Штамм микроводоросли desmodesmus sp. для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 обладает высокими показателями фиксации CO₂ и толерантностью к высоким концентрациям CO₂ в среде культивирования, а также высокой способностью к накоплению липидов, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами. Штамм депонирован в Коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН (IPPAS) под регистрационным номером Desmodesmus sp. IPPAS S-2014 и может быть использован для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок. Изобретение позволяет повысить скорость фиксации CO₂ в газовоздушной смеси. 4 ил., 1 табл.

 

Область применения

Изобретение относится к фотобиотехнологии и представляет собой новый штамм микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, предназначенный для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок.

Уровень техники

Согласно отчетам Межправительственной группы экспертов по изменению климата (IPCC), повышение содержания CO₂ в атмосфере из-за техногенных выбросов - одна из основных причин глобального потепления, а биологическая (фотосинтетическая) фиксация - единственный на сегодня рентабельный и экологичный метод утилизации техногенного CO₂ (М. Huntley, D. Redalje. CO₂ mitigation and renewable oil from photosynthetic microbes: a new appraisal. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 2007, V.12-4, p.573-608; B. Wang, Y. Li, N. Wu, C. Lan. CO₂ biomitigation using microalgae. Applied microbiology and biotechnology. 2008. V.79-5, p.707-718). Особенно эффективно биологическое изъятие с помощью микроводорослей. Существенное преимущество технологий биоизъятия CO₂ с помощью микроводорослей - возможность их интеграции с существующими технологическими процессами генерации электроэнергии и очистки выбросов без существенной переделки этих технологий (М. Cuaresma, М. Janssen, С. Vilchez, R.Н. Wijffels. Horizontal or vertical photobioreactors? How to improve microalgae photosynthetic efficiency. Bioresource Technology. 2011, V.102, №8, p.5129-5137). Тем не менее, одной из ключевых трудностей при разработке фотобиотехнологий для биоизъятия является недостаток информации о физиологических эффектах высоких концентраций CO₂ и механизмов толерантности микроводорослей к этому фактору.

Одним из наиболее перспективных способов биологической конверсии CO₂ в биомассу, содержащую биологически активные вещества, пигменты-антиоксиданты и исходные вещества для производства биотоплива, считается использование фотоавтотрофных микроорганизмов (микроводорослей). Известны некоторые эффекты широкого диапазона концентраций (от атмосферной до 100%) CO₂ в газовоздушной смеси, которой продуваются культуры MB, преимущественно из родов Chlorella sp., Scenedesmus sp., Nannochloropsis sp. и Chlorococcum (M. Negoro, N. Shioji, K. Miyamoto, Y. Micira. Growth of Microalgae in High CO2 Gas and Effects of SOX and NOX. Applied Biochemistry and Biotechnology. 1991, V.28-29, №1. p.877-886; M. Olaizola. Microalgal removal of CO₂ from flue gases: Changes in medium pH and flue gas composition do not appear to affect the photochemical yield of microalgal cultures. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2003, V.8, №6, p.360-367; N. Kurano et all. Fixation and utilization of carbon dioxide by microalgal photosynthesis. Energy Conversion and Management. 1995, V.36, №6-9, p.689-692; K. Maeda et all. CO2 fixation from the flue gas on coal-fired thermal power plant by microalgae. Energy Conversion and Management. 1995, V.6, №6-9. p.717-720).

Рост и фотосинтез чувствительных штаммов при CO₂ 2-5% замедляется или прекращается. У толерантных штаммов рост и фотосинтез замедляются при существенно более высоких концентрациях CO₂ и возобновляются после лаг-периода, длина которого зависит от концентрации CO₂ и видовых особенностей (A. Satoh, N. Kurano, Н. Senger, S. Miyachi. Regulation of energy balance in photosystems in response to changes in CO₂ concentrations and light intensities during growth in extremely-high-CO₂-tolerant green microalgae. Plant and Cell Physiology. 2002, V.43, №4, p.440-451). У одних микроводорослей (например, у Chlorella) при акклимации к высоким уровням CO₂ наблюдается существенное повышение скорости фотосинтеза, в то время как у других (Chlamydomonas) этого не происходит (М. Baba, I. Suzuki, Y. Shiraiwa. Proteomic Analysis of High-CO₂-Inducible Extracellular Proteins in the Unicellular Green Alga, Chlamydomonas reinhardtii. Plant and Cell Physiology. 2011, V.52, №8, p.1302-1314).

Известна микроводоросль, толерантная к высоким уровням CO₂ - Chlorococcum littorale, выделенная из солоноводного пруда и сохраняющая способность к быстрому росту при концентрации CO₂ до 60% (S. Miyachi, I. Iwasaki, Y. Shiraiwa. Historical perspective on microalgal and cyanobacterial acclimation to low - and extremely high-CO₂ conditions. Photosynthesis Research. 2003, V.77, №2. p.139-153).

