Штамм бактерии pseudomonas aeruginosa № 9 для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней

Авторы патента:

Скориков Александр Владимирович (RU)

A61P31/04 - антибактериальные средства

Владельцы патента RU 2553631:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный аграрный университет" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается штамма возбудителя псевдомоноза свиней, коллекции ФГБУ ВГНКИ, депонированного под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №9» и регистрационным номером «№9-ДЕП», предназначенного для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней. Изобретение обеспечивает высокую иммуногенную активность и возможность изготовления вакцины против псевдомоноза свиней. 4 пр., 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и предназначено для производства вакцинных препаратов против псевдомоноза свиней.

Псевдомоноз - острая инфекционная болезнь животных и птицы, характеризующаяся у молодняка септическим процессом, поражением легких, желудочно-кишечного тракта и суставов, а у взрослых особей репродуктивных органов и молочной железы. Возбудителем псевдомоноза является грамотрицательная аэробная бактерия Pseudomonas aeruginosa, которая по антигенной структуре подразделяется на 20 серологических групп (Псевдомоноз животных / И.А. Болоцкий, А.Г. Шипицын, А.К. Васильев и др. - М.: Колос, 2010. - 223 с.).

Псевдомоноз животных, в т.ч. свиней, регистрируется во всех регионах России независимо от природно-географических условий. В подавляющем большинстве случаев возбудителем псевдомоноза свиней является Pseudomonas aeruginosa серогрупп O1, O3, O4, O6, O11, 019 (Пруцаков С.В. Псевдомоноз продуктивных животных в регионе Северного Кавказа / Автореф. дисс. докт. вет. наук. - Краснодар, 2011. - 37 с.). Учитывая данные обстоятельства, для профилактики болезни была разработана вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных (Пат. РФ №2308288), которая в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих к 10 серогруппам (O1, O2, O3, O4, O6, O10, O11, O13, O18, O19), полученных путем отбора паренхиматозных пораженных органов из местного эпизоотического очага. Существенным недостатком такой вакцины является использование для ее получения неохарактеризованных (случайных) штаммов с неизвестными иммуногенными свойствами.

Известен вакцинный штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa 514₂, используемый для изготовления вакцины против псевдомоноза пушных зверей (Пат. РФ 2169193, прототип). Недостатком данного штамма является то обстоятельство, что он ориентирован на создание вакцины против псевдомоноза пушных зверей, при этом у вакцинированных животных формируется иммунитет к экзотоксину А, а не к соматическому O-антигену, который сохраняется непродолжительное время.

Технического решения, в ходе которого использовался штамм Pseudomonas aeruginosa для получения вакцины против псевдомоноза свиней с заданным O-антигенным профилем и иммунногенными свойствами, в доступной научной и патентной литературе нами не выявлено.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №9 выделен от павшего поросенка в 2003 г., в 2011 г. предложен в качестве вакцинного штамма, а в 2013 г. депонирован во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородствое шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером «№9-ДЕП».

Штамм Pseudomonas aeruginosa №9-ДЕП предназначен в качестве производственного штамма для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней и хранится в ФГУП «Армавирская биофабрика».

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов Pseudomonas aeruginosa, обладающих и длительно сохраняющих свои иммунногенные свойства и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных препаратов.

Технический результат достигается тем, что штамм возбудителя псевдомоноза свиней, коллекции ФГБУ ВГНКИ, депонированный под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №9» и регистрационным номером «№9-ДЕП», предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Штамм Pseudomonas aeruginosa №9-ДЕП характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки: грамотрицательная палочка, размерами 2-3×0,5-0,8 мкм, подвижная, спор и капсул не образует, располагается поодиночно. Растет на простых питательных средах с образованием сине-зеленого пигмента пиоцианина и слизи. На поверхности мясо-пептонного бульона дает пленку серовато-серебристого цвета, а на поверхности мясо-пептонного агара - шероховатые неправильной формы колонии.

Физиолого-биохимические признаки: мезофил, аэроб, растет при температуре от 18 до 42°С, но оптимальная температура роста 35-37°С. Окисляет глюкозу, восстанавливает нитраты до нитритов, ферментирует аргинин, разжижает желатину, свертывает молоко, разрушает эритроциты барана, образует цитохромоксидазу.

Антигенные свойства: агглютинируется типовой сывороткой 04 до титра 1:1280.

Вирулентные свойства: Вызывает гибель белых мышей при внутрибрюшинном введении 2-3×10⁶ микробных клеток.

Иммуногенные свойства: при двукратной иммунизации кроликов инактивированными формалином клетками в дозе 1-2×10¹⁰ и взрослых свиней в дозе 4-6×10¹⁰ микробных тел через 14 дней после последней иммунизации в сыворотке крови животных появляются антитела в титре 1:512-1:1024. Защитный титр антител, равный для данного штамма 1:64, сохраняется у иммунизированных животных в течение 12 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas aeruginosa №9 выращивают на бульоне Хоттингера в течение 24-46 ч при 36-37°С с рН 7,2-7,4 и постоянном встряхивании на шуттель-аппарате. По истечении срока инкубации культуру проверяют на чистоту путем окрашивания по Граму, доводят физиологическим раствором до концентрации 10 млрд. микробных клеток в 1 мл, после чего инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида до конечной концентрации 0,3-0,4% и выдерживают в течение 14 суток при температуре культивирования. После окончания срока инактивации в культуру вносят 3%-й раствор гидроокиси алюминия, фасуют во флаконы и укупоривают. Полученная вакцина представляет собой прозрачную жидкость желтовато-зеленоватого цвета с беловато-сероватым рыхлым осадком, при встряхивании образуется однородная суспензия.

Пример 2. Полученную по примеру 1 вакцину проверяют на стерильность и безвредность.

Стерильность вакцины контролируют по отсутствию роста при посеве на среды Сабуро (на грибы), Эндо (колиформные бактерии), МПА (мезофильные аэробные бактерии), Китта-Тароци (на анаэробы). Рост на всех средах отсутствовал, что свидетельствует о стерильности вакцины.

Безвредность проверяют на 3 белых мышах массой 18-20 г, которым вакцину вводят подкожно в объеме 0,3 мл и наблюдают в течение 7 дней. Все подопытные животные остались живы, на месте введения вакцины патологических изменений не было, что свидетельствует о безвредности препарата.

Пример 3. Иммуногенность вакцины оценивают по протективности при экспериментальном псевдомонозе на белых мышах и величине накопления титров специфических антител у иммунизированных вакциной кроликов и свиней.

3 группы белых мышей по 10 животных в каждой за 10 дней до заражения эпизоотическим штаммом Pseudomonas aeruginosa O4 иммунизировали: мышей 1 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9 в дозе 0,1 мл подкожно; мышей из 2 группы вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ в дозе 0,1 мл подкожно; мышам из 3 группы ввели физраствор в объеме 0,1 мл подкожно. Через 10 дней после иммунизации всех мышей заразили патогенным изолятом Pseudomonas aeruginosa серогруппы 04 в дозе 100 млн. микробных тел внутрибрюшинно. В течение 14 дней за мышами вели наблюдение и производили учет павших.

Результаты отражены в таблице 1, из которой видно, что в первой группе выжило 80% экспериментально зараженных животных, что на 30% больше, чем во второй группе, животные которой иммунизировались вакциной из эпизоотического штамма. В контрольной группе, где животным вводился физраствор, погибли все мыши. Следовательно, вакцина против псевдомоноза из штамма Pseudomonas aeruginosa №9 защитила наибольшее количество экспериментально зараженных животных, а значит она более иммуногенна, чем вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Таблица 1 -
Защитный эффект вакцин при экспериментальном псевдомонозе, обусловленном Pseudomonas aeruginosa серогруппы O4
Группа	Кол-во мышей	Пало	Выжило	Защитный эффект вакцины, %
1. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9	10	2	8	80
2. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂	10	5	5	50
3. Контроль (вводился физраствор)	10	10	-	-

Иммуногенность штамма Pseudomonas aeruginosa №9 оценивали по способности стимулировать выработку специфических антител на 10 кроликах и 10 взрослых свиньях. Для этого животных иммунизируют дважды с интервалом 14 дней кроликов в дозе 1 мл на голову, свиней - 5 мл на голову. По истечении 14, 30, 90, 180, 270 и 360 дней после последней иммунизации в реакции агглютинации определяют титры антител к Pseudomonas aeruginosa серогруппы O4.

