Штамм вируса ящура aphtae epizooticae типа а для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а
Владельцы патента RU 2553219:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picomaviridae, рода Aphtovirus. Охарактеризованный штамм выделен от больных свиней и получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток и депонирован в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный). Представленный штамм репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,0÷7,0 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1÷10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей. Изобретение может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А. 6 табл., 6 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Ящур - это острое, контагиозное, вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30÷40.
Вирус ящура относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов.
Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.
Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.
В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.
Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР и РФ в течение последних 50 лет.
К ним относятся следующие штаммы: А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А7 №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае.
Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны.
Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими им в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» [1, 2, 3].
Известен штамм №550 вируса ящура А22, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах постсоветсткого пространства.
В 1990-2000-х годах в Центральной Азии и на Ближнем Востоке доминировали две генетические линии вируса ящура типа А: линия А/Иран/96 (к этой генетической группе относится российский производственный штамм А/Армения/98) и А/Иран/2005. Генетическая линия А/Иран/99 не получила такого широкого распространения, как две упомянутые выше. Штаммы из группы А/Иран/99 и А/Иран/96 не входят в настоящее время в первоочередной перечень рекомендуемых Всемирной референтной лабораторией МЭБ/ФАО по ящуру вакцинных штаммов, тогда как штамм А/Иран/2005 (А/Турция/06)относится к высокоприоритетным [4].
Известен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae A №1707 «Армения-98» для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [5].
Выделение в 1998 г. в хозяйстве Охчик Амассийского района Армении от КРС вируса ящура типа А и изучение его филогенетического родства показало, что при сравнительном исследовании первичной структуры гена VPi штамма вируса ящура типа А №1707 «Армения-98» с производственными штаммами и полевыми изолятами установлено, что изоляты Армения/98 идентичны между собой и родственны штаммам типа А Турция/97, Турция/98 и Иран/96. Также установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа А22 (18% различий), куда относится и используемый для производства средств диагностики и специфической профилактики штамм А22 №550.
Производственный штамм А №1707 «Армения-98» применяли в составе противоящурных вакцин в буферной зоне Закавказья.
Известен относящийся к этой же линии выделенный в 1999 г. от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия штамм А (Грузия) 1999/№1721 [6].
С 2003 года на территории Ирана был выделен изолят вируса ящура типа А, значительно отличающийся от ранее изученных штаммов этого типа. В течение 2005-2006 гг. ящур типа А получил широкое распространение в странах Западной Азии-Иране, Турции, Саудовской Аравии и Пакистане. В феврале 2006 года ящур типа А линии Иран/05 попал во Фракию - европейскую часть Турции, которая граничит с Болгарией и Грецией. Проведение 100% вакцинации всех жвачных с применением штамма Азз во Фракии в феврале-марте 2006 г. предотвратило распространение ящура в соседние Грецию и Болгарию, однако через 3-4 месяца появились свежие случаи заболевания [7].
Известен штамм вируса ящура А 2045/Киргизия/2007, выделенный в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г., принадлежащий к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [8].
Недостатки вышеуказанных штаммов в том, что приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.
Штамм, относящийся к настоящему изобретению, ранее на территории РФ не встречался.
Вспышка ящура, вызванная вирусом типа А, была отмечена 22 сентября 2013 года у крупного рогатого скота (3 головы) и 4 свиней. Заболевание зарегистрировано в 2 дворах. Свиньи не были вакцинированы против ящура. Жвачные животные в 2013 году были иммунизированы 3 раза, в том числе: 2 апреля 2013 года, 10 июня 2013 года - вакциной содержащей производственный штамм A22 №550.
Третий раз жвачные животные были привиты вакциной универсальной сорбированной из вируса ящура типа А, содержащей производственный штамм «А/Иран/2005».
Все это свидетельствовало о недостаточной эффективности вакцин из указанных производственных штаммов.
В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.
Указанная задача решена получением штамма А №2187/Кути/2013 (авторское наименование) вируса ящура типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в сентябре 2013 года от больных свиней в селе Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187). Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А депонирован 22 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный).
По сравнению с известными штаммами штамм А №2187/Кути/2013 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.
Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2187/Кути/2013 для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2187/Кути/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А.
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picomaviridae, роду Aphtovims, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2187/Кути/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А22 №550 - 21,49%, А22/Ирак/64 - 21,73%, А/Иран/96 - 22,03%, А/Армения/98 - 22,39%, А/Турция/06 - 22,11%, А/Иран/05 - 22,32%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2187/Кути/2013 принадлежит к генетической линии Юго-Восточная Азия 97 (Sea-97) топотипа Азия.
Антигенное родство штамма ВЯ А №2187/Кути/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2187/Кути/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А №2179/Щелковский биокомбинат, А/Иран/97, А/Киргизия/07 (А/Иран/05). Штамм ВЯ А №2187/Кути/2013 имеется слабо выраженное антигенное родство со штаммом А/Турция/06 (А/Иран/05).
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,13, А №2179/Щелковский биокомбинат - 0,11, А/Иран/97 - 0,004, А/Турция/06 - 0,37, А №2045/Киргизия/07 - 0,13. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [9, 10].
Биотехнологические характеристики
Штамм А №2187/Кути/2013 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2, и в течение 18÷24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,0 до 7,0 lg ТЦД50о/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).
Генотаксономическая характеристика
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×106 Да.
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2187/Кути/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе иактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в сентябре 2013 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187/2013). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 26 сентября 2013 года.
При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [11].
Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса, которое проводили на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90÷100 ЦПД в монослое.
Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.
Эпизоотический изолят А №2187/Кути/2013, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.
Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.
Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2187/Кути/2013 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК. Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.
Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2187/Кути/2013.
Пример 2
Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма А№2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8÷10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025÷0,05% при значении рН 8,0÷8,3.
Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см3 внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [11].
После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.
После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5÷1,0 см3 и высушивают методом сублимации под вакуумом.
Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.
Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.
Пример 3
Чтобы получить антиген для серологических и иммунохимических реакций, использовали вирус ящура типа А штамма А №2187/Кути/2013, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.
Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8÷10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом. Данные представлены в таблице 5.
Пример 4
Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной типа А из штамма А №2187/Кути/2013, вирус ящура репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001÷0,05 ТЦЦ50 на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре (36°С)÷(37°С). Через 8÷10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет (%) 15÷20, то культивирование продолжают еще 2÷3 часа. При достижении количества мертвых клеток (%) 90÷95 культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75 S компонентов.
Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см3. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленной ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной (%) 0,025÷0,05. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при (36°C)÷(37°C) и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до (4°С)÷(8°С). В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).
Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см3 Р<0,01 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см3. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.
Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или полипропиленовые флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТ 28085-89.
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см3, затем подкожно в дозе 10 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 5 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.
Пример 5
Штамм А №2187/Кути/2013 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250÷300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000÷10000000 ИД50/1 см3 с антибиотиками, вводят по 0,2÷0,3 см3 в 20÷40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20÷-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в РСК на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.
Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 104,0 ИД50/0,1 см3. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°С÷40°С).
Пример 6
Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из штамма вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов КРС массой 200÷250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:4 и третьей группе из 5 голов в разведении 1:16. Четвертая группа из 2 голов осталась без вакцинации.
Объем прививной дозы составил 2,0 см3. На 19 день после вакцинации у 15 вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 в дозе 104,0 ИД50/0,2 см3.
Результаты испытания вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А из штамма вируса ящура типа А №2187/Кути/2013 на КРС представлены в таблице 6.
Антигенную активность вакцины контролировали по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови в РН на монослое первично трипсинизированной культуры клеток СП и в реакции микронейтрализации (РМН) на культуре клеток IB-RS-2. На 19 день после вакцинации уровень вируснейтрализующих антител в РН у КРС, привитых цельной вакциной, составил 6,2±0,27 log2, уровень вируснейтрализующих антител в РМН - 8,4±0,30 log2.
Через 8 дней после заражения провели патологоанатомичеекое исследование КРС. Заболели 2 контрольных животных, 1 животное, привитое разведением вакцины 1:4, и 4 животных, привитых разведением вакцины 1:16.
ИмД50 вакцины составила 0,25 см3. Прививная доза вакцины содержала 8,0 ПД50 в прививном объеме 2,0 см3, что свидетельствует об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.
Источники информации
1. Ререр X. Ящур: пер. с нем. Г.А. Сурковой / Под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
3. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.
4. WRLFMD Quarterly Report July-September 2013 - URL http://www.wrlfmd.org/rei_labs/ref_lab_reports/OIE-FAO
5. Пат. РФ №2140452, C12N 7/00, A61K 39/135, G01N 33/569, A61K 39/42, C07K 16/08, 27.10.1999 г.
6. Пат. РФ №2242513, C12N 7/00, A61K 39/135, 20.12.2004 г.
7. Foot-and-mouth Disease. Situation worldwide and major epidemiological events in 2005-2006 / K. Sumption, J. Lubroth, T. Murrai, S. De La Rocqe // EMPRESS / Focus on…, 2007, №1, IIP.
8. Пат. РФ №2451745, C12N 7/00, А61К39/135, 27.05.2012 г.
9. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. -, Paris, 2012 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.
