Аттенуированный штамм вируса сендай


 


Владельцы патента RU 2552487:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Объектом изобретения является новый штамм вируса Сендай Sen293nsk1, адаптированный к эффективному размножению в культуре клеток человека НЕК293. Полученный штамм вируса Сендай обладает меньшей вирулентностью для лабораторных мышей и повышенной способностью уничтожать опухолевые клетки человека. Штамм предполагается использовать для испытаний в качестве терапевтического онколитического препарата для лечения злокачественных заболеваний. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения онкологических заболеваний за счет использования непатогенного для человека мышиного вируса Сендай, обладающего усиленной онколитической активностью и усиливающего противоопухолевый иммунитет. Изобретение может быть использовано при лечении онкологических заболеваний. 1 табл.

.

 

Изобретение относится к области иммунологии, медицины, в частности к онкологии, а именно к новому штамму вируса Сендай.

Уровень техники

Во многих случаях метастатический рак остается неизлечимым заболеванием, и, следовательно, необходима разработка новых терапевтических противораковых стратегий. Идея применения вирусов для лечения злокачественных заболеваний восходит к началу XX века, когда было замечено, что у некоторых пациентов происходила спонтанная регрессия опухоли после противовирусных вакцинаций или вирусного заболевания (Mullen J. Т., Viral Oncolysis, Oncologist 7, 2002, p.106-119). В онкологию был введен термин "онколитический" вирус. Считается, что подобный вирус способен специфично разрушать злокачественные клетки и оставлять невредимыми нормальные. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую как за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, так и опосредованно, за счет стимуляции иммунной системы в процессе бессимптомной вирусной инфекции.

Терапия с применением онколитических вирусов имеет ряд преимуществ перед стандартными методами противораковой терапии. Вирусы могут быть направленно модифицированы с применением технологии рекомбинантных ДНК (Kelly E., History of oncolytic viruses: genesis to engineering, Mol. Ther. 15, 2007, p.651-659). Таким образом, можно оперативно внедрять новейшие знания в области молекулярной биологии клетки в процесс создания онколитических вирусов. Онколитические свойства вирусов могут быть также усилены методом биологической селекции, направленной на отбор штаммов, обладающих максимальной избирательностью в отношении опухолевых клеток и поражающих с большей эффективностью максимальное число типов злокачественных клеток (Beier R., Hermiston Т., Mumberg D., Isolation of more potent oncolytic paramyxovirus by bioselection, Gene Ther., 23, 2012, p.13).

Данное изобретение имеет отношение к онколитическому вирусу, принадлежащему к семейству Paramyxoviridae. Среди представителей этого семейства были исследованы в качестве противораковых агентов ослабленные штаммы вирусов кори и эпидемического паротита, а также безвредные для человека патогены животных, такие как вирус болезни НьюКастла (NDV) и вирус Сендай (SeV).

Ослабленный штамм вируса кори (MV) продемонстрировал сильную противоопухолевую активность в ряде модельных систем (Galanis E., Therapeutic potential of Oncolytic Measles Virus: Promises and Challenges. E Galanis, Clinical Pharmacology & Therapeutics, Nov. 2010, Vol.88, No. 5:620-625).

Противораковое действие вируса эпидемического паротита (род Rubulavirus) изучено меньше. Описаны три клинических испытания по лечению рака с применением вируса эпидемического паротита (Shimizu Y., Immunotherapy of advanced gynecologic cancer patients utilizing mumps virus, cancer Detect. Prev. 12, 1988, p.487-495).

Применяемый в настоящее время в производстве человеческого лейкоцитарного интерферона в качестве индуктора вакцинный штамм «Н» ВБН - Ньюкасла (NDV) является эффективным вирусным индуктором (Mogensen K.E. et al., 1977; Фролова В.М. и др., 1984). Противораковое действие вируса NDV изучается в целом ряде стран, в том числе и в России (патент РФ 2379055 С1, опубл. 20.01.2010).

В мировой практике противораковое действие вируса Сендай (SeV), также известного как вирус парагриппа мышей 1 типа, или гемагглютинирующий японский вирус, еще только начинают исследовать. Этот парамиксовирус (семейство Paramyxoviridae), принадлежащий к роду Respirovirus. Геном вируса представлен минус цепью РНК длиной 15.3 килобазы. Всего у вируса выявляется шесть генов, кодирующих белки. Из них два белка кодируют поверхностные гликопротеины HN и F, три белка кодируют нуклеокапсиды: белки NP, Р и L, и один негликозилированный внутренний белок М. Вирус SeV вызывает легко передающуюся инфекцию дыхательных путей у мышей, хомяков, морских свинок, крыс и иногда - у свиней. SeV способен распространяться как через воздух, так и при непосредственном контакте. Его можно обнаружить в колониях мышей по всему миру, но считается, что он в высокой степени безопасен для людей.

Описываемый онколитический штамм вируса Сендай был получен на основе вируса, который был выделен в лаборатории В.М. Жданова в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР от мыши в начале 60-х годов и в дальнейшем изучался как модельный патоген (Zhdanov V.M., Bukrinskaya A.G., Autoradiographic study of the penetration of Sendai virus into tissue culture cells. I. Preparation of Sendai virus labelled with radioactive isotopes, 1961, Probl. Virol., v.6, pp.588-93). Этот вирус был также передан для изучения в Институт предотвращения и контроля за вирусными заболеваниями, город Пекин, Китайская Народная Республика. Для этого штамма вируса, получившего название ВВ1, китайскими коллегами была получена полная последовательность нуклеотидов генома (GeneBank accession number DQ219803). Происхождение штамма ВВ1 и его местоположение на филогенетическом дереве других парамиксовирусов было описано Shi L.Y., A new paramyxovirus, Tianjin strain, isolated from common cotton-eared marmoset: genome characterization and structural protein sequence analysis, Arch. ViroL, 2008; v.153, pp.1715-1723). Вариант оригинального штамма вируса Сендай, прошедший неустановленное число пассажей на куриных эмбрионах в Онкологическом научном центре РАМН, был секвенирован в Новосибирском государственном университете в 2012 году (Тикунова Н.В., Кочнева Г.В., Тикунов А.Ю., Нетесов С.В., Матвеева О.В., Чумаков П.М., не опубликовано) и получил название «Московский штамм вируса Сендай» (M-SeV). Этот штамм отличается от штамма ВВ1 всего несколькими заменами нуклеотидов.

Известен штамм вируса парагриппа 1 Сендай ГКВ N 2339. Штамм селекционирован в отделении интерферонов предприятия "Биомед" им. Мечникова, типирован со штаммом вируса парагриппа 1 Сендай ГКВ N 326 и отличается от него титром инфекционной активности. Штамм используется для создания противовирусного препарата для индукции интерфероногенеза. Он депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Ивановского (патент RU 2108804 С1, опубл. 1998.04.20). В источнике не раскрывается создание противоракового препарата.

Известны две независимые линии штаммов вируса SeV: Z/H/Fushimi и Ohita M/Hamamatsu (doc.rero.ch/record/9055/files/these.pdf). Нуклеотидные последовательности генома штаммов внутри каждой линии идентичны на 99%, в то время как родство между представителями разных линий составляет всего 89%.

Линия штаммов Z/H/Fushimi происходит от вирусов, выделенных в Японии в 1956 году. Эти штаммы непрерывно пересевали в яйцах в течение нескольких десятилетий. Они умеренно вирулентны для мышей (50% летальной дозы [LD50]=103 до 104 БОЕ).

Штаммы линий Ohita M (SeVM) и Hamamatsu исходно высоко вирулентны для мышей (LD50<102), однако после 30 пассажей на куриных эмбрионах происходит их аттенуация и утрата вирулентности (Kiyotani K., et al., Attenuation of a field Sendai virus isolate through egg-passages is associated with an impediment of viral genome replication in mouse respiratory cells, Arch. Virol., 2001, v.146, pp.893-908).

Ряд работ, проведенных в Японии, показал, что ослабленный генно-инженерными методами непатогенный для грызунов вирус может интенсивно распространяться в опухолевых клетках, не затрагивая окружающие их нормальные клетки. Такое распространение приводит к ингибированию роста опухоли у мышей. Среди испытанных моделей ксенотрансплантатов были клетки фибросаркомы, панкреатической эпителиоидной карциномы и клетки рака толстого кишечника человека (Kinoh H., et al., Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrix metalloproteinases. Gene Ther., 2004, v.11, pp.1137-1145).

Задачей изобретения является получение штамма вируса Сендай, максимально пригодного для использования в качестве онкологического препарата. Эта задача решается путем получения штамма вируса Сендай, адаптированного к росту в культуре клеток человека. Адаптация к росту в культуре сопровождается увеличением репликативного потенциала вируса при заражении клеток человека и утратой вирулентности для лабораторных животных. В процессе адаптации наблюдается повышение онкоселективности вируса, заключающееся в приобретении большей избирательности в отношении широкого спектра опухолевых клеток человека по сравнению с культурами нормальных клеток человека. Селекция нового варианта штамма вируса Сендай проводилась путем 20 адаптационных пассажей на клетках НЕК293, в процессе которых происходило повышение репликативной активности вируса, проявляющейся в 30-50-кратном увеличении титров вируса на завершающих пассажах, по сравнению с титрами вируса, получаемыми на клетках НЕК293 при заражении равными дозами препарата вируса Сендай (Московский штамм М-SeV), полученными на куриных эмбрионах. Полученный новый аттенуированный штамм вируса Сендай получил название Sen293nsk1. Этот штамм депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора для возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов, располагающейся в ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл.) под № V-648. Штамм предназначен для создания противоракового онколитического препарата.

SeV может оказывать онколитическое действие за счет нескольких независимых механизмов. Он может напрямую убивать злокачественные клетки, реплицируясь в них. В процессе размножения SeV вызывает образование синцития из 50-100 клеток. Клетки, слившиеся в синцитий, не могут делиться и обречены на коллективную синхронную гибель. Кроме того, вирус может вызывать опосредованное иммунной системой уничтожение злокачественных клеток. Это происходит за счет активации противоопухолевой активности натуральных киллеров, благодаря усилению опухолеспецифичной цитотоксической активности Т-клеток, стимуляции антиген презентирующих дендритных клеток и подавления иммуносупрессорной активности Т-клеток. Вирус содержит в составе своей наружной оболочки фермент нейраминидазу, которая способна отщеплять сиаловые кислоты с поверхности злокачественных клеток, делая соответствующие раковые антигены более видимыми для иммунной системы.

Протокол наращивания вируса Сендай.

Наращивание препаратов вируса Сендай производится на клетках НЕК293, культивируемых на декстрановых микрогранулах Cytodex. Клетки НЕК293 представляют собой иммортализованные клетки почки зеленой обезьяны Cercopitecus aethiops (Graham F.L., et al., Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5, J. Gen. Virol., 1977, v.36, pp.59-72). Они сертифицированы для производства вирусных препаратов, применяемых в качестве вакцин. Клетки хорошо поддерживают монослой после достижения конфлуентности, что позволяет многократно собирать урожай вируса. Это монослойная культура, которая также способна расти на поверхности декстрановых микрогранул Cytodex. Культивирование на гранулах Cytodex характеризуется максимальной экономией среды и позволяет наращивание клеток и получение вирусного препарата в суспензии в колбах при перемешивании с помощью магнитных мешалок.

Для пересаживания клеток на гранулы, выросшие в монослойной культуре клетки подвергают обработке 0.2% раствором трипсина, приготовленным на фосфатном буферном растворе, содержащем 0.1% EDTA. После подсчета клеток в гемоцитометре 106 клеток помещают в 10 мл культуральной среды MEM в модификации Дульбекко с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, содержащей 1% суспензию гранул Cytodex (GE-Healthcare, США). Суспензию помещают на магнитную мешалку в закрытой колбе и инкубируют при 37°С. Через 2 суток происходит зарастание поверхности гранул монослоем клеток НЕК293, что контролируется микроскопией.

Перед заражением вирусом гранулы промываются средой без сыворотки. Гранулы инкубируют в 1/10 исходного объема в среде без сыворотки с добавленным препаратом вируса Сендай (100 физических частиц на клетку). Адсорбцию вируса проводят в течение 30 минут, после чего клетки повторно отмывают средой без сыворотки и помещают в колбы со средой, содержащей 1% эмбриональной сыворотки и 10 мкг/мл трипсина. Добавление трипсина требуется для эффективного созревания инфекционного вируса Сендай, которое требует экзогенной протеазной активности для расщепления F-белка (Heminaway В. R., et al., Role of basic residues in the proteolytic activation of Sendai virus fusion glycoprotein, Virus Res., 1995, v.36, pp.15-35). Контроль развития инфекции производят ежедневно путем визуального осмотра под микроскопом. Сбор вируса производят на третьи-четвертые сутки после заражения, когда образовавшиеся синцитии начинают подвергаться апоптозу. Титр нарабатываемого вируса определяют в реакции гемагглютинации.

Морфологические свойства штамма

При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы, размером 90-100 нм, морфологически тождественные представителям SeV. He патогенен для человека, для потенциально восприимчивых лабораторных животных (мыши линии Balb/c) не вирулентен (LD50>105 БОЕ).

Определение нуклеотидной последовательности

Известно (Lamb R.A., Parks G.D., Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields Virology. 2007. 5th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, pp.1449-1496.), что геном вируса Сендай включает 7 генов, кодирующих вирусные белки (Таблица 1).

Последовательность нуклеотидов штамма Sen293nsk1 приведена в Приложении.

Проведенный сравнительный анализ генома штаммов вируса Сендай, исходного M-SeV и адаптированного Sen293nsk1, позволил заключить, что новый предложенный штамм характеризуется 10 нуклеотидными заменами, которые располагаются в кодирующей области, причем 6 из нуклеотидных замен сопровождаются изменениями последовательности аминокислот аминокислотных вирусных белков. Изучение различий между вирусными белками различных штаммов вируса Сендай показало, что все замены приводят к изменениям класса аминокислоты. Стоит отметить, что одна аминокислотная замена обнаруживается в белке F (валин заменен на метионин), а пять замен приходится на белок HN. Таким образом, все аминокислотные замены сосредоточены в вирионных белках, расположенных на наружной оболочке вируса, что может изменять эффективность проникновения вируса в клетки.

Полученный штамм характеризуется высокой репродуцирующей способностью, безвредностью, отсутствием контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм обладает повышенной репродуктивной и онколитической активностью. Штамм может найти применение для производства онкопрепарата, который позволит повысить эффективность лечения онкологических заболеваний за счет непосредственной гибели злокачественных клеток под действием вируса, а также стимуляции противоопухолевого иммунитета

Приложение

Последовательность нуклеотидов штамма Sen293nsk1 вируса Сендай

TAA ATT TCC TTG TCT CTT TGT AAG TTT TTC TTA CTA TTG TCA TAT 45

GGA TAA GTC CAA GAC TTC TAG GCA CCG TGC ACC CTA ACT CAC CCC 90

GCA TGA TAA TGA TTA CTT ATT CCG AGC CGT CAT ATG GCT CGA TGT 135

CAT CCA ACG ATC CAT CAT CAA CCA CGG TCA TGT ACT CAT TAT GCC 180

TGG CTC CGA ACA TCT TGA CAG CTC CTA AAA TCT TCA TCA AAA TCT 225

TTA TCT CTT TAG TGA GGA ATC TAT ATG TTA TAC TAT GTA TAA TAT 270

TCT CAA ACC TAT CTA ATA CAG TTT TTG TGA TAA CCC TCA AGT TCC 315

TGA TTT CAC GAG ATG ACA GTG AGA CTA TCC CCA ATT GAA GTC TCG 360

CCT CAA ACT TCT GGT CAG GGA ACG ACC CGG TTA CCA GTC TTG TAG 405

ACA TAG ATA ATG ATA TCC AAG ACA ACA CAA GTC TCC TGG AGA TTG 450

TCT TTA ACT TGC CTG AGT CTC TAA CAG GGT ACA AGT CAT ACT TAC 495

CGG TCA GTT TGA GCC TCT TGT CTG ACT CGA TTA TTC TGG CCC ATT 540

CAA AGA TTG TAT CCT TTA AAA CTC TAT TGA AAG CTG TCA TGC AGT 585

TGT GTG TGT CAG CTA TGT TCA TGG TGG ACA AGA AAT CCC TGC TCA 630

ATT TAT ATA AGT TGG GTT CAA AAC CAA ACG TTT GTA GCG CCT GGT 675

GGT AAG GTC TAA GCA TCC CTG ACG ACG AGC TTC CTT CTC TTA ACT 720

CTC GGG TAA CCC ATT CGT GAG CCT TTG CTT TCT CTA TTA GGA TCC 765

ACT TTT CTA TCT TGA TGC TAT CTC CCT TCG ATA GAG GGT TGA GAC 810

TGG CCA GCA CTG TCT TGC TAT CTT CTA TAA TAT CAG ACT TAG GGT 855

GCC GTG ATA GTA GAT ACA TCT CTG CAG AAG CAG GAT TAG ATG TTT 900

TAA GTA CAA CCA AGT TGA CCT CAT CCC AGT ACC TCA GGT ATA GGC 945

TAA GCT GCC TGG TCC AAT CTG TGC CCA GCT TAG GAG CAA TCT TGC 990

TTA TCA GCA CAA CGT CTC GAT CCC CCA CCA GAT ACG CGA TCC TGA 1035

TCA CAC TGT AAT GCT CAT GCA GTA CAA CTT GAT CAT CCT TAT GGT 1080

CCC CTC CCT CCA TGT CGC AAT GGA CTA GAC CTA TCG AGC TAT TCT 1125

GCA GTT CAT TCC AAA TCA AAG CCT CAC ACT CAT CAT TCC CAA TCC 1170

ATG TCG AGC CAG GAT TTC CGT TGA ACA ACA CCT TAA CTC TCT GAC 1215

CCA GAC TAG TAA CAT TGT TTA GTT TCT TCC CCA CTA ATG CCA CCT 1260

CAG CAG GAT ATA TAT TTA ACT CTC TCT GCC CAT TGA CAT CAC AAG 1305

AGT ATA CTC CCG AGT TAT AAT AGT TGA TGC ATG GGC CAA GAG TAG 1350

CGT CAT AAC AGG AAA GCA TAG CCC CGG CTC CTT CCC CTA AAA ACA 1395

GCC TGT CCT TAT CCT TGT CAA CCA AAG GGC TTA ATA AGT AGG TAA 1440

GTT CAA GCG CCT TCA AGC AGC TAG TGC TGT TAA TAC CAA AGA GCC 1485

TCA GCT GGT GAG ATA GGT ACC TTC CAT CGA ATG GTA ACG TCA GAC 1530

CAA CAC CTG ATC TGC CTA CCT CTC CTT TTG TGA TCT CCT CGT ACC 1575

CCC GTA GAC GCA GTA CCT GTG ACT TGG ATA CTC TCA GCC CCC AAA 1620

AGG GGG CCC TAG TCT GAT GTC CTA AGG GAA TAT TCT GTT GTA TTT 1665

CTG CCG CGA TGC CGT CTA GCA GTG CAT TAT CCG CAT CGG GAT CCC 1710

AAT CCT CTA AGA CTT CGG GGA CTC CTA TAC CTC TCG TTC TTA ATA 1755

CTT TTA TAG ATG ACT TCC GGA TGT AGG TCA GAG TTG ACG GGA ATA 1800

CTT TGA TGA CTA AGC CAG TCA ATT GAC TGT ACC TCA GTA TAG GGT 1845

CAT CAA GAA ATG TGA GTT CCA GAT AGC TCT TTA AAG AGT CTA GCC 1890

TCT CAA GGG ATG TCA TTG ATT CTA GTC TTG GCC CAT CCC TAG ATA 1935

TCT CTG CCA AGC TGC ACA GGT ATG CAA GAT GTC TAG CCA AGA AAG 1980

AGG ACC TCC TCA TGT CAG CCA CAT CTG GGT CAT TAT CAC AGA TAA 2025

AGA CCT CAA GCG GTA CAC CCC CTT GCC AGT CAT GCA TAA ATA GAT 2070

CTA CAG AAT ATT CAC ATA CAG AGA GGG CCA GGA GTG TCT TAT CCT 2115

GAT TTG AGA GGT TAG GCC CAT ACA CAG GTT CTA CAA CAC CTG CAT 2160

TCC AAA ATC GCT TGA AGA TCT TTG GAT GGG ATA AAG CAT TAG ATA 2205

AGA CTT TCA GAA CTG CGT GGG AGG TAT CTT TCA GAA TCC GGA CTA 2250

CAT GTC CCC ATA TTT CTT CTC TCC CTC TGA TGT TCA ATC CGT AGA 2295

GTG AGT ATG CAA ACT GAT TGA CTA GGA TAC CCC CGA ATG TTG AGC 2340

AAA ATA GAG GAA CAT CAA CCA CCA TGA ACT CAG TAA TCA AGC TGT 2385

TAA CAT CGT CAT CAT TTA CTA GTG CTA TCA TCT CTT TTA GAT TGT 2430

CTC TAT CTA ATT GAG ACA TTG TGT CGG CTA TTG TCA TTG CAG TAC 2475

ATA TGC TGG TCG CCC TGA TGA CTT CGT CAT CCG ACC AAT AAG TCA 2520

TGT CAA CTG TAT GTA CGA CAT CTC TGA CCT TGC TAA ATA GCT CAA 2565

GGT CCA CAT CCT TGA GTG GAT CAG GGT CAT AGA TCA ATT TAT TGT 2610

TTT CCT GTG TGA TCT CCA AAT CCA GTG TAG ATC TTG GAG GGA TAT 2655

TTG CCT CCT GTG GGG ACT CCA TTA TAC AGC ACC CGT TAT TAA GAT 2700

GTA AGT GTA ATA TCA GTG GCT TCT CTA AGG AAC CTT TCT TAT ACC 2745

TCA TAT TGA ATT CGA ACA AGC TTA GCC CAG TTA GCA TAA TCT GCT 2790

GAT ACA CGA GAT TAG TGT CCT TCG ACT CTC CTG CTT CCT TGA GTG 2835

CCA TGT TGT CAT TTG ATA TTG TTA TGA ACC GAC TTG CAC GGA CCA 2880

GTG TTG CAC TGG AGA ACT TCA TCT GGG TTG CTG TGT CCT TTA ACC 2925

TAT GAG AGA GAT TCG TGG ATG TTG AAA CAG GAG TCA GCA GTT TTA 2970

GAT TTT CCA GGC TCA GAT TAG CTC TTG TTT GGG CTA TGA GAG CAG 3015

CTT CCA TCC ACG ATA CCT CAT CGG TCC CGT AGG CCC ACG TGT ACA 3060

CCA TAG CTA TCC GGA TAG CTG CCT TTG CTG GTT TGC TTA GAT TCC 3105

TTA CGT ATC CAA GTT GAG CTT CCG ATC TTT CAT CAG TGG CTG ATC 3150

CGA AGT AGG GAA TCC TTA TAG CCG GGC TCC CGT TTG TAA GTG TAT 3195

CCA AGT CTA TAT TGT CCG GGA GGT AAA ACC ATG TAT AGA TAG GGT 3240

CCG TTC CTT CAG ACC TGC AAA GCT TGC AGA CCT CCG AGC CCT CAA 3285

TAA ATG TCC CCC TCA AGA GCT CTA AAG GAT CTG GTG TTT CTA GCC 3330

CAT GTA TGG GTC TCC CAT ACG TCA GGT GGA TCC ACA TTT TCT GCC 3375

TTA AAC CGA CAG CCA GCT CAA CGG AAC ACA TAT ACT CAT ACT CAA 3420

TGT TAT CTT TCA CCG GCT TCC TGA GAG TTC TAG TCA GTG TCT CGT 3465

ACT GCA ACA GAT CAT AGT TGA CAA GTC TCC TCA ATA TCC CAT ATG 3510

ACA ACC CTC CCT TCT TAA CGC TTG CCC TCA CCA GAG ACT TGG TTG 3555

TAT CAA GCA TCC CTG CAA TTG CTT CTC TAA CCC CTG TTA AGG AAT 3600

TGC CCA GGA TCT CAT GAG CTA CTC TCG GTA GGA TGA CTT TCC GGT 3645

CCA TAA GGA ACG CGG CCA GGT TGA GAT CCT CTT CGC CAC TGG ACT 3690

CTG TGA AAA GAC CAG ACA GCA AGG GGT TCG GGG ATT CCT GCA GCA 3735

CAG ACC TAG CAG TGA TAT TCT TTA TAA TTG TAG TTA TAC TCT GGG 3780

AAT GCG GAA GGT TAC ATG AAT AGG GAT CTG AAG CCC AAT CTA GGA 3825

AGC TAG AAT CAC CGG GTT CTT GAT TCA TGA CCC TGT ACA ACA CTT 3870

GCT TAT CTA GCA GAT CCG CTC TGA TGA ACC TCT TGA GAT CGG CCA 3915

GGG CCG CTA CTG CAG GAT CCC CGA TAT TCC TGA CGA AGC ACC TAG 3960

ATG TAG ACA TGT AGT TGA ATC CCC CAA CAT TGG CCG GAA TTA ATA 4005

CTG CAC ATC TCA GCC AGT TTT TAC CCT TAA AGT ACT GAT CTC TTA 4050

CGG TCG GGT TGA TTG TTG GAT TTA TAG TCA TCC CCA GTG AAA TAC 4095

ACA CCT GCT GAC AGG TCT TGT ACA ACG CAA TGC AGT AGC CCA GTA 4140

TAG GAG AAT ACC CAT TTT CTA TGG CCT TGG CTA TAG ATG TTG AGA 4185

TAT TTG AGC AGG CAG ACC TGT TCT CAT CTA CCA ACG TCT CAG ACC 4230

AGA ATA CAC ATC TGG TCA AGG CTT TTA GAC ATT GTG GTA GGA TTT 4275

TCC CAT CAT AAT ATA TCC TTT TGC TGT AGA CAA ACA TTT TGC TAC 4320

TAA TGA TAG TCT CAT TCA ACT TTA GCT CAT GCC CTA TAT CAA ACA 4365

TGA CAT GTC TCA GAG CAC TGA AAT AGC GAG TGA TCT CTT CAT AGA 4410

CAT GAT TTT TCT TCT GCT TAT AAG TCT GGG CTA CAG GTA CCC TTG 4455

ATG TCA CCG CTA TAG CTT GAT TGT CGC CCT GGA CCA TTG CAG AGA 4500

CCC TGA CAC CCA CTC TCA CAG CTG CTA GGT GGA TAG CAC TGA TTG 4545

AGA TTA AGG TCC ATA GTT TCT GGC AAT AAC CTT CTA TTC CCC CCC 4590

TAG GAT TGT GTA TGA AGA TGC CAG AGT CTG CAT GAT CTT GCA GTT 4635

GTT GAT GCA TCC TGT CAG CGA CCG GAC AGT AAG GGT CTC CAA CAT 4680

ATA TTG TAC ACT TTT CGA GGA CTG GAT GCA TCC AGT TAA AAA AGG 4725

TCT TGA AGC CAA ATA TCT CGT TGC ACC TCT GCC CGA AAA GTG CAG 4770

TGC TCT CAA ATC TCC AAT TTA AGC AGT ACT TCT TAA GGT CTG TTG 4815

TTA GGA AGC AAC TTA ACG TCT CAT ATC CGT CTG TTG ATG AAT CTG 4860

TTG CCT TAA ATT CAT GTC TCG ATC TCT TCT TTT CGT CCC AGT ACC 4905

CCT TTG AGT TCC TCT TCC TTA TGC CTT CAT TTC TCT TCT CTG ATG 4950

ATC TAG GGT TAT TGT ACA CTG AAT CAG TCC TAG GGA CTC CTG AGA 4995

CAG AGA GGG TAG TTA GTC TTT TAA GTA AGT CTA TCT CTC CTT TTA 5040

CCA TTC CAT TCT CGC TGA ACA ATT CTC CTA TTC CTT TCG CCA GCA 5085

GTG TCT CCG CTA GTA CCT GTA CGG CCC GCA TTT TAT AAG TCA TCT 5130

TTG CGA ACA GAC GGC CCT CTT GTT TGA TCT CTT TCT CTT TCA AAC 5175

TAT ACG AGA TGT TGA ACT TCT CAT CTT TCA ACC AGT CTC CTG ATT 5220

CCA CGT AAT CTA TTA TGT CCT CTG GGT TGA AGT TCT CAT CAT TTA 5265

TAA ATA CTT CGA TGA GCC GCC TGG TCT CCT CAG ACT CTG GAA CTT 5310

TGT AGT ACA GGT TAC TAT CTG GAT ACA CAG AGT CCC ATG CCT CTC 5355

TCC TAG GCG ATA ATG CTT TGT CCT TCA TAT ATA TCG TGA GAT CTT 5400

CAT CTA GTT GTG GTT CTA TAA ACT TCC GAA ACT TGA AGC CTA TGA 5445

AAC TTG TAT AAT TGT CTA CGG CAC ACT CGT AGG AGA TAG CCG TAT 5490

TGG ACC CTT GAG CAT TTC TAA GTT CCA GGC ACA CAT GGT CAG GGA 5535

AAT CAC AGG GGG GCC ACT GTC CGC CAT GCC TTT CCC TGT ATC CAT 5580

TTA TGA TGA TTG TAC AGA ATA CTG CGT GAC ACT CGT GTA AGG TCT 5625

TAA GCT TTA TTG CCT TCT GTG CAT ACA TAT GAG CCC GTA CCT TGT 5670

CAG CTG CAG TGA CGG CCT CTA AGC TAG GAT GAC CGA ATG TCC GAA 5715

AGA ATG AAA AGA TCT CTG CTT TCT CAT CAA TAG AAG TTC CAT GGA 5760

AGA TAG CCA GTA ACG ACT CCA CAA TGG CAT CTG CCT CAG GAT CCG 5805

TAT ACA CGT CCT TGT TTG TTA AAA CAG TCT GAA GCT CTG TCA ACA 5850

CAT GCC TCA TGA ATG CAC CAC GTA GAG GTA TAA CAG GAT CAC TTA 5895

ACT GTA TAA GAG CAA GTG ATA AAG GCT CGA GTA ATG CGA TGA CAT 5940

TGT ATA TCT CTT CCC CGA GAC TCG AAA AGA GGG AAT CCA CTA GCC 5985

TCC ATA GCT CCT CCC CTT TGC TTG TTA TCC CAG AGG ACC TCT TAT 6030

CTA ACT GCC CTG CAG CAG ACA TGT TCC ACC TCC CTT CCA CAA CAT 6075

CAC AAT ACA TTA ACA CCA GCT CAG GTG TCA GAA TAT ACC CTG TCA 6120

GTG TCA ACT TAT TCA GTA TCA TGA CAA GAT CTC CAT ATG TTA CTA 6165