Результаты отражены в таблице 2, из которой видно, что депонированный штамм Pseudomonas aeruginosa №9, предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней, обладает более выраженными иммуногенными свойствами, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку обеспечивает образование в 3-5 раз большего уровня специфических антител. Кроме того, в организме иммунизированных животных в группах, где использовалась вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa №9, защитный уровень антител к соматическому антигену O4 (не менее 1:64) сохранялся в течение 12 месяцев, а у животных, иммунизированных вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ - только 3-6 месяцев. Отсюда следует, что вакцина, приготовленная из штамма Pseudomonas aeruginosa №9, обеспечивает более продолжительный иммунитет, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂.

Таблица 2 -
Иммуногенность вакцин против псевдомоноза
Группа	Титр антител к соматическому антигену O4 Pseudomonas aeruginosa после иммунизации по дням
14	30	90	180	270	360
Кролики (n=10)
1. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9	1:819,2	1:1228,8	1:716,8	1:512	1:232,8	1:64
2. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂	1:273,1	1:341,3	1:204,8	1:64	1:16	1:8
Свиньи (n=10)
1. Иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9	1:1024	1:1433,6	1:716,8	1:307,2	1:256	1:83,2
2. Иммунизировалась вакциной из эпизоотического штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂	1:238,9	1:286,7	1:128	1:44,8	1:8	1:2

Пример 4. На свино-товарной ферме, неблагополучной по псевдомонозу, иммунизируют 30 поросят 2-недельного возраста полученной по примеру 1 вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9 (опытная группа) и 30 поросят аналогичного возраста вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂ (положительный контроль), 30 поросят не иммунизировались (отрицательный контроль). Бактериологическими исследованиями установлено, что заболевание вызывает Pseudomonas aeruginosa серогруппы O4. Поросята опытной группы и группы положительного контроля иммунизировались по одинаковой схеме: дважды с интервалом 14 дней внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 1,0 и 1,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 120 дней, отмечая все случаи заболевания и гибели поросят связанные с псевдомонозом.

Результаты опыта отражены в таблице 3, из материалов которой видно, что в опытной группе заболело псевдомонозом 6 поросят, из них 1 пал. В группе положительного контроля заболело 10 поросят, из которых пало 3. В группе отрицательного контроля заболело 16 поросят, из которых пало - 7. Следовательно, заболеваемость и смертность в опытной группе составила соответственно 20 и 3,3%, в группе положительного контроля - 33,3 и 10%, в группе отрицательного контроля - 50,3 и 23,3%. Сохранность поросят в опытной группе составила 96,7%, в группе положительного контроля - 90% и в группе отрицательного контроля - 76,7%.

Таблица 3 -
Профилактическая эффективность вакцины против псевдомоноза свиней из штамма Pseudomonas aeruginosa №9
Группа	Количество поросят, подвергнутых иммунизации	Заболело поросят в группе	Пало поросят в группе	Сохранность поросят, %
1. Опытная, иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa №9	30	6 (20%)	1 (3,3%)	96,7
2. Контрольная, иммунизировалась вакциной из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂	30	10 (33,3%)	3 (10%)	90,0
3. Контрольная, не иммунизировалась	30	16 (50,3%)	7 (23,3%)	76,7

