Производные индол-3-карбоновой кислоты, обладающие противовирусной активностью
Владельцы патента RU 2552422:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медицинский радиологический научный центр " Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ МРНЦ Минздрава России) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к области органической химии, а именно к аминоалкиловым эфирам 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты и их фармакологически приемлемым солям общей формулы (I), где R1 представляет собой циклогексил, C1-3алкил; R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь 1-2 заместителя галогена или С1-4алоксигруппу, или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода; n равно 1, 2, 3, 4; каждый из R независимо выбирается из С1-4алкила; за исключением соединений, указанных в формуле изобретения. Также изобретение относится к способу получения соединения формулы (I) и его применению. Технический результат: получены новые производные 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты, обладающие противовирусной активностью. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 12 пр.
Данное изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека, а именно к лекарственным средствам, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности и медицине. Более конкретно, изобретение относится к классу соединений диалкиламиноалкиловым эфирам производных индол-3-карбоновой кислоты.
Вирусные инфекции, несмотря на значительные успехи современной вирусологии и фармакологии, продолжают оставаться малоконтролируемыми инфекциями (Киселев О.И. и соавт. Пандемия гриппа 2009/2010: противовирусная терапия и тактика лечения / СПб., 2010, 97с.). Согласно данным медицинской статистики, 60-65% эпидемических инфекций имеют вирусную этиологию. Причем, перечень вирусных инфекций, способных к эпидемическому распространению, неуклонно расширяется - за последние десятилетия обнаружено не менее 30 новых патогенных вирусов, являющихся возбудителями опасных для человека заболеваний, таких как СПИД, вирусные гепатиты, энтероколиты, пневмонии и геморрагические лихорадки (Sloots Т.Р. et al. Emerging respiratory agents: new viruses for old diseases? // J. Clin. Virol. 2008. 42(3), 233-243; Kahn J.S. Newly discovered respiratory viruses: significance and implications // Curr. Opin. Pharmacol. 2007, 7(5), 478-483). Некоторые из них, такие как птичий грипп, по мнению специалистов, в настоящее время представляют реальную угрозу для человечества и вызывают особую тревогу (Perdue M.L., Swayne D.E. Public health risk from avian influenza viruses // Avian Dis. 49(3), 317-327; Liu J.P. Avian influenza - a pandemic waiting to happen? J. Microbiol. Immunol. Infect. 2006, 39(1), 4-10; Malik Peiris J.S. Avian influenza viruses in humans // Rev. Sci. Tech. 2009, 28(1), 161-173).
В качестве средств профилактики и лечения заболеваний, вызываемых вирусами, в настоящее время используют природные и синтетические соединения: вакцины, интерфероны и индукторы интерферонов, противовирусные химиотерапевтические препараты, подавляющие репродукцию вируса, и/или обладающие вирулицидным действием.
Однако в большинстве своем действующие вакцины являются узкоспецифичными. В этой связи, несвоевременность их применения и появление устойчивых штаммов в результате мутаций исходного вируса, а также несоответствие вакцины штаммам, циркулирующих во время эпидемиий, способны резко снизить эффект вакцинации (Katsunuma Т. et al. Hospitalizations associated with pandemic influenza A (H1N1) 2009 in asthmatic children in Japan // Allergol. Int. 2012. 61(1), 75-82; Blondel B. et al. Failure of the vaccination campaign against A (H1N1) influenza in pregnant women in France: results from a national survey // Vaccine. 2012. 3(38), 5661-5665; Nachtnebel M. et al. Lessons from a one-year hospital-based surveillance of acute respiratory infections in Berlin - comparing case definitions to monitor influenza // BMC Public Health. 2012, 12, 245).
Имеющиеся противовирусные химиотерапевтические препараты, подавляющие вирусную репродукцию, в том числе аномальные нуклеозиды, ингибиторы вирус-специфических белков и ферментов, в отличие от вакцин, как правило, эффективны в отношении большего круга патогенных вирусов.
Однако в ходе их применения нередко развиваются побочные эффекты и также формируются резистентные штаммы вируса, что приводит к рецидиву и обострению заболевания (Kozal M.J. Drug-resistant human immunodeflency virus // Clin. Microbiol. Infect. 2009, 15(1), 69-73; Samson M. et al. Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors // Antiviral. Res. 2013, 98(2), 174-185; Wyles D.L. Antiviral resistance and the future landscape of hepatitis С virus infection therapy // J. Infect. Dis. 2013, 207(1), 33-39).
В настоящее время число противовирусных препаратов, допущенных к клиническому применению, весьма ограничено - не более 50 (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 т., 14-е изд. / М.: Новая Волна, 2002; Brunton L., Chabner В., Knollman В. Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics / 12th ed. NY: McGraw Hill Professional, 2010, 1808), что не может удовлетворять современных потребностей в профилактике и лечении вирусных заболеваний. Более того, существуют вирусные инфекции, для лечения которых не существует специфических химиотерапевтических средств, например вирусов герпеса-6, тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), геморрагических лихорадок, оспы, птичьего гриппа, аденовирусов (De Clerecq Е. Recent highlights in the development of new antiviral drugs // Curr. Opin. Microbiol. 2005, 8(5), 552-560).
В качестве прототипа одним из наиболее удачных и широко используемых противовирусных препаратов, близких по химической структуре к соединениям, заявленным в настоящем изобретении, является арбидол (международное наименование Umifenovirum (WHO Drug Information // 2001, 25(1), 91)). Арбидол представляет собой гидрохлорид моногидрата 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола (см., например, RU 2033156). Он отличается по механизму действия от многих препаратов, применяемых в лечении вирусных инфекций, таких как амантадин, ремантадин, занамивир и осельтамивир. Арбидол оказывает специфическое противовирусное действие, ингибируя слияние вирусной оболочки с клеточными мембранами, что предотвращает проникновение вируса внутрь клеток и нарушает его репродукцию (Leneva I.A. et al. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol // Antiviral Res. 2009, 81(2), 132-140). Кроме того, арбидол усиливает общую противовирусную защиту, стимулируя выработку интерферонов и повышая активность клеточного иммунитета (Глушков Р.Г. и соавт. Механизмы иммуномодулирующего действия арбидола // Вестник РАМН, 1999, 3, 36-40). Показана эффективность арбидола в отношении вирусов гриппа А и В, включая подтипы H1N1, H2N2, H3N2 и H5N1, а также к ряду возбудителей ОРВИ - аденовирусу, респираторно-синцитиальному вирусу, коронавирусу, включая возбудителя атипичной пневмонии (Boriskin Y.S. et al. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion // Curr. Med. Chem. 2008, 15(10), 997-1005; Fediakina I.T. et al. Susceptibility of pandemic influenza virus A 2009 H1N1 and highly pathogenic avian influenza virus A H5N1 to antiinfluenza agents in cell culture // Antibiot. Khimioter. 2011, 56(3-4), 3-9; Brooks M.J. et al. Antiviral activity of arbidol, a broad-spectrum drug for use against respiratory viruses, varies according to test conditions // J. Med. Virol. 2012, 84(1), 170-181).
Недостатки: терапевтическая эффективность арбидола, как и большинства других препаратов, во многом ограничена. Значимый клинический эффект арбидола при гриппе и ОРВИ наблюдается только при его применении на ранних этапах заболевания. Кроме того, арбидол оказывает слабое противовирусное действие ко многим распространенным патогенным вирусам (например, в отношении вирусов герпеса и гепатита), и при лечении заболеваний, вызванных такими возбудителями (например, герпетической инфекции), арбидол используется в комплексной терапии, в большей степени в качестве иммуностимулирующего, а не в качестве противовирусного средства.
Ограниченность противовирусной активности арбидола во многом вызвана его физико-химическими особенностями, а именно тем, что это соединение не растворимо в воде. Низкая биодоступность и слабая проникающая способность нерастворимого арбидола в пораженные вирусом ткани могут существенно ослаблять его терапевтическую эффективность и широту применимости. Как минимум такая особенность арбидола требует для достижения значимого эффекта высоких доз препарата, что далеко не всегда допустимо и безопасно.
Более корректным решением представляется синтез близких по химической структуре к арбидолу водорастворимых низкомолекулярных соединений, обладающих противовирусной активностью. В настоящее время известен ряд водорастворимых соединений из близких к арбидолу химических классов, для которых показана активность против некоторых вирусов: замещенные 2-(5-гидрокси-2-метил-1H-индол-3-ил)уксусные кислоты и их эфиры (RU 2397975), обладающие активностью против вируса гриппа и вируса гепатита С; замещенные [4(6)-бром-5-гидрокси-1H-индол-3-ил]уксусные кислоты и их эфиры (RU 2393149), обладающие активностью против вируса гриппа; производные 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]пиримидина (RU 2456288), обладающие активностью против пикорнавирусов; замещенные эфиры 1,2,3,7-тетрагидропирроло[3,2-f][1,3]бензоксазин-5-карбоновых кислот (RU 2323221), обладающих активностью против вирусов гепатита и SARS.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в синтезе новых низкомолекулярных соединений, обладающих высокой противовирусной активностью, которые могут быть использованы для создания эффективных лекарственных средств, способных расширить возможности терапии вирусных заболеваний.
Сущностью изобретения является синтез и применение в качестве противовирусных средств в отношении вирусов энцефаломиокардита и герпеса аминоалкиловых эфиров 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты общей формулы (I)
в которой:
R1 представляет собой циклогексил-C1-3алкил, фенил, в котором заместители выбраны из атомов галогенов, C1-4алкила, C1-4алкоксигруппы, нитро, циано;
R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь заместители галогена, C1-4алкил, C1-4алкоксигруппу, или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода, который может быть замещен C1-4алкилом;
n равно 1, 2, 3, 4;
каждый из R независимо выбирается из C1-4алкила или оба R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-7-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода.
Изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям соединений формулы (I), таким как моногидрохлориды, дигидрохлордиды, гидробромиды, дигидробромиды, мезилаты, ацетаты, салицилаты, оксалаты, которые могут быть получены обычными методами, например, обработкой соединения формулы (I) соответствующей кислотой.
Основой получения аминоалкиловых эфиров 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты формулы (I) согласно изобретению является способ, заключающийся в том, что хлорангидрид общей формулы (II)
в котором R1 и R2 определены выше, подвергается взаимодействию с аминоалканолом общей формулы HO(CH2)nN(R)2 , в которой R и n определены выше.
На схеме 1 показан способ получения соединения формулы (I) со значением R1 - циклогексил, R2 - фенилтио.
Согласно указанной схеме могут быть получены и другие соединения формулы (I) со значениями R1, R2, R и n, определенными выше. Приведенные ниже примеры подробно описывают, но не ограничивают данное изобретение.
Промежуточный 6-бром-5-гидрокси-2-метил-1-циклогексил-3-этоксикарбонилининдол (соединение IV) получен бромированием соединения (III) бромом в кислой среде или бромсукцинимидом в органическом растворителе.
Пример 1. 6-Бром-2-метил-5-метокси-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндол (V)
К раствору 4,23 г (0,011 моля) 6-бром-5-гидрокси-2-метил-1-циклогексил-3-этоксикарбонилининдола (IV) в 22 мл диоксана добавляют 22 мл 10% раствора едкого натра, затем при комнатной температуре прикапывают 3 мл диметилсульфата при перемешивании. Продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную массу выливают в воду, охлаждают, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и перекристаллизовывают из этанола. Выход 3,88 г, TПЛ 142-143°C (из спирта).
Пример 2. 6-Бром-2-бромметил-5-метокси-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндол (VI)
Смесь 1,78 г (0,01 моля) бромсукцинимида, 0,1 г перекиси бензоила и 3,88 г (0,01 моля) 6-бром-2-метил-5-метокси-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндола (соединение V) в 25 мл четыреххлористого углерода при освещении кипятят 5 часов. После отделения сукцинимида в горячем виде и охлаждения осадок отфильтровывают. Выход 4,18 г, TПЛ 173°C. Используют в следующей стадии без кристаллизации.
Пример 3. 6-Бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндол (VII)
К раствору 0,5 г едкого калия в 13 мл спирта добавляют 0,91 мл тиофенола, затем при перемешивании раствор 4,18 г (0,0085 моля) 6-бром-2-бромметил-5-метокси-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндола (соединение VI) в 35 мл бензола и оставляют на ночь. Отфильтровывают бромид калия. После отгонки бензола добавляют спирт, осадок промывают водой. Выход 4,3 г, TПЛ 93-95°C.
Пример 4. 6-Бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексилиндол-3-илкарбоновая кислота (VIII)
Раствор 2,01 г (0,004 моля) 6-бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексил-3-этоксикарбонилиндола (VII), 2,0 г едкого натра, 1,2 мл воды и 12 мл этанола кипятят 1 час. После охлаждения и подкисления концентрированной HCl, осадок отфильтровывают, промывают водой. Выход 1,82 г, TПЛ 224°C.
Пример 5. Хлорангидрид 6-бром-5-метокси-2-феншггиометил-1-циклогексилиндол-3-илкарбоновой кислоты (IX)
К раствору 0,66 г (0,0014 моля) 6-бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексилиндол-3-илкарбоновой кислоты (VIII), 0,6 мл хлористого тионила в 6 мл диоксана добавляют 1 каплю диметилформамида и греют на водяной бане до исчезновения исходного (VIII). После упаривания в вакууме продукт используют в следующей стадии без очистки.
Пример 6. 6-Бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексил-3-(2′-диметиламиноэтокси)карбонилиндол (X)
К раствору 0,0014 моля хлорангидрида 6-бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексилиндол-3-илкарбоновой кислоты (IX) в 5 мл бензола добавляют 0,25 г (0,0028 моля) 2-диметиламиноэтанола. На следующий день после упаривания в вакууме добавляют спирт. Осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из изопропилового спирта. TПЛ 132-134°C.
Гидрохлорид соединения (X) получают добавлением эфирного раствора HCl к раствору основания в ацетоне, TПЛ 198°C.
Аналогично получают:
- гидрохлорид 6-бром-2-метил-5-метокси-1-циклогексил-3-(3′-диэтиламинопропокси) карбонилиндола (XI), TПЛ 190°C (из изопропилового спирта);
- гидрохлорид 6-бром-5-метокси-1-циклогексил-2-фенилтиометил-3-(3′-диэтиламинопропокси) карбонилиндола (XII), TПЛ 188-190°C.
Из исходных соединений 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-этоксикарбонилиндола и 6-бром-2-диалкиламинометил-1-метил-5-метокси-3-этоксикарбонилиндола (Трофимов Ф.А., Цышкова Н.Г., ХГС, 1973, №3, 308-311.) после получения из них соответствующих кислот и хлорангидридов в качестве промежуточных продуктов (аналогично Пр.4 и 5), получены следующие соединения.
Пример 7. 6-Бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометилиндол-3-илкарбоновая кислота (XIII)
Раствор 5,0 г едкого натра, 3,8 г (0,009 моля) 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-этоксикарбонилиндола, 3 мл воды и 100 мл спирта кипятят 3 часа. После охлаждения и подкисления концентрированной HCl осадок отфильтровывают, промывают водой. Выход 3,4 г (92%), TПЛ 213°C (с разложением, из диоксана).
Вычислено %: C 53,21, H 3.96; C18H16BrNO3S. Найдено %: C 53,37; H 3,94.
Пример 8. 6-Бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(21-диметиламиноэтокси)-карбонилиндол (XIV)
К раствору 1,05 мл (0,0027 моля) хлорангидрида (XI) в 10 мл бензола добавляют 0,48 г (0,0054 моля) 2-диметиламиноэтанола. На следующий день после отгонки бензола добавляют воду. Осадок отфильтровывают, промывают водой. Выход 1,0 г (77,5%), TПЛ 128°C (из спирта).
Вычислено %: C 55,34; H 5,28; C22H25BrN2O3S. Найдено %: C 55,24; H 5,31.
Аналогично получают:
- гидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(21-диэтиламиноэтокси)карбонилиндола (XV). TПЛ 196-198°C (из абсолютного спирта с эфиром). Вычислено %: C 53,19; H 5,58; C24H30BrClN2O3S; найдено %: C 53,09; H 5,63;
- 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(31-диэтиламинопропокси)карбонилиндол (XVI). TПЛ 75°C (из гексана). Вычислено %: C 57,80; H 6,01; N 5,39; C25H31BrN2O3S; найдено %: С 57,69; Н 6,03; N 5,39;
- гидрохлорид 1-бензил-6-бром-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(2-диметиламиноэтокси)карбонилиндола (XVII). TПЛ 185-187°C (из абсолютного спирта);
- гидрохлорид 1-бензил-6-бром-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(31-диэтиламинопропокси)карбонилиндола (XVIII). TПЛ 175-176°C (из абсолютного спирта с эфиром);
- гидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(21,41-дибромфенилокси)-метил-3-(21-диметиламиноэтокси)карбонилиндола (XIX). TПЛ 215-217°C (из спирта);
- оксалат 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(41-метоксифенилокси)метил-3-(21-диэтиламиноэтокси)карбонилиндола (XX). TПЛ 132°C.