10. Selection of foot and mouth disease vaccine strains - a review / D.J. Paton, J.-F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol. 24(3). - P.981-993.
11. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.
| Таблица 1 | |
| Антигенное соответствие (r1) в РМН штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А с производственными штаммами вируса ящура типа А | |
| Штамм | Показатель r1 |
| An №550 | 0,13 |
| А №2179/Щелковский биокомбинат | 0,11 |
| А/Иран/97 | 0,004 |
| А/Турция/06 (А/Иран/05) | 0,37 |
| А №2045/Киргизия/2007 (А/Иран/05) | 0,13 |
| Таблица 2 | ||||
| Биологические свойства вируса эпизоотического штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А | ||||
| Система репродукции вируса | Время проявления биологической активности (часы) | Количество адаптационных пассажей | Характеристика адаптированного материала | |
| Активность в РСК | Титр инфекционной активности(lg ТЦД50/см3) | |||
| ПСГК-30 | 20 | 5 | 1:2 | 6,0 |
| IB-RS-2 | 24 | 5 | 1:4 | 6,23 |
| ВНК-21 | 18 | 5 | 1:2 | 7,0 |
| Таблица 3 | ||||||||||
| Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала в РСК (экспертиза №2187/Кути/2013) | ||||||||||
| Экспертиза №2187 | Контроль | |||||||||
| Гипериммунные сыворотки в рабочем разведении | цельный | 1:2 | 1:4 | 1:8 | к/а | А/Турция/ 06 | А22/Ирак/64 | O PanAsia2 | Азия-1 Шамир 3/89 | б/а |
| А/Турция/06 | + | - | - | - | 4 | 4 | - | - | - | |
| А22/Ирак/64 | 4 | 4 | - | - | 4 | - | - | - | ||
| O PanAsia2 | - | - | - | - | - | - | 4 | - | - | |
| Азия-1 Шамир 3/89 | - | - | - | - | - | - | 4 | - | ||
| б/с | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| б/к | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
| Примечание: 4 - 100% задержка гемолиза; | ||||||||||
| «- « полный гемолиз; | ||||||||||
| б/с - без сыворотки; | ||||||||||
| б/а - без антигена; | ||||||||||
| б/к - без комплемента |
| Таблица 4 | ||||||
| Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А | ||||||
| Наименование препарата | Серия | Объем (см3) | Активность в РСК | |||
| с гомологичным антигеном | с гетерологичными антигенами | |||||
| А/Турция/06 | O PanAsia2 | Азия-1 Шамир 3/89 | ||||
| Гипериммунная сыворотка | 1 | 200 | 1:40 | <1:20 | <1:20 | <1:20 |
| Таблица 5 | ||||
| Характеристика диагностических антигенов из штамма А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, выращенного на различных культурах клеток | ||||
| Наименование препарата | Серия | Объем (см3) | Активность в РСК | |
| с гомологичным диагностикумом А №2187/Кути/2013 | с гетерологичным диагностикумом А | |||
| Культуральный антиген ПСГК-30 | 1 | 40 | 1:8 | <1:2 |
| Культуральный антиген IB-RS-2 | 1 | 60 | 1:8 | 1:2 |
| Таблица 6 | ||||
| Результаты испытания вакцины инактивированной против ящура типа А из штамма №2187/Кути/2013 на КРС | ||||
| Разведение | Количество вируснейтрализующих антител (log2) в сыворотке крови на 19 день после вакцинации | Количество КРС, защищенного при контрольном заражении | ИмД50 | |
| РН | РМН | |||
| Ц | 6,25 | 9,0 | 5/5 | 0,25 см3 |
| 6,5 | 8,0 | |||
| 7,0 | 8,5 | |||
| 5,5 | 8,5 | |||
| 5,75 | 8,0 | |||
| М±m | 6,20±0,27 | 8,4±0,30 | ||
| 1:4 | 4,0 | 6,0 | 4/5 | |
| 3,0 | 5,0 | |||
| 6,0 | 7,5 | |||
| 4,75 | 7,5 | |||
| 4,75 | 6,0 | |||
| 4,0 | 6,0 | |||
| М±m | 4,5±0,49 | 7,6±0,54 | ||
| 1:16 | 3,25 | 5,5 | 1/5 | |
| 1,75 | 5,0 | |||
| 2,5 | 5,0 | |||
| 2,25 | 6,0 | |||
| 2,75 | 4,5 | |||
| 3,25 | 5,5 | |||
| М±m | 2,5±0,25 | 6,3±0,28 | ||
| Контроль 1 | <4,0 | 0/2 | ||
| Контроль 2 | <4,0 |
Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2187/Кути/2013 (производственный) для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