Таким образом, вакцина, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, а именно из штамма Pseudomonas aeruginosa №9, обеспечивает наибольшую выживаемость животных при экспериментальном и спонтанном псевдомонозе, чем вакцина из штамма Pseudomonas aeruginosa 514₂, поскольку способна в большей степени стимулировать выработку и циркуляцию в организме иммунизированных животных специфических антител к соматическому антигену O4. Следовательно, штамм Pseudomonas aeruginosa №9 пригоден для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Штамм возбудителя псевдомоноза свиней, коллекции ФГБУ ВГНКИ, депонированный под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №9» и регистрационным номером «№9-ДЕП», предназначенный для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, и касается разработки и создания новых комбинаций, обеспечивающих потенцирование бактерицидного действия и эффективное подавление гнойной инфекции, вызываемой метициллинорезистентными стафилококками, на основе использования двух классов соединений, обладающих принципиально различным механизмом антимикробного действия.

Капли плетнева, обладающие противовирусным и иммуномодулирующим эффектами // 2553308

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к каплям, обладающим противовирусным и иммуномодулирующим эффектами. Капли, обладающие противовирусным и иммуномодулирующим эффектами, характеризующиеся тем, что они представляют собой настойку на 95%-ном этиловом спирте листьев земляники и плодов, выбранных из ряда: плоды малины обыкновенной, плоды рябины обыкновенной, плоды черники обыкновенной, плоды боярышника кроваво-красного, плоды шиповника майского, при содержании 15-25 мг субстанции в 1 мл настойки.

Полимерные кетиминовые производные антибиотика доксициклина // 2552620

Изобретение относится к химии биологически активных полимеров, конкретно к полимерным кетиминовым производным доксициклина, которые получают путем конденсации гидрохлорида доксициклина с катионными сополимерами акриламида с 2-амимноэтилметакрилатом (ММ=16-20 кДа), при молярном соотношении сополимер/антибиотик, равном 1.1-2.0/1, в водном растворе с pH 8.0 при 23°C.

Терапевтические пептиды // 2548905

Настоящее изобретение относится к пептиду, пептидомиметику или производному аминокислоты, которые содержат двузамещенную β-аминокислоту, в которой каждая из замещающих групп в β-аминокислоте, которые могут быть одинаковыми или разными, включает по меньшей мере 7 неводородных атомов, является липофильной и включает по меньшей мере одну циклическую группу, причем одна или больше циклических групп в замещающей группе могут быть связаны или конденсированы с одной или большим числом циклических групп в другой замещающей группе, и когда циклические группы слиты таким образом, совокупное общее количество неводородных атомов для таких двух замещающих групп составляет по меньшей мере 12, где указанный пептид, пептидомиметик или производное аминокислоты состоят из 1-4 аминокислот или эквивалентных по длине субъединиц.

Ингибирование организмов биопленки // 2548786

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается применения цистеамина в лечении микробной инфекции, вызванной микробной биопленкой, а также к продукту, содержащему по меньшей мере два агента против биопленки, где по меньшей мере один агент против биопленки представляет собой антимикробный пептид, а второй агент против биопленки представляет собой цистеамин.

Аралкилбензиловые простые эфиры, способ их получения, промежуточные соединения, применение таких соединений, способы лечения и/или профилактики, фармацевтическая композиция и лекарственный препарат, содержащие эти соединения // 2548009

Изобретение относится к области органической химии, а именно к бензиларалкиловому простому эфиру общей формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, где: Ar представляет собой имидазолил; R1, R2, R4 и R5 независимо представляют собой водород; R3 представляет собой галоген; R6 представляет трифторметил или трихлорметил; n представляют целое число от 0 до 2; и m представляет собой 1.

Способ лечения мастита у лактирующих овец // 2547550

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения мастита у овец. Способ включает внутримышечное введение тилозинсодержащего препарата в дозе 0,05 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 3-4 дней при всех формах мастита.

Средство "ихтиосин" // 2546030

Изобретение относится к области медицины, а именно к лекарственному средству, и может быть использовано для местного лечения трофических язв, инфицированных и длительно незаживающих гнойных ран, ожогов I-II-IIIA степени, повреждений кожи вследствие травм, гнойно-воспалительных заболеваний кожи, пролежней и др.