Синтез соединений формулы (I), имеющих диалкиламинометильный радикал во 2-м положении индольного цикла, проводился по схеме 2.
Схема 2
Пример 9. Гидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)индол-3-карбоновой кислоты (XXI)
Раствор 6,0 г едкого натра, 4,1 г (0,01 моль) 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)-3-карбэтоксииндола, 3 мл воды и 60 мл этилового спирта кипятят 3 часа. После охлаждения добавляют 10 мл воды, подкисляют концентрированной HCl, осадок отфильтровывают. Выход 4,1 г (98%), TПЛ 236-238°C (из водного спирта).
Аналогично получают гидрохлорид 6-бром-1-метил-2-(1-морфолинометил)индол-3-карбоновой кислоты (XXII), TПЛ 227-228°C.
Пример 10. Дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)-3-(21-диметиламиноэтокси)карбонилиндола (XXIII)
Смесь 1,25 г (0,003 моля) гидрохлорида 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)индолил-3-карбоновой кислоты, 2 мл хлористого тионила, 1 капли диметилформамида в 20 мл диоксана греют на водяной бане 3 часа. После упаривания в вакууме осадок промывают эфиром. К полученному осадку добавляют 15 мл бензола и смесь 0,54 г (0,006 моль) диметиламиноэтанола и 0,8 мл триэталамина в 5 мл бензола и греют на водяной бане 2 часа. Отфильтровывают осадок гидрохлорида триэталамина, промывают горячим бензолом. После упаривания бензола в вакууме добавляют гексан. Осадок отфильтровывают, промывают гексаном. Выход 0,6 г (44,4%), TПЛ 120-121°C (из гексана со спиртом). Дигидрохлорид получают добавлением эфира, насыщенного HCl, к раствору основания в ацетоне, TПЛ 248-250°С (с разложением).
Аналогично получают:
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)-3-(31-диэтиламинопропокси)карбонилиндола (XXIV), TПЛ 238-240°C;
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинометил)-3-(21-диэтиламиноэтокси)карбонилиндола (XXV), TПЛ 237-240°C;
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-морфолинометил)-3-(21-диметиламиноэтокси)карбонилиндола (XXVI), TПЛ 241-242°C;
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пирролидинометил)-3-(21-диэтиламиноэтокси)карбонилиндола (XXVII), TПЛ 239-240°C (из абсолютного спирта);
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пирролидинометил)-3-(31-диэтиламинопропокси)карбонилиндола (XXVIII), TПЛ 237-239°C (из абсолютного спирта);
- дигидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(1-морфолинометил)-3-(3′-диэтиламинопропокси)карбониоиндола (XXIX), TПЛ 235-237°C.
Структуры полученных соединений подтверждены данными спектров ПМР, элементным анализом, индивидуальность - тонкослойной хроматографией на пластинках Silufol UV254.
Следующий аспект изобретения состоит в том, что соединения формулы (I) обладают высокой противовирусной активностью, что подтверждено результатами экспериментальных исследований.
Пример 11. Исследование цитотоксических свойств и противовирусной активности в отношении вируса энцефаломиокардита (ВЭМК)
Изучение специфической противовирусной активности заявленных соединений в отношении ВЭМК мышей (штамм «Колумбия SK-Col-SK») проведено in vitro на культуре перевиваемых клеток костного мозга человека больного лейкемией Л-41 (клон J-96). Клетки Л-41 в исходной концентрации 2·105 кл/мл высевались по 0,2 мл в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), глутамина (300 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл) (полная питательная среда - ППС). Культивировали клетки 24 часа при 37°C, 5% CO2 и 90% влажности до образования клеточного монослоя. Далее ППС меняли на поддерживающую среду (среда 199 с 2% эмбриональной сыворотки КРС, глутамина (300 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл) - ПС), внося в каждую лунку по 0,1 мл ПС. Затем вносили исследуемое соединение в объеме 0,1 мл в первую лунку планшета в исходной концентрации (10 мг/мл) (разведение 1:2). В последующие лунки соединение вносили в различных разведениях начальной концентрации (с шагом разведения 1:2 - и от 1/2 до 1/4096). Титрование соединения повторяли 3 раза. Через 24 часа культивирования клеток с тестируемым соединением изучали его цитотоксическое действие при различных концентрациях. Далее в каждую лунку вносили ВЭМК с исходным титром 106 ТЦД50/МЛ в разведении 10-4. Через 24 часа инкубации клеток с вирусом изучали цитопатогенное действие вируса в присутствии различных концентраций исследуемого соединения. Цитопатогенное действие вирусов и цитотоксическое действие соединений изучали визуально под инвертированным микроскопом Leitz (объектив ×20, окуляр ×10). Противовирусную активность оценивали по среднеэффективной вирусингибирующей концентрации (ЭК50) - концентрации соединения, защищающей 50% клеток от цитопатогенного действия вируса в дозе 100·ТЦД50/мл. Цитотоксическое действие оценивали по среднетоксической концентрации (ТК50) - концентрации соединения, вызывающей гибель 50% клеток. В качестве критерия специфической противовирусной активности исследуемого соединения использовали химиотерапевтический индекс (ХТИ), равный отношению ТК50/ЭК50.
Результаты экспериментов показали, что практически все исследованные соединения формулы (I) проявляли противовирусное действие в отношении ВЭМК (Табл.1). Причем значительная часть протестированных соединений (в первую очередь, водорастворимые - XI, XIV, XIX, XXIV) оказывала эффективное вирусингибирующее действие при концентрациях на 1-2 порядка ниже, чем арбидол. Сопоставление противовирусной активности и токсичности по химиотерапевтическому индексу показывает, что в ряду исследованных веществ имеется несколько соединений (ХТИ>4), которые согласно действующим рекомендациям по изучению потенциальных противовирусных средств (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / М.: Гриф и К., 2012, 944 с.) можно считать перспективными для дальнейших детальных исследований в опытах на животных.
| Таблица 1 | ||||
| Показатели токсичности и противовирусной активности заявленных соединений в отношении вируса ЭМК | ||||
| Соединение | Растворимость | ТК50, мкг/мл | ЭК50, мкг/мл | ХТИ |
| XI | + | 4,89 | 0,61 | 8 |
| XIV | + | 9,77 | 2,44 | 4 |
| XVIII | + | >10000 | 2500 | >4 |
| XIX | + | 39,06 | 9,77 | 4 |
| XXIII | + | 156,25 | 39,06 | 4 |
| XXIV | + | 39,06 | 4,88 | 8 |
| XXV | + | 156,25 | 39,06 | 4 |
| XXVI | + | 156,25 | 39,06 | 4 |
| XXVII | + | 78,13 | 19,53 | 4 |
| Арбидол | - | >10000 | 78,13 | >128 |
Пример 12. Изучение специфической противогерпесной активности
Оценка специфической противовирусной активности заявленных соединений в отношении вируса герпеса 1-го типа (штамм VR3) проведена на перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки Vero. Клетки высевались в концентрации 1,5·105 кл/мл по 1 мл в 24-луночные культуральные планшеты в среде состава: 2/3 среды Игла MEM, 1/3 среды ДМЕМ, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением гентамицина (15 МЕ/мл). Культивировали клетки 24 часа при 37°C, 5% CO2 и 90% влажности до образования клеточного монослоя. Далее в лунки вносили по 1 мл вируса герпеса 1-го типа (VR3) в разведениях 10-3-10-7 (исходный титр 107 ТЦД50/МЛ). Одновременно в опытные лунки вносили исследуемое соединение в различных концентрациях. В контрольные лунки вносили в том же объеме раствор плацебо. Через 24 часа инкубации клеток с вирусом и тестируемым соединением подсчитывали число симпластов в контрольных и опытных лунках. Специфическую противогерпесную активность соединения оценивали по подавлению образования симпластов, рассчитывая индекс ингибирования (ИИ):
где a и b - число симпластов в контрольных и опытных лунках, соответственно.
Результаты экспериментов показали, что соединение подавляет симпластообразование, индуцированное в клеточной культуре вирусом простого герпеса 1-го типа (Табл.2). Причем эффективная противогерпесная активность исследованных соединений наблюдается при тех же концентрациях, как и специфическая активность против ВЭМК (Табл.1). Это позволяет ожидать у соединений формулы (I) наличие широкого спектра противовирусной активности.
| Таблица 2 | ||||
| Показатели антигерпесной активности заявленного соединения | ||||
| № опыта | Соединение | Концентрация, мкг/мл | Число симпластов | ИИ, % |
| 1 | XXV | 100,0 | Токсично | - |
| 5,0 | 42 | 59 | ||
| 2,5 | 88 | 14 | ||
| 0,5 | ≥100 | - | ||
| 0,25 | ≥100 | - | ||
| Контроль | - | 102 | - | |
| 2 | XXV | 10 | 29 | 62 |
| 5 | 47 | 38 | ||
| Контроль | - | 76 | - |
В приведенных примерах последовательного изучения противовирусной эффективности исследуемых веществ представлены 2 этапа: первый - этап первичного отбора (пример 11), когда исследуемые соединения подразделяются на активные и неактивные с одновременным исследованием цитотоксичности в клеточной культуре; и второй этап - когда вещества, проявившие активность на первом этапе, изучаются дополнительно в тестах специфической активности (Пример 12). Технический результат достигается тем, что в результате проведенных исследований была выбрана группа водорастворимых соединений аминоалкиловых эфиров 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты общей формулы (I) с противовирусной активностью. Низкая токсичность, водорастворимость и высокая биодоступность таких соединений в сочетании с широким спектром противовирусной активности делает их перспективными для разработки лекарственных средств для профилактики и лечения широкого спектра вирусных заболеваний. В то же время одно из изученных соединений (XXV) обладает высокой специфической активностью в отношении вирусов группы герпеса с индексом эффективности не менее 60%.
1. Аминоалкиловые эфиры 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты общей формулы (I) или его фармакологически приемлемые соли:
в которой:
R1 представляет собой циклогексил, C1-3алкил;
R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь 1-2 заместителя галогена, или С1-4алкоксигруппу или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода;
n равно 1, 2, 3, 4;
каждый из R независимо выбирается из С1-4алкила;
за исключением:
оксалата 6-бром-1-метил-5-метокси-2-(41-метоксифенилокси)метил-3-(21-диэтиламиноэтокси) карбонилиндола;
6-Бром-1-метил-5-метокси-2-(1-пиперидинилметил)-3-(21-диэтиламинопропокси) карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-2-фенилтиометил-1-циклогексил-3-(2'-диметиламиноэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-фенилтиометил-3-(2'-диизопропилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-(1-пиперидинилметил)-3-(2'-диэтилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-((4-метоксифенокси)метил)-3-(2'-диэтилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-((4-морфолино)метил)-3-(2'-диметилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-(1-пиперидинилметил)-3-(2'-диметилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-((4-метоксифенокси)метил)-3-(2'-диизопропилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-((4-метоксифенокси)метил)-3-(2'-диэтилпропокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-фенилтиометил-3-(2'-диэтилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-5-метокси-1-метил-2-((2,4-дибромфенокси)метил)-3-(2'-диметилэтокси)карбонилиндола;
6-Бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(31-диэтиламинопропокси) карбонилиндола;
6-Бром-1-метил-6-метокси-2-фенилтиометил-3-(21-диметиламиноэтокси)карбонилиндола.
2. Соединения по п.1 в виде фармакологически приемлемых солей, таких как моногидрохлориды, дигидрохлордиды, гидробромиды, дигидробромиды, мезилаты, ацетаты, салицилаты, оксалаты.
3. Способ получения соединения формулы (I)
заключающийся во взаимодействии хлорангидрида общей формулы (II)
с аминоалканолом общей формулы HO(CH2)nN(R)2, где R1 представляет собой циклогексил, С1-3алкил;
R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь 1-2 заместителя галогена или С1-4алкоксигруппу, или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода;
n равно 1, 2, 3, 4;
каждый из R независимо выбирается из С1-4алкила.
4. Применение соединения формулы (I)
в которой
R1 представляет собой циклогексил, С1-3алкил;
R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь 1-2 заместителя галогена или С1-4алкоксигруппу, или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода;
n равно 1, 2, 3, 4;
каждый из R независимо выбирается из С1-4алкила в качестве действующего вещества в фармацевтических композициях, предназначенных для профилактики и лечения вирусных заболеваний.
