenica, Globularia punctata, Hyssopus cretaceous, Potentilla volgarica, Scrophularia sareptana, Silene cretacea, Silene hellmannii посредством активации пазушных меристем без ущерба качеству регенерантов.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда для микроразмножения растений в культуре in vitro, включающая витамины и аминокислоты по прописи МС, сахарозу, агар-агар, дистиллированную воду, а также регуляторы роста БАП, ГК и ИУК в качестве добавок, согласно заявляемому решению содержит минеральный состав WPM, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л: БАП - 0.1-0.3, кинетин - 0.9-1.1, ГК - 0.9-1.1, ИУК - 0.4-0.6.

Заявляемая питательная среда содержит известный минеральный состав WPM, включающий в себя следующие компоненты (мг/л): NH4NO3 - 400, KH2PO4 - 170, MgSO4×7H2O - 370, CaCl2×2H2O - 96, Ca(NO3)2×4H2O - 799.5, K2SO4 - 990, H3BO3 - 6.2, MnSO4×4H2O - 22.3, KJ - 0.75, CuSO4×5H2O - 0.25, Na2MoO4×2H2O - 0.25, ZnSO4×4H2O - 8.6, FeSO4×7H2O - 27.8, Na2EDTA×2H2O - 37.3. Состав содержит витамины и аминокислоты по прописи МС (мг/л): мезоинозит - 100, глицин - 2.0, тиамин-HCl - 0.5, пиридоксин-HCl - 0.5, никотиновую кислоту - 0.5. Питательная среда содержит также сахарозу - 20 000, агар-агар - 8 000. Указанные компоненты растворены в дистиллированной воде. Указанный технический результат достигается внесением в заявляемую питательную среду следующего сочетания регуляторов роста: БАП - 0.1-0.3 мг/л, кинетин - 0.9-1.1 мг/л, ГК - 0.9-1.1 мг/л, ИУК - 0.4-0.6 мг/л. Полученная питательная среда условно обозначена авторами «SCS» («Silene cretacea Saratov»).

Апробирование питательных сред с различными комбинациями регуляторов роста на редких и исчезающих видах растений, в частности, некоторых кальцефильных видах растений (Centaurea ruthenica Lam., Globularia punctata Lapeyr., Hyssopus cretaceous Dubjan., Potentilla volgarica Juz., Scrophularia sareptana Kleop.Ex Ivanina, Silene cretacea Fisch.ex Spreng., Silene hellmannii Claus), привело к следующим результатам (табл.1).

Таблица 1 - Влияние различных регуляторов роста и их сочетаний на коэффициент размножения Silene cretacea (длительность одного пассажа - 21 сутки)

Регулятор роста, мг/л Кол-во регенери-ровавших микропобегов/
эксплант, шт.
Общее состояние эксплантов
Контроль (б/г) 2.50±0.64 Все экспланты нормальные, зеленого цвета, каллус отсутствует, есть корни
БАП 0.5 7.25±3.05 Разрастание каллусной ткани, на ней - побеги с антоциановой окраской или фрагменты корней с корневыми волосками
Кинетин 0.5 - Гибель (выпад) всех эксплантов
Зеатин 0.5 2.67±1.80 Разрастание каллусной ткани, на ней - единичные побеги зеленого цвета с недоразвитыми (сильно укороченными) листьями
2-ip 0.5 0.86±0.56 Разрастание каллусной ткани, на ней - единичные побеги зеленого цвета с недоразвитыми (сильно укороченными) листьями
БАП 0.2+Кин. 1.0 4.28±2.08 Все экспланты нормальные, прочные, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
БАП 0.2+ГК 1.0 9.00±2.07 Все экспланты вытянутые, тонкие, зеленого цвета, междоузлия удлинены, каллус практически отсутствует
БАП 0.2+ИУК 0.5 4.25±1.15 Разрастание каллусной ткани, на ней - укороченные побеги зеленого цвета или фрагменты корней с корневыми волосками
Кин. 1.0+ГК 1.0 5.00±1.05 Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
Кин. 1.0+ИУК 0.5 3.57±1.34 Разрастание каллусной ткани, на ней - укороченные побеги зеленого цвета или фрагменты корней с корневыми волосками
БАП 0.2+Кин. 1.0+ГК 1.0 8.14±2.47 Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, каллус практически отсутствует
Кин. 1.0+ГК 1.0+ИУК 0.5 4.62±1.57 Разрастание каллусной ткани, на ней - тонкие и хрупкие побеги зеленого цвета
БАП 0.2+ГК 1.0+ИУК 0.5 7.00±2.22 Все экспланты вытянутые, тонкие и хрупкие, зеленого цвета, много каллуса
БАП 0.2+Кин. 1.0+ГК 1.0+ИУК 0.5(SCS) 9.37±1.22 Все экспланты нормальные, прочные, зеленого цвета, каллус присутствует только в основании побегов

Внесение данного сочетания способствует интенсивному формированию микропобегов (табл.2), легко отделяющихся друг от друга и способных сразу переходить к этапу укоренения без дополнительной стадии элонгации.

Таблица 2 - Коэффициенты размножения исследуемых объектов, полученные на питательной среде SCS (подсчет микропобегов осуществляли на 21-40 сутки культивирования в зависимости от скорости морфогенеза объекта).

Культура Кол-во регенерировавших микропобегов/эксплант, шт.
Centaurea ruthenica 9.75±1.87
Globularia punctata 4.20±1.48
Hyssopus cretaceous 7.60±0.89
Potentilla volgarica 9.42±3.19
Scrophularia sareptana 19.50±2.71
Silene cretacea 9.37±1.22
Silene hellmannii 13.85±0.17

Заявляемое изобретение «Silene cretacea Saratov» («SCS») позволяет улучшить качество и количество микропобегов.

Питательная среда для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro, включающая растворенные в дистиллированной воде витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скугу, сахарозу в количестве 20000 мг/л, агар-агар в количестве 8000 мг/л, а также регуляторы роста 6-бензиламинопурин, гибберелловую кислоту и 3-индолил уксусную кислоту, отличающаяся тем, что содержит минеральный состав Woody Plant Medium, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мг/л:

6-бензиламинопурин 0.1-0.3
кинетин 0.9-1.1
гибберелловая кислота 0.9-1.1
3-индолил уксусная кислота 0.4-0.6



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции в культуре in vitro гибели плюрипотентных стволовых клеток и клеток, отличных от кардиомиоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, путем культивирования клеточной популяции, включающей плюрипотентные стволовые клетки, клетки, отличные от кардиомиоцитов, происходящих из плюрипотентных стволовых клеток, и кардиомиоциты, происходящие из плюрипотентных стволовых клеток, в гипертоническом растворе, содержащем сахариды (углеводы) и имеющем осмотическое давление от 370 мОсм/кг до 1000 мОсм/кг.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ закрепления плюрипотентных стволовых клеток человека на плоском носителе.

Изобретение относится к области медицины, генетической инженерии и биотехнологии. Предложен способ обеспечения безопухолевой тканезаместительной терапии на основе получаемых из взрослых соматических клеток индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), где последние генетически модифицируют при помощи искусственной хромосомы (ИХ), несущей бицистронную кассету с геном-самоубийцей и геном чувствительности к антибиотику под контролем регуляторного элемента, специфичного для плюрипотентных стволовых клеток, при этом модифицированные иПСК отбирают в присутствии соответствующего антибиотика, подтверждают отсутствие интеграции ИХ в геном иПСК, вводят в организм реципиента напрямую, без предварительной дифференцировки in vitro, через 1-14 дней реципиентам проводят 5-10-дневный курс терапии индуктором токсичности продукта гена-самоубийцы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к предварительной оценке эффективности трансплантации аутологичного клеточного материала для стимуляции роста кровеносных сосудов, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ закрепления плюрипотентных стволовых клеток человека на плоском носителе.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для анализа локализации и содержания белкового компонента в клетках млекопитающих с различным уровнем синтетических процессов.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композициям для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающим ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к ортопедии, и может быть использована для получения трансплантата для регенерации костной ткани трубчатых костей.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается перевиваемой гибридной сублинии клеток A4C2/9к SUS SCROFA. Представленная сублиния клеток A4C2/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС.

Изобретение относится к способам защиты клеток и тканей от гипоксического повреждения и может быть использовано для разработки средств защиты от повреждения при гипоксии и ишемии.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани. Далее полученные TILs аутотрансплантируют указанному пациенту. Изобретение позволяет повысить способность апоптина проникать в опухолевые клетки и оказывать онколитический эффект в отношении всех клеток опухоли. 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Раскрыт способ промотирования регенеративных процессов в культуре ткани или культуре клеток. Способ предусматривает введение антитела, которое связывается с конечным продуктом гликирования клетки. Также описано применение такого антитела для производства лекарственного средства. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выращиванию колоний клеток. Система культивирования плюрипотентных стволовых клеток состоит из соединенных между собой системы управления и блока культивирования. При этом блок культивирования содержит один или более отсеков культивирования с установленными на нем устройством введения агента, изменяющего эпигенетический статус клетки, по крайней мере, одним устройством введения, по крайней мере, одного модификатора, восстанавливающего генетический статус клетки, отвечающий за клеточный цикл, устройством введения монооксида азота, устройством введения ингибитора пролиферации и устройством введения ингибитора апоптоза. Причем упомянутые устройства выполнены с возможностью перемещения по внешней стороне блока культивирования плюрипотентных стволовых клеток и поочередного введения их содержимого в отсеки культивирования. Система позволяет выращивать плюрипотентные стволовые клетки, поддерживать их жизнеобеспечение и предупреждать канцерогенез впоследствии полученных из них дифференцированных клеток. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для лечения инфекционного перитонита в эксперименте. Для этого крысам внутривенно вводят суспензию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток из расчета 1,5×106 на 100 г массы животного в 2 мл физиологического раствора. Летальность животных в основной группе составила 27%, а в контрольной - 94%. Предложенный способ лечения инфекционного перитонита в эксперименте открывает новые возможности использования клеточных технологий для снижения летальности пациентов при перитоните. 11 ил., 1 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована в лабораторной диагностике как тест-система и способ определения антивирусной активности интерферона альфа (ИФН-α) в сыворотке крови человека. Тест-система для определения уровня активности ИФН-α в сыворотке крови человека, включает диплоидные клетки, вируссодержащую жидкость и стандартный интерферон-α (ИФН-α) человека. В качестве диплоидных клеток тест-система включает клетки охарактеризованной линии диплоидных клеток - фибробластов человека М-20 на уровне 20-33 пассажей, культивированные в среде с добавлением 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП). А в качестве вируса - адаптированный к клеткам линии М-20 вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана, при этом тест-система дополнительно включает витальный краситель на основе двух флуорохромов - трипафлавина и родамина С. Группа изобретений включает также способ определения уровня активности ИФН-α в сыворотке крови человека с использованием разработанной системы. Использование данных изобретений позволяет количественно, с хорошей воспроизводимостью, определить активность ИФН-α в образцах исследуемой сыворотки крови с помощью люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных витальным красителем на основе флуорохромов. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение касается способа получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности и маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы. Представленный способ предусматривает следующие стадии (а) получение популяции клеток, экспрессирующих маркеры HNF-3β, GATA-4, Mixl1, CXCR4, и SOX-17, характерные для линии сформированной эндодермы, и (b) культивирование популяции клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся перед культивированием предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде с добавлением активина А и лиганда Wnt и IGF-1 или инсулина, трансферрина и селена, где культивируемые клетки экспрессируют маркеры линии сформированной эндодермы и маркеры плюрипотентности. Охарактеризованное изобретение позволяет получать клетки, способные культивироваться в условиях гипоксии, не требующие линий питающих клеток, покрытий из сложных белков матрикса и сохраняющие потенциал дифференцировки. 15 з.п. ф-лы, 39 ил., 9 табл., 32 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка задепонированна в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (СХЖ РАСХН) под №89 и предназначена для репродукции вируса ящура типа А, О, С, Азия-1, CAT-1, CAT-2, CAT-3 и вируса бешенства штамм «Щелково-51», используемых для изготовления противовирусных вакцин против ящура и бешенства. Результат, достигаемый при использовании данной клеточной культуры, заключается в повышении иммуногенности, инфекционности и концентрации клеток ВНК-21/13-13 при промышленном суспензионном культивировании в биореакторах. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток фиброзированных легких в фибробластные клетки, характеризующийся тем, что из правой доли фиброзированных легких выделяют клетки с фенотипом мезенхимальных стволовых клеток (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45-), способные самообновляться in vitro в течение 60 дней, затем при добавлении в культуру мезенхимальных стволовых клеток фактора роста фибробластов 2 мкг/мл получают фибробластные клетки. Способ позволяет получить донорские клетки больных идиопатическим фиброзом из тканей фиброзированных легких. 3 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ выращивания эмбриональных стволовых клеток человека. Способ предусматривает прикрепление популяции клеток к микроносителю в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы. Далее проводят культивирование клеток, отделение клеток от микроносителя и прикрепление полученных клеток ко второму микроносителю в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы. Изобретение может быть использовано в медицине. 6 з.п. ф-лы, 48 ил., 3 табл., 11 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток или выделенных фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, включающий обеспечение внеклеточного матрикса, инкубирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани, содержащего указанные эпителиальные стволовые клетки, с внеклеточным матриксом, культивирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани в присутствии клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду для клеток животного или человека, в которую добавлены ингибитор морфогенетического белка кости (BMP) и 5- 500 нг/мл митогенного фактора роста, а также клеточная культуральная среда, ее применение, способ культивирования трехмерного органоида, способ его получения, трехмерный органоид и его применение. 9 н. и 23 з.п. ф-лы, 10 пр., 34 ил.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для микроразмножения кальцефильных растений в культуре in vitro, включающую растворенные в дистиллированной воде витамины и аминокислоты по прописи Мурасиге и Скуга, сахарозу в количестве 20000 мгл, агар-агар в количестве 8000 мгл, а также регуляторы роста 6-бензиламинопурин, гибберелловую кислоту и 3-индолил уксусную кислоту, минеральный состав Woody Plant Medium, кинетин, при этом регуляторы роста взяты в следующей концентрации, мгл:6-бензиламинопурин0.1-0.3кинетин0.9-1.1гибберелловая кислота0.9-1.13-индолил уксусная кислота0.4-0.6Изобретение позволяет увеличить коэффициент размножения посредством активации пазушных меристем без ущерба качеству регенерантов. 2 табл.

Наверх