Наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент-поликатион-полианион и способ их получения



Наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент-поликатион-полианион и способ их получения
Наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент-поликатион-полианион и способ их получения
Наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент-поликатион-полианион и способ их получения

 


Владельцы патента RU 2552340:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) (RU)
Юниверсити оф Норс Каролина (UNC) в Чапел Хил (US)

Изобретение относится к химической энзимологии, в частности к созданию наночастиц антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для медицинского применения в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион, характеризующихся тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, где в качестве поликатиона использован протамин или полиаргинин, в качестве полианиона использован блок-сополимер поли(глутаминовой кислоты) и полиэтиленгликоля (ПГ-ПЭГ), при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-70 нм. Также изобретение относится к дисперсии, содержащей наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для медицинского применения в виде полиэлектролитных комплексов типа фермент/поликатион/полианион, и способу получения такой дисперсии. Изобретение обеспечивает повышение стабильности фермента в чужеродной среде при сохранении его активности. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к химической энзимологии, в частности к созданию наночастиц антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион, которые предназначены для медицинского применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Активные формы кислорода (АФК) являются естественными продуктами метаболизма клеток. Избыток АФК и их производных образуется в результате ряда заболеваний: болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инфаркт, инсульт, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и т.д. Отдельно стоит упомянуть про процессы воспаления вообще и роль, которую играют в них АФК. Источниками свободных радикалов в зоне воспаления служат: дыхательный взрыв фагоцитов при их стимуляции, каскад арахидоновой кислоты, ферментные процессы в эндоплазматическом ретикулуме и пероксисомах, митохондриях, цитозоле, а также самоокисление катехоламинов, лейкофлавинов, гидрохинонов [Петрович Ю.А., Гуткин Д.В. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса // Патол. физиолог. и эксперимент. терапия, 1986, Т.5, С.85-92]. В очаге воспаления процессы, связанные со свободными радикалами, значительно активируются. Например, в случае контузионной травмы спинного мозга (КТСМ), известно, что свободнорадикальное окисление является одним из основополагающих факторов в патогенезе постравматической нейродегенерации и клеточной смерти [Hall E.D., Yonkers P.A., Andrus P.K., Сох J.W., Anderson D.K. Biochemistry and pharmacology of lipid antioxidants in acute brain and spinal cord injury // J Neurotrauma, 1992, V.9., P.425-442]. Взрывообразное высвобождение свободных радикалов в области травмы спинного и/или головного мозга приводит к истощению эндогенных антиокисдантов, что способствует постравматической клеточной смерти путем неконтролируемого перекисного окисления. Это является важным фактором воспаления и сопутствующего отека, который оказывает давление на нервные волокна и приводит к дегенерации и демиелинизации нервных проводников, гибелью части аксонов и глии. Предполагается, что введение антиоксидантных препаратов непосредственно после травмы, в остром периоде, способно привести к уменьшению перекисного окисления и таким образом уменьшить объем повреждения. К числу факторов антиоксидантной защиты тканей относятся ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, а также витамин К, α-токоферол, метионин и др.

Ферменты обладают высокой специфичностью и, как следствие, их антиоксидантная эффективность на порядок выше по сравнению с витаминами. Поэтому введение именно антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза) позволит нейтрализовать АФК в зоне травмы, способствуя уменьшению отека и нейродегенерации. Так как супероксид радикал лежит в основе цепочки превращений, приводящей к появлению самых различных АФК, в первую очередь использование супероксиддисмутазы (СОД) является приоритетным направлением.

Однако введение в организм нативных ферментов крайне нерационально, так как они подвергаются протеолизу и быстро выводятся из организма. Для увеличения времени жизни фермента и эффективности его транспорта в организме были разработаны самые разные подходы: конъюгация с полимерными цепями, включение в наноконтейнеры и др. Время циркуляции и стабильность ферментов в чужеродной среде может быть увеличена до нескольких часов путем их ПЭГилирования - модификации белка ПЭГ цепями [J.S. Beckman, R.L. Minor Jr., C.W. White, J.E. Repine, G.M. Rosen, B.A. Freeman. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.6884-6892; F.M. Veronese, P. Caliceti, O. Schiavon, M. Sergi. Polyethylene glycol-superoxide dismutase, a conjugate in search of exploitation // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V.54. P.587-606]. Однако такая модификация значительно понижает проницаемость ферментов через микрососуды в область повреждения [Francis JW, Ren J, Warren J, Brown RH Jr, Finklestein SP. Postischemic infusion of Cu/Zn superoxide dismutase or SOD: Tet451 reduces cerebral infarction following focal ischemia/reperfusion in rats. Exp Neurol. 1997; 146:435-443]. Кроме того, ПЭГилирование СОД ведет к образованию гетерогенных продуктов из-за большого количества доступных аминогрупп на поверхности фермента (20 лизинов для димера). Длина ПЭГ чрезвычайным образом влияет на биораспределение и времена циркуляции СОД-ПЭГ в организме, а также на антигенные и иммуногенные свойства конструкции [K. Knop, R. Hoogenboom, D. Fischer, U.S. Schubert. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives // Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6288-6308].

Другой подход заключается во включении СОД в биоразлагаемые и биосовместимые полилактогликолевые (ПЛГ) наночастицы на основе сополимера D,L-лактид-гликоля [М.К. Reddy, V. Labhasetwar. Nanoparticle-mediated delivery of superoxide dismutase to the brain: an effective strategy to reduce ischemia-reperfusion injury // FASEB J. 2009. V.23. P.1384-1395]. Однако ПЛГ матрица затрудняет доступ субстрата к активному центру фермента и имеет достаточно большие размеры (гидродинамический диаметр 290 нм, таблица 1). Кроме того, гидролиз полилактогликоля может быстро дезактивировать ферменты в матрице [W. Jiang, S.P. Schwendeman. Stabilization of tetanus toxoid encapsulated in PLGA microspheres. Mol. Pharm. 2008. V.5. P.808-817].

Для увеличения времени жизни ферментов в крови была разработана технология их включения в липосомы [M.L. Corvo, О.С. Boerman, W.J. Oyen, L. Van Bloois, M.E. Cruz, D.J. Crommelin, G. Storm. Intravenous administration of superoxide dismutase entrapped in long circulating liposomes: in vivo fate in a rat model of adjuvant arthritis // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1419. P. 325-334; B.A. Freeman, S.L. Young, J.D. Crapo. Liposome-mediated augmentation of superoxide dismutase in endothelial cells prevents oxygen injury // J. Biol. Chem. 1983. V.258. P.12534-12542]. Внутривенное введение катионных липосом, содержащих СОД, привело к частичному уменьшению объема повреждения при ишемии головного мозга у крыс, однако липосомы оказались нестабильными (период полураспада 4,2 ч) и потенциально токсичными [Imaizumi, S., Woolworth, V., Fishman, R.A., and Chan, P.H. Liposome-entrapped superoxide dismutase reduces cerebral infarction in cerebral ischemia in rats. Stroke, 1990, V.21, P. 1312-1317; Sinha J, Das N, Basu MK. Liposomal antioxidants in combating ischemia-reperfusion injury in rat brain. Biomed Pharmacother. 2001, V.55, P.264-271]. Кроме того, СОД может постепенно высвобождаться из липосом, в зависимости от их размеров, и быстро выводиться из организма (период полувыведения свободной СОД - 6 мин).

С помощью генной инженерии были разработаны конъюгаты PEP-1-СОД 1 и РЕР-1-каталаза для лечения последствий инсульта [W.S. Eum, D.W. Kim, I.K. Hwang, K.Y. Yoo, T.C. Kang, S.H. Jang, H.S. Choi, S.H. Choi, Y.H., Kim, S.Y. Kim, H.Y. Kwon, J.H. Kang, O.S. Kwon, S.W. Cho, K.S. Lee, J. Park, M.H. Won, S.Y. Choi. In vivo protein transduction: biologically active intact pep-1-superoxide dismutase fusion protein efficiently protects against ischemic insult // Free Radic. Biol. Med. 2004, V.37, P. 1656-1669]. Однако эти конъюгаты относительно нестабильны в кровотоке и могут вызывать иммунный ответ у пациентов.

Также была разработана методика получения наночастиц (нанозимов) на основе комплексов ферментов и блок-сополимеров, основанная на самопроизвольной сборке противоположно заряженных полиионов [Klyachko N.L., Manickam D.S., Brynskikh A.M., Uglanova S.V., Li S., Higginbotham S.M., Bronich Т.K., Batrakova E.V., Kabanov A.V. Cross-linked antioxidant nanozymes for improved delivery to CNS // Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2012. V.8. P.119-129]. Это простой в техническом плане подход позволяет получить стехиометрические комплексы со 100% эффективностью загрузки ферментом (по сравнению с 32% для СОД и 21% для каталазы в случае липосом [Т. Yusa, J.D. Crapo, B.A. Freeman. Liposome-mediated augmentation of brain SOD and catalase inhibits CNS O2 toxicity // J. Appl. Physiol. 1984. V.57. P.1674-1681]). Авторами была показана биологическая активность полученных препаратов в модели гипертензии, вызванной ангиотензином-II [E.G. Rosenbaugh, J.W. Roat, L. Gao, R.F. Yang, D.S. Manickam, J.X. Yin, H.D. Schultz, Т.K. Bronich, E.V. Batrakova, A.V. Kabanov, I.H. Zucker, M.C. Zimmerman. The attenuation of central angiotensin II-dependent pressor response and intra-neuronal signaling by intracarotid injection of nanoformulated copper/zinc superoxide dismutase // Biomaterials. 2010. V.31. P.5218-5226]. Для увеличения стабильности при разведении блок-иономерного комплекса в его структуру вводили ковалентные сшивки, что приводило к существенной потери активности фермента: например, для комплекса СОД/полилизин-ПЭГ выход по активности СОД составил 45% [заявка WO 2012162490 А1, опубл. 29.11.2012; заявка US 2013/0052154 А1, опубл. 28.02.2013; Devika S. Manickam, Anna M. Brynskikh, Jennifer L. Kopanic, Paul L. Sorgen, Natalia L. Klyachko, Elena V. Batrakova, Tatiana K. Bronich, Alexander V. Kabanov. Well-defined cross-linked antioxidant nanozymes for treatment of ischemic brain injury // Journal of Controlled Release. 2012. V.162. P.636-645]. Чтобы как можно меньше затрагивать активность СОД при конъюгации, авторы вводили небольшое количество ковалентных сшивок, что в итоге привело к низкому выходу по белку (около 10%). В итоге выход по суммарной активности СОД (произведение активности на выход по белку отражает эффективность всего синтеза) составил только 5%. Поэтому актуальной является проблема получения нанозимов без существенной потери активности ферментов и с высоким выходом по белку.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является получение наночастиц антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент/поликатион/полианион и, в частности, разработка способа создания дисперсии, содержащей такие наночастицы.

Предлагаемая наночастица антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион характеризуется тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-70 нм.

Такие наночастицы могут быть получены, в частности, способом, согласно которому к раствору супероксиддисмутазы (СОД) добавляют по каплям при перемешивании раствор поликатиона, затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор полианиона и выдерживают смесь при температуре 4°C в течение 8-12 часов, после чего непрореагировавшие реагенты удаляют многократным центрифугированием, используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да, с получением дисперсии, содержащей наночастицы фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион. При этом фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона. Наночастицы имеют гидродинамический диаметр в диапазоне 40-70 нм.

Предлагается также новый продукт - дисперсия, содержащая вышеописанные наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитных комплексов типа фермент/поликатион/полианион и полученная вышеуказанным способом.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявленной группы изобретений, заключается в повышении стабильности фермента в чужеродной среде, сохранении активности фермента и, как следствие, общей активности системы.

Поставленная задача решается тем, что фермент покрывается послойно положительными и отрицательно заряженными полимерами, образуя систему фермент/поликатион/полианион. Первый слой - поликатион - образует полиэлектролитный комплекс с ферментом и защищает его активный центр. Так как положительные полимеры более токсичные по сравнению с отрицательно заряженными, то вводится второй слой полимера - полианион. В результате, образуется водная дисперсия, содержащая наночастицы типа фермент/поликатион/полианион. При этом в качестве полианиона может быть использован конъюгат отрицательно заряженного полимера (полианиона) с полиэтиленгликолем или другим водорастворимым незаряженным полимерным блоком (введение в систему блок-сополимера полианион-полиэтиленгликоль) для уменьшения скорости опсонизации и увеличения времени циркуляции в крови наночастиц фермента. При таком подходе достигается большее сохранение активности фермента по сравнению с запатентованной системой фермент/поликатион (сохранение суммарной активности 5%, заявка US 2013/0052154 A1).

В качестве первого (поликатионного) слоя могут быть использованы полиаминокислоты (например, полилизин, полиаргинин, полигистидин), спермин, протамин, хитозан и другие положительно заряженные полимеры, которые основаны на мономерных звеньях, включающие: аминокислоты (например, лизин, аргинин, гистидин), виниловые мономеры (винилкапролактам, винилпиридин и др.), алкиленимины (например, этиленимин, пропиленимин, бутеленимин и др), первичные, вторичные или третичные амины, которые могут быть полностью или частично в виде аммониевой соли, и другие.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве поликатиона используется протамин.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве поликатиона используется полиаргинин.

В качестве второго (полианионного) слоя могут быть использованы отрицательно заряженные полимеры или блок-сополимеры состава А-В или В-А-В, где А - полярный отрицательно заряженный блок и В - полярный незаряженный блок (например, где В - это полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксазолин, полисахариды и др). В качестве отрицательно заряженного блока могут выступать следующие полимеры и их производные: полиаминокислоты (например, полиглутаминовая кислота, полиаспарагиновая кислота), полиметакриловая кислота, полиакриловая кислота, полилактид, карбоксилированные декстраны и другие.

Частными вариантами настоящей группы изобретений являются упомянутые выше наночастицы и способ, согласно которым в качестве полианиона используется поли(глутаминовая кислота)-полиэтиленгликоль (ПГ-ПЭГ).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ чертежа

На фигуре 1 представлены результаты стабильности дисперсий полиэлектролитных наночастиц фермент/поликатион/полианион при различных значениях ионной силы среды. Образцы: 1 - СОД/протамин/ПГ-ПЭГ в фосфатном буфере (рН 7,4); 2 - СОД/протамин/ПГ-ПЭГ в физиологическом растворе (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, 0,15 М NaCl); 3 - СОД/протамин/ПГ-ПЭГ в присутствии избытка низкомолекулярного электролита (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, 0,6 М NaCl).

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Синтез полиэлектролитных наночастиц фермент/поликатион/полианион на примере получения нанодисперсии наночастиц, содержащих фермент супероксиддисмутазу, поликатион - протамин или полиаргинин, полианион - блок-сополимер полиглутаминовой кислоты и полиэтиленгликоля.

Фермент СОД растворяли в ХЕПЕС-NaCl-буфере для получения раствора концентрацией 5 мг/мл. Затем по каплям при перемешивании добавляли раствор поликатиона (протамин или полиаргинин) концентрацией 5 мг/мл. Количество поликатиона считали как кратный избыток аминогрупп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД (частным вариантом является соотношение 2:1). Смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем по каплям при перемешивании добавляли раствор полианиона (ПГ-ПЭГ) концентрацией 5 мг/мл. Количество полианиона считали как кратный избыток карбоксильных групп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД (частным вариантом является соотношение 2:1). Смесь оставляли на 8-12 часов (например, на ночь) при 4°С. Далее свободные полимеры удаляли многократным центрифугированием (2-3 раза), используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да (800 g, 4°С, ХЕПЕС-NaCl). Полученную дисперсию полиэлектролитных наночастиц в водном растворе собирали в эппендорф, анализировали и хранили при 4°C.

Характеризация полученной дисперсии, содержащей наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса состава фермент/поликатион/полианион

Таблица 1. Физико-химические характеристики полученных наночастиц СОД в виде полиэлектролитного комплекса СОД/поликатион/ПГ-ПЭГ в сравнении с известными препаратами.

Таблица 1
Физико-химические характеристики полученных наночастиц СОД в виде полиэлектролитного комплекса СОД/поликатион/ПГ-ПЭГ в сравнении с известными препаратами
Наночастицы по изобретению(соотношение СОД/поликатион/ ПГ-ПЭГ) Выход по белку Выход по активности Суммарный выход по активности Гидродинамический диаметр, нм Индекс полидисперсности Поверхностный потенциал, мВ
СОД/полиаргинин /ПГ-ПЭГ (1:2:2) 31% 79% 25% 68±3 0,24±0,05 0,7±0,3
СОД/протамин/ ПГ-ПЭГ (1:2:2) 34% 56% 19% 47±5 0,06±0,02 -2,5±0,6
Известные
препараты
СОД/полилизин (патент US 2013/0052154 A1) 10% 45% 4,5% 30±1 0,17±0,03 -1±1
Наночастицы ПЛГ/СОД - - 75% 290 0,12 -24,5±1,8
Липосомы/СОД 10-30% 50-70% 5-20% 200-300 0,2-0,3 30-50

В Таблице 1 представлены выход по белку и выход по активности для исследованных полиэлектролитных комплексов фермент/поликатион/полианион, а также суммарная активность конечного продукта. Видно, что полученная дисперсия наночастиц имеет более высокую суммарную активность (в 4-5 раз) по сравнению с похожей системой СОД/полилизин. Размер и полидисперсность наночастиц СОД/поликатион/ПГ-ПЭГ близки к соответствующим характеристикам препарата СОД/полилизин, и значительно меньше по сравнению с ПЛГ наночастицами или липосомами, что благоприятно сказывается на биораспределении в организме. Считается, что оптимальные размеры наночастиц варьируются от 20 до 100 нм [F. Alexis, E. Pridgen, L.K. Molnar, О.С. Farokhzad, Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles, Molecular Pharmaceutics., 2008. V.5, P.505-515; S.V. Vinogradov, Т.K. Bronich, A.V. Kabanov, Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells. Adv. Drug Deliv. Rev., 2002. V.54, P.135-147].

Определение белка проводилось с помощью набора Micro BCA™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu+, образующимися путем восстановления Cu2+ белками. Предел обнаружения белка - 0,5 мкг/мл.

Анализ активности СОД в образцах проводили с использованием двух методов, в основе которых лежат реакции ингибирования автоокисления кверцетина (а) и пирогаллола (б) по известным методикам.

а) Определение активности СОД по кверцетину [Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. мед. химии. 1990. Т.36. С.88-91]. В одноразовую спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл вносили 0-40 мкл образца и 930-970 мкл рабочего буферного раствора (0,02 M фосфатный буфер, рН 7,4 с добавлением 0,08 мМ ЭДТА и 0,125% ТМЭДА). Реакцию инициировали добавлением 30 мкл раствора кверцетина в ДМСО (0,15 мг/мл) и сразу же измеряли оптическую плотность при длине волны 406 нм (D0), образец инкубировали в течение 20 мин и вновь измеряли оптическую плотность при длине волны 406 нм (D20). В контрольной кювете (без добавления анализируемого раствора) проводили аналогичные измерения - (кD0) и (кD20).

Процент ингибирования реакции автоокисления кверцетина в анализируемых пробах рассчитывали по формуле:

Варьировали объем анализируемого образца в кювете или разбавляли анализируемый раствор фосфатным буфером так, чтобы процент ингибирования реакции автоокисления кверцетина находился в диапазоне 30-55%. Концентрацию СОД, при которой наблюдалось 50% ингибирование реакции автоокисления кверцетина в реакционной среде, принимали за 1 Ед/мл. Для результатов в пределах 30-55% ингибирования проводили расчет активности. Учитывали разведение образца, если оно производилось.

б) Определение активности по пирогаллолу [X. Yi, M.C. Zimmerman, R. Yang, J. Tong, S. Vinogradov, A.V. Kabanov, Pluronic-modified superoxide dismutase 1 (SOD1) attenuates angiotensin II-induced increase in intracellular superoxide in neurons // Free Radic. Biol. Med. 2010. V.49. P.548-58]. Измерения проводили в 96-луночном планшете. Для одного образца использовали 12 лунок (один ряд). Последовательным разбавлением получали 12 точек объемом 20 мкл с концентрациями от 400 до 0,2 мкг/мл. Добавляли 160 мкл Трис-буфера и 20 мкл раствора пирогаллола (раствор пирогаллола в ацетоне 5 мг/мл, затем разбавляли в 10 раз водой). Строили график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации СОД в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимировали кривой «доза-ответ» и находили концентрацию, соответствующую 50% ингибированию (EC50, мкг/мл). Далее рассчитывали активность по формуле:

Определение размеров и поверхностного заряда образцов проводили на установке динамического лазерного светорассеяния - Zetasizer Nano ZS «Malvern Instrument», Великобритания. Аликвоту раствора исследуемого образца разбавляли до концентрации 10 мкг/мл и фильтровали через 0,2 мкм фильтр (Coming, Германия). Затем проводили измерения при комнатной температуре. Программное обеспечение, предоставленное производителем, использовали для расчета значений гидродинамического диаметра, ζ-потенциала и относительной ширины распределения частиц по размерам, равной среднеквадратичному отношению ширины распределения к среднему значению размера частиц. Средние значения гидродинамического диаметра и ζ-потенциала для всех образцов рассчитывали как минимум из трех измерений, данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение.

Стабильность полученных наночастиц СОД в виде полиэлектролитного комплекса СОД/поликатион/ПГ-ПЭГ оценивали во времени, используя метод динамического светорассеяния (фигура 1). Найдено, что частицы стабильны как минимум 90 часов в фосфатном буфере и в физиологическом растворе (рН 7,4, 0,15 М NaCl). При повышении ионной силы раствора (образец 3) частицы распадаются, что подтверждает стабильность системы за счет электростатических взаимодействий между полиэлектролитными блоками (в частности протамин и ПГ-ПЭГ).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион и продукт, представляющий собой дисперсию таких наночастиц, являются перспективными для использования в медицине, в частности для лечения заболеваний, связанных с неконтролируемым выбросом реактивных свободных радикалов. Такое взрывообразное высвобождение активных форм кислорода характерно для таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, инфаркт, инсульт, ревматоидный артрит, онкологические и аутоиммунные заболевания, различные травмы спинного и головного мозга.

1. Наночастица антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для медицинского применения в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион, характеризующаяся тем, что фермент покрыт внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, где в качестве поликатиона использован протамин или полиаргинин, в качестве полианиона использован блок-сополимер поли(глутаминовой кислоты) и полиэтиленгликоля (ПГ-ПЭГ), при этом наночастица имеет гидродинамический диаметр в диапазоне 40-70 нм.

2. Способ получения дисперсии, содержащей наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для медицинского применения в виде полиэлектролитных комплексов типа фермент/поликатион/полианион по п. 1, характеризующийся тем, что к раствору супероксиддисмутазы (СОД) добавляют по каплям при перемешивании раствор поликатиона - протамина или полиаргинина, затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего по каплям при перемешивании добавляют раствор полианиона - блок-сополимера поли(глутаминовой кислоты) и полиэтиленгликоля, и выдерживают смесь при температуре 4°С в течение 8-12 часов, после чего непрореагировавшие реагенты удаляют многократным центрифугированием, используя фильтрующие системы с пределом пропускания ультрафильтрационной мембраны 50000 Да, с получением дисперсии, содержащей наночастицы фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что используют раствор супероксиддисмутазы с концентрацией 5 мг/мл в ХЕПЕС-NaCl-буфере.

