Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера



Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера
Способ выявления мутаций в гене myo7a, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты и синдромом ушера

 


Владельцы патента RU 2555755:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу выявления мутаций в гене MYO7A, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты или синдрома Ушера. Способ включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проведение ПЦР, амплификацию 18 участков гена MYO7A, детекцию в денатурирующем акриламидном геле и секвенирование. ПЦР проводят с использованием специально подобранных последовательностей олигонуклеотидов, фланкирующих области 18 экзонов гена MYO7A с возможным содержанием различных мутаций. Изобретение позволяет упростить способ и повысить точность определения мутаций гена MYO7A, а также сократить время исследования. 3 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии, может быть использовано для диагностики врожденной наследственной глухоты у человека, вызванной мутациями в гене MYO7A.

Врожденная глухота - одно из частых заболеваний человека, регистрируемое с частотой 1:1000 новорожденных детей. К сожалению, существует множество причин ослабления слуха и возникновения глухоты. Потеря слуха является одновременно медицинской и социальной проблемой. Наибольшее значение имеет врожденная глухота как тяжелое и инвалидизирующее заболевание. В вопросах этиологии и патогенеза заболевания остается много неясных аспектов, но считается, что примерно половина всех случаев врожденной глухоты имеет наследственное происхождение. Несмотря на острую социальную значимость проблемы, до сих пор не разработаны способы ранней диагностики и система профилактических мероприятий.

Наследственная глухота относится к тем заболеваниям, в которых анамнестические и клинические данные представляют довольно скудный материал для постановки правильного диагноза с определением этиологии заболевания. Вместе с тем, своевременная и точная диагностика этого наследственного дефекта позволит наиболее качественно и в самые ранние сроки начинать реабилитационные мероприятия для обеспечения полноценной социальной адаптации лиц с наследственными дефектами слуха.

Клинический полиморфизм многих наследственных синдромальных и несиндромальных форм тугоухости/глухоты обусловлен в первую очередь ее значительной генетической гетерогенностью [Morton C.C. et al., 2006; Eisen M.D. et al., 2007]. На данный момент известно более 400 синдромов, сочетающихся с патологией слуха [OMIM].

Одной из наиболее распространенных в мире синдромальных форм глухоты является синдром Ушера (СУ), при различных формах которого наблюдается сочетание нарушения слуха и зрения. СУ - это наследственное заболевание, характеризующееся врожденными нарушениями слуха различной степени, вестибулярной дисфункцией и прогрессирующей пигментной дегенерацией сетчатки (ПДС), приводящей к постепенному сужению полей зрения и слепоте, но характер поражения органов свето- и звуковосприятия может быть различным. СУ встречается у 3-10% больных с врожденной глухотой и у 50% детей со слепоглухотой [Boughman J.A. et al., 1983; Pennings R.J., 2005].

Преимущества предлагаемой разработки перед существующими аналогами заключаются в оптимальности разрабатываемых подходов ДНК-диагностики заболеваний, основанных на выявлении существующего своеобразия генофонда народов Волго-Уральского региона.

Белковый продукт гена MYO7A - миозин VIIA, является структурным компонентом стереоцилий в волосковых клетках внутреннего уха и отвечает за везикулярный транспорт в клетках сетчатки и вестибулярного аппарата и принадлежит суперсемейству необычных (неконвенциональных) миозинов, которые взаимодействуют с актином посредством своего моторного домена и благодаря гидролизу АТФ получают энергию для перемещения вдоль актиновых филамент [Mermall V. et al., 1998].

Как и предполагали многие исследователи, различные мутации в гене MYO7A могут вызывать как несиндромальную глухоту (DFNA11, DFNB2), так и СУ [Ahmed Z.M. et al., 2003; Morton C.C. et al., 2006]. Ген MYO7A состоит из 49 экзонов [Adato A. et al., 1997], занимает примерно 87 kb геномной ДНК и кодирует белок в 2215 аминокислотных остатках [Chen Z.Y. et al., 1996].

На сегодняшний день известно более 400 мутаций, идентифицированных в гене MYO7A у больных с DFNA11, DFNB2 и USH1B (Weston M.D et al., 1996; Ahmed Z.M. et al, 2003; Le Quesne Stabej et al., 2012).

Мутации распределены почти по всем экзонам MYO7A, но большинство из них локализовано в экзонах, кодирующих моторный домен (с 3 по 18 экзон) (Weston M.D et al., 1996; Ahmed Z.M. et al., 2003; Yang et al., 2013).

Известны способы детекции различных мутаций гена MYO7A посредством SSCP-анализа каждого из 49 экзонов (Adato A, Weil D, Kalinski Н, Pel-Or Y, Ayadi H, Petit С, Korostishevsky M, Bonne-Tamir В. 1997. Mutation profile of all 49 exons of the human myosin VIIA gene, and haplotype analysis, in Usher 1B families from diverse origins. Am J Hum Genet. 61 (4): 813-821; Weston MD, Kelley PM, Overbeck LD, Wagenaar M, Orten, DJ, Hasson T, Chen Z-Y, et al. 1996) Myosin VIIA mutation screening in 189 Usher syndrome type 1 patients. Am J Hum Genet 59: 1074-1083; Levy G, Levi-Acobas B, Blanchard S, Gerber S, Larget-Piet D, Chenal V, Liu XZ, et al. (1997) Myosin VIIA gene: heterogeneity of the mutations responsible for Usher syndrome type IB. Hum Mol Genet 6: 111-117). Существенными недостатками этих методов являются их трудоемкость, а также большое количество затрачиваемого времени (около 10 суток).

Известен способ детекции мутаций гена MY07A посредством гибридизации на чипах (Sandie Le Guedard-Mereuze, Christel Vache., David Baux, Vale, rie Fauge're, Lise Larrieu, Caroline Abadie, Andreas Janecke, Mireille Claustres, Anne-Francoise Roux, and Sylvie Tuffery-Giraud. 2010, Ex Vivo Splicing Assays of Mutations at Noncanonical Positions of Splice Sites in Usher Genes. Human Mutation, Vol.31, No. 3, 347-355; Prachi Kothiyal, Stephanie Cox, Jonathan Ebert, Ammar Husami, Margaret A Kenna, John H Greinwald, Bruce J Aronow, Heidi L Rehm. High-throughput detection of mutations responsible for childhood hearing loss using resequencing microarrays BMC Biotechnology, 2010, 10:10). Однако гибридизация на чипах - достаточно дорогостоящий и сложный метод, который, к тому же, практически невыполним в условиях диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений.

Прототипом изобретения является работа Orita М. с соавторами, предложенная в 1989 году (Orita М., Iwahana Н., Kanazawa Н., Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism // Protocols Natl. Acad. Sci. - 1989. - V.86. - P.2766-2770). Разработанный Orita M. с соавторами метод выявления однонуклеотидных замен и делеций позволяет идентифицировать различные мутации в ДНК. Время исследования составляет 4 дня.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа и повышение точности определения мутаций гена MYO7A и сокращение времени исследования (до 2-х суток) посредством разработки мультиплексной (триплексной) ПЦР у больных наследственными формами глухоты и у гетерозиготных носителей данных мутаций.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации гена MYO7A, амплифицируют одновременно восемнадцать участков гена MYO7A в шести триплексных системах олигонуклеотидов: триплекс 1 (7 exon) фланкирующих области 18 экзонов с прилегающими сайтами сплайсинга с учетом картины распределения мутаций по экзонам, их локализации, функциональной значимости затрагиваемых доменов белкового продукта гена с последующей детекцией в денатурирующем акриламидном геле.

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл венозной крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Метью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA. // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M.Y.L.: Human Press. 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан объемом 50 мл, туда же добавляется 30 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис HCl (pH 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 0,4 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на 16 часов в термостате при температуре 37°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке:

4. К лизату добавляют 0,5 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до pH 7,8.

5. Смесь встряхивают на шейкере и центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин.

6. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК и неденатурированные белки.

7. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем хлороформом.

8. Препараты осаждают двумя объемами охлажденного этанола 96%.

9. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H2O; раствор хранят при -20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для мультиплексной полимеразной цепной реакции (М-ПЦР) для амплификации 18 фрагментов кодирующего региона гена MYO7A. Первичная последовательность (сиквенс) генов была получена из базы генетических последовательностей GenBank® Национального Института Здоровья, США (National Institute of Health) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. На основе полученной интрон-экзонной структуры соответствующих генов [http://www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas/] были подобраны специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров с помощью пакета биологических программ: Primer Express® Software v2.0 Applied Biosystems, DNASTAR (Primer select 5.05 - 1993-2002), Primer Premier 5.0.

При подборе синтетических олигонуклеотидов в соответствующих биологических программах были заданы стандартные условия: длина синтетического олигонуклеотида 19-24 п.н., средняя температура отжига 60°C, размер ампликона 250-400 п.н. При отборе подобранных программой пар праймеров в мультиплексной системе учитывались следующие критерии:

1) фланкирование всего кодирующего региона (экзона гена);

2) существенные различия в размерах синтезируемых ПЦР продуктах (30 и более п.н.);

3) минимальное наличие или полное отсутствие гетеро- (димеров) и гомо-комплексов - («шпилек»), образуемых праймерами;

4) незначительные отличия в температуре отжига праймеров;

5) отсутствие гомологии с другими участками человеческого генома.

Для этого, на последнем этапе работы предложенные программой олигонуклеотиды оценивались на степень гомологии с ДНК Homo sapiens посредством сравнения последовательностей праймеров и баз данных на сайте http://www.genebee.msu.su/blast_new/blast.html.

Реакционную смесь для проведения полимеразного синтеза, содержащую 0,8 мкг геномной ДНК, рассчитанное количество каждого олигонуклеотида, 125 мкМ соответствующего дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP) (Promega, USA), помещали в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, pH 8,8, 6,7 mM MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20. К полученной смеси прибавляли 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл стерильного минерального масла. ПЦР проводилась на амплификаторе “Терцик” производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс».

Оптимальный температурный режим амплификации для конкретных участков генов подбирался экспериментально и составлял приблизительно 64°C±2°C, с учетом разного G-C контента использованных пар праймеров и первичной последовательности матрицы, а также специфичности самой полимеразной цепной реакции.

Используются шесть триплексных систем олигонуклеотидов: триплекс 1 (7 exon) (F) 5′

После проведения ПЦР 10 мкл амплификата смешивали с 3,3 мкл денатурирующей смеси (5M NaOH и 0,5M ЭДТА) и нагревали в течение 15 минут при 42°C. После этого к пробам добавляли 3-4 мкл формамидной краски, смешанной с 0,5% бромфеноловым синим и 0,5% ксиленцианолом, и наносили на 10% полиакриламидный гель с 3% мочевиной (исходное соотношение акриламида/метиленбисакриламида 29:1) и 5% глицерином. Для проведения электрофореза использовали 0,5*TBE буфер.

Электрофорез геля длиной 20 см, толщиной 1 мм проходил при комнатной температуре при напряжении 100 В в течение 20-40 часов при температуре +4°C. Окраска геля проводилась в течение 15 минут 0,09% раствором азотнокислого серебра (AgNO3). Далее гель промывался дистиллированной водой и помещался в раствор, содержащий 40% формалин и NaOH (5М). После проявления гель еще раз промывали дистиллированной водой.

Идентификацию генотипов проводили по критерию присутствия или отсутствия дополнительных полос в сравнении с контрольной ДНК (норма) и панели образцов ДНК с мутациями (фигура 1).

Подготовка матриц для секвенирования включала очистку продуктов ПЦР от избытка праймеров, димеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) путем ферментативной обработки экзонуклеазой (ExoI) и последующей очисткой на колонках из сорбента Sepfadex G50 фирмы Fine Chemicals АВ (Упсала, Швеция).

Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель 310 (Applied Biosystems) с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamic ЕТ согласно протоколу фирмы производителя [Amersham Pharmacia Biotech DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit].

Для «прочтения» последовательности нуклеотидов использовали приложение BioEdit v.5.0.9. (1997-2001), а для анализа полученных сиквенсов - MegAlign из пакета программ DNAStar Inc (1993-2002).

На фигуре 1 представлено электрофоретическое разделение продуктов амплификации 6 мультиплексных систем гена MYO7A. Дорожка 1 - молекулярный маркер λpUC19/Pst1; дорожка 2 - триплекс 1 (экзон 7 - 172 п.н., экзон 3 - 220 п.н., экзон 5 - 260 п.н.), дорожка 3 - триплекс 2 (экзон 17 - 275 п.н., экзон 31 - 306 п.н., экзон 13 - 330 п.н.), дорожка 4 - триплекс 3 (экзон 23 - 292 п.н., экзон 35 - 364 п.н., экзон 16 - 383 п.н.), дорожка 5 - триплекс 4 (экзон 41 - 317 п.н., экзон 47 - 344 п.н., экзон 36 - 378 п.н.); дорожка 6 - триплекс 5 (экзон 23 - 295 п.н., экзон 9 - 328 п.н., экзон 16 - 401 п.н.), дорожка 7 - триплекс 6 (экзон 12 - 251 п.н., экзон 10 - 288 п.н., экзон 34 - 359 п.н.).

Предметом исследования послужили образцы ДНК неродственных индивидов. В качестве контроля использовалась ДНК обследованных здоровых доноров.

В качестве конкретных примеров в целом были обследованы 40 неродственных пациентов с диагнозом «синдром Ушера», а также 231 пробанд с диагнозом двухсторонняя нейросенсорная тугоухость предположительно наследственной этиологии, состоящих на учете в Республиканском сурдологическом центре Республиканской детской клинической больницы г.Уфы, члены их семей, а также здоровые доноры, проживающие в Волго-Уральском регионе. Диагноз глухоты или тугоухости устанавливался на основе данных тональной пороговой аудиометрии (аудиометр «GSI-61», Grason Stadler Instruments, USA), акустической импедансометрии (импедансометр «Zodiac 901», Дания) и регистрации отоакустической эмиссии (система «ILO 92», Otodynamics Ltd., Великобритания). Диагноз синдрома Ушера был поставлен на основании аудиологических (отоскопии, чистотональной аудиометрии, вызванной отоакустической эмиссии), офтальмологических (фундоскопии, остроты зрения, полей зрения, электроретинографии) данных, а также анализа вестибулярной функции (электронистагмографии). В ходе исследования уточнялись данные об этнической принадлежности пациентов путем анкетирования и выяснения национальной принадлежности родителей до третьего поколения. При этом особое внимание было уделено выявлению кровнородственных браков в семьях исследованных больных.

Наследственный характер глухоты в семьях устанавливали на основании генеалогических данных и ретроспективного анализа анамнеза больных с целью исключения возможного влияния факторов внешней среды во время пренатального и постнатального развития: учитывали отсутствие инфекций, травм слухового аппарата. В качестве контроля использованы ДНК 50 здоровых индивидов, обследованных в ГУ УфНИИГБ АНРБ и сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности с обследуемой группой. Аналогично, для сравнения по этнической принадлежности были выбраны представители трех основных этнических групп - русских, татар и башкир, проживающих на территории РБ. Представители других национальностей не вошли в данную часть исследования из-за их малочисленности в выборке больных.

SSCP - анализ 5, 9, 18, 22, 36 экзонов гена MYO7A не выявил изменений подвижности одноцепочечной ДНК в выборке больных.

В экзоне 3 нами было зафиксировано одинаковое изменение подвижности у 5 неродственных больных. Секвенционный анализ данного экзона позволил обнаружить нуклеотидную замену цитозина на тимин в 47 положении (с.47T>C), приводящую к замене аминокислоты (p.Leu16Ser) в кодирующей части третьего экзона (Фигура 2).

Из всей выборки больных (N=231) из Республики Башкортостан данная нуклеотидная замена в гетерозиготном состоянии была выявлена у 111 больных, что составило частоту 48%, частота аллеля *C при этом была 0,48.

В группе контроля аллель *C не был выявлен. У всех пациентов была установлена наследственная несиндромальная форма потери слуха. В результате проведенного статистического анализа выявлены достоверные различия (χ2=21,068; p>0,000) в распределении частот аллелей гена между выборками здорового контроля и группами пациентов с нарушениями зрения и слуха.

Полученные нами данные согласуются с литературными и подтверждают предположение о возможной патогенетической роли найденной нуклеотидной замены в патогенезе нарушений слуха и зрения.

Идентифицированные нами частоты аллелей T* и C* совпадают с результатами, полученными в центре по изучению полиморфизмов человека в Париже (СЕРН), где мажорным аллелем является C*. Данные, предоставленные другими научно-исследовательскими центрами из Азиатских стран - Японии, Китая, свидетельствуют о том, что в этих популяциях мажорным является другой аллель - C*.

Полученное соотношение частот аллелей, возможно, объясняется этническим своеобразием индивидов, составивших исследуемые выборки пациентов и группу контроля.

SSCP-анализ ПЦР продуктов, синтезированных с использованием мультиплексной системы (триплекса) на 13, 17, 31 экзоны гена MYO7A обнаружил изменение электрофоретической подвижности в 31 экзоне у двух пациентов с несиндромальной глухотой, последующее секвенирование которого позволило выявить изменение нуклеотидной последовательности в 4074 положении, ранее не описанное в литературе (Фигура 3).

Данный полиморфный вариант был обнаружен у двух пациентов русской этнической принадлежности из Республики Башкортостан с диагнозом врожденной нейросенсорной тугоухости IV степени. В группе контроля С.4074C>T (p.Ser1358Ser) обнаружен не был. Выявленная нуклеотидная замена является синонимичной, на основании чего ее можно считать полиморфизмом по типу транзиции.

Полученные высокие значения частоты p.Leu16Ser среди больных острой нейросенсорной тугоухостью в Башкортостане подтверждают важность определения этого изменения нуклеотидной последовательности в гене MYO7A при медико-генетическом консультировании пациентов с наследственными формами потери слуха.

Пример. Больной Ф.Ш., