Иммуногенные композиции bordetella bronchiseptica

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены вакцинная композиция, содержащая Bordetella bronchiseptica и выделенный пертактиновый антиген, и применение вакцинной композиции для лечения и предупреждения комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак. Предложенная вакцина, содержащая одновременно бактерин или бактериальный экстракт Bordetella bronchiseptica и выделенный белок пертактин, позволяет предупредить развитие комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак, вызванных как Bordetella bronchiseptica, так и такими патогенами, как вирус собачьего парагриппа, собачий аденовирус-2, собачий респираторный коронавирус и вирус собачьего гриппа. Вакцинная композиция может быть использована для профилактики и лечения перечисленных инфекций в ветеринарии. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области иммунологии, в частности к области иммуногенных композиций и комозиций вакцин. Более конкретно, настоящее описание относится к композициям, содержащим препарат Bordetella bronchiseptica в комбинации с пертактином для лечения или предупреждения респираторного(ых) заболевания(ий) у собаки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Bordetella bronchiseptica представляет собой грамотрицательную бактерию, которая колонизирует респираторный тракт собак и вызывает трехеобронхит или «кашель псарен». Hawkins, E.C., Veterinary Internal Medicine (1995), pp.767-811. Bordetella bronchiseptica предрасполагает собак к влиянию других респираторных агентов и часто существует одновременно с ними. К настоящему времени доступен ряд вакцин для лечения трахеобронхита, вызванного Bordetella bronchiseptica, включая Nobivac®, Bronchi-Shield®, Bronchicine® CAe, Vanguard® B, Univac 2, Recombitek® KC2, Naramune™-2 и Kennel-Jec™ 2.

Однако для большинства существующих имеющихся в продаже вакцин требуется обременительное интраназальное введение, а также добавление адъювантов, что может приводить к вредным побочным эффектам, таким как жжение и раздражение. Viera Scheibner et al., Nexus Dec 2000 (Vol 8, No1). Вакцины для интраназального введения не популярны у практикующих ветеринаров из-за их личного риска при работе с беспокойными животными во время введения вакцины. Были исследованы субъединичные вакцины, такие как вакцины, предполагающие применение белка p68 Bordetella bronchiseptica (пертактин), но до настоящего времени они не были включены в какие-либо имеющиеся в продаже вакцины для собак, возможно из-за недостаточной иммуногенности, реактивности и/или стабильности композиции.

Bordetella bronchiseptica является значимым фактором в комплексе инфекционных респираторных заболеваний собак (CIRDC), который представляет собой высокозаразное заболевание, обычное у собак, содержащихся в скученных условиях, таких как центры по поиску новых хозяев, гостиницы или тренировочные центры для собак. Патогенез CIRDC считается многофакторым, включающим несколько вирусов и бактерий. Инфекционные агенты, известные в качестве возбудителей CIRDC, помимо бактерии Bordetella bronchiseptica (Bemis et al., Lab. Anim. Sci., 29:48-52, 1977), включают собачий респираторный коронавирус (CRCoV) (Erles et al., Virology, 310(2):216-223, 2003), вирус собачьего гриппа (CIV) (Crawford et al., Science, 310(5747):482-485, 2005), вирус собачьего парагриппа (CPIV) (Binn et al., Exp.Biol. Med., 126:140-145, 1967), Mycoplasma cynos (Chalker et al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004) и собачий аденовирус серотипа 2 (CAV-2) (Ditchfield et al., Can. Vet. J., 3:238-247, 1962). До настоящего времени не появилось комплексной комбинированной вакцины против всех или большинства вышеупомянутых патогенов.

Соответственно, сохраняется потребность в иммуногенной композиции, которую можно безопасно вводить собаке парентерально, которая обеспечивает длительно действующую иммунную защиту против Bordetella bronchiseptica без вредных побочных эффектов или взаимодействия с другими антигенами в комбинированной вакцине или подвергания риску практикующего ветеринара. Настоящее описание удовлетворяет эти и другие связанные с ними потребности.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая, среди прочих, Bordetella bronchiseptica и выделенный пертактиновый антиген. В другом воплощении указанный пертактиновый антиген представляет собой рекомбинантный белок. В другом воплощении указанный пертактиновый антиген происходит из Bordetella bronchiseptica. В другом воплощении указанный пертактиновый антиген представляет собой p68. В другом воплощении указанная композиция дополнительно содержит выделенный антиген Bsp22.

В другом воплощении компонент в виде Bordetella bronchiseptica представляет собой бактерии или бактериальный экстракт. В другом воплощении указанная композиция не является адъювантной. В другом воплощении указанная композиция дополнительно содержит адъювант.

В другом воплощении указанный пертактиновый антиген присутствует в количестве от примерно 1 мкг до примерно 30 мкг. Более конкретно, указанный пертактин присутствует в количестве от примерно 5 мкг до примерно 20 мкг, еще более конкретно - от примерно 7 мкг до примерно 15 мкг и даже более конкретно - примерно 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг или 20 мкг. Предпочтительно указанный пертактиновый антиген получают путем солюбилизации телец включений пертактина в мочевине и возможно очистки колоночной хроматографией. Указанные пертактиновые антигены являются растворимыми и предпочтительно по существу не содержат агрегатов.

Согласно другому воплощению предложена иммуногенная композиция, содержащая множество антигенов в виде рекомбинантного пертактина p68, где указанная композиция по существу не содержит агрегатов p68. Более конкретно, указанное множество антигенов в виде рекомбинантного пертактина p68 получают путем солюбилизации телец включений пертактина в мочевине и возможно очистки колоночной хроматографией. Согласно изобретению также предложены способы получения антигенов в виде пертактина p68 путем солюбилизации телец включений пертактина в мочевине и возможно очистки колоночной хроматографией.

В другом воплощении указанная композиция разработана для парентерального введения, так что она дополнительно содержит разбавитель или эксципиент для парентерального введения собаке.

В другом воплощении указанная композиция дополнительно содержит антиген из собачьего респираторного патогена, выбранного из группы, состоящей из вируса собачьего парагриппа (CPIV), собачьего аденовируса-2 (CAV-2), собачьего респираторного коронавируса (CRCoV) и вируса собачьего гриппа (CIV). В более конкретном воплощении указанная композиция содержит по меньшей мере два, три или четыре антигена из собачьих респираторных патогенов.

В другом воплощении описанные здесь иммуногенные композиции не содержат нереспираторных антигенов. Таким образом, согласно одному воплощению изобретения предложена композиция, как раскрыто в данном описании, при условии, что она не включает нереспираторный антиген. Нереспираторные антигены не вызывают у субъекта респираторное заболевание. Неограничивающие примеры таких нереспираторных антигенов включают вирус бешенства, собачий парвовирус, энтеральный собачий коронавирус, виды Leptospira и Borrelia burgdorferi.

В другом воплощении указанный антиген происходит из собачьего респираторного коронавируса (CRCoV). В другом воплощении указанный антиген происходит из вируса собачьего гриппа (CIV). В другом воплощении указанный антиген происходит из вируса собачьего парагриппа (CPIV). В другом воплощении указанный антиген происходит из собачьего аденовируса-2 (CAV-2). В другом воплощении указанный антиген происходит из вируса собачьего парагриппа (CPIV) и собачьего аденовируса-2 (CAV-2).

В другом воплощении указанная композиция содержит антигены из вируса собачьего парагриппа (CPIV), собачьего аденовируса-2 (CAV-2), собачьего респираторного коронавируса (CRCoV) и вируса собачьего гриппа (CIV).

В другом воплощении композиция индуцирует иммунный ответ на Bordetella bronchiseptica и по меньшей мере один из следующего: вирус собачьего парагриппа (CPIV), собачий аденовирус-2 (CAV-2), собачий респираторный коронавирус (CRCoV) и вирус собачьего гриппа (CIV).

Согласно другому воплощению изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая собачий респираторный коронавирус (CRCoV), препарат Bordetella bronchiseptica и вирус собачьего гриппа (CIV). Более конкретно, указанная композиция содержит выделенный пертактиновый антиген.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложен способ или применение иммуногенной композиции по любому из вышеупомянутых воплощений для лечения или предупреждения инфекции собачьим респираторным патогеном у собаки. В другом воплощении указанная композиция предупреждает инфекцию указанным собачьим респираторным патогеном у указанной собаки в течение 6-месячного или большего периода. В другом воплощении указанная композиция предупреждает инфекцию указанным собачьим респираторным патогеном у указанной собаки в течение примерно 1 года.

В другом воплощении собачий респираторный патоген представляет собой Bordetella bronchiseptica. В другом воплощении собачий респираторный патоген дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующего: вирус собачьего парагриппа (CPIV), собачий аденовирус-2 (CAV-2), собачий респираторный коронавирус (CRCoV) и вирус собачьего гриппа (CIV).

Согласно другому воплощению настоящего изобретения предложен способ или применение иммуногенной композиции по любому из вышеупомянутых воплощений для лечения или предупреждения комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак (CIRDC), где композиция лечит или предупреждает инфекцию множеством собачих респираторных патогенов. Согласно другому воплощению предложено применение или способ парентерального введения иммуногенной композиции, как здесь описано.

Согласно другому воплощению предложено изготовление лекарственного средства, содержащего иммуногенную композицию для лечения или предупреждения инфекции собачьим респираторным патогеном у собаки.

Эти и другие воплощения, отличительные признаки и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания и прилагаемой формулы изобретения, изложенных здесь ниже. Понятно, что каждое из вышеупомянутых и следующих воплощений может быть объединено в одно воплощение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К данному описанию применяются приведенные ниже определения. Они заменяют собой любые противоречащие определения, содержащиеся в каждой индивидуальной ссылке, включенной сюда посредством ссылки. Неопределенные слова имеют значение, обычно используемое специалистом в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе будут включать термины во множественном числе и термины во множественном числе будут включать термины в единственном числе.

«Примерно» или «приблизительно» при использовании в связи с измеримой численной переменной относятся к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанного значения (например, в пределах 95%-ного доверительного интервала среднего значения) или в пределах 10 процентов указанного значения, в зависимости от того, какое из этих значений больше. Если «примерно» используется в ссылке на интервал времени в неделях, «примерно 3 недели» составляет от 17 до 25 суток и «от примерно 2 до примерно 4 недель» составляет от 10 до 40 суток.

Термин «адъювант» в том виде, как он здесь используется, относится к любому веществу, которое служит в качестве неспецифичного стимулятора иммунного ответа. Смотрите ниже дополнительне описание адъювантов.

Термин «животное» в том виде, как он здесь используется, включает любое животное, которое чувствительно к инфекции Bordetella bronchiseptica и/или комплексу респираторных заболеваний собак, включая млекопитающих, как одомашненных, так и диких. Предпочтительно термин «животное» в том виде, как он здесь используется, относится к собаке или к человеку.