GAG TGT ATG ATT TGC ACT CTA GGA GAT TAT GTG AGT TGG AGG TAT 6210

CAA GAG GTC CCC CTG GCC TAG TTT TTT GCA TCC ACC GCA TGT CAT 6255

ATT TGA TAC TGA ACC AAG TTA GGA ATG GCC TAT ACC ATT TGT TCC 6300

TGC TAT ACT TAT CAG TTA TCT CAG GGA TGG TGC TAA TGT CCT GCA 6345

ATG GAT CGT ACC CCT CTC TTC CTT CTA TAT TAC CTA GTT GCT TAA 6390

AGA TAT TCA ACC AGA GAT CCT GAA ACC CAT TAG ATA ACT CCT TTG 6435

TTA GCC GAT CCG AGA CTG CGA AAA CAG ATC GGA TCT TGT CAC ATA 6480

TCT CTG GTA TAT CGA GTC TAA ATA ACT CCT GAG AAT AGG TTG GGT 6525

ACG GTT CAA ACG TGT ACC GGT CCA GAT CCT TTA TTG TGC GTT GGA 6570

GAG CCT TGC CTA GAG ATC TGA TCT TAA TTT GGC GAG GGG ATA GTC 6615

CAC CAT TCC TGA TCT TGT GTT TTG TGA TAT TGA TTA TGC TGT CGT 6660

CTT TCA GAC TAT AAG GCT GGT TAA CAT CTA ACA AAA CGT GCA GCT 6705

GTG CAA TCT TCC CCC TCA CTA TAG GGG AGT TCA GGT GAC ATT CTG 6750

GAT AGA GTA TAT CAG AAG GGT TTT GGG AGG ACT CTT GCC TGT CCA 6795

TGG CCT ATG ACA GGC TTC CCA TTC ACC CTG GGT TTT TCT TAA TAC 6840

TAT GGG AGA TGT GAG ATA CCA GGA GAT ATT GTG GAT GTA CAT TGA 6885

TGA CCC CCG TGC CAT CAA GGC CGA CCA GCC CGC TGA TTA GTG AAG 6930

TTT ATG GCT CGA CCC TGC ATA GTT TCG GGA TGC TGG TCT TAA AGA 6975

GCA TCG GTT GCA GGG TGT TCA AGC TCT TTT GGT TGA TCT CGA TGA 7020

TGT GGA AAC AGT AGC CTT TGC CAA AGT GCG TGA TGC ACG ATG TTG 7065

TGG TGT ATG CAG CCT CCA GTC GGA CGT CTT TTA TCC TCA ACA TAT 7110

TTA TAA TGT TGG TAG TGT TGG AAT ACA TGA TCG TTG GAT TAA CAC 7155

GTG AAG TGT TGG CAT ATA ACG TGA CGG TGG CTA CAT TAG CTG CAT 7200

CAG GGG ATA GGG GAT AAG CGT CGG TAT ACA CAC CTG ATA TGC ATT 7245

CCC TCG GAC AAG TAT TGT ACC AAT TGC ACT CTC CTT TTC CTG GCC 7290

TAG ACA AGG CCT CAT GAG GCG TCC AGT TGA TAG TCA AGG GGT GGC 7335

TGA TAT CAA GTA CCC CTA TCT GCA GTT GAG AGT GCC AAC CTG ACG 7380

ATC TCG TGT AGA TGT ACA CTT GAT CAC CCA ATT TTA ATA ATC TGC 7425

CCT CCG CTC CGA GGT AGT TCT GAG TGA CTG GAA TAG TTG TGA CTC 7470

TTA TCT TTG GTC TCT CTG AGA GAT AGT CGT TGA CTT GGA TGA GCA 7515

CAC TGA CCA CCT GCT TCC CCC CCA GCC ATG TAA TCT TCA GGG CTT 7560

CAT TGC ATG TGT CTT GCG ACA CCT GTT GGC ATC CTT GGG TCC TAC 7605

ACT TCG TGT CAC CTT GCA ATG GGG TGG TTA GCC CAC CAT ACC CGA 7650

GGA ACA TCA GTG AAC CTT CTG TTG CAA TGC CGC TGC CCA CAC TGG 7695

GGT ATA GTG CAG AAT ACG GGT GGT CAA AAT CTA CCT CGC TGT TGC 7740

TAT ACC GGT GGG ACT TGG TTC TTC CTT TGA GAT CTA GGA TGT CAA 7785

GGA CCA CAT CTT CTA TGC CAT CAC TTG AGT AGT CAG TTC TTT CGT 7830

CTA CGG TCG GCA TGG AGC AAA GCT GAT AAC CCC TAG TCC CGG TTG 7875

CCA CTA CCG AGC ACG ATT TCC GGT TAT CAT TGA TGT CAT AAG TGT 7920

GAG ACA CTA CTG GGT TGA GGT CAG GAA ACA TAT CTG AAT TGA GTG 7965

ATA TGT ACC CTA GCT GCA GGA CCT GAT ATG ACT TCC CAA TGT CAG 8010

TAC AGC CTT GTG TGA TGA GGT TTG ACG AAT AGG CAT AGA TCG CCT 8055

CAC CGA TTG AAA GTG AGG GGA GTC TAA CAC ATC CAG AGA TCG TTG 8100

TCG AAC CAG GCA ATA GGC TTG GAC CAG GCA ACA ATG AGA TTT CAG 8145

GGT CCG GGC TGA GAT ACG GTT CCC CTG CAG GGC ATC TCC AGA AGC 8190

TAT GTG GTT CAA GTG GGG CGA TTC CCT CAG CAT GAT GAA CTG CAA 8235

TTG TAC TAT CGC AGA GCT GCG TGA GAT CCT GTC TGT TGC ACG ACT 8280

TTT CAA TCA GCT GGG TAA CAT CTC TGC TGT TCT TGT TCA ACA AGA 8325

CAG GGA TCC CAG TTT GCA CAG AAC TCT GAA TGT TAA CGG CTC TAG 8370

TGA TAA CCT CTT GCC TTA TTA GAC TGG TGA GTG ACT CCT TTA CTT 8415

CTT TGC TAC TTA TGT TCA GTG CCT CTA TAG TTG TTG AAT ATT TTC 8460

TCA TAC TAT GCC CTT GCC TAG CAA CGA TCA CGA TGC AAA TGA TCA 8505

CTG TAG CAA TCG ACA AGG CCC ATT GAG TGA ATG CGA GAA TCA ACA 8550

ACC AGG TGT CAA TTT TAC CTG ACC TCC CCC AGT CTG ATA CTR ATT 8595

TTG TAG TGC TAC CAC TAG GGG AGG TAG ACC AAT ACG AAT CCC GCT 8640

TGC GTT TAT CAC CAT CCA TGA TCT GTA CCT GTT TGA GGT GAA AGC 8685

TAT AGT GTT AAG CGG CCC AAC TTT CAC CCT AAG TTT TTC TTA TTA 8730

TGT ACA GAC CTC AAC AAA TAC CAT ACC TAC TTT ATC AAG CAT CCA 8775

ACA AGA ATT GTG ATC ATC TTT TCC CAG TCA TAG CAT TAA ATC CAC 8820

CGT TGG TAT ACA TAT GCC TTA TCT TTG GCT CTA ATG TGT ATG TGT 8865

CTC TTG ATA CCC GAC CAG CCG GAT TAC CCG TCA GCA TTG ATC TCC 8910

TGA GCC TGT AGA GCA CGA TGA CAA TCA CTA TAA TGA CCA CTA ATA 8955

TCA CAA TCA CGA CTA CTA TGA TCG TAA TCA AAG TCG CCC CTG AAT 9000

TGT ACC ATC TAC CTA CTT CAG ATA GGA TTT TTC GTG CCC TCT CAA 9045

GCT CAA CTC TAG AGT CTT GCA GGA AAT CCG TAG CAG CAG CAA GGT 9090

TGA GAG AAA TAT CCA CGG GCC TGA TAG CGA TTG CAG GAC CAA CCG 9135

TCA AAT TCT GGA CCC CCC AAG TGG CAT CAC CCC CTT TCC GGT TAG 9180

CAT ACA ATT CTA TCC CGT TGA CTC CTA TCA GAC CAC AGT TAT CAT 9225

GGG TTA AGA ACA CCA CAC CTT TAG AGC GAT CTT GAC TGA TTG GTC 9270

TTC GGC TTA TTC CGC AGG TAC ACG AGG ATG CTA TGC AAT TAG CGA 9315

CAA CAC CTC CGT TCA CAA AGG CAA ATT TGG GGA TGA GGC TAT CCA 9360

CAA CCC TTG TGA CAG GAC ACC TTG TTG TAT CCC CCA AGA TAC ATT 9405

TTT GCT GAC TGT CAG GTA TCA ATT GTG CAG GAT CCC TGG GGC ATA 9450

TGT AGG TCA ACC TGG ACT CTA CAC AAT CGA CTA TGT TTG CAC CCC 9495

CAA GGA AGG AGG CAC GAC TGA GTA TAT GAC TGG GGA CAG TTA CAT 9540

ACC ACT CCT CCC CGT CTA TAT TAT AAG AAA TAG ACG ATG CCT TGT 9585

GTA TAA GCA CGC CTG GGA CCT CAG AAA GAA TGG GGA TCT TCA CAG 9630

ACA GGG TAA CCA TGT ATC TCT CTA GGT CTA CAT CAA TCA CAG TTC 9675

CCT TGA TCT GTT CTG TAT AAA TGA CAT CAT AGA TGT TAG ACT GCC 9720

CTG TCC TGA CAG TGG TCA TAA TCT CAG TGA TGT TAG CAG AGT AGA 9765

GTG AAG ACA GCG CCT GCA GTG TGA GGC TCT TTT CTC CGA TAG TTC 9810

CAA AAT TGG ATC CGA ATG CAG TCA GCA ACT CAG AGT AAT GTT GTG 9855

TCA GTT TTA TCC CCA GTC TTA GAG CGG CAG TTT CAC AAC CTA ATT 9900

CTC TTA TTG CGG GTT TGA TCT CAT CAT TCA CAA AAT CCT GGA GTG 9945

TCT TTA GAG CAA GAA TTT GTT CCC CCA CAG CGT TTT GCA GCA GTT 9990

CTA TGG ACT TGT GTG TTT TTG TCA TTG ATT CTT TTA TGA GTG CTA 10035

TGC CTC TCT TGG CTT CCC TCG CTT CGG CTA GCG CGA TCC CTG CGG 10080

TTA TCT GTG CTG ATG TTG CTA CTC CAA GTG CAA TGG TAC CAA TCA 10125

CGG CAC CGA AGA ATC TTG CCT GTG GAA CAC CGG CAT TTG TCA TCG 10170

TGT CAT TAG TGA CAG TTA TCA GTG CTT CCT GAA GGT CTA AGG CAT 10215

CTC TTA GTG GGA TTA ACA ACC GGT TCA GTA GGC TCT TAT ACT GGA 10260

TGA CCT GAA CAG TTC CGC ACC CAT TCT CGA GGT CAA CCC CTG GGA 10305

CTA AAC TTA GTA CGA TGT ACC TCG ATT CGT GGG ATC CAG CAA TCT 10350

TCA GTG ATT TCC CTT CAT CTA CTA TGA CCC CTA TAT TAG AGA GCT 10395

TAT CCC TAG GAA TTT GAC ACG AGG CTA GTT TTA TGA GCA CAA TTG 10440

TCA ATA ATG CAG ATA TGC ACT GTA CTC TCA GAG TGT AGG TCG CCA 10485

TGT TTC TCA GGG GAG AAG TTT TAC AAT AAG GCA CGA ACA AGG GAC 10530

TTT ATC CCT AAG TTT TTC TTA TTT GAG ACA AGG AGC AAT GCT GTG 10575

GCT CCA ACT GCA AAG TGG TGG CTG CTT AAA GTA GTG CCA CAG GTC 10620

CCT GAT AGA TGC ACA TTT ATA GCT TCC TGA TCC TTC CTA TGT TCC 10665

TTG CCA CGA CAT TAG GGT AGT AGC GGA AAT CAC GAG GGA TGG CCG 10710

GTT GGA ACA CCG CAT CAA CAT CTG TGA TCT CAA CAG ATG CAG CCC 10755

AAA TCA CCA AGT TCA TAT GAG GAT TCA CGT CCA TTA ATG GGA AGC 10800

AGA CCG CCC TCT TCC ATG CGA GCT GAC TCA TAA ATG TCT TAG ATA 10845

GGG TCC CAG TAA CCT GAA CAT GGA AAC TTA TGC CGC CGA TCA ACC 10890

CAA GGG AGA AAA TAA GCC GCA TCT TTT CAA TCT TGC TCT TGC AGT 10935

ACT CAA CGG AGT ATA TTT TCC CGA CTT TTC TTC TGA TCA ACC CAA 10980

GGT GCA CCA TGA AAT TGA GCT TCT TCT CTC CTT GAT CAT CAA GTA 11025

CCG GGA GTA CCC CCT TTT GTT CTG TGG GAA TTC CGG TCT TAA GTG 11070

TCA CTA GCA GGT TAA CAG AGA TAG AAT TAG GCA ATG CAA GGT CTG 11115

CAA GAG TTT TCG GGA TCT TGG CTA TTG TGA TTG CCC CCA GAG ATG 11160

TCC CAT TGA CAA ACA CCA CTC TGA ATC TTA TGT CCT TAT CCA CCG 11205

GGA GGC ACT GAG GGG CGA GTG CGA CCT TGT TAG CAT TAA ATA TCA 11250

TTC CCT GTC TCA GCC TGC CTG ACC ATG GTA GGA GTG GAG CAC CGA 11295

TCG AAT CCA CCA TGT ATA CTA TCA TTT CTC CTG CTC GAA CAG TCC 11340

TCC TCA CTG TAA TTT TGA GAT CGG TGC AGG CCT TTA AGA GTT CCT 11385

GAT CAG ACC CGT AAT ATT TGG CTA CAC CTA TGG GTA ACG ACC CGG 11430

ATC CGC AGA TTG AGT AGC CAG TGT GCT CTG TTA AAT CGG ACA CAC 11475

TCC CTA GGC TAG CTG TTT GTT TCG GAG TCT CAA AGA AGC CCA AGA 11520

GCA ATA AAT CTA AGT ATC TCA CTC CAT GCT TCG GAG GGT CTC CTA 11565

CCT TGA CAA TCC TGA TGT GAG GGA TAG CTT TCT TAT CTG GGC CAG 11610

TTC TTA GAG GCA GAG GTT CCA CAG TAC CGT TGT CCT CAT ATG AGA 11655

ATT TGG GGA ATT TGT AGA TGT CGG CCA TTG TGT CTT GTT GGG TGA 11700

AAT TTC TTT CAC CCT AAG TTT TTC TTA ATC TCT ACT GGC TGA TGC 11745

TAA CAA AGG ATT GGG TCG CTC CAT GAC TGA GGA TGA TTA GAT GCC 11790

TCA TCT AGT TCC TAA CCA GTC AGT GAT TCT ATG TCT TCT TCT ACG 11835

AGC TCC ATG ACT TCC TTA ACC TCT CGA TCT GTC TTG CAC TTG GAT 11880

AAC AAT TTT ACA TAT GCT GCT TTC TCA GCT CTG CTT AGG GGA CTG 11925

CTC TCT ATA ACG AGC CTG AGG GAG TGC ATT GTA GGC TTC TCC TTT 11970

GAG GGG AGC AGA CGC GAT GCG TTG GAG GCT CTG GAT TCG GTC TCT 12015

CTT TCC TGG TAC ACC GGG TTG CGG ATC TCA TCC CTA AAT TCA TCC 12060

TCT CGG AGT AGG TCC GGC TTA TAC TTC ATA TCC CCC AAG GTC TCC 12105

ATA GAC GGG TCA AAC CTG ATC ACT TTG TTC TTG CTC TCT TTT GTT 12150

TTT GCA AAG ACA GAG GGA GAT CTT GTA GGG GAA TCT GTG TTG TCG 12195

GTC TTG CCA CCT CTA TCT GTG ATG ATA TGA AGT GTA GAT AGG TTG 12240

GAC ATC AGT AAT GAG TTT TGT TCC TTC TGA TAC TCG GAG AAC CTC 12285

TTR TAT ATA TCC CGA AAT GAT TCC ACA CTT TCT TGG ATC TGT TTA 12330

AGC AGC TGT TTA TTC TCA TCT ACC CTA TTA GCG AAA GAC TTC TCG 12375

GCA GAA AGG ATT AGA CCG CAT ACA TTA AAT GTC ATC TCT GCA TAG 12420

TTT GCA GAT TTT AGG GCA CGC CTT GCA AAC ACA TAA CTC GCG TCT 12465

CGG GAT GAC TCG AAT TCT TGA GCA GAC TGG ATT ACA CCA AGA CTC 12510

TTT AAC AAT GTA GCC ATC TCT TTC ATA GAT GAT GTG CTC CCT CCT 12555

GTG CCC TTT TTT GTT GCG TCG GTC TCC GGA CCT GGA TGA GTT GGA 12600

TGA CCG TCG GCC GGA CGG TCT GGG GCA GAG CGG GTC CCT GCT GGT 12645

AGT CTC CGG TCC TTG GTC CTA ACA GCG GGG GCA TTT CTG GAG TTG 12690

GTG TAC TCA CCC TGT GTG GTT GGG GGT TTC CCT GGT GGT GAC CTT 12735

GTG CTG TTG TCA TGA CCC GGT GAT GAG GAC TGA ATG CCG GGC GCG 12780

GCC GCT GGT GTG AGG GGT CTG GAC CCA CTG TTG ACG GGT CGT CTC 12825

TTG TTC CTT TGT AGT ACA GCC TCT TCG AGC TCA GGA CTA GGG ATC 12870

ACC AAG ACT CCG GTC ACT CTT GTA CTA TGT GGG CTG CCA GAC TCC 12915

ATG CCT CTT CCA TTA TTA TCT GCT CTA CCT TCT CCT TCA TCA GGT 12960

AAG GGT GCA CTT CTT CGT ACC TCC TCT GGA AAT CCT TCA GCT TGG 13005

TCT TCT CCC CTC TTA TCA GGG TTC GCA GCC ATC TCT CGG TTT TCA 13050

TTT TCA GCA CCT GAT CTC GGA TGT CCT CCC TCA TTT GGA GGA TCT 13095

TCA AGG ATT CCG GAG TTT CCT CCA TTG CCC AGA TCC TGA GAT ACA 13140

GCG TTT GTA CCA GCT CCT CTC CCA GCG GTC CGG TGT ATA TTT TGT 13185

TTA TCA ACA TCT CTA GCA TGT GCT TCT GCC TCT GAC TTG CTT GTT 13230

CTC CCA GGG ACT CTA CTC TCC TCA CCT GGT CGA TTA TCT TGG GTC 13275

GGA GAT GTC GAG ACT TCT CCC TCC CCA TCA CTT TTG ATT CTG TAG 13320

GTA GAG CCT GGC CCT TGG AGG GTG TCG ATA GTG TTG TAG AGC CAG 13365

CTT CTG TCT CCT CCG ATT TCA GTT GGT TCA CTT GAT AGG ACT GCA 13410

TCG AGG AAT CCG ATA ACA TCC GAG AGC GAC TCT CGT CCT CCT GAC 13455

GCC TCC CTC TCA ACT TCA GAA TCT TCT TTA GGA ATG AGG GCA TCT 13500

TGA TCC ATG CGG GAA ATG TAG CCG AAG CCG TGA TTG TCT GGA CTG 13545

CTG AGT GTG GTC GAT GGG GTT GGA TGT GGC CTG ATC TGG GCG GAT 13590

CGG TGG ATG AGC TTT CAC CCT AAG TTT TTC TTA CTA TAG GTC ATG 13635

TAT CCC GGA ACC TAG TGT GAT CTT AGA TCC CTC CTA TTC CAG CTG 13680

CTG CTG CGG CAT CAT CCT CTT CAT CCT GAT CAA CAT CGT TGT TAC 13725

GGC CTC CGT CTT CGT GGG TTG TAG TGC CAT CTT GCC TTC TCT CTG 13770

CAA GTC TCC TGG CTA TTC TCC TCT CTA TGT CTG AGA CAT CCT CAA 13815

CTT TAG TTT CCT CCT CCA ACC GTT CTG CCC CGT GTA ATG TGA TAA 13860

AAT GAC CAC TGC TTG CCG GGC GAG CCC ATC TGT CAC CAC TGT CCT 13905

CGC CCC AAC CCC TGA CGT CCT GGT CTG TGT GAG TTT CAG GTT CTA 13950

GGT CTA TGT CAG CAT TAT CTA TAG CTA CTT CGA TTG CAC CGC CAC 13995

CCG TCG GCT TGT GGT ATG CGC CAT CTC CAC CAG ACA GAT TAG CCA 14040

AAT GAT GTC TGA GTC TCT CCT TAG CCG TAT CTG TCA CTC CTA GTT 14085

CAT CCT CCA GAG CAC TGC TGA TCT TAG ATT CAG CGT CCT TTG CTA 14130

CGG CTT GTC CTA GTA GGA ACA TCT CCA TAT CAA GGT ATG TTC TTC 14175

CTG TGA CAT ACT GCT GCA TCG CCT TGT TCT GTA CAA CGG CGA CCC 14220

CCA TTG CAT AGC TCC AGA GTG CTG GAT AGT TGC CTG GTG CAA ACT 14265

CTC CAT GGA CAG GGT CCT TAA GGA TAC AAA TAA AAG GGG CTC TGG 14310

GAC CTT TTG ACA AGT AGG TGT CTA TGA GGC TTC TCA GCT TAT TTA 14355

TAT CAG GCC TCA AGT TTG ATA GTG TTA GAG CCG CCA TCT TGG TCT 14400

CTA CCC CAT ATT TGA TAG TGT TCA TGA AAG AGG CTA GCC CTG CAT 14445

CTC GGA TGT AGT TCC CGA CGA TCT GGA TGT TCT TCT CTA GCG TAG 14490

TGA GGT CGG ATC TCG CAG TGT TCA TAG TCA CAA GGG TCT CAA CCA 14535

TGA GAG ATA CCA AGC TTT GCT GAG ATC TCA TAA CCG AAC CTA TCC 14580

CCT CAA CTG TCT CTC CAG TGA AAA CTA ATG CAC CTT TCA CGG TCC 14625

CAT CTT GTC GGA ACG CCT CTA ATC TGT TGA AAA ATC CTT TCC TTA 14670

GAC CGG CGC TAC TTG TGA TTG CCT TCA CCA ACA CAA TCC AGA CCT 14715

GGA CAA TTA TTG CTC CTA GGC ATG CCG GAT ACC CAT AGA TTT GAA 14760

GGA GTG CAT CAG GAT CTG CAG AAT CTC GTT GTC CCT GGA AAA GCG 14805

GGC TCT TGT TGA CCA TGG GTC CAA ACA GCC ATT CTG TGG TCC TCT 14850

CAT ACT CCA TAT CTC TAG TCT TCA CAA TGA ATC CAT CTG TCT TTG 14895

TCC TCT TAG GGT CCT TTT CTA TGT TGT AGA TCA CGT ATT TAA CAT 14940

CGG CAT TTA CCC CGT TCG TTG TCA GGT ATA ATT CTG GAC TAC TGT 14985

AAG CCA TGG CAA GTA GGG AGA CTA GGA AAC CTC CTC TCT GAG AGT 15030

GCT GCT TAT CTG TGT CCA ATG AGT GAG CTA AGA AGG TGG TTG CAA 15075

TGA ATA ACT TGT CTG CAT CGT CAG CCA CAC TTG GGC CTA GTA CGA 15120

ACA CTG AGA CTG TGC TCC TCT GGC CAG GGA TAA CAG CAC CTC CCC 15165

CTG ACT TAT TAA TAC TTT CAC TCC TCC TAG AGC TAA ATG TAT CAA 15210

AAG TGC TCA ACA GCC CAG CCA TCG TAA ATT CCG GCA GCA AAG CTA 15255

AAG GTC TGA AAC CTG CTC TTC AGG GTG GAT ACT TTG ACC CTA AAA 15300

TCC TGT CCA 15309

Аттенуированный культуральный штамм вируса Сендай Sen293nskl для создания противоракового препарата, депонированный в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" под № V-648.



 

Похожие патенты:
Данное изобретение имеет отношение к таким композициям и фармацевтическим композициям, которые включают поксвирусы, и более конкретно, которые включают внеклеточные оболочечные вирусы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа их использования. Предложенный способ выявления и дифференциации генома вакцинного штамма В-82 от полевых изолятов вируса миксомы кроликов включает: выделение ДНК из биологического материала, постановку мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, комплементарных участкам генов M130R и M151R вируса миксомы кролика и имеющих следующий нуклеотидный состав: амплификацию ДНК вируса и оценку проведения реакции.

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и иммунологии. В частности, настоящее изобретение относится к новому птичьему астровирусу; к антителам и их фрагментам, направленным против указанного нового вируса; к антигенным препаратам, белкам и ДНК-молекулам нового птичьего астровируса; к вакцинам на основе указанного нового вируса или к его антигенным препаратам, белку или ДНК; к способам получения таких вакцин и к диагностическим наборам.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ получения вирусов гриппа А или В в культуре клеток, и композиция клеточной культуры для получения вирусов гриппа А или В.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен способ получения вирусоподобных частиц вируса гриппа (ВПЧ) в растении или его части.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм В/60/Массачусетс/2012/10 - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса В/Массачусетс/2/2012 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается перевиваемой гибридной сублинии клеток A4C2/9к SUS SCROFA. Представленная сублиния клеток A4C2/9к обладает высокой чувствительностью к вирусу АЧС.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм А/17/Индиана/2011/72 (H3N2v) - реассортант, полученный путем скрещивания «дикого» вируса А/Индиана/10/2011 (H3N2v) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/13 4/17/57 (H2N2) - донором аттенуации.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается вакцинного штамма вируса гриппа. Охарактеризованный штамм В/60/Висконсин/2010/125 - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса В/Висконсин/1/2010 с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом В/СССР/60/69 - донором аттенуации.
Изобретение относится к вирусологии и касается штамма вируса осповакцины. Предложенный штамм выделен из гомогената тканей легких морских свинок, инфицированных 7-м пассажем вируса осповакцины.

Изобретение относится к медицине и предназначено для лечения рака желудка. Предварительно определяют уровни онкомаркеров СЕА, СА 19-9, СА 72-4, М2-ПК, индекс пролиферации Ki-67, выполняют совмещенную позитронно-эмиссионную и компьютерную томографию (ПЭТ/КТ).
Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональным антителам, связывающимся с с-Met, способных ингибировать как лиганд-зависимую, так и лиганд-независимую активацию с-Меt.
Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым гетероциклическим соединениям формулы (1) и/или к их фармацевтически приемлемым солям, где А1 представляет СН; А4 и А5 независимо представляют собой СR2 или N; А2 и А3 совместно с кольцом В представляют собой 5-членный гетероарил или гетероцикл, причем указанный 5-членный гетероарил или гетероцикл выбран из где t представляет собой 1 или 2; и R3 независимо выбран из Н, С1-С6 алкила, С6-арила, С3-С6-членного циклоалкила, C(O)NRcRd, -ORb, гетероарила, представляющего собой пиридин, и гетероцикла, представляющего собой пиперидин и тетрагидропиран; и каждый из вышеуказанных алкила, арила, циклоалкила, гетероарила и гетероцикла может быть замещен одной группой, независимо выбранной из С1-С6 алкила, возможно замещенного одним заместителем, выбранным из -CONMe2, С3-членного циклоалкила, -CN, -ОМе, -пиридина, тетрагидропирана, -СО-морфолина, -СО-пирролидина, (3-метил)оксетана; -ОН; -C(O)Ra; -CN; -C(O)NRcRd; -NRcRd; -ORb; -S(O)nRe; галогена; и замещенного одной группой -СОМе гетероцикла, представляющего собой пиперидин; при условии, что когда А4 представляет собой CR2, А2 и А3 совместно с кольцом В выбраны из структуры (3), (5) или (6); представляет собой одинарную связь или двойную связь; R1 представляет собой гетероарил, представляющий собой 6-членное или 9-10-членное ароматическое моно- или бициклическое кольцо, содержащее 1-3 гетероатома, выбранных из азота, кислорода и серы, возможно замещенный одной или двумя группами, независимо выбранными из С1алкила, С2алкинила, -NRcRd, -NRcS(O)nRe, -ORb, галогена, галогеналкила; R2 независимо выбран из Н; каждый Ra, Rb, Rc, Rd, и Re независимо выбран из Н; С1-С4алкила, возможно замещенного одним заместителем, выбранным из -ОН, -ОМе, -CN, -NH2, -NMe2, С3-циклоалкила; С2-С3алкенила; С3алкинила; С6арила, возможно замещенного одним или двумя заместителями, выбранными из фтора или метильной группы; С3-членного циклоалкила, возможно замещенного одним заместителем, выбранным из -ОН и -CN; галогеналкила; гетероарила, представляющего собой пиридин; и замещенного одной метильной группой гетероцикла, представляющего собой пиперидин, или Rc и Rd совместно с атомом (атомами), к которым они присоединены, образуют 5-6-членное гетероциклическое кольцо, представляющее собой пирролидин или морфолин; и в каждом случае n независимо равен 2.
Данное изобретение имеет отношение к таким композициям и фармацевтическим композициям, которые включают поксвирусы, и более конкретно, которые включают внеклеточные оболочечные вирусы.
Предложенное изобретение относится к области иммунологии. Описаны варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, связывающиеся с человеческим 4-1ВВ.

Изобретение относится к производным бетулиновой кислоты, их получению и использованию против рака. Для получения производных формул бетулин трансформируют в бетулоновую кислоту, затем в дигидробетулоновую кислоту и соответствующие дигидробетулонаты с последующим ацетилированием последних, после чего гидроборируют полученные соединения с последующим окислением, затем трансформируют в соответствующие галогенопроизводные, проводят гидрогенолиз и взаимодействие с трифенилфосфином с получением производных указанных выше формул.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к N-(4-(4-((2-(4-хлорфенил)-5,5-диметил-1-циклогекс-1-ен-1-ил)метил)пиперазин-1-ил)бензоил)-4-(((1R)-3-(морфолин-4-ил)-1-((фенилсульфанил)метил)пропил)-амино)-3-((трифторметил)сульфонил)бензолсульфонамиду (АВТ-263) в твердой кристаллической форме.

Изобретение относится к области органической химии, конкретно к области получения (5Z,9Z)-5,9-эйкозадиеновой кислоты формулы (1), проявляющей ингибирующее действие на человеческую топоизомеразу I.

Изобретение относится к замещенным фосфорсодержащей группой хинолинам формулы (I), которые могут использоваться в медицине , где Ζ представляет собой , V1 и V2 независимо выбраны из водорода или галогена; один из R и R` представляет собой фосфорсодержащий заместитель Q, другой выбран из водорода или метоксила; где фосфорсодержащий заместитель Q представляет собой , А представляет собой О; L представляет собой С1-6алкил; J представляет собой NH или С3-6гетероциклоалкил и J возможно замещен G3; X отсутствует или представляет собой -С(=O)-; Υ отсутствует или представляет собой C1-6алкил; каждый из R1 и R2 независимо выбран из С1-6алкила или С1-6алкокси; G3 представляет собой С1-6алкил, R3S(=O)m-, R5C(=O)- или R3R4NC(=O)-; R3, R4 и R5 независимо выбраны из Η или С1-6алкила; m равен 0-2.
Изобретение относится к медицине, а именно нейрохирургии, нейроонкологии, и может быть использовано для лечения глиальных опухолей головного мозга супратенториальной локализации.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани. Далее полученные TILs аутотрансплантируют указанному пациенту. Изобретение позволяет повысить способность апоптина проникать в опухолевые клетки и оказывать онколитический эффект в отношении всех клеток опухоли. 2 ил., 3 пр.
Наверх