4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве поликатиона используют протамин или полиаргинин в виде раствора с концентрацией 5 мг/мл.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что поликатион используют в количестве, рассчитанном как двухкратный избыток аминогрупп по отношению к количеству карбоксильных групп в молекуле СОД.

6. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве полианиона используют блок-сополимер поли(глутаминовой кислоты) и полиэтиленгликоля в виде раствора с концентрацией 5 мг/мл.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что полианион используют в количестве, рассчитанном как двухкратный избыток карбоксильных групп по отношению к карбоксильным группам в молекуле СОД.

8. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что полученную дисперсию, содержащую наночастицы фермента супероксиддисмутазы в виде полиэлектролитного комплекса типа фермент/поликатион/полианион, хранят при 4°С.

9. Дисперсия, содержащая наночастицы антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы для медицинского применения в виде полиэлектролитных комплексов типа фермент/поликатион/полианион по п. 1, полученная способом по п. 2.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биофизики и прикладной биохимии и может быть использовано для контролируемого введения веществ в микрообъекты. Для этого вводят в микрообъект нанокапилляр, содержащий не менее двух изолированных друг от друга каналов, с последующим введением вещества.

Изобретение относится к способам получения порошков нанокристаллического диоксида титана, которые могут быть использованы для фотокаталитической очистки и обеззараживания воздуха и воды, создания фотоэлектрических преобразователей энергии, новых композиционных и каталитических материалов.

Изобретение относится к химической промышленности. Способ разделения фуллеренов включает растворение фуллеренов в о-ксилоле, высокотемпературную обработку полученного раствора при 70-90°C 60-120 минут с получением концентрата С60 и раствора, направляемого на низкотемпературную обработку при (-15)÷(-25)°C в течение 10-30 часов.

Изобретение относится к получению термостойких нанокомпозитов. В качестве исходного материала для матрицы используют гранулированный материал или тонкоразмолотый порошок диоксида титана, или диоксида циркония, или диоксида олова, или их смесь.

Изобретение относится к области изготовления наноструктур, а именно к синтезу оксидных пленок нанометровой толщины на поверхности полупроводников класса АIIIBV, и может быть применено при формировании элементов электроники на поверхности полупроводников, в высокочастотных полевых транзисторах и длинноволновых лазерах, а также в солнечных элементах.
Изобретение может быть использовано в области порошковой металлургии. Способ получения карбида титана включает нагрев шихты, состоящей из диоксида титана и порошка нановолокнистого углерода с удельной поверхностью 138…160 м2/г, взятых в массовом соотношении диоксида титана к порошку нановолокнистого углерода 68,5:31,5, при температуре 2250°C.

Изобретения относятся к нанотехнологии и могут быть использованы при изготовлении катализаторов и сорбентов. Графеновая пемза состоит из графенов, расположенных параллельно на расстояниях больше 0,335 нм, и аморфного углерода в качестве связующего по их краям, при соотношении графена и связующего от 1:0,1 до 1:1 по массе.
Изобретение относится к области производства керамических конструкционных и функциональных материалов. Для получения керамического композитного материала на основе оксидов алюминия и циркония проводят стабилизацию в тетрагональной фазе диоксида циркония механическим способом: смешивают в активаторе соль циркония и стабилизатор (соль редкоземельного элемента), затем смесь термообрабатывают при температуре 500-600°C в течение 1-3 часов.

Изобретение относится к процессам нефтепереработки. Изобретение касается способа получения высокоочищенных твердых нефтяных парафинов путем гидрооблагораживания парафина-сырца при температуре 240-380°C и давлении 20-35 кгс/см2 в присутствии каталитической системы, состоящей из катализаторов защитного и основного слоев с последующим разделением газопродуктовой смеси на жидкую и газообразную фазу и стабилизацией жидкой фазы.

Изобретение может быть использовано в производстве катодного материала химических источников тока, а также термисторов, резисторов, устройств для записи и хранения информации.

Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции, содержащей суспензию, которая включает смесь гидрофобной среды и твердой формы, где твердая форма содержит терапевтически эффективное количество октреотида и, по меньшей мере, одну соль жирной кислоты со средней длиной цепи, имеющей длину цепи от 6 до 14 атомов углерода, и полимер, формирующий матрицу, выбранный из декстрана и поливинилпирролидона (PVP), причем соль жирной кислоты со средней длиной цепи присутствует в композиции в количестве 10% по массе или более.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для ускорения заживления ран и регенерации тканей, содержащее оксиметилурацил, лоратадин, натрия альгинат, глицерин, стабилизатор, консервант и воду дистиллированную, причем компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.%.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой противовоспалительное антибактериальное ранозаживляющее средство, содержащее в качестве формообразующего агента полиэтиленоксидную основу с молекулярной массой 400 (ПЭО-400), а также полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500 (ПЭО-1500), в качестве активно действующего вещества хлорамфеникол и метилурацил, отличающееся тем, что в качестве активно действующего вещества средство дополнительно содержит рифампицин и/или циклосерин, причем содержание циклосерина в смеси с рифампицином выбрано от 18 до 82 мас.%, а компоненты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.%.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных средств для лечения дерматозов. Лекарственное средство согласно изобретению, выполненное в виде крема, содержит мометазона фуроат, консервант, гидрофильный неводный растворитель, эмульгатор 1 рода, эмульгатор 2 рода, эмолент, динатрия эдетат (трилон Б), агент, регулирующий рН, и воду очищенную в указанных в формуле изобретения количествах.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую композицию в виде геля, который включает клиндамицина фосфат, комбинацию гелеобразующего полимера и гидрофильной дисперсионной фазы, регулятор рН, аллантоин и лаурилиминодипропионат токоферилфосфат натрия, причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении в граммах на 100 грамм.

Изобретение относится к сбалансированной жировой композиции, пригодной для зондового питания. Жировая композиция, пригодная для зондового питания, содержит от 8 до 15 вес.% линолевой кислоты (LA); от 3,0 до 6,0 вес.% смеси, состоящей из ω-3 полиненасыщенных жирных кислот, альфа-линоленовой кислоты (ALA), докозагексаеноевой кислоты (DHA) и эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА), где количество ALA>2,5 вес.% и смешанное количество DHA и ЕРА≤2,5 вес.%; от 10 до 20 вес.% по меньшей мере одной среднецепочечной жирной кислоты (MCFA); и от 35 до 79 вес.% одной мононенасыщенной жирной кислоты (MUFA).
Изобретение относится к области медицины, а именно к лекарственному средству, и может быть использовано для местного лечения трофических язв, инфицированных и длительно незаживающих гнойных ран, ожогов I-II-IIIA степени, повреждений кожи вследствие травм, гнойно-воспалительных заболеваний кожи, пролежней и др.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой стабильную композиция для лечения поражений, связанных с герпес-вирусными инфекциями, в форме, выбранной из кремов и гелей, содержащих трихлоруксусную кислоту в низкой концентрации, при этом количество трихлоруксусной кислоты составляет менее чем 6% (мас./мас.) массы крема или геля.
Изобретение относится к способу получения энтеросорбента на основе глауконита и к энтеросорбенту, полученному указанным способом. Заявленный способ включает измельчение глауконита с содержанием породы от 20 до 95%, отбор фракции 1,0-10 мкм, приготовление 40-80% суспензии глауконита в воде.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственного средства в форме геля для лечения проявлений герпетической инфекции у больных с ожогами или отморожениями.
Изобретение относится к области инкапсуляции, в частности способу получения микрокапсул Биопага-Д в оболочке из интерферона человеческого лейкоцитарного (β- или α-интерферона).
Наверх