Термин «антитело» в том виде, как он здесь используется, представляет собой любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт, независимо от источника, способа получения или других характеристик. Он относится к молекуле иммуноглобулина или к ее фрагменту, который специфично связывается с антигеном в результате иммунного ответа на данный антиген. Иммуноглобулины представляют собой белки сыворотки, состоящие из «легких» и «тяжелых» полипептидных цепей, имеющих «константные» и «вариабельные» области, и они делятся на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) на основе состава константных областей. Антитело, которое является «специфичным» в отношении данного антигена, означает, что вариабельные области этого антитела распознают и связываются исключительно с конкретным антигеном. Этот термин включает поликлональное антитело, моноклональное антитело, моноспецифичное антитело, полиспецифичное антитело, гуманизированное антитело, тетрамерное антитело, четырехвалентное антитело, мультиспецифичное антитело, одноцепочечное антитело, домен-специфичное антитело, однодоменное антитело, антитело с удаленным доменом, слитый белок, слитый белок ScFc, химерное антитело, синтетическое антитело, рекомбинантное антитело, гибридное антитело, мутировавшее антитело и антитела с пересаженными CDR (гипервариабельная область), но не ограничивается ими. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, происходящими из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. «Антитело» может быть превращено в антигенсвязывающий белок, который включает, без ограничения ими, фрагменты антител, которые включают, без ограничения ими: Fab, F(ab′)₂, фрагмент Fab′, фрагмент Fv, одноцепочечный фрагмент Fv (ScFv), фрагмент Fd, фрагмент dAb, диатела, пептид CDR3, «ограниченный» пептид FR3-CDR3-FR4, нанотело, двухвалентное нанотело, малое модульное иммунофармацевтическое вещество (SMIP) и минитело; и любой из вышеупомянутых фрагментов или их аналогов, полученных в результате химической или генетической манипуляции, а также другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию. Типично такие фрагменты содержали бы антигенсвязывающий домен. Как будет понятно специалистам в данной области, любую из таких молекул можно конструировать (например, возвращать им последовательность зародышевой линии) для уменьшения ее иммуногенности, увеличения ее аффинности, изменения ее специфичности или для других целей.

Термин «антиген» или «иммуноген» в том виде, как он здесь используется, относится к молекуле, содержащей один или более чем один эпитоп (линейный, конформационный или оба), которая, при воздействии на субъект, будет индуцировать иммунный ответ, который является специфичным в отношении данного антигена. Эпитоп представляет собой специфичный сайт антигена, который связывается с рецептором Т-клетки или специфичным антителом и типично содержит от примерно 3 аминокислотных остатков до примерно 20 аминокислотных остатков. Термин антиген относится к субъединичным антигенам - антигенам, отдельным и обособленным от целого организма, с которым антиген ассоциирован в природе, а также к умерщвленным, ослабленным или инактивированным бактериям, вирусам, грибкам, паразитам или другим микробам. Термин антиген также относится к антителам, таким как антиидиотипические антитела или их фрагменты, и к синтетическим пептидным мимотопам, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин антиген также относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, как, например, в приложениях по ДНК иммунизации.

Термин «антигенность» в том виде, как он здесь используется, относится к способности белка или полипептида быть иммуноспецифично связанным антителом, индуцированным против белка или полипептида.

Термин "Bordetella bronchiseptica" или "B. bronchiseptica" относится к живой ослабленной бактерии Bordetella bronchiseptica, экстракту умерщвленных цельных клеток (бактерину) Bordetella bronchiseptica или клеточному бактериальному экстракту Bordetella bronchiseptica.

Термин «буфер» означает химическую систему, которая предотвращает изменение концентрации другого химического вещества. Системы доноров и акцепторов протонов служат в качестве буферов, предотвращая заметные изменения концентрации ионов водорода (pH). Другим примером буфера является раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (сопряженное основание) или слабого основания и его соли (сопряженная кислота).

Термин «собачий» в том виде, как он здесь используется, включает то, что обычно называют собакой, но он включает и других членов семейства Canidae.

Термин «линия клеток» или «клетка-хозяин» в том виде, как он здесь используется, означает прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой может реплицироваться или поддерживаться вирус.

Термин «культура» в том виде, как он здесь используется, означает популяцию клеток или микроорганизмов, растущую в отсутствие других видов или типов.

Термин «доза» относится к вакцине или иммуногенной композиции, которую дают субъекту. «Первая доза» или «примирующая доза» относится к дозе такой композиции, которую дают в Сутки 0. «Вторая доза» или «третья доза» или «ежегодная доза» относятся к количеству такой композиции, которое дают после первой дозы, причем эта копмозиция, может быть, однако не обязательно является той же вакциной или иммуногенной композицией, что и первая доза.

«Эпитоп» представляет собой специфичный сайт антигена, который связывается с рецептором T-клетки или специфичным антителом и типично содержит от примерно 3 аминокислотных остатков до примерно 20 аминокислотных остатков.

Термин «эксципиент» в том виде, как он здесь используется, относится к компоненту вакцины или иммуногенной композиции в виде нереакционноспособного носителя, который не является антигеном. Предпочтительными эксципиентами являются эксципиенты, известные в области парентеральной инъекции.

Термин «фрагмент» относится к усеченной части белка или гена. Термины «функциональный фрагмент» и «биологически активный фрагмент» относятся к фрагменту, который сохраняет биологические свойства полноразмерного белка или гена.

Термин «гомология» или «процент гомологии» относится к процентной доле нуклеотидов или аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными или аналогичными остаткам в сравниваемой(ых) последовательности(ях) после выравнивания последовательностей и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента гомологии последовательности; и также рассмотрения любых консервативных замен в качестве части гомологии последовательностей.

«Гомологи» или «видовые гомологи» включают гены, обнаруженные у двух или более чем двух разных видов, которые обладают существенной гомологией полинуклеотидной последовательности и обладают такими же или аналогичными биологическими функциями и/или свойствами. Предпочтительные полинуклеотидные последовательности, которые представляют собой видовые гомологи, будут гибридизоваться при умеренно жестких условиях, как описано здесь посредством примера, и обладают такими же или аналогичными биологическими активностями и/или свойствами. В другом аспекте полинуклеотиды, представляющие собой видовые гомологи, будут иметь больше чем примерно 60% гомологии последовательности, больше чем примерно 70% гомологии последовательности, больше чем примерно 80% гомологии последовательности, больше чем примерно 90% гомологии последовательности, больше чем примерно 95% гомологии последовательности, больше чем примерно 96% гомологии последовательности, больше чем примерно 97% гомологии последовательности, больше чем примерно 98% гомологии последовательности или больше чем примерно 99% гомологии последовательности.

Термин «идентичность» или «процент идентичности» относится к процентной доле нуклеотидов или аминокислот в последовательности кандидате, которые являются идентичными остаткам в сравниваемой последовательности после выравнивания обеих последовательностей и, если необходимо, введения пробелов для достижения максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривая любые консервативные замены в качестве части идентичности последовательностей.

Термин «иммунный ответ» у субъекта в том виде, как он здесь используется, относится к развитию гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Термин «гуморальный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, который по меньшей мере частично опосредован антителами. «Клеточный иммунный ответ» представляет собой иммунный ответ, опосредованный T-лимфоцитами или другими белыми кровяными клетками, либо и теми, и другими, и включает продукцию цитокинов, хемокинов и аналогичных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками, белыми кровяными клетками, либо и теми, и другими. Иммунные ответы можно определять с использованием стандартных иммуноанализов и анализов нейтрализации, которые известны в данной области.

Термин «иммуногенность» в том виде, как он здесь используется, относится к способности белка или полипептида индуцировать иммунный ответ, специфично направленный против бактерии или вируса, который вызывает идентифицированное заболевание.

«Иммуногенная композиция» представляет собой препарат, содержащий иммуноген, включающий, например, белок, пептид, цельную клетку, инактивированный, субъединичный или ослабленный вирус, или полисахарид, либо их комбинацию, вводимый для стимулирования гуморальной и клеточной иммунных систем реципиента к одному или более чем одному антигену, присутствующему в иммуногенной композиции. «Иммунизация» представляет собой процесс введения иммуногенной композиции и стимулирования иммунного или иммуногенного ответа на антиген у хозяина. Предпочтительными хозяевами являются млекопитающие, такие как собаки. Предпочтительно иммуногенной композицией является вакцина.

Фраза «иммунологически защищающее количество» в том виде, как она здесь используется, представляет собой эффективное количество антигена для индукции иммуногенного ответа у реципиента, который является адекватным для предупреждения или ослабления признаков или симптомов заболевания, включая вредные эффекты на здоровье или их осложнения. Могут быть индуцированы либо гуморальный иммунитет, либо клеточно-опосредованный иммунитет, либо оба. Иммуногенный ответ животного на композицию можно оценивать, например, опосредованно через измерение титров антител, анализы пролиферации лимфоцитов, либо непосредственно через отслеживание признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, который дает композиция или вакцина, можно оценивать измерением, например, уменьшения выделения заражающих организмов, уменьшения клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температура и общее физическое состояние, здоровье и поведение субъекта. Иммунный ответ может включать в себя, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета. Количество композиции или вакцины, которое является терапевтически эффективным, может варьировать, в зависимости от конкретного использованного организма или состояния животного, которое лечат или вакцинируют, и может быть определено ветеринаром.

Термин «интраназальное» введение в том виде, как он здесь используется, относится к введению вещества, такого как вакцина или другая композиция, в организм субъекта через или посредством носа и включает транспорт вещества прежде всего через слизистую носа.

Термин «выделенный» относится к веществу, которое либо находится в по существу чистой форме, например, имеет чистоту больше чем примерно 95%; либо является определенным образом извлечен из его естественной среды путем очистки или обогащения. Ссылка на «выделенный пертактин» указывает на белок пертактин, который перемещен из его естественной среды, как, например, из животного-хозяина/собаки, в ростовые среды или очищен из цельноклеточного препарата Bordetella bronchiseptica и может затем быть добавлен в композицию, содержащую экстракт Bordetella bronchiseptica (т.е. композицию с внесенными изолятами пертактина). Термин «выделенный» охватывает иммуногены, которые находятся в растворе с другими агентами/разбавителями/эксципиентами/адъювантами/белками.

Термин «медицинский агент» относится к любому агенту, который является полезным в предупреждении, лечении или улучшении медицинского состояния, или предупреждении некоторого физиологического состояния или проявления.

Термин «моноклональное антитело» в том виде, как он здесь используется, относится к антителам, продуцируемым отдельной линией гибридомных клеток, все из которых направлены к одному эпитопу на конкретном антигене. Антиген, используемый для получения моноклонального антитела, может быть предоставлен в виде выделенного белка патогена или цельного патогена. «Гибридома» представляет собой клональную линию клеток, которая состоит из гибридных клеток, образованных слиянием миеломной клетки и клетки, продуцирующей специфичные антитела. В общем, моноклональные антитела имеют мышиное происхождение. Однако, термин «моноклональное антитело» также относится к клональной популяции антител, полученных против конкретного эпитопа антигена, полученного технологией фагового дисплея или способом, который является эквивалентным фаговому дисплею, или к гибридным клеткам немышиного происхождения.

Термин «оральное» или «пероральное» введение в том виде, как он здесь используется, относится к введению вещества, такого как вакцина или другая композиция, в организм субъекта через или посредством рта и включает в себя проглатывание или транспорт через слизистую рта (например, подъязычное или щечное поглощение), либо и то, и другое. Внутритрахеальное введение также является способом орального или перорального введения.

Термин «ороназальное» введение в том виде, как он здесь используется, относится к введению вещества, такого как композиция или вакцина, в организм субъекта через или посредством носа и рта, как происходило бы, например, при помещении одной или более чем одной капли в нос. Ороназальное введение включает транспортные процессы, ассоциированные с пероральным и интраназальным введением.

Термин «парентеральное введение» в том виде, как он здесь используется, относится к введению вещества, такого как композиция или вакцина, в организм субъекта через или посредством пути, который не включает пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, внутриартериальное и внутривенное введение. Для целей данного описания парентеральное введение исключает пути введения, которые прежде всего включают в себя транспорт вещества через ткань слизистой во рту, носу, трахее и легких.