Формованный сорбент внииту-1пвп, способ его изготовления и способ лечения эндометрита // 2545743

Изобретение относится к области медицины, а именно к формованному сорбенту с антибактериальными свойствами для лечения эндометрита, представляющему собой нанодисперсный мезопористый углеродный материал с удельной адсорбционной поверхностью не более 50 м2/г и прочностью на раздавливание не менее 20 кг/см2, содержащему поливинилпирролидон в количестве не менее 5,0%, характеризующемуся тем, что выполнен в виде цилиндров диаметром 2-4 мм, длиной 15-25 мм с одним внутренним каналом круглого сечения, к способу его изготовления, а также к способу лечения эндометрита.

Способ получения бальзама шостаковского и лекарственное средство на его основе // 2545705

Группа изобретений относится к медицине и касается способа получения бальзама Шостаковского, включающего смешение винилбутилового эфира и бутилового спирта, далее при непрерывном перемешивании прогревание реакционной массы, после достижения требуемой температуры осуществление подачи катализатора, затем проведение очистки полученного полимера от примесей, слив полимера, подогретого до температуры 50-70°C, в тару через многослойный фильтр; лекарственного средства, обладающего ранозаживляющим, бактериостатическим и анальгезирующим свойствами, полученного указанным способом.

Штамм бактерий pseudomonas aeruginosa для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней // 2553558

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №6-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Штамм бактерий pseudomonas aeruginosa для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней // 2553555

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм Pseudomonas aeruginosa №1 КВЛ-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Штамм бактерий pseudomonas aeruginosa для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней // 2553554

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №25-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Штамм бактерий pseudomonas aeruginosa для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней // 2553553

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa №34-ДЕП депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ.

Штамм бактерии pseudomonas aeruginosa // 2553306

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Штамм Pseudomonas aeruginosa O11 депонирован в коллекции ФГБУ ВГНКИ под наименованием «Pseudomonas aeruginosa №10» и регистрационным номером «№10-ДЕП».

Способ получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза // 2540902

Изобретение относится к способу получения антигенного эритроцитарного диагностикума для обнаружения антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза. Указанный способ включает стерилизацию культуры авирулентного штамма Burkholderia pseudomallei 107, суспендирование высушенной бактериальной массы в 0,15 М растворе NaCl, обработку полученной суспензии ультразвуком, центрифугирование взвеси разрушенных клеток с последующим отделением супернатанта и высаливание из него гликопротеиновой фракции, на основе которой получают диагностикум.

Вакцина против псевдомоноза нутрий // 2388488

Изобретение относится к ветеринарной медицине. .

Способ изготовления вакцины против псевдомоноза нутрий // 2388487

Изобретение относится к ветеринарной медицине. .

Улучшенные везикулы наружной мембраны бактерий // 2325184

Способ изготовления вакцины против псевдомоноза свиней // 2309767

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. .

Способ получения 7-гидроксиройлеанона, обладающего антимикробным действием // 2554501

Изобретение относится к способу получения 7-гидроксиройлеанона, обладающего антимикробным действием. Указанный способ включает экстракцию измельченных корней шалфея лекарственного 96% этиловым спиртом с последующим упариванием экстракта, обработкой водой, отгонкой спирта и обработкой гидрофобным растворителем или экстракцию указанного сырья хлороформом с последующей обработкой экстракта водой и упариванием; затем целевой продукт извлекают из органической фазы переведением в растворимые в воде феноляты, обрабатывая водным раствором гидроксида натрия; промывают щелочной раствор хлороформом; подкисляют соляной или серной кислотой; полученный осадок отфильтровывают; сушат и измельчают. Изобретение характеризуется улучшенной технологичностью процесса и обеспечивает получение из корней шалфея лекарственного индивидуального вещества с более высокой антимикробной активностью, чем ранее выделенные производные ройлеанона. 2 табл., 6 пр.