Таблица 1
CO2-толерантность некоторых видов микроводорослей
Вид	Макс. концентрация CO2	Источник
Cyanidium caldarium	100%	Seckbach J, Baker FA, Shugarman PM (1970) Algae thrive under pure CO2. Nature 227 (5259): 744-745
Scenedesmus sp.	80%	Hanagata N, Takeuchi T, Fukuju Y, Barnes DJ, Karube I (1992) Tolerance of microalgae to high CO2 and high temperature. Phytochemistry 31 (10): 3345-3348.
Chlorococcum littorale	60%	Kodama M, Ikemoto H, Miyachi S (1993) A new species of highly CO2-tolreant fast-growing marine microalga suitable for high-density culture. J Mar Biotechnol 1: 21-25
Synechococcus elongatus	60%	Miyairi S (1995) CO2 assimilation in a thermophilic cyanobacterium. Energy Convers Manage 36 (6): 763-766
Moheimani NR (2013) Inorganic carbon and pH effect on growth and lipid productivity of Tetraselmis suecica and Chlorella sp (Chlorophyta) grown outdoors in bag

Вид	Макс. концентрация CO2	Источник
		photobioreactors. J Appl Phycol 25 (2): 387-398
Euglena gracilis	45%	Nakano Y, Miyatake K, Okuno H, Hamazaki K, Takenaka S, Honami N, Kiyota M, Aiga I, Kondo J Growth of photosynthetic algae Euglena in high CO2 conditions and its photosynthetic characteristics. In: International Symposium on Plant Production in Closed Ecosystems 440, 1996. pp 49-54
Chlorella sp.	40%	Hanagata N, Takeuchi T, Fukuju Y, Barnes DJ, Karube I (1992) Tolerance of microalgae to high CO2 and high temperature. Phytochemistry 31 (10): 3345-3348.
Eudorina spp.	20%

Кроме толерантности к высоким концентрациям CO₂, для эффективного использования микроводорослей в промышленности, необходимо, чтобы биомасса содержала значительные количества ценных соединений, таких как жирные кислоты, каротиноиды, витамины и пр.

При культивировании микроводоросли Botryococcus braunii шт 765 удается получить биомассу, содержащую до 12% общих липидов и 8% жирных кислот, при этом продуктивность по жирным кислотам составляет 0,08 г/л за 15 суток культивирования при барботировании газовой смесью с содержанием в ней 20% CO₂ (Ge, Y., J. Liu, et al. Growth characteristics of Botryococcus braunii 765 under high CO2 concentration in photobioreactor. Bioresource Technology, 2011. 102 (1): p.130-134).

Известна микроводоросль Parietochloris incisa, содержащая в составе внутриклеточных липидов жирные кислоты, продуктивность по которым достигает 0,25 г/л (что составляет 12-14% ЖК от веса сухой биомассы), путем ее выращивания на минеральной среде, барботированной газовой смесью с повышенным содержанием углекислоты в ней в количестве не менее 1% по объему, не содержащей связанного азота, и освещенности порядка 400 мкЕ ФАР м^-2 с^-1 (Solovchenko, A., et al., Effects of light intensity and nitrogen starvation on growth, total fatty acids and arachidonic acid in the green microalga Parietochloris incisa. Journal of Applied Phycology, 2008. 20 (3): p.245-251).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является микроводоросль Scenedesmus sp., депонированная в Корейской Коллекции Культур (KCTC) под номером KCTC11336BP (US 20110076749 A1, 2010). Культура характеризуется скоростью фиксации CO₂ 0.88 мг/л/сут при максимальной концентрации CO₂ в газовоздушной смеси 10% и требуемой освещенности 125 мкЕ/(м²*с). К недостаткам прототипа можно отнести недостаточно высокую скорость фиксации CO₂, невысокие максимальные концентрации CO₂ в газовоздушной смеси и необходимость в создании условий с достаточно высокой освещенностью культуры.

Раскрытие изобретения

Задача изобретения - получение штамма микроводорослей для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок, характеризующегося высокой скоростью фиксации CO₂ и толерантностью к высоким концентрациям CO₂ в среде культивирования.

Эта задача была решена получением штамма микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, выделенного авторами из Ругозергской губы Кандалашского залива Белого моря и депонированного в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS C-2014.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм микроводоросли, способный к активному росту на средах с высокой концентрацией CO₂ и способностью к высокой степени фиксации углекислого газа.

Сущность изобретения заключается в том, что для достижения цели используют зеленую микроводоросль Desmodesmus sp. штамм 3Dp86E-1, выделенный и идентифицированный авторами заявки, сиквенс которого зарегистрирован в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером JQ313132. В результате полученный штамм характеризуется способностью расти на средах, с высоким содержанием CO₂ в газовоздушной смеси (до 99-100%), высокой способностью к фиксации CO₂ (до 1,5-2 мг/л/сут) и обладает высокой продуктивностью. При этом биомасса микроводоросли Desmodesmus sp. штамм 3Dp86E-1 содержит значительное количество ценных соединений, в частности жирных кислот. Инокулят вносят в среду при конечной концентрации хлорофилла в смеси 4-6 мкг/мл, культивирование проводят в фотобиореакторе при постоянном освещении с интенсивностью 60-80 мкЕ ФАР м^-2с^-1 с помощью светодиодов при постоянном продувании среды газовоздушной смесью с концентрацией CO₂ 20-100%, при скорости продувания - 0,2-0,4 л/мин при температуре 25-27°C. После этого отделяют биомассу от среды центрифугированием. В результате получают накопление биомассы 60-80 г сухого веса/м² в сутки; фиксацию CO₂ со скоростью 2-3 г/л культуры в сутки и накопление жирных кислот 33-35%).

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлен электронно-микроскопический снимок в режиме сканирующей микроскопии, отражающий морфологию микроводоросли Scenedesmus sp. 3Dp86E-1. Обозначения: Ас - автоспора; Сп - спорангий; Тр - трубочка.

На Фиг.2 показана характерная кинетика роста Scenedesmus sp. 3Dp86E-1 при продувании культуры атмосферным воздухом (светлые символы, Air+N) и газовоздушной смесью, содержащей 20 объемных % CO₂ (темные символы, 20+N).

На Фиг.3 представлены данные о накоплении жирных кислот липидов биомассы Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 во время роста при продувании 20% CO₂ в атмосферном воздухе. Содержание линоленовой кислоты (18:3) в биомассе - 15-20% от суммы жирных кислот.

На Фиг.4 приводится частичная последовательность нуклеотидов гена 18S рРНК микроводоросли Scenedesmus sp. 3Dp86E-1.

Осуществление изобретения

Штамм Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 выделен из фрагментов беспозвоночного животного гидроида Dynamena pumila, собранного в районе поселка Приморский Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова, Ругозергской губы Кандалакшского залива Белого моря. Отселектирован в результате скрининга по толерантности к сверхвысоким концентрациям CO₂ и накоплению нейтральных липидов в биомассе культуры.

Способ выделения - из накопительной культуры, полученной из предварительно простерилизованных перекисью водородом фрагментов гидроида Dynamena pumila и помещенных на среду BG-11, с дальнейшим интенсивным культивированием на среде BG-11.

Морфологические признаки.

Клетки округлой формы, размером от 4 до 6 мкм. Пиреноид присутствует, размер 1-1,5 мкм, хроматофор многолопастной, окраска зеленая, жгутик отсутствует, на поверхности клеточной стенки выраженные эпиструктуры в виде бородавок и розеток (Фиг.1).

Физиологические свойства штамма.

Оптимальные условия культивирования

Для культивирования используют жидкую питательную среду BG-11 следующего состава:

K₂HPO₄ - 0,04 г/л,

NaNO₃ - 1,5 г/л,

MgSO₄·7H₂O - 0,075 г/л,

CaCl₂·2H₂O - 0,037 г/л,

лимонная кислота - 0,006 г/л,

FeSO₄·7H₂O - 0,006 г/л,

Na₂CO₃ - 0,2 г/л,

ЭДТА - 0,001 г/л,

раствор FeSO₄·7H₂O (7,45 г/л)+ЭДТА (5,57 г/л) - 1 мл/л,

раствор микроэлементов (H₃BO₃ - 2,86 г/л, MnCl₂·4H₂O - 1,86 г/л, ZnSO₄·7H₂O - 0,22 г/л, CuSO₄·5H₂O - 0,08 г/л, Na₂MoO₄·7H₂O - 0,39 г/л, Co(NO₃)₂·6H₂O - 0,05 г/л) - 1 мл/л,

pH - 7,0-7,2,

содержание CO₂ в ГВС - 2-100%,

скорость барботажа 0,3 л/мин,

температура 27°C,

освещение круглосуточное,

освещенность: 5-12 Вт/м², 60-80 мкмоль квантов ФАР на м² в с,

тип ламп: люминесцентные либо белые светодиодные.

Продуктивность в оптимальных условиях культивирования:

по накоплению биомассы (сухой вес, мг/мл в сутки): 200-250;

скорость роста 0,2-0,3 млн/мл в сутки;

выход полезного продукта (липиды) 20-40 мг/сутки на мг биомассы.

Для данной культуры отсутствует сезонность, отмечается высокая бактерицидность, не выявлен автолиз, характерная слабая агглютинация.

Характеристика роста культуры при повышенных концентрациях CO₂:

хорошо растет при высоких концентрациях CO₂, ингибирующих рост большинства других микроводорослей (характерная кривая роста представлена на Фиг.2). При этом культура фиксирует до 3 г/л в сутки углекислоты при содержании хлорофилла 100 мкг/л.

Биотехнологическая характеристика штамма.

Штамм Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 обладает следующими ценными биотехнологическими характеристиками: интенсивный рост (Фиг.2 при высоких (20-100 об.%) концентрациях CO₂ в газовоздушной смеси; биомассой, обогащенной нейтральными липидами, содержащими полиненасыщенные жирные кислоты (Фиг.3), и каротиноидами (до 90 мкг/г сухого веса клеток), пригодной для производства кормовых добавок.

Генотипирование.

Выделение ДНК.

Для выделения ДНК отбирали 5-10 мг биомассы культуры микроводоросли. Выделение ДНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Перед выделением проводили трехкратное замораживание образцов при -4°C с последующим оттаиванием. Это было необходимо для разрушения прочных клеточных стенок водорослей. Образцы инкубировали в течение часа в 300 мкл TE буфера (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 1 mM EDTA), содержащего 10 мг/мл лизоцима при 37°C. Затем добавляли 2% додецилсульфата натрия и инкубировали в течение часа при 40°C и интенсивном перемешивании. Далее добавляли 1 М NaCl и оставляли на ночь на льду для высаливания белков. После чего проводили процедуру фенол-хлороформной экстракции. Чистоту образцов ДНК оценивали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Полученные образцы ДНК хранили в TE-буфере при -4°C.

Множественное выравнивание.

Проведено множественное выравнивание известных нуклеотидных последовательностей Desmodesmus для участка генов 18S рибосомальной РНК, включающих в себя последовательности ITS1, ITS2 с использованием программы ClustalW.

Проведена ПЦР амплификация соответствующих участков геномной ДНК исследуемых изолятов. Продукты ПЦР очищены с использованием набора для очистки Cleanup Standard (Евроген, Россия) и отсеквенированы с использованием автоматического секвенатора. Для культуры получена последовательность нуклеотидов указанного участка как смысловой (Фиг.4), так и антисмысловой цепи ДНК.

При помощи программы BLAST в базе данных GenBank был проведен поиск ближайших гомологов исследуемых последовательностей. Наибольшее сходство наблюдалось с последовательностями генов 18S pРНК водорослей из родов Desmodesmus. При помощи полученного множественного выравнивания в программе ClustalW было построено филогенетическое дерево.

Филогенетический анализ.

В результате анализа, полученного в работе множественного выравнивания, имеющуюся последовательность можно отнести к роду Desmodesmus.

В результате проведенного филогенетического анализа установлена видовая принадлежность исследуемого изолята. Изолят идентифицирован как Desmodesmus sp. и получил идентификатор 3Dp86E-1; после депонирования в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) ему присвоен идентификатор IPPAS C-2014.

Полученный сиквенс зарегистрирован в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) под номером JQ313132.

Следующие материалы иллюстрируют достижение цели.

Скорость фиксации CO₂ у культуры микроводорослей Desmodesmus sp. штамм 3Dp86E-1 составляет 2-3 г/л культуры в сутки, что в несколько раз превышает аналогичный показатель у прототипа при равной плотности инокулята, максимальная концентрация CO₂ в газовоздушной среде составляет 100%, что в 10 раз выше, чем у прототипа, необходимая освещенность составляет 80 мкЕ/(м²*c), что приблизительно на 35% ниже, чем у прототипа, что также показывает экономическую привлекательность использования данного штамма по сравнению с аналогами.

Штамм микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 успешно прошел предварительное тестирование и этап пробного культивирования в экспериментальных и полупромышленных фотобиореакторах объемом до 50 л. Таким образом, можно считать степень готовности штамма к масштабированию культуры для промышленного применения высокой.

В результате получен штамм микроводоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, депонированный в Российской Коллекции Микроводорослей при учреждении Российской Академии Наук Институте Физиологии Растений им. К.А. Тимирязева (IPPAS) с присвоенным идентификатором IPPAS C-2014, который обладает более высокими показателями фиксации CO₂ и толерантностью к высоким концентрациям CO₂ в среде культивирования, а также более высокой способностью к накоплению нейтральных липидов по сравнению с известными аналогами.

Штамм микроводорослей Desmodesmus sp., депонированный в Коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS S-2014, для конверсии углекислоты из промышленных сбросных газов в сырье для производства биотоплива и кормовых добавок.