Термин «патоген» или «патогенный микроорганизм» в том виде, как он здесь используется, означает микроорганизм, например CPIV, CAV-2, CRCoV, Mycoplasma cynos, CIV или Bordetella bronchiseptica, который способен индуцировать или вызывать у его животного-хозяина заболевание, недомогание или ненормальное состояние, предпочтительно респираторное заболевание, такое как CIRDC.

Термин «пертактин» в том виде, как он здесь используется, относится к белку наружной мембраны Bordetella. Предпочтительно пертактин происходит из B. bronchiseptica, и наиболее предпочтительно представляет собой «p68» и кодируется геном prnА. Пертактин может быть выделен в его нативной форме из Bordetella bronchiseptica, или он может быть получен рекомбинантно. Последовательности и примеры пертактина приведены в патенте США №7736658, содержание которого тем самым включено посредством ссылки. Используемый здесь пертактиновый антиген включает липидированные формы белка.

Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к веществам, которые, в рамках медицинской точки зрения, подходят для применения в контакте с тканями субъектов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа и тому подобного, соразмерно приемлемому отношению пользы к риску, и являются эффективными для их намеченного применения.

Термин «поликлональное антитело» в том виде, как он здесь используется, относится к смешанной популяции антител, полученных против конкретного патогена или антигена. В общем, данная популяция содержит множество групп антител, причем каждая группа направлена на конкретный эпитоп патогена или антигена. Для получения поликлональных антител цельный патоген или выделенный антиген вводится в хозяина посредством инокуляции или инфекции, что индуцирует хозяина к образованию антител против патогена или антигена.

Термин «полинуклеотид» в том виде, как он здесь используется, означает молекулу органического полимера, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепь. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) представляют собой примеры полинуклеотидов с различной биологической функцией.

Термин «полипептид» в том виде, как он здесь используется, означает молекулу органического полимера, состоящую из двух или более чем двух аминокислот, связанных в цепь.

Фраза «предупреждение инфекции» в том виде, как она здесь используется, означает предупреждение или ингибирование репликации бактерии или вируса, которые вызывают идентифицированное заболевание, для ингибирования передачи бактерии или вируса, для предотвращения колонизации хозяина бактерией или вирусом, или для облегчения симптомов заболевания, вызванного инфекцией. Лечение считается терапевтическим, если имеется уменьшение бактериальной или вирусной нагрузки.

Термины «защита», «осуществление защиты», «защитный иммунитет» и тому подобное в том виде, в котором они здесь используются в отношении вакцины или другой композиции, означают то, что вакцина или композиция предупреждает или ослабляет симптомы заболевания, вызванного организмом, из которого получен(ы) антиген(ы), используемый(е) в вакцине или композиции. Термины «защита», «осуществление защиты» и тому подобное также означают то, что вакцину или композицию можно использовать для «лечения» заболевания или одного или более чем одного симптома заболевания, которое уже существует у субъекта.

Термин «респираторное» введение в том виде, как он здесь используется, относится к введению вещества, такого как вакцина или другая композиция, в организм субъекта через или посредством ингаляции распыляемого (атомизированного) вещества. При респираторном введении механизм первичного транспорта включает поглощение атомизированного вещества через слизистую в трахеях, бронхах и легких и, следовательно, отличается от интраназального или перорального введения.

Термины «специфичное связывание», «связывается специфично» и тому подобное определяются как две или более чем две молекулы, которые образуют комплекс, который можно измерить при физиологических условиях или условиях анализа и который является избирательным. Считают, что антитело или другой ингибитор «специфично связывается» с белком, если, при правильно выбранных условиях, такое связывание по существу не ингибируется, тогда как неспецифичное связывание в то же самое время ингибируется. Специфичное связывание характеризуется высокой аффинностью и является селективным в отношении соединения или белка. Неспецифичное связывание обычно имеет низкую аффинность. Связывание у антител IgG, например, обычно характеризуется аффинностью по меньшей мере примерно 10^-7 М или выше, как, например, по меньшей мере примерно 10^-8 M или выше, или по меньшей мере примерно 10^-9 M или выше, или по меньшей мере примерно 10^-10 M или выше, или по меньшей мере примерно 10^-11 M или выше, или по меньшей мере примерно 10^-12 M или выше. Данный термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен является специфичным в отношении конкретного эпитопа, который не несут многочисленные антигены, причем в данном случае антитело, несущее данный антигенсвязывающий домен, обычно не будет связываться с другими антигенами.

Термин «специфичный иммуногенный фрагмент» в том виде, как он здесь используется, относится к части последовательности, которая распознается антителом или T-клеткой, специфичной в отношении данной последовательности.

Термин «субъект» в том виде, как он здесь используется, относится к любому животному, имеющему иммунную систему, что включает в себя млекопитающих, таких как собаки.

Фраза «по существу идентичный» в том виде, как она здесь используется, относится к степени идентичности последовательности по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%.

Термины «субъединичная вакцина» и «субъединичная композиция» в том виде, как они здесь используются, относятся к типу вакцины или композиции, которая включает антигены, но не все антигены, которые получены из или являются гомологичными антигенам из интересующего патогена, такого как вирус, бактерия, паразит или грибок. Такая композиция или вакцина по существу не содержит интактных патогенных клеток или патогенных частиц, или лизат таких клеток или частиц. Таким образом, субъединичная вакцина или субъединичная композиция может быть получена из по меньшей мере частично очищенных или по существу очищенных иммуногенных полипептидов из патогена или из их аналогов. Способы получения антигена или антигенов в субъединичной вакцине или субъединичной композиции включают стандартные методики очистки, рекомбинантную продукцию или химический синтез. Термины «субъединичная вакцина» и «субъединичная композиция», таким образом, относятся к вакцине или композиции, состоящей из определенного антигенного компонента или компонентов вируса, бактерии или другого иммуногена. Предпочтительно субъединичный компонент по настоящему изобретению продуцируется рекомбинантно, и наиболее предпочтительно он представляет собой пертактин (p68).

Термин «TCID₅₀» относится к «дозе заражения культуры ткани» и определяется как такое разведение вируса, которое требуется для заражения 50% данной партии инокулированных клеточных культур. Для расчета TCID₅₀ можно использовать разные методы, включая метод Спирмена-Карбера, который используется во всей данной заявке. Для описания метода Спирмена-Карбера смотрите B.W. Mahy & H.O. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996).

Термин «терапевтический агент» в том виде, как он здесь используется, относится к любой молекуле, соединению, вирусу или обработке, предпочтительно к ослабленному или умерщвленному вирусу, или к субъединице, или соединению, которое способствует лечению вирусной, бактериальной, паразитарной или грибковой инфекции, заболевания или вызванного ими состояния.

Термин «терапевтически эффективное количество» в том виде, как он здесь используется, относится к количеству антигена или вакцины, или композиции, которое индуцировало бы иммунный ответ у субъекта (например, собаки), получающего антиген или вакцину или композицию, которое является адекватным для предупреждения или облегчения признаков или симптомов заболевания, включая вредные для здоровья эффекты или их осложнения, вызванные инфекцией патогеном, таким как вирус, бактерия, паразит или грибок. Может индуцироваться гуморальный иммунитет или клеточно-опосредованный иммунитет, или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет. Иммуногенный ответ животного на антиген, вакцину или композицию можно оценивать опосредованно через измерение титров антитела, анализы пролиферации лимфоцитов, или непосредственно через отслеживание признаков и симптомов после заражения штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, который дается вакциной или композицией, можно оценивать измерением уменьшения выделения инфицирующего организма и/или по уменьшению клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температура и общее физическое состояние, здоровье и поведение субъекта. Количество вакцины или композиции, которое является терапевтически эффективным, может варьировать, в зависимости от конкретного использованного иммуногена или состояния субъекта, и оно может быть определено специалистом в данной области.

Термины «лечить» или «проведение лечения» в том виде, как они здесь используются, относятся к обращению, облегчению, ингибированию развития или предупреждению расстройства, состояния или заболевания, к которому применяется данный термин, или к предупреждению одного или более чем одного симптома такого расстройства, состояния или заболевания.

Термин «лечение» в том виде, как он здесь используется, относится к акту «проведения лечения», как было непосредственно определено выше.

Термин «вакцина» или «композиция вакцины» в том виде, как он здесь используется, относится к иммуногенной композиции, выбранной из вируса или бактерии, которые могут быть живыми модифицированными, ослабленными, или умерщвленными, либо к субъединичной вакцине, либо к любой комбинации вышеупомянутого. Введение вакцины субъекту приводит к иммунному ответу. Вакцину можно вводить непосредственно в субъекта любым известным путем введения, включая парентеральный, пероральный и тому подобное. Данные термины означают композицию, которая предупреждает или ослабляет инфекцию, или которая предупреждает или ослабляет один или более чем один признак или симптом инфекции. Защитные эффекты композиции вакцины против патогена обычно достигаются индуцированием иммунного ответа субъекта. В общих чертах, исчезнувшая или пониженная заболеваемость от инфекции, ослабление признаков или симптомов, или ускоренное устранение микроорганизма из инфицированных субъектов указывают на защитные эффекты композиции вакцины. Композиции вакцины по настоящему изобретению дают защитные эффекты против инфекций, вызванных патогенами собачьих респираторных заболеваний.

Фраза «ветеринарно приемлемый» в том виде, как она здесь используется, относится к веществам, которые, в рамках медицинской точки зрения, являются подходящими для применения в контакте с тканями ветеринарных субъектов без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа и тому подобного, соразмерно приемлемому отношению пользы к риску, и являются эффективными для их намеченного применения.

Фраза «ветеринарно приемлемый носитель» в том виде, как она здесь используется, относится к среде-носителю, которая не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента и не является токсичной для ветеринарного субъекта, которому ее вводят.

Антигены, иммуногенные композиции и вакцины

Настоящее описание основано на неожиданном открытии того, что включение выделенных пертактиновых антигенов в сочетании с препаратом Bordetella bronchiseptica приводит к существенно улучшенной эффективности и безопасности. То есть, при введении собаке парентерально до бактериального заражения композиция предупреждает начало трахеобронхита и не приводит к вредным побочным эффектам.

Согласно настоящему изобретению также предложены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие один или более чем один вирус и бактерию или субъединицу, которые подходят для введения собаке для лечения CIRDC. Собачий респираторный коронавирус (CRCoV), охватываемый данным изобретением, можно охарактеризовать как коронавирус, присутствующий в респираторном тракте собак с инфекционным респираторным заболеванием. Филогенетически CRCoV является наиболее близкородственным коровьему коронавирусу (BCoV), человеческому коронавирусу (HCoV) штамма OC43 и вирусу гемагглютинирующего энцефаломиелита (HEV); энтеральный собачий коронавирус (CCoV) является лишь отдаленно родственным CRCoV. Репрезентативный пример CRCoV, подходящего для применения в настоящем изобретении, включает штамм, идентифицированный как штамм CRCoV 4182 (Erles et al., Virus Res., 124:78-87, 2007).

Антигеном вируса гриппа, охватываемым данным изобретением, может быть любой идентифицированный штамм вируса гриппа из любой птицы или млекопитающего, включающий вирус гриппа, имеющий гемагглютинин подтипа НЗ и нейраминидазу подтипа N8, или подтип H3N8, чаще называемый вирусом H3N8, но не ограничивающийся им. Вирус гриппа может происходить из млекопитающего или птицы, включая, без ограничения ими, происхождение из свиньи, лошади или собаки. В одном воплощении используется антиген собачьего гриппа. В одном воплощении используется антиген лошадиного гриппа. В одном воплощении используется штамм, имеющий гликопротеины подтипа, обозначенного как H3 или N8. В одном воплощении используется штамм, имеющий гликопротеины обоих подтипов H3 и N8.

Антигены гриппа, охватываемые данным изобретением, могут быть выделены из собак, лошадей, свиней и птиц, как домашних, так и диких. Животные, выбранные для отбора образцов, должны демонстрировать острые и/или подострые клинические синдромы, которые могут включать респираторные симптомы и лихорадку от умеренной до тяжелой. Животные также могут демонстрировать признаки анорексии и вялости. Способы выделения вируса хорошо известны специалистам в данной области и включают: инокулирование культур клеток млекопитающих или птиц, инокулирование яиц с зародышами образцами назальной или глоточной слизи из клинических образцов, отбор посредством мазка носовых ходов или глотки, или посредством отбора таких тканей, как селезенка, легкое, миндалина, печень и легочный лаваж. Цитопатический эффект вируса можно наблюдать в культуре клеток. Аллантоисную жидкость или клеточные лизаты можно тестировать на их способность агглютинировать человеческие, куриные, индюшачьи эритроциты или эритроциты морской свинки, что является предположительным доказательством присутствия вируса гриппа.

Репрезентативный пример штамма вируса собачьего гриппа (CIV), подходящего для применения в настоящем изобретении, включает штамм, идентифицированный как A/canine/lowa/9A1/B5/08/D12, который был депонирован в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, как PTA-7694 29 июня 2006 года. Репрезентативным штаммом антигена CIV является штамм вируса CIV в имеющейся в продаже вакцине Vanguard® CIV (Pfizer). Данное изобретение также охватывает вакцины, содержащие штамм, идентифицированный как штамм лошадиного гриппа A/Equine/2/Miami/1/63. Данный штамм депонирован в АТСС с номером доступа VR 317. Дополнительные примеры вирусов гриппа для применения в настоящем изобретении представляют собой: A/canine/lowa/13628/2005, A/Equine/Kentucky/1998, A/Equine/Kentucky/15/2002, A/Equine/Ohio/1/2003, A/Equine/Kentucky/1/1994, A/Equine/Massachusetts/213/2003, A/Equine/Wisconsin/2003, A/Equine/NewYork/1999 и A/Equine/Newmarket/A2/1993. Другие предпочтительные штаммы и/или изоляты CIV включают штаммы и/или изоляты, раскрытые в патентах США №7959929 (особенно штаммы и последовательности HA, идентифицированные здесь как Jacksonville/2005, Miami/2005, FL/242/03 и Florida/43/04), 7384642, 7572620 и 7468187, содержание которых, включая все последовательности, особенно последовательности НА, и штаммы, тем самым включено посредством ссылки, как если бы оно здесь было полностью изложено. Дополнительно, штамм CIV, подходящий для применения здесь, включает изолят CIV Colorado, описанный в Barrel! et al., J. Vet. Intern. Med., 24 (6), 1524-1527 (2010), имеющий номер доступа ADW41784.

Собачий вирус парагриппа (CPIV), охватываемый данным изобретением, можно охарактеризовать как один из вирусов, известных в качестве возбудителя заболевания, ассоциированного с кашлем псарен. Репрезентативным штаммом антигена CPIV является штамм ослабленного вируса CPI в имеющейся в продаже вакцине Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Другим репрезентативным штаммом антигена CPIV является штамм ослабленного вируса CPI, имеющий обозначение "NL-CPI-5" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).

Собачий аденовирус типа 2 (CAV-2), охватываемый данным изобретением, можно охарактеризовать как один из вирусов, также известных в качестве возбудителя заболевания, ассоциированного с кашлем псарен. Репрезентативным штаммом антигена CAV-2 является штамм ослабленного вируса CAV-2 в имеющейся в продаже вакцине Vanguard® Plus 5 (Pfizer). Репрезентативным штаммом антигена CAV-2 является штамм ослабленного CAV-2, обозначенный как штамм "Manhattan" (National Veterinary Service Laboratory, Ames, IA).

Mycoplasma cynos {M. cynos), охватываемая данным изобретением, описана в Chalkeret al., Microbiology, 150:3491-3497, 2004 и представляет собой единственный вид микоплазмы, обычно ассоциированный с респираторным заболеванием. Иммуногенные композиции против M. cynos описаны в патенте США 2007/0098739, включенном сюда посредством ссылки.

Компонент в виде Bordetella bronchiseptica, охватываемый данным изобретением, может быть охарактеризован как бактериальный возбудитель заболевания, ассоциированный с кашлем псарен. Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, могут представлять собой одно или более чем одно из следующего: живую ослабленную Bordetella bronchiseptica, бактерии Bordetella bronchiseptica или бактериальный экстракт Bordetella bronchiseptica. Дополнительно композиция предпочтительно также включает выделенный субъединичный антиген Bordetella bronchiseptica.

В одном воплощении Bordetella bronchiseptica получают в виде продукта разрушения цельных клеток ультразвуком, очищенного посредством колоночной хроматографии, как предложено в патентной заявке № FR 2571618, поданной 12 октября 1984 года. Другим репрезентативным примером Bordetella bronchiseptica является бактериальный экстракт Bronchicine™ САе (Pfizer), который получают из антигенного материала, экстрагированного из клеток Bordetella bronchiseptica. Другим примером Bordetella bronchiseptica является живой ослабленный штамм bronchiseptica В-С2, присутствующий в Nobivac® и/или живой штамм bronchiseptica из Intra-Trac®, Bronchi-Shield®, Naramune™, Recombitek®, Univac и/или Kennel-Jec™.

Кроме того, в комбинации с компонентом в виде Bordetella bronchiseptica также предпочтительно присутствует субъединица (т.е. дополняет). Репрезентативным примером данной субъединицы является выделенный пертактиновый антиген, предпочтительно антиген p68 Bordetella bronchiseptica, в частности рекомбинантный антиген p68 Bordetella bronchiseptica, который распознается специфичным в отношении p68 моноклональным антителом Bord 2-7 (описано в патенте США 7736658, включенном сюда посредством ссылки) и в одном предпочтительном воплощении имеет аминокислотную последовательность, как изложено в патенте США 7736658, или имеет гомологию с ней.

Рекомбинантный пертактиновый антиген p68 предпочтительно получают в растворимой форме, так что структура, подобная нативной, сохраняется или восстанавливается во время переработки. Соответственно, согласно одному аспекту изобретения предложен рекомбинантный пертактин p68, который по существу не содержит (меньше чем примерно 80%, 90%, 95% или даже 99%) агрегатов. В другом воплощении рекомбинантный пертактин p68 солюбилизируется с мочевиной, предпочтительно примерно 0,1 M, 0,5 M, 1 M, 2 M, 3 M или 6 M раствором мочевины. Затем антиген p68 можно очищать, например, посредством колоночной хроматографии. Один такой способ солюбилизации описан в Surinderet al., J. Bioscience and Bioengineering, v. 99(4), pgs 303-310 (2005).

Используемые здесь пертактиновые антигены также включают липидированные формы. Примеры получения липидированных белков приведены в Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1) p.81-90, включенной посредством ссылки. Раскрытые здесь способы можно использовать для получения посттрансляционно модифицированных белков пертактина, которые содержат присоединенную липидную группировку.

Кроме того, в другом воплощении предложена иммуногенная композиция, содержащая Bordetella bronchiseptica и выделенный антиген Bsp22. В другом воплощении иммуногенная композиция содержит Bordetella bronchiseptica, выделенный пертактиновый антиген и дополнительно содержит выделенный антиген Bsp22. Антиген Bsp22 можно получать, как предложено в Medhekar et al., Molecular Microbiology (2009) 71(2), 492-504. Предпочтительно выделенный антиген Bsp22 присутствует в сочетании с экстрактом Bordetella bronchiseptica и выделенным пертактиновым антигеном, конкретно рекомбинантным p68 (т.е. в дополнение к ним). «Bsp22» также включает липидированные формы антигена. Примеры получения липидированных белков предложены в Erdile et al., Infection and Immunity, (1993) v.61(1) p.81-90, включенной сюда посредством ссылки. Раскрытые там способы можно использовать для получения посттрансляционно модифицированных белков Bsp22, которые содержат присоединенную липидную группировку.

Вирусы, охватываемые настоящим изобретением, можно размножать в клетках, линиях клеток и клетках-хозяевах. Указанные клетки, линии клеток и клетки-хозяева могут, например, представлять собой клетки млекопитающих и клетки, не являющимися клетками млекопитающих, включая клетки насекомых и растительные клетки, но не ограничиваться ими. Клетки, линии клеток и клетки-хозяева, в которых можно размножать вирусы, охватываемые настоящим изобретением, хорошо известны и доступны для обычных специалистов в данной области.

Бактерии, охватываемые настоящим изобретением, можно культивировать и размножать с использованием различных культуральных сред, известных обычным специалистам в данной области, включая как бульоны (жидкие среды), так и агаризованные (твердые; полутвердые) среды для культивирования. Некоторые бактерии также можно культивировать и размножать в клетках млекопитающих или в клетках, не являющихся клетками млекопитающих.

Вирусы и бактерии, охватываемые настоящим изобретением, могут быть ослабленными или инактивированными до применения в иммуногенной композиции или вакцине. Методы ослабления и инактивации хорошо известны специалистам в данной области. Методы ослабления включают серийное пассирование в культуре клеток на подходящей линии клеток (вирусы и некоторые бактерии), серийное пассирование в жидкой культуре (бактерии), облучение ультрафиолетом (вирусы и бактерии) и химический мутагенез (вирусы и бактерии), но не ограничиваются ими. Методы инактивации вирусов или бактерий включают обработку формалином, бета-проприолактоном (BPL) или бинарным этиленимином (BEI), или другие способы, известные специалистам в данной области, но не ограничиваются ими.

Инактивацию формалином можно проводить смешиванием суспензии, содержащей микроорганизм, с 37%-ным формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,5%. Смесь микроорганизм-формальдегид непрерывно перемешивают в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Смесь инактивированного микроорганизма затем тестируют на присутствие остаточных живых организмов путем анализа роста на подходящей линии клеток или жидких средах.

Для некоторых антигенов можно проводить инактивацию BEI путем смешивания суспензии, содержащей микроорганизм по настоящему изобретению, с 0,1 М BEI (2-бром-этиламин в 0,175 н. NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Для других антигенов конечная концентрация BEI составляет 2 мМ. Специалисту в данной области известна подходящая концентрация для применения. Смесь вирус-BEI непрерывно перемешивают в течение приблизительно 48 часов при комнатной температуре, с последующим добавлением 1,0 M тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Смешивание продолжают в течение еще двух часов. Смесь, содержащую инактивированный микроорганизм, тестируют на присутствие остаточного живого вируса путем анализа роста на подходящей линии клеток или жидких средах.

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, могут включать один или более чем один ветеринарно приемлемый носитель. Термин «ветеринарно приемлемый носитель» в том виде, как он здесь используется, включает любые растворители, диспергирующие среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотоничные агенты, агенты, замедляющие/отсрочивающие поглощение и тому подобное. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотоничные агенты, среди прочих, известных специалистам в данной области, могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы, среди прочих, известных специалистам в данной области, включают альбумин. Консерванты, среди прочих, известных специалистам в данной области, включают мертиолат.

Адъювант может быть метаболизируемым, причем данный термин относится к адъювантам, состоящим из компонентов, которые способны метаболизироваться намеченным видом, таким как адъюванты на основе растительного масла. Метаболизируемый адъювант может быть метаболизируемым маслом. Метаболизируемые масла представляют собой жиры и масла, которые типично встречаются в растениях и животных, и обычно состоят, главным образом, из смесей триацилглицеринов, также известных как триглицериды или нейтральные жиры. Эти неполярные нерастворимые в воде вещества представляют собой триэфиры жирных кислот и глицерина. Триацилглицерины различаются согласно типу и расположению их трех жирнокислотных остатков или боковых цепей.

Адъювант также может быть неметаболизируемым, причем данный термин относится к адъювантам, состоящим из компонентов, которые не могут быть метаболизированы в организме животного субъекта, которому вводится эмульсия. Неметаболизируемые масла, подходящие для применения в композициях по настоящему изобретению, включают алканы, алкены, алкины и их соответствующие кислоты и спирты, их простые и сложные эфиры и их смеси. Предпочтительно индивидуальные соединения в составе масла представляют собой легкие углеводородные соединения, т.е. такие компоненты, которые имеют от 6 до 30 атомов углерода. Масло может быть получено синтетически или очищено из нефтепродуктов. Предпочтительные неметаболизируемые масла для применения в описанных здесь композициях включают, например, минеральное масло, парафиновое масло и циклопарафины. Термин «минеральное масло» относится к неметаболизируемому адъювантному маслу, которое представляет собой смесь жидких углеводородов, полученных из вазелина посредством методики перегонки. Данный термин является синонимичным «сжиженному парафину», «вазелиновому маслу» и «светлому минеральному маслу». Также подразумевается, что данный термин включает «легкое минеральное масло», т.е. масло, которое, аналогичным образом, получают перегонкой вазелина, но которое имеет слегка меньшую удельную плотность, чем светлое минеральное масло. Минеральное масло может быть получено из разных коммерческих источников, например, от J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). Легкое минеральное масло имеется в продаже под наименованием DRAKEOL®.

Адъюванты включают адъювантную систему Emulsigen (MVP Laboratories; Ralston, NE), адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), квасцы, гель гидроксида алюминия, эмульсии типа «масло в воде», эмульсии типа «вода в масле», такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) или другие фракции сапонина, монофосфорил липид A, липид-аминный адъювант Avridine, термолабильный энтеротоксин из E.coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин, мурамилдипептид, сквален/плюроновый блок-сополимер/поверхностно-активное вещество (SP-масло), сульфолипобета-циклодекстрин (SL-CD), липосомы, содержащие иммуномодулятор (например, CpG или поли I:C), мурамилдипептид (MDP), искоматрикс (Quil A/фосфатидилхолин), CpG/DEAE-декстран/минеральное масло (ТХО), CpG, тритерпеноиды (например, Quil A или другой очищенный или частично очищенный препарат сапонина), стеролы (например, холестерин), иммуномодулирующие агенты (например, диметилдиоктадециламмония бромид - DDA), полимеры (например, полиакриловая кислота, такая как CARBOPOL®), и стимуляторы Th2 (например, гликолипиды, такие как Bay R1005®) и их комбинации, среди многих других адъювантов, известных специалистам в данной области, но не ограничиваются ими.

Неограничивающие примеры различных комбинаций, которые можно использовать, включают тритерпеноид плюс стерол (например, Quil А/холестерин, также известный как QAC), тритерпеноид плюс стерол, иммуномодулирующий агент, и полимер (например, Quil А/холестерин/DDA/ CARBOPOL®, также известный как QCDC), и тритерпеноид плюс стерол, иммуномодулирующий агент, полимер и стимулятор Th2 (например, Quil A/холестерин/DDA/CARBOPOL® и Bay R1005®, также известный как QCDCR).

Количества и концентрации адъювантов и добавок, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены специалистом. В одном воплощении согласно настоящему изобретению рассматриваются иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 20 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта. В другом воплощении адъювант включен в количестве от примерно 100 мкг до примерно 1500 мкг, или от примерно 250 мкг до примерно 1000 мкг, или от примерно 350 мкг до примерно 750 мкг. В другом воплощении адъювант включен в количестве примерно 500 мкг на 2 мл дозу иммуногенной композиции или вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины также могут включать антибиотики. Такие антибиотики включают антибиотики из классов аминогликозидов, карбапенемов, цефалоспоринов, гликопептидов, макролидов, пенициллинов, полипептидов, хинолонов, сульфонамидов и тетрациклинов, но не ограничиваются ими. В одном воплощении согласно настоящему изобретению рассматриваются иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотика. В другом воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат от примерно 5 мкг/мл до примерно 55 мкг/мл антибиотика, или от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл антибиотика, или от примерно 15 мкг/мл до примерно 45 мкг/мл антибиотика, или от примерно 20 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл антибиотика, или от примерно 25 мкг/мл до примерно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат меньше чем примерно 30 мкг/мл антибиотика.

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, могут включать одну или более чем одну полинуклеотидную молекулу, кодирующую вирус или бактерию, или вирусный или бактериальный белок. В иммуногенных композициях или вакцинах можно использовать молекулы ДНК или РНК. Молекулу ДНК или РНК можно вводить в отсутствие других агентов, или ее можно вводить вместе с агентом, облегчающим поглощение в клетку (например, липосомы или катионные липиды). Общая концентрация полинуклеотида в иммуногенной композиции или вакцине обычно составляет от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 5,0 мг/мл. В другом воплощении общая концентрация полинуклеотида в иммуногенной композиции или вакцине будет составлять от примерно 1 мкг/мл до примерно 4,0 мг/мл, или от примерно 10 мкг/мл до примерно 3,0 мг/мл, или от примерно 100 мкг/мл до примерно 2,0 мг/мл. Вакцины и методики вакцинации, в которых используются нуклеиновые кислоты (ДНК или мРНК), были описаны в данной области, например, в патенте США №5703055, патенте США №5580859, патенте США №5589466, все из которых включены сюда посредством ссылки.

Помимо вирусов или бактерий, описанных выше, иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, могут включать другие дополнительные антигены. Антигены могут находиться в форме препарата инактивированного цельного микроорганизма или его части, или в форме антигенных молекул, полученных методиками генной инженерии или химическим синтезом. Другие антигены, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают антигены, происходящие из патогенных вирусов, таких как вирус собачей чумы, вирус собачьего герпеса, вирус собачьего гриппа, вирус бешенства, патогенных бактерий, таких как Leptospira bratislava, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira hardjobovis, Porphyromonas spp., Bacteriodes spp., Borrelia spp., Streptococcus spp., включая Streptococcus equi подвида zooepidemicus, Ehrlichia spp., Mycoplasma spp., включая Mycoplasma cynos и Microsporum canis, но не ограничиваются ими. Антигены также могут быть получены из патогенных грибков, таких как Candida, протистов, таких как Cryptosporidium parvum, Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., Leishmania spp., или гельминтов, таких как Taenia, Cuterebra, Echinococcus и Paragonimus spp.Формы, дозировки, пути введения

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, можно вводить животным для индукции эффективного иммунного ответа против CIRDC. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены способы стимулирования эффективного иммунного ответа путем введения животному терапевтически эффективного количества описанной здесь иммуногенной композиции или вакцины.

Описанные здесь иммуногенные композиции и вакцины можно вводить животному для вакцинации животного субъекта против CIRDC. Иммуногенные композиции и вакцины можно вводить животному для предупреждения или лечения у животного CIRDC. Соответственно, здесь описаны способы вакцинирования животного против CIRDC и предупреждения или лечения CIRDC, включающие введение животному терапевтически эффективного количества описанной здесь иммуногенной композиции или вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины, охватываемые настоящим изобретением, можно получать в разных формах, в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции и вакцины можно получать в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для применения посредством инъекции, или получать в лиофилизированных формах с использованием методик сублимационной сушки. Лиофилизированные иммуногенные композиции и вакцины типично хранят при примерно 4°C, и их можно растворять в стабилизирующем растворе, например, в физиологическом растворе или HEPES с адъювантом или без него. Иммуногенные композиции и вакцины также можно получать в форме суспензий или эмульсий.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению включают терапевтически эффективное количество одного или более чем одного из вышеописанных микроорганизмов. Очищенные вирусы и/или бактерии можно использовать непосредственно в иммуногенной композиции или вакцине, или можно дополнительно ослаблять, либо инактивировать. Типично, иммуногенная композиция или вакцина содержит от примерно 1×10² до примерно 1×10¹² вирусных или бактериальный частиц, или от примерно 1×10³ до примерно 1×10¹¹ частиц, или от примерно 1×10⁴ до примерно 1×10¹⁰ частиц, или от примерно 1×10⁵ до примерно 1×10⁹ частиц, или от примерно 1×10⁶ до примерно 1×10⁸ частиц. Точное количество микроорганизма в иммуногенной композиции или вакцине, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может быть определено специалистом в данной области.

Иммуногенные композиции и вакцины обычно содержат ветеринарно приемлемый носитель в объеме от примерно 0,5 мл до примерно 5 мл. В другом воплощении объем носителя составляет от примерно 1 мл до примерно 4 мл или от примерно 2 мл до примерно 3 мл. В другом воплощении объем носителя составляет примерно 1 мл или примерно 2 мл, или примерно 5 мл. Ветеринарно приемлемые носители, подходящие для применения в иммуногенных композициях и вакцинах, могут быть любыми из ветеринарно приемлемых носителей, описанных выше.

Специалисты в данной области легко могут определить, следует ли ослаблять или инактивировать вирус или бактерию перед введением. В другом воплощении настоящего изобретения вирус или бактерию можно вводить животному непосредственно без дальнейшего ослабления. Количество микроорганизма, которое является терапевтически эффективным, может варьировать, в зависимости от конкретного использованного микроорганизма, состояния животного и/или степени инфекции, и может быть определено специалистом.

Согласно способам по настоящему изобретению, животным можно вводить одну дозу или, альтернативно, могут осуществляться две или более чем две инокуляции с интервалами от примерно двух до примерно десяти недель. Могут потребоваться схемы бустер-иммунизации, и режим дозирования может корректироваться для обеспечения оптимальной иммунизации. Специалисты в данной области могут легко определять оптимальную схему введения.

Иммуногенные композиции и вакцины можно вводить непосредственно в кровоток, в мышцу, во внутренний орган или под кожу. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное и подкожное введение. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольные (включая микроигольные) инъекторы и безыгольные инъекторы.

Парентеральные композиции типично представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы, белки и буферные агенты (предпочтительно корректирующие pH до интервала от примерно 3 до примерно 9, или от примерно 4 до примерно 8, или от примерно 5 до примерно 7,5, или от примерно 6 до примерно 7,5, или от примерно 7 до примерно 7,5), но, для некоторых применений, они могут быть более подходящим способом приготовлены в виде стерильного неводного раствора или высушенной формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода или физиологический раствор.

Получение парентеральных препаратов при стерильных условиях, например, посредством лиофилизации, может быть легко выполнено с использованием стандартных фармацевтических методик, хорошо известных специалистам в данной области.

Растворимость веществ, используемых при получении парентеральных растворов, можно повышать путем использования соответствующих методик приготовления, известных специалисту в данной области, таких как включение агентов, увеличивающих растворимость, включая буферы, соли, поверхностно-активные вещества, липосомы, циклодекстрины и тому подобное.

Композиции для парентерального введения можно изготавливать в форме немедленного или модифицированного высвобождения. Композиции с модифицированным высвобождением включают композиции с отложенным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным и программируемым высвобождением. Таким образом, иммуногенные композиции и вакцины можно готовить в виде твердого, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо, обеспечивающего модифицированное высвобождение иммуногенных композиций и вакцин.

Другие способы введения иммуногенной композиции или вакцины включают доставку микроигольной или безыгольной (например, Powderject™, Bioject™ и т.д.) инъекцией.

В случаях, когда используется подкожная или внутримышечная инъекция, предпочтительной является изотоническая композиция. Обычно добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В конкретных случаях используют изотоничные растворы, такие как фосфатно-солевой буферный раствор. Композиции могут дополнительно содержать стабилизаторы, такие как желатин и альбумин. В некоторых воплощениях в композицию добавляют сосудосуживающий агент. Фармацевтические препараты согласно настоящему изобретению обычно готовят в стерильной или апирогенной форме. Однако специалистам в данной области хорошо известно, что композиции для фармацевтически приемлемого носителя представляют собой те фармацевтические носители, которые одобрены правилами, обнародованными Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов или эквивалентным правительственным органом в иностранном государстве, таком как Канада или Мексика, либо в любом европейском государстве, для любой собачьей вакцины, полипептидных (антигенных) субъединичных иммуногенных композиций и вакцин, вакцин на основе рекомбинантного вирусного вектора и ДНК-вакцин. Следовательно, фармацевтически приемлемый носитель для коммерческого производства иммуногенных композиций или вакцин представляет собой носитель, который уже одобрен или будет одобрен подходящим правительственным органом в Соединенных Штатах Америки или иностранном государстве. Иммуногенные композиции и вакцины могут кроме того быть смешаны с адъювантом, который является фармацевтически приемлемым. В определенных препаратах иммуногенных композиций и вакцин иммуногенную композицию или вакцину объединяют с другими собачьими иммуногенными композициями или вакцинами для получения поливалентного продукта, который может защищать представителей семейства псовых от широкого спектра заболеваний, вызванных другими собачьими патогенами.

Способы детекции и диагностики

Степень и природу иммунных ответов, индуцированных у животного, можно оценивать с использованием множества методик. Например, у подвергавшихся инокуляции животных можно отобрать сыворотку и протестировать на присутствие или отсутствие антител, специфичных в отношении иммуногенов. Детекция отвечающих цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) в лимфоидных тканях, указывающая на индукцию клеточного иммунного ответа, может достигаться такими анализами, как анализ пролиферации T-клеток. Релевантные методики хорошо описаны в данной области.

Наборы

Поскольку может быть желательным введение иммуногенной композиции или вакцины в комбинации с дополнительными композициями или соединениями, например, с целью лечения конкретного заболевания или состояния, в рамках настоящего изобретения находится то, что иммуногенную композицию или вакцину можно с удобством включать в набор или объединять в форме набора, подходящего для введения или совместного введения композиций.

Таким образом, наборы, охватываемые настоящим изобретением, могут включать одну или более чем одну отдельную фармацевтическую композицию, по меньшей мере одна из которых представляет собой иммуногенную композицию или вакцину согласно настоящему изобретению, и средства для раздельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутыль или разделенная упаковка из фольги. Примером такого набора является шприц и игла, и тому подобное. Набор по настоящему изобретению является особенно подходящим для введения разных лекарственных форм, например, пероральной или парентеральной, для введения отдельных композиций с разными интервалами дозировки, или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Для помощи вводящему композицию, охватываемую настоящим изобретением, данный набор типично содержит руководства для введения.

Другой набор, охватываемый настоящим изобретением, может содержать один или более чем один реактив, полезный для детекции инфицированного животного. Данный набор может включать реактивы для анализа образца на присутствие цельных микроорганизмов, полипептидов, эпитопов или полинуклеотидных последовательностей. Присутствие вируса, бактерии, полипептидов или полинуклеотидных последовательностей можно определять с использованием антител, ПЦР (полимеразная цепная реакция), гибридизации и других методов детекции, известных специалистам в данной области.

В другом наборе, охватываемом настоящем изобретением, могут быть предложены реактивы для детекции антител против конкретных эпитопов. Такие реактивы являются полезными для анализа образца на присутствие антител и хорошо известны и доступны обычному специалисту в данной области. Присутствие антител можно определять с использованием стандартных методов детекции, известных специалистам в данной области.

В определенных воплощениях наборы могут включать комплект отпечатанных инструкций или этикетку, указывающую, что набор является пригодным для детекции инфицированных животных.

Антитела

Антитела могут быть моноклональными, либо поликлональными, либо рекомбинантными. Антитела можно получать против иммуногена или его части. Например, может быть выделен и использован в качестве иммуногена синтетический пептид на основе аминокислотной последовательности иммуногена или полученный рекомбинантно методиками клонирования, или природный генный продукт, и/или его части. Иммуногены можно использовать для продукции антител стандартной методикой получения антител, хорошо известной специалистам в данной области. Из антител также могут быть получены фрагменты антител способами, известными специалистам в данной области, и они включают фрагменты Fab, F(ab′)₂ и Fv.

При получении антител скрининг на желательное антитело можно проводить стандартными методами иммунологии, известными в данной области. В общем, ELISA и вестерн-блоттинг являются предпочтительными типами иммуноанализов. Оба анализа хорошо известны специалистам в данной области. В анализах можно использовать и поликлональные, и моноклональные антитела. Антитело может быть связано с субстратом в виде твердой подложки, конъюгировано с детектируемой группировкой, или и связано, и конъюгировано, как хорошо известно в данной области. Связывание антител с субстратом в виде твердой подложки также хорошо известно в данной области. Детектируемые группировки, рассматриваемые для применения в настоящем изобретении, могут включать флуоресцентные, металлические, ферментативные и радиоактивные маркеры, такие как биотин, золото, ферритин, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза, уреаза, флуоресцеин, родамин, тритий, ¹⁴C и йодирование, но не ограничиваются ими.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, но ни в коей мере не ограничивается следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Иммуногенность бактериального экстракта Bordetella bronchiseptica, субъединичная вакцина

В исследование включали тридцать два щенка породы бигль в возрасте примерно 8-недель с низким уровнем Bordetella bronchiseptica (титры микроагглютинирующих антител (МАТ), меньшие или равные 16). Щенков случайным образом делили на две группы обработки (T1 и T2), причем каждая из них включала 16 особей. Одного щенка из Т2 удалили до первой вакцинации из-за паховой грыжи.

Таблица 1
Схема исследования
Группа	Вакцина	N	Вакцинация	Заражение
Объем мл	Сутки исследования	Путь введения	Сутки исследования	Доза/собаку	Путь введения
T1	Физиологический раствор	16	1,0				6,4×108 КОЕ (колониеобразующая единица)	Интраназальное распыление аэрозоля в камере
T2	Экстракт B. bronchiseptica - Субъединичная вакцина	15	1,0	0 и 21	п.к.	42

Собак вакцинировали подкожно (п.к.) соответствующей вакциной в сутки 0 и 21 согласно схеме исследования, показанной в Таблице 1. Вакцины вводили каждой собаке в область правого плеча для первой вакцинации и в область левого плеча - для второй вакцинации.

В сутки 42 собак из всех групп обработки подвергали интраназальному заражению Bordetella bronchiseptica посредством распыления аэрозоля в плексигласовой камере в течение 30 минут. За один раз заражали четырех собак, 2 из T1 и 2 из T2, за исключением одной группы, в которой было только 3 животных, где заражали двух из T1 и одного из T2, поскольку одно животное было удалено из данного исследования ранее.

Основной переменной эффективности был кашель. Все другие переменные (выделения из носа, выделения из глаз, чихание, депрессия, позыв на рвоту, дыхание) считали поддерживающими вторичными переменными. Клинические наблюдения за признаками респираторного заболевания, включающими кашель, проводили дважды в сутки («периоды наблюдения»; до полудня и после полудня) в течение приблизительно 30 минут в каждой комнате на каждую сеанс с суток 42 и до суток 70 (завершение исследования). Для каждого животного рассчитывали, кашляло ли животное в течение двух последовательных периодов наблюдения после заражения, или нет. Для каждой обработки рассчитывали частотное распределение присутствия/отсутствия кашля в течение двух последовательных периодов наблюдения. Присутствие/отсутствие кашля в течение двух последовательных периодов наблюдения анализировали с использованием критерия Кохрана-Армитажа, осуществляя поправку на помещение, поскольку анализ данных обобщенной линейной смешанной моделью был не возможен. Для каждой обработки и момента времени рассчитывали частотные распределения выделения бактерий из носа (+/-). Для каждого животного также определяли, имело ли оно когда-либо бактерии, выделенные после заражения, или нет.

Частотное распределение того, имело ли когда-либо животное B. bronchiseptica, выделенную после заражения, было рассчитано для каждой обработки и было проанализировано, если это возможно, обобщенной линейной смешанной моделью. Для каждого животного рассчитывали продолжительность выделения из носа после заражения и анализировали обобщенной линейной смешанной моделью. Титры антител подвергали логарифмическому преобразованию и анализировали с использованием обобщенной линейной смешанной модели для повторных измерений.

Результаты: ни у одной из собак после вакцинации не сообщалось о боли или лихорадке (температура не ниже 39,5°C). Сообщалось, что некоторые собаки в обеих группах обработки почесывались во время вакцинации. О небольших припухлостях в месте инъекции (2×2×1 см) сообщалось только у двух собак в T2 на протяжении 3-6 часов наблюдения после первой вакцинации. Данные указывают на то, что вакцина была безопасной и хорошо переносимой собаками.

У всех животных контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, развивался кашель, что указывало на достаточное заражение. Средние значения, полученные методом наименьших квадратов (LS), для продолжительности кашля в контрольной группе составляли 20,3. В отличие от этого, вакцина значительно снижала продолжительность кашля до среднего значения LS 5,2 у вакцинированных со значением p меньше 0,0001. Кроме того, у вакцинированных животных по сравнению с контрольными ослабевали другие респираторные клинические признаки, такие как позыв на рвоту и тяжелое дыхание.

Данные по выделению бактерий после заражения показали, что тестируемая вакцина значительно уменьшала продолжительность выделения из носа заражающего организма в вакцинированной группе (среднее значение LS 20,5) по сравнению с контрольными животными, которым вводили физиологический раствор (среднее значение LS 25,3) со значением p 0,0061. Данные указывают на то, что вакцина является эффективной в уменьшении уровня инфекции, что подтверждается сниженной продолжительностью выделения у вакцинированных животных.

Антительные ответы, генерированные после вакцинации (сутки 21 и 42) в группе 12, были аналогичными Т1, вероятно из-за природы анализа агглютинации антител, а не из-за недостатка антигенности. В сутки 70 после заражения у большинства вакцинированных животных наблюдалась индукция сильного вторичного иммунного ответа (среднее значение LS 426) по сравнению с контрольными животными, которыми вводили физиологический раствор (среднее значение LS 13), что указывает на эффективную иммунизацию.

Взятые в совокупности, данные из этого исследования ясно указывают на то, что бактериальный экстракт Bordetella bronchiseptica, субъединичная вакцина демонстрировали эффективность сокращением продолжительности кашля и выделения из носа.

Пример 2. Оценка эффективности и безопасности инъецируемой вакцины против Bordetella bronchiseptica

В исследование включали пятьдесят собак породы бигль в возрасте примерно 8-недель. Собак делили на 5 групп по 10 животных в каждой. Все животные находились в хорошем общем состоянии здоровья и не получали каких-либо Bordetella вакцинаций. Образцы сыворотки до скрининга были негативными в отношении B. bronchiseptica с титрами меньше 16, определенными тестом микроагглютинации (МАТ) до первой вакцинации. Посредством теста по выделению бактерии из назального мазка было определено, что все животные не содержали B. bronchiseptica до первой вакцинации (сутки 0).

Таблица 2
Схема исследования
Группа	Исследуемый ветеринарный продукт (IVP)	N	Вакцинация	Заражение
Объем мл	Сутки исследования	Путь введения	Сутки исследования	Доза/собаку	Путь введения
T01	Физиологический раствор	10	1,0	0 и 21	п.к.
T02	Бактериальный экстракт B. bronchiseptica 1 пертактин (10 мкг) /QCDC	10	1.0	0 и 21	п.к.
T03	Модифицированная имеющаяся в продаже адъювантная вакцина на основе экстракта B. bronchiseptica	10	1,0	0 и 21	п.к.	42	5.4×108 КОЕ (колониеобразующая единица)	Интраназальное распыление аэрозоля в камере
T04	Пертактин (10 мкг) /QCDC	10	1,0	0 и 21	п.к.
T05	Имеющаяся в продаже интраназальная вакцина	10	0,5	0	и.н.

Животных вакцинировали соответствующей вакциной в сутки 0 и 21 согласно схеме исследования, показанной в Таблице 2. Вакцины для групп T01, T02, T03 и T04 вводили каждой собаке подкожно в область правого плеча для первой вакцинации и в область левого плеча для второй вакцинации. Группа T05 получала однократную интраназальную вакцинацию имеющейся в продаже интраназальной вакциной в сутки 0. Эту группу вакцинировали в последнюю очередь для предотвращения распространения живой вакцины в вышеупомянутых группах, и собак данной группы содержали отдельно в другой комнате для предотвращения воздействия на них животных других групп.

В сутки 42 собак из всех групп обработки подвергали интраназальному заражению Bordetella bronchiseptica посредством распыления аэрозоля в плексигласовой камере всего в течение 30 минут. За один раз заражали пять собак из того же самого вольера (одну из каждой группы обработки).

Основной переменной эффективности был кашель; выделение бактерий было второй переменной. Клинические наблюдения за признаками респираторного заболевания, включающими кашель, проводили дважды в сутки («периоды наблюдения»; до полудня и после полудня) в течение приблизительно 30 минут в каждой комнате на каждый сеанс с суток 42 до суток 62 и один раз (до полудня) в сутки 63 (завершение исследования). До анализа кашля процентную долю периодов наблюдения с кашлем преобразовывали с использованием преобразования посредством арксинуса квадратного корня. Преобразованную процентную долю периодов наблюдения и число суток с кашлем анализировали с использованием обобщенной линейной смешанной модели. Для каждого животного рассчитывали процентную долю периодов наблюдения после заражения, в которые животное кашляет, и число суток после заражения с кашлем.

Результаты: у собак из групп обработки T02 и T04 в местах инъекции наблюдали припухлости от легких до умеренных (данные не показаны). Тяжесть реакций и число вовлеченных в них собак возрастали после второй вакцинации. Легкие реакции в месте инъекции наблюдали у нескольких собак в группе обработки T03. В группе T01, животным которой вводили физиологический раствор, не наблюдали измеримых припухлостей в местах инъекции. Не наблюдали клинической лихорадки (температура не ниже 39,5°C), за исключением одной собаки в группе T02 в сутки 4 после вакцинации. Не сообщалось о боли у какой-либо из вакцинированных собак.

Заражающая инокуляция B. bronchiseptica индуцировала кашель у всех невакцинированных контрольных животных (кашляли 53,3% и 14,7 суток), указывая на то, что заражение было достаточным для оценки тестируемых вакцин. Результаты, полученные для группы T05, получавшей имеющуюся в продаже интраназальную вакцину (позитивный контроль), демонстрировали 4,6% наблюдаемого кашля вплоть до 2 суток после заражения, что свидетельствовало о том, что уровень заражения являлся оптимальным, а не чрезмерным.

В данном исследовании оценивали три тестируемых композиции. T02 имела 16,1% наблюдаемого кашля вплоть до 6 суток после заражения, T03 имела 34,7% наблюдаемого кашля вплоть до 10,5 суток после заражения, и T04 имела 34,5% наблюдаемого кашля вплоть до 10,7 суток после заражения. Соответственно, все вакцинированные группы демонстрировали пониженную балльную оценку кашля по сравнению с невакцинированными контрольными животными. Группа T02, вакцинированная бактериальным экстрактом B. bronchiseptica с добавлением пертактина и адъюванта QCDC, демонстрировала статистически значимое уменьшение критериев балльной оценки кашля. Таким образом, эффективность препарата, протестированного в T02, оказалась высокой.

Пример 3. Безопасность и эффективность вакцин, содержащих Bordetella bronchiseptica, у собак

Для исследования отбирали пятьдесят (50) собак, разделенных на 5 групп обработки. То, что животные были пригодны для исследования, определяли на основе медицинского осмотра в сутки 4.

Образцы крови (приблизительно 8 мл) для серологии отбирали у всех животных в пробирки SST в сутки исследования 2, 21 и 28 до каждой вакцинации. Образцы сыворотки, отобранные в сутки -2, использовали для подтверждения того, что животные не содержали B. bronchiseptica. Назальные мазки отбирали до вакцинации в сутки 0 и тестировали на присутствие B. bronchiseptica. Температуры барабанной перепонки замеряли, начиная с суток 4, для установления исходного уровня до вакцинации.

Животных вакцинировали соответствующей вакциной в сутки 0, 21 и 28 согласно схеме исследования, показанной в Таблице 3. Вакцины вводили каждой собаке подкожно в область правого плеча для первой вакцинации и в область левого плеча для второй вакцинации.

Таблица 3
Схема исследования
Группа	IVP	N	Вакцинация1	Заражение2
Объем (мл)	Сутки исследования	Путь введения	Сутки исследования	Целевая доза/собаку	Путь введения
T01	B. bronchiseptica (инактивированная) + пертактин (10 мкг) без адъюванта	10	1.0	0 и 28
T02	Физиологический раствор	10	1.0	0 и 28
T03	B. bronchiseptica (инактивированная) + пертактин (10 мкг) без адъюванта	10	1.0	0 и 21
T04	CRCoV/CIV/CPIV/ CAV2, регидратированная с B. bronchiseptica (инактивированной) + пертактин (10 мкг) без адъюванта	10	1,0	0 и 28	п.к.	56	109	Интраназальный (аэрозоль; камера)
T05	CRCoV/CIV/CPIV/CAV2, регидратированная с водой (разбавитель)	10	1.0	0 и 28
1 Исследуемый ветеринарный продукт (IVP) вводили подкожно (п.к.). 2 Целевая заражающая доза - 10 $${}^9$$ организмов штамма Bordetella bronchiseptica.

Всех животных осматривали в сутки вакцинации 0, 21 и 28 на предмет реакций в месте инъекции после вакцинации. Их осматривали ежесуточно на предмет реакций на инъекцию после вакцинации в сутки 1-7 и 22-35. Температуру барабанной перепонки замеряли в сутки 0-7 и 21-35.

Образцы крови (приблизительно 6 мл) на серологию отбирали в сутки 55, за одни сутки до заражения. Температуру барабанной перепонки измеряли в сутки 54, 55 и 56 до заражения. Назальные мазки отбирали в сутки 55, за одни сутки до заражения и тестировали на присутствие B. bronchiseptica. Животных наблюдали дважды в сутки (до полудня и после полудня), приблизительно в течение 30 минут в каждый сеанс в сутки 54 и 55 и до полудня в сутки 56 на предмет клинических признаков респираторного заболевания, чтобы установить исходные значения.

Заражающий штамм Bordetella bronchiseptica использовали для получения намеченной заражающей дозы 10⁹ КОЕ/4 мл/собаку. В сутки 56 собак из всех групп обработки подвергали интраназальному заражению B. bronchiseptica путем распыления аэрозоля в плексигласовой камере всего в течение 30 минут для каждого зараженного вольера. За один раз заражали пять собак из того же самого вольера (одну из каждой группы обработки).

Температуры барабанной перепонки записывали один раз в сутки после заражения с суток 56 до суток 77. Клинические наблюдения проводили дважды в сутки (до полудня и после полудня), в течение приблизительно 30 минут в каждой комнате на каждую сессию, с суток 56 и до суток 76 и один раз (до полудня) в сутки 77. Кратко, наблюдали кашель, выделения из носа, чихание, выделения из глаз, позыв на рвоту и депрессию с использованием следующей системы баллов: отсутствует (0), слабый (1), умеренный (2) и сильный (3). Назальные мазки отбирали в сутки 59, 62, 66, 69, 74, 76 и 77 для определения выделения заражающих организмов.

Образцы крови (приблизительно 6 мл) для серологии отбирали в сутки 77. Назальные мазки для выделения B. bronchiseptica отбирали с использованием тампонов и транспортных сред.

Агглютинирующие антитела к B. bronchiseptica определяли посредством теста микроагглютинации (МАТ). Образцы сыворотки из групп обработки T04 и T05, полученные в сутки 0, 28, 55 и 77, титровали на антитела против CRCoV посредством нейтрализации сыворотки и IFA (иммуноферментный анализ) и против CIV - посредством HAI (подавление гемагглютинации). Выделение B. bronchiseptica из назальных мазков проводили согласно стандартной методике. Каждый образец качественно тестировали на присутствие или отсутствие бактерии.

Результаты. Посредством выделения культуры из назальных мазков подтвердили, что пятьдесят (50) здоровых щенков породы бигль в возрасте приблизительно 8-недель не содержали организмы B. bronchiseptica в сутки 0. Образцы сыворотки, оцененные на наличие агглютинирующих антител против B. bronchiseptica посреством МАТ подтвердили, что все щенки были чувствительными, с титрами МАТ, меньшими или равными 8 в сутки -2.

Все экспериментальные вакцины, оцененные в данном исследовании, давали либо слабые припухлости, либо не давали припухлостей в месте инъекции после первой вакцинации. Для большинства вакцинированных животных наличие припухлости в месте инъекции ограничивалось сутками исследования 0. После второй вакцинации также сообщалось о слабых припухлостях до их отсутствия в месте инъекции. При проявлении припухлостей в месте инъекции они рассасывались в течение одних-трех суток после второй вакцинации. О почесывании сообщалось преимущественно в группе, животным которой вводили 5-компонентную комбинированную вакцину (T04). После вакцинаций не сообщалось о клинической лихорадке. В группе, животным которой вводили физиологический раствор, не сообщалась о припухлостях в месте инъекции. Данные подтвердили безопасность вакцин.

Определение числа колоний, выполненное до и после заражающей инокуляции, подтвердило, что в среднем в камере было распылено 1,45×10⁸ КОЕ Bordetella на собаку. Заражающая инокуляция индуцировала кашель у всех контрольных собак, которым вводили физиологический раствор (T02) со средней наблюдаемой процентной долей кашляющих 43,5% и 12,2 сутками кашля. У группы обработки T05, вакцинированной 4-компонентной вакциной, содержащей только вирусы (CRCoV/CIV/CPIV/CAV2), без антигена Bordetella развивался кашель, аналогичный кашлю у животных контрольной группы, которым вводили физиологический раствор со средней наблюдаемой процентной долей кашляющих 43,4% и 12,2 сутками кашля. Эти данные указывают на то, что заражение было достаточным и стойким для оценки тестируемых вакцин.

Собаки в группе обработки Т01, вакцинированные Bordetella вакциной, были значимо защищенными от заражения (3,6 суток кашля, p меньше 0,0001) по сравнению с контрольной группой (12,2 суток кашля). Та же самая вакцина также значимо защищала собак в T03, при введении в режиме с 3-недельным интервалом (5,8 суток кашля, p равно 0,0004). Уменьшение балльной оценки кашля в этих двух группах (Т01 относительно T03) не было значимо отличным (значение p равно 0,1883), что свидетельствует о том, что уровень защиты для вакцины, вводимой с 3- или 4-недельными интервалами, является аналогичным.

Собаки в T04, которые получали неадъювантную 5-компонентную комбинированную вакцину были значимо (p равно 0,0016) защищены против заражения Bordetella (6,6 суток кашля) по сравнению с контрольными, которым вводили физиологический раствор (12,2 суток кашля), и по сравнению с собаками группы T05, получавшими 4-компонентную вирусную (CRCoV/CIV/CPIV/CAV2) комбинацию (12,1 суток кашля, p равно 0,0019), что указывает на эффективность фракции Bordetella в комбинированной вакцине, не содержащей адъювант.

Серологическая оценка вирусных фракций в 5-компонентной комбинированной вакцине была возможна только для двух фракций, CIV и CRCoV, где было подтверждено, что собаки были серонегативными в сутки исследования -2. Ответ HAI на CIV в группе, животным которой вводили 4-компонентную вакцину (T04), в сутки исследования 56 был количественно сходным с ответом в группе, животным которой вводили 5-компонентную вакцину (T05), что указывает на отсутствие негативного воздействия фракции Bordetella на антиген CIV. Ответы SN на CRCoV в сутки исследования 56 были количественно сильнее в группе, животным которой вводили 4-компонентную вакцину (T04), чем в группе, животным которой вводили 5-компонентную вакцину (T05), что указывает на возможное негативное воздействие Bordetella на фракцию CRCoV. Однако эти данные не являются окончательными, поскольку данные вакцины не были адъювантными, композиция не была оптимизирована, и заражение CRCoV не было проведено для тестирования эффективности.

Было подтверждено, что моновалентная вакцина на основе Bordetella является безопасной и эффективной. Эффективность моновалентной вакцины продемонстрировали, когда вакцину вводили с 21- или 28-суточными интервалами. Также было показано, что фракция Bordetella является эффективной при введении в составе 5-компонентной неадъювантной комбинированной вакцины.

Пример 4. Мультивалентное серологическое исследование

Сорок собак в возрасте приблизительно 8 недель и с хорошим общим состоянием здоровья подвергали предварительному скринингу на наличие Bordetella bronchiseptica посредством теста микроагглютинации (МАТ) и на наличие собачьего респираторного коронавируса (CRCoV) посредством непрямого флуоресцентного анализа антител (IFA). Для оценки уровней антител также использовали нейтрализацию сыворотки (SN). В сутки 0 все собаки были негативными в отношении антител к Bordetella bronchiseptica, как было определено посредством МАТ (меньше или равно 16) и негативными в отношении антител к CRCoV, как было определено посредством IFA (меньше 40). Все собаки также не содержали Bordetella bronchiseptica и CRCoV, как было определено тестом по выделению назального мазка до первой вакцинации (Сутки 0).

Собак делили на 5 групп обработки по 8 собак в каждой и вакцинировали согласно схеме исследования, показанной в Таблице 4. Вакцины вводили каждой собаке в область правого плеча для первой вакцинации и в область левого плеча для второй вакцинации.

Таблица 4
Схема исследования
Группа обработки	Исследуемый ветеринарный продукт (IVP)	Адъювант	N	Вакцинация1
Сутки исследования	Путь введения
T01	СAV2/CPIV/CРV/L4	5% Rehydragel	8
T02	CAV-2, CPI, CRCoV + Bordetella, CIV	QCDC	8
T03	CAV-2, CPI, CRCoV + Bordetella, CIV	1% EMA1/3% Neocryl/5% Emulsigen SA	8	0 и 21	Подкожно (п.к.)
T04	CAV-2, CPI, CRCoV + Bordetella, CIV	QCDC	8
T05	CAV-2, CPI, CRCoV + Bordetella, CIV	QCDC	8
1ЕМА - этиленмалеиновый ангидрид

После второй вакцинации группы T04 и T05 были удалены из исследования из-за осложнений. Собак в оставшихся группах (T01, T02 и T03) осматривали ежесуточно на предмет реакции после вакцинации и отслеживали температуру тела (барабанной перепонки) в течение 7 суток после каждой вакцинации. Образцы крови отбирали у собак в сутки 0, 21, 42 и 56 для измерения антительных ответов.

Образцы сыворотки, полученные в сутки 0, 21, 42 и 56, тестировали на агглютинирующие антитела к Bordetella bronchiseptica посредством анализа МАТ. Образцы сыворотки, полученные в те же самые сутки, также титровали на антитела против CRCoV посредством нейтрализации сыворотки, против CIV -посредством HAI, и для антител против CAV-2 и CPI - посредством нейтрализации сыворотки. Для каждой группы обработки были получены средние геометрические титров антител.

Результаты:

Тестируемые вакцины в группах T02 и T03 индуцировали антительные ответы у всех (100%) вакцинированных собак после второй дозы, что указывает на активную иммунизацию против вирусных антигенов. Антительный ответ увеличивался после второй вакцинации у большинства вакцинированных собак, что указывает на бустерный эффект второй вакцинации. Важно отметить, что антительные ответы среди вирусных фракций достигались в присутствии многочисленных вирусных и бактериальных (B. bronchiseptica) антигенов, что указывает на отсутствие иммунологического негативного взаимодействия. Серология МАТ не коррелирует с защитой против Bordetella, а скорее является ценным инструментом скрининга для включения в исследование подходящих животных. В заключение, на основе иммунологического ответа у вакцинированных собак предсказывается эффективность вирусных антигенов в 5-компонентной мультивалентной вакцине.

Пример 5. Исследование продолжительности иммунитета

A. Моновалентное

Целью данного исследования является демонстрация продолжительности иммунитета против заражения вирулентной B. bronchiseptica у 8-недельных собак, вакцинированных субъединичной вакциной на основе экстракта Bordetella bronchiseptica.

Все животные имели хорошее состояние здоровья и не получали каких-либо вакцинаций Bordetella. Животные имели низкие титры антител (меньшие или равные 16) или не имели титров антител на B. bronchiseptica до первой вакцинации, как было определено посредством теста микроаглютинации (МАТ).

Все животные также не содержат B. bronchiseptica до первой вакцинации, что определено посредством теста по выделению бактерии из назального мазка.

Собак разделили на 2 группы обработки: одна группа получает плацебо вакцины, а другая - экстракт B. bronchiseptica, дополненный рекомбинантным антигеном. Антигеном является пертактин, Bsp22 или оба из них. Животных вакцинируют дважды, с интервалом приблизительно 3-4 недели. После каждой вакцинации их осматривают на предмет реакций в месте инъекции.

Приблизительно через 6-12 месяцев после вакцинации собак из всех групп обработки заражают распылением аэрозоля Bordetella bronchiseptica. Заражающую дозу и чистоту заражающего инокулята определяют до и после заражения. Клинические наблюдения проводятся ближе к заражению и после него.

Для выделения B. bronchiseptica отбирают назальные мазки. От каждого животного отбирают кровь на сыворотку. Агглютинирующие антитела на B. bronchiseptica определяют с помощью МАТ. Образцы сыворотки титруют на ответ антител IgG, специфичных к пертактину, посредством ELISA. Выделение B. bronchiseptica из назальных мазков проводят согласно стандартной методике.

Кашель, выделение Bordetella (после заражения) и серологический ответ после вакцинации являются критериями, используемыми для оценки эффективности вакцины в исследовании.

Б. Мультивалентное

Целью данного исследования является демонстрация продолжительности иммунитета мультивалентной комбинированной вакцины против респираторных заболеваний у собак. Данная вакцина содержит следующие антигенные компоненты: модифицированный живой CAV-2, модифицированный живой CPIV, инактивированный CIV, инактивированный CRCoV и экстракт Bordetella bronchiseptica, дополненный рекомбинантным антигеном - пертактином, Bsp22, либо ими обоими.

Все животные имеют хорошее общее состояние здоровья и не получали каких-либо вакцинаций в отношении патогенов, для защиты против которых сконструирована вакцина. Собак разделили на множественные серии групп обработки. Каждая серия состоит из двух групп обработки: контрольной группы, получающей плацебо вакцины, и вакцинируемой группы, получающей тестируемую вакцину. Животных вакцинируют дважды с интервалом приблизительно 2-4 недели. После каждой вакцинации их осматривают на предмет реакций в месте инъекции.

Приблизительно через 6-12 месяцев после вакцинации каждую серию из двух групп обработки (вакцинированные и контрольные) заражают одним из патогенов, для защиты против которого сконструирована вакцина. Клинические наблюдения проводятся ближе к заражению и после него. Назальные мазки для выделения заражающего патогена отбирают на протяжении периода после заражения. У каждого животного отбирают кровь для получения сыворотки, которую используют для последующего аналитического исследования. В качестве критериев для оценки эффективности вакцин используют клинические признаки респираторного заболевания, выделение патогена после заражения и серологические ответы.

Таким образом, после подробного описания различных воплощений настоящего изобретения, следует понимать, что изобретение определено прилагаемой формулой изобретения и не должно ограничиваться конкретными деталями, раскрытыми в приведенном выше описании, поскольку возможны его многочисленные очевидные вариации без выхода за пределы сущности и объема настоящего изобретения.

Все вышеописанные ссылки включены сюда посредством ссылки, как если бы они были здесь полностью изложены.

1. Вакцинная композиция, содержащая эффективные количества Bordetella bronchiseptica и выделенного пертактинового антигена.

2. Вакцинная композиция по п. 1, где указанный пертактиновый антиген представляет собой белок Bordetella bronchiseptica.

3. Вакцинная композиция по п. 2, где указанный пертактиновый антиген представляет собой рекомбинантный белок p68.

4. Вакцинная композиция по п. 1, где Bordetella bronchiseptica представляет собой бактерин или бактериальный экстракт.

5. Вакцинная композиция по п. 1, которая не является адъювантной.

6. Вакцинная композиция по п. 1, где указанный пертактиновый антиген присутствует в количестве от примерно 1 мкг до примерно 30 мкг.

7. Вакцинная композиция по п. 1, дополнительно содержащая разбавитель или эксципиент для парентерального введения собаке.

8. Вакцинная композиция по п. 1, дополнительно содержащая эффективное количество выделенного антигена Bsp22, который возможно является липидированным.

9. Вакцинная композиция по любому из пп. 1-8, дополнительно содержащая эффективное количество антигена из собачьего респираторного патогена, выбранного из группы, состоящей из следующего: вирус собачьего парагриппа (CPIV), собачий аденовирус-2 (CAV-2), собачий респираторный коронавирус (CRCoV), Mycoplasma cynos (M. cynos) и вирус собачьего гриппа (CIV).

10. Вакцинная композиция по п. 9, содержащая по меньшей мере два, три или четыре антигена из собачьего респираторного патогена.

11. Вакцинная композиция по п. 9, содержащая антигены из вируса собачьего парагриппа (CPIV), собачьего аденовируса-2 (CAV-2), собачьего респираторного коронавируса (CRCoV) и вируса собачьего гриппа (CIV).

12. Применение вакцинной композиции по любому из пп. 1-11 для лечения или предупреждения инфекции собачьим респираторным патогеном у собаки.

13. Применение по п. 12, где указанная композиция предупреждает инфекцию указанным собачьим респираторным патогеном у указанной собаки в течение периода времени 6 месяцев или более.

14. Применение по п. 12, где собачий респираторный патоген представляет собой Bordetella bronchiseptica.

15. Применение по п. 14, где собачий респираторный патоген дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующего: вирус собачьего парагриппа (CPIV), собачий аденовирус-2 (CAV-2), собачий респираторный коронавирус (CRCoV) и вирус собачьего гриппа (CIV).

16. Применение по любому из пп. 12-15 для лечения или предупреждения комплекса инфекционных респираторных заболеваний собак (CIRDC), где композиция лечит или предупреждает инфекцию множеством указанных патогенов.