Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени



Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени
Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации рнк вируса лихорадки долины рифт методом от пцр в реальном времени

 


Владельцы патента RU 2552795:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса лихорадки долины Рифт методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Изобретение позволяет эффективно идентифицировать вирус лихорадки долины Рифт. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине для выявления генетического материала (РНК) вируса лихорадки долины Рифт (ВЛДР) в клинических или биологических образцах, а также в объектах окружающей среды.

Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - острое зоонозное заболевание, распространенное во многих странах Африки и на Ближнем Востоке. Возбудитель, относящийся к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridae, характеризуется высокой вирулентностью в отношении многих видов диких и домашних копытных животных и человека.

Геном ВЛДР представлен одноцепочечной негативной РНК, разделенной на три сегмента (S, M и L). Биполярный S-сегмент содержит гены нуклеопротеина и неструктурных белков, М-сегмент кодирует оболочечные гликопротеины, L-сегмент - РНК-зависимую РНК полимеразу.

Передача вируса осуществляется через укусы комаров Culex spp. и Aëdes spp., его природный резервуар неизвестен. Заражение человека может произойти также при контакте с тканями и кровью заболевших животных либо при вдыхании вируссодержащих аэрозолей.

Лихорадка долины Рифт в настоящее время включена в группу карантинных инфекций, контролируемых Международными медико-санитарными правилами 2005 года. Эпизоотии ЛДР наносят огромный экономический ущерб животноводству, вызывая 80-100% гибель молодняка и внутриутробную гибель плода на любых сроках беременности. Клиническая картина характеризуется выраженной лихорадкой, некротическим гепатитом, гастроэнтеритом, обильными кровотечениями со слизистых оболочек.

У человека проявления заболевания варьируют от легкой гриппоподобной формы до тяжелой, сопровождающейся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитом. При осложненном течении ЛДР показатели смертности могут достигать 50%, у выживших пациентов отмечаются остаточные неврологические явления и стойкое снижение остроты зрения, приводящее к инвалидизации. Наиболее часто развитие тяжелых форм ЛДР наблюдается во время вспышек, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных.

Своевременное проведение диагностических мероприятий, оценка эпидемической и эпизоотической ситуации по ЛДР, разработка комплексной программы профилактики инфекции требуют быстрой, высокочувствительной и достоверной идентификации возбудителя.

Одним из методов оперативной детекции РНК ВЛДР является метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, используемые для выявления генетического материала ВЛДР, на основе амплификации консервативных последовательностей S- или М-сегментов РНК [1-4].

Однако данные наборы праймеров не предполагают использование флуоресцентно-меченых зондов для детекции результатов, что не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени. Кроме того, в некоторых работах специфичность детекции была достигнута за счет т.н. «гнездовой», или двухраундовой, ПНР с применением дополнительной пары внутренних праймеров [2, 5]. Известны синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа (патент РФ №2457255, МПК C12Q 1/68, опубл. 27.07.2012 г.). Гидролиз продуктов ПЦР проводят эндонуклеазами рестрикции, а детекцию результатов анализа путем электрофореза в агарозном геле.

К недостаткам данного изобретения относятся следующие:

- увеличение общего времени анализа образцов до 5-6 часов (вместо 2,5-3 часов), поскольку отсутствие флуоресцентно-меченого зонда не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени;

- невозможность автоматического фиксирования и обработки экспериментальных данных;

- дополнительные манипуляции с ампликонами (ферментативный гидролиз и гель-электрофорез) многократно повышают вероятность ложно положительных результатов, связанных с контаминацией помещений и лабораторного оборудования продуктами ПЦР.

Известны «Primers and probe for detecting fragment S of rift valley fever virus» (патент Китая № CN 102433392 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2012-05-02). В изобретении представлены олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, предназначенные для идентификации РНК вируса лихорадки долины Рифт методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Область гибридизации праймеров и зонда (участок NS-гена S-сегмента, позиции №№37-128).

Однако, поскольку в изобретении для анализа выбран более вариабельный фрагмент РНК ВЛДР, праймеры и зонд в ряде случаев могут оказаться недостаточно специфичными для достоверной идентификации вируса.

Известны «PRIMERS AND ITS APPLICATION IN MULTIPLEX PCR TO IDENTIFY RINDERPEST, PESTE-DES-PETITS-RUMINANTS VIRUS, BLUETONGUE VIRUS AND RIFT VALLEY FEVER» (патент Респ. Кореи № KR 20110017706 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2011-02-22). Представленные в патенте олигонуклеотидные праймеры являются специфичными в отношении РНК вируса лихорадки долины Рифт. Они применяются в составе мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией результатов анализа.

Однако конкуренция различных олигонуклеотидных пар в отношении компонентов реакционной смеси (Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты, ионы магния) может привести к снижению аналитической чувствительности системы. Кроме того, увеличение общего времени анализа образцов составляет до 5-6 часов (вместо 2,5-3 часов), поскольку отсутствие флуоресцентно-меченого зонда не позволяет регистрировать накопление специфичных ПЦР-продуктов в режиме реального времени. В изобретении не предполагается автоматическое фиксирование и обработка экспериментальных данных. Дополнительные манипуляции с ампликонами (ферментативный гидролиз и гель-электрофорез) многократно повышают вероятность ложно положительных результатов, связанных с контаминацией помещений и лабораторного оборудования продуктами ПЦР.

Известна «New fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) detection method for rift valley fever virus and rift valley fever virus detection PCR System» (патент Китая № CN 102140528 (А), МПК C12Q 1/68, опубл. 2011-08-03). Представленные в изобретении олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд предназначены для идентификации РНК вируса лихорадки долины Рифт методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени. Область гибридизации праймеров и зонда отличается от заявляемого технического решения.

Однако, поскольку в данном изобретении для анализа выбран более вариабельный фрагмент РНК ВЛДР, праймеры и зонд в ряде случаев могут оказаться недостаточно специфичными для достоверной идентификации вируса.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд, позволяющие выявлять РНК ВЛДР в исследуемом образце путем амплификации участка S-сегмента (ген нуклеокапсидного белка N) с детекцией результатов в режиме реального времени [6].

Однако, учитывая данные по геномному разнообразию ВЛДР, представленные в GenBank, указанные праймеры и зонд, подобранные по шести нуклеотидным последовательностям референтных штаммов, могут в ряде случаев не обеспечить достоверной идентификации вируса вследствие недостаточной специфичности в отношении геновариантов ВЛДР, выявленных позже.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание более специфичного набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала ВЛДР в клинических и биологических образцах и объектах внешней среды методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Поставленная задача достигается подбором олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, имеющих следующий нуклеотидный состав:

Праймер RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′

Праймер RVFV-2a: 5′-GGCTCAAATGATCAAMCC-3′

Зонд RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′.

На начальном этапе был проведен поиск и определение наиболее консервативных участков L-сегмента РНК ВЛДР по 94 известным нуклеотидным последовательностям, представленным в базе данных NCBI MegaBLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]. В качестве мишени для диагностических праймеров и зонда была выбрана область, включающая 167 пар нуклеотидов (позиции №№180-346).

Обратную транскрипцию вирусной РНК, совмещенную с последующей амплификацией фрагмента кДНК в полимеразной цепной реакции, проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США). Детекция продуктов амплификации осуществлялась непосредственно в ходе ПНР благодаря применению флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, гибридизующегося с продуктом реакции (ампликоном) и обеспечивающего дополнительную специфичность метода. Интенсивность флуоресценции возрастала в течение реакции пропорционально накоплению ампликонов.

Определяющим отличительным признаком предлагаемых праймеров и зонда по сравнению с прототипом является гибридизация к более специфичным последовательностям 94-х известных геномов ВЛДР.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Проверка аналитической чувствительности набора праймеров и зондов

Для контроля аналитической чувствительности предложенного набора праймеров и зондов была сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая вставку кДНК ВЛДР: плазмида pUC19, гидролизованная рестриктазой SmaI (позиция №415) была лигирована с фрагментом кДНК L-сегмента РНК ВЛДР (позиции №№180-346). Концентрацию ДНК рекомбинантной плазмиды (мкг/мл) определяли при помощи спектрофотометра «NanoView Plus» (GE Healthcare, США). Концентрацию геномных эквивалентов (ГЭ) вируса ЛДР рассчитывали с учетом молекулярного веса рекомбинантной плазмиды по формуле (1):

где М - концентрация плазмидной ДНК [ГЭ/мл];

С - концентрация рекомбинантной плазмиды [мкг/мл];

10-6 - коэффициент перевода [мкг/мл] в [г/мл];

6,02·1023 - число Авогадро;

2853 - длина плазмиды [пар оснований, п.н.];

3,26·102 - средний молекулярный вес одного звена нуклеотидной цепи [Да].

Из концентрированного раствора, содержащего в среднем 107 ГЭ/мл, были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК, которые использовались в качестве образцов для ОТ-ПЦР в режиме реального времени (по 10 мкл на реакцию). Соответственно, образцы содержали от 105 и менее ГЭ на реакцию. Для контроля возможной контаминации в отдельную пробирку вносили 10 мкл воды для ПЦР.

Реакционная смесь общим объемом 25 мкл (включая объем исследуемого образца) содержала 1×AS-полимеразный буфер (67 mM Tris HCl, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20), 0,4 mM каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 3 mM MgCl2, 1-5 е.а. обратной транскриптазы М-MuLV, 1 е.а. Hot Start Taq ДНК полимеразы (ООО «Сибэнзим», Новосибирск, Россия), 0,8 µМ каждого праймера и зонда (RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′, RVFV-2а: 5′-GGCTCAAA TGATCAAMCC-3′, RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).

ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени по каналу FAM/Green проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США) согласно протоколу, приведенному в таблице 1.

Таблица 1
Температура, °С Время Детекция флуоресценции Количество циклов
45 30 мин - 1
94 3 мин - 1
94 10 с -
55 30 с - 5
72 20 с -
94 10 с -
55 30 с FAM/Green 40
72 20 с -

Результаты реакции интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривых флуоресценции с пороговыми линиями, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе таблицы результатов программы амплификатора. Результат считали положительным (образец содержит заявленное число ГЭ ВЛДР) в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную экспоненциальную фазу роста и пересекала пороговую линию. При этом значение «Ct» для данного образца, возрастающее пропорционально его разведению, не должно было превышать 35.

Аналитическая чувствительность предложенного набора праймеров и зондов, определенная в результате экспериментов (фиг.1), составила 100 ГЭ ВЛДР (копий плазмидной ДНК, содержащей вирусспецифическую вставку) на 25 мкл реакционной смеси.

Пример 2. Определение генетического материала ВЛДР в вируссодержащем образце

Эффективность выявления РНК ВЛДР оценивали с использованием инактивированного образца музейного штамма RVF 2002/09-ПС, предоставленного ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров, Московская область, Россия).

Выделение РНК из исследуемого материала проводили с помощью набора реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБИО», Москва, Россия) в соответствии с инструкцией по применению в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО).

ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией ампликонов проводили в реакционной смеси следующего состава: 1×AS-полимеразный буфер (67 mM Tris HCl, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20), 0,4 mM каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 3 mM MgCl2, 1-5 е.а. обратной транскриптазы M-MuLV, 1 е.a. Hot Start Taq ДНК полимеразы (ООО «Сибэнзим», Новосибирск, Россия), 0,8 μΜ каждого праймера и зонда (RVFV-2s: 5′-AGGAGCATCTGAAATAGG-3′, RVFV-2a: 5′-GGCTCAAA TGATCAAMCC-3′, RVFV-2: 5′-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQI-3′) (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).

Общий объем реакционной смеси (на одно исследование) составил 25 мкл, включая 10 мкл исследуемого образца. Для контроля возможной контаминации в отдельную пробирку вносили 10 мкл воды для ПЦР.

Совмещенную ОТ-ГТЦР и регистрацию результатов в режиме реального времени проводили на амплификаторе «CFX96» (BioRad, США) согласно протоколу, приведенному в таблице 2.

Детекция флуоресценции осуществлялась на канале FAM/Green для амплификации кДНК ВЛДР и на канале HEX/Yellow для амплификации ВКО.

Таблица 2
Температура, °С Время Детекция флуоресценции Количество циклов
45 30 мин - 1
94 3 мин - 1
94 10 с -
55 30 с - 5
72 20 с -
94 10 с -
55 30 с FAM/Green, HEX/Yellow 40
72 20 с -

Результаты реакции интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривых флуоресценции с пороговыми линиями, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе таблицы результатов программы амплификатора. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную экспоненциальную фазу роста и пересекала пороговую линию. При этом значение «Ct» для данного образца не должно было превышать 35 (фиг.2).

Таким образом, из вышеприведенных примеров 1 и 2 видно достижение заявляемого технического результата: созданы олигонуклеотидные праймеры и зонд для идентификации генетического материала ВЛДР в клинических и биологических образцах и объектах внешней среды методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Также определена аналитическая чувствительность набора для детекции ВЛДР, которая составила 100 геномных эквивалентов на 25 мкл реакционной смеси.

Источники информации

1. Jupp P.G., Grobbelaar A.A., Leman P.A. et al. Experimental detection of Rift Valley fever virus by reverse transcription-polymerase chain reaction assay in large samples of mosquitoes // J. Med. Entomol., 2000, 37: 467-471;

2. Sail A.A., Macondo E.A., Sène O.K. Use of reverse transcriptase PCR in early diagnosis of Rift Valley fever // Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2002, 9: 713-715;

3. Espach Α., Romito M., Nel L.H. Development of a diagnostic one-tube RT-PCR for the detection of Rift Valley fever virus // Onderstepoort J. Vet. Res., 2002, 69 (3): 247-52; Yeh J.-Y., Lee J.-H., Seo H.-J. Simultaneous detection of Rift Valley fever, bluetongue, rinderpest and peste des petits ruminants viruses by a single-tube multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual-priming oligonucleotide system // J. Clin. Microbiol., 2011, 49: 1389-1394;

4. патент РФ №2457255, МПК C12N 15/33, C12Q 1/68, опубл. 27.07.2012 г.

5. Yeh J.-Y., Lee J.-H., Seo H.-J. Simultaneous detection of Rift Valley fever, bluetongue, rinderpest and peste des petits ruminants viruses by a single-tube multiplex reverse transcriptase-PCR assay using a dual-priming oligonucleotide system // J. Clin. Microbiol., 2011, 49: 1389-1394;

6. Белов A.B., Гребенникова T.B., Забережный А.Д. и др. Тест-система на основе ПНР в реальном времени для выявления вируса ЛДР // Ветеринария, 2007, 6: 53-55.

Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса лихорадки долины Рифт методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающий пару олигодезоксирибонуклеотидов, обладающих специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно-меченый зонд, имеющие следующую структуру:



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. Способ предусматривает выделение ДНК, проведение ПЦР с применением синтезированных праймеров для амплификации фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDF_0064-YPDSF_0065 исследуемого штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа соматических мутаций в генах EGFR, KRAS и BRAF. Способ включает амплификацию фрагментов генов EGFR, KRAS и BRAF с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется образец опухолевой ДНК.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики вагинита у женщин репродуктивного возраста. Во влагалищных соскобах измеряют уровни экспрессии мРНК генов TNF, IL18, GATA3 и TLR4.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к микроматричной геномной селекции (MGS). Устройство содержит:(a) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри реакционной зоны; (b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и (c) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной нереакционной зоной (b).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления устойчивых к пиразииамиду изолятов Mycobacterium tuberculosis, путем определения наличия мутаций в гене pncA, ассоциированных с формированием устойчивости к пиразинамиду, посредством проведения ПЦР в режиме «реального времени» с использованием HRM-анализа.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных зондов для диагностики популяции людей, проживающих на территории РФ, на наследственные моногенные заболевания, путем выявления мутаций и/или полиморфизмов.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выявления и генотипирования бактерии Pasteurella multocida. Предложенный способ включает проведение ПЦР с электрофоретической детекцией результатов, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции.
Изобретение касается набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации и субтипирования ДНК бактерии Pasteurella multocida серотипов А, B, D, E, F методом ПЦР в режиме реального времени.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу идентификации микобактерий туберкулеза кластера Beijing B0/W148. Применяют полимеразную цепную реакцию для амплификации фрагментов ДНК М.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к паре синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и к способу диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием данных праймеров. Пара праймеров имеет следующую структуру - PF: 5′-TGGAGAAGGGAATTTCAGATGGG-3′ и PR: 5′-TTTGGGTCAAGTGCTACATATTGTGG-3′. Способ включает проведение ПЦР с детекцией полученных результатов методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Амплификацию проводят в следующем режиме: тотальная денатурация при 95°С в течение 5 мин, цикл денатурация при 95°С в течение 20 или 60 сек, отжиг при 56°С в течение 20 или 60 сек, элонгация при 72°С в течение 40 или 60 сек. Цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 35 раз. Проводят заключительную элонгацию при 72°С в течение 5 мин. В случае наличия амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности длиной 366 п.н. судят о наличии FIV в организме кошки. Предложенное изобретение позволяет провести диагностику вирусного иммунодефицита кошек с высокой эффективностью. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области кардиологии и касается набора синтетических олигонуклотидов. Представленный набор используется для выявления мутаций кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца. Мутации выявляют путем определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4. Осуществляют амплификацию кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4 с помощью 15 пар синтетических олигонуклеотидов при одной температуре и времени отжига с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации с помощью одной пары универсальных праймеров. Предложенное изобретение позволяет чувствительно и специфично определять мутации генов NKX2.5, CFC1, GATA4, при этом сокращаются время реакции амплификации, количество манипуляций, время внесения реактивов для реакции секвенирования и снижается вероятность ошибки при постановке реакции. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н. Представленные изобретения могут использоваться в ветеринарных диагностических и научно-практических лабораториях для выявления генетического материала Mycobacterium avium в пробах. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт. Охарактеризованное изобретение может быть использовано в создании банка нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт Gn, Gc и N, которые можно использовать при создании диагностических и вакцинных препаратов, на основе рекомбинантных технологий. 3пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления мутаций в гене MYO7A, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты или синдрома Ушера. Способ включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проведение ПЦР, амплификацию 18 участков гена MYO7A, детекцию в денатурирующем акриламидном геле и секвенирование. ПЦР проводят с использованием специально подобранных последовательностей олигонуклеотидов, фланкирующих области 18 экзонов гена MYO7A с возможным содержанием различных мутаций. Изобретение позволяет упростить способ и повысить точность определения мутаций гена MYO7A, а также сократить время исследования. 3 ил., 1 пр.

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы. Охарактеризованный способ включает проведение ПЦР с использованием специфических праймеров к генам vc0497, vc0502 и vc0514 из острова пандемичности VSP-II. Охарактеризованная тест-система содержит компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, включающие, в частности, смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно. Изобретения позволяют быстро и достоверно дифференцировать токсигенные генетически измененные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на геноварианты с низким и высоким эпидемическим потенциалом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Группа изобретений относится к области лизиса клеток. Предложен способ избирательного лизиса животных клеток, а также прибор для обнаружения микроорганизмов. Способ избирательного лизиса животных клеток в пробе воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, включает этапы обеспечения пробы воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, добавления в упомянутую пробу неионогенного детергента и буферного раствора для получения раствора со значением pH около 9,5 или выше, инкубации упомянутого раствора на протяжении периода, достаточного для лизиса животных клеток. Прибор для обнаружения микроорганизмов в пробе состоит из лизисной камеры для принятия пробы воды с животными клетками, сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH 9,5 или выше и неионогенным детергентом, или сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH около 9,5 или более и сосуда с неионогенным детергентом, фильтра, соединенного с лизисной камерой для фильтрации пробы после лизиса животных клеток, камеры индикации для анализа присутствия ДНК микроорганизмов. Предложенные изобретения обеспечивают обработку образца без его значительного разбавления и без применения ферментативного расщепления ДНК или термической обработки, а также позволяют обрабатывать более значительные объемы образца и определять низкие концентрации болезнетворных микроорганизмов в образце. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов. Способ включает проведение электрофореза с указанной РНК. Определяют, удовлетворяет ли указанная РНК следующему уравнению: В/А≤1, где А представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, а В представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом. Если указанная РНК, экстрагированная из ткани или клетки (клеток), удовлетворяет указанному уравнению, то она пригодна для анализа экспрессии генов. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой эффективностью определить пригодность РНК для анализа экспрессии генов. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 11 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к интернализации терапевтических молекул внутрь клетки, и может быть использовано в медицине. Получают композицию для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки, содержащую по меньшей мере один пептид с по меньшей мере 92% идентичностью к GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); или YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), присоединенный к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот. Изобретение позволяет повысить эффективность доставки молекул нуклеиновых кислот внутрь клетки млекопитающего за счет пептида, способного интернализироваться внутрь клетки млекопитающего с эффективностью, составляющей по меньшей мере 200% от эффективности интернализации пептида ТАТ, имеющего аминокислотную последовательность GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения полиморфизма гена GP6 человека, кодирующего гликопротеин VI, по полиморфной позиции rs 1613662, основанный на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами. Благодаря увеличению надежности определения вариабельных позиций и возможности проводить определение в одной пробирке на стандартном оборудовании способ может быть эффективно использован для диагностики наследственных предрасположенностей человека с регистрацией результатов ПЦР в реальном времени. 1 ил.
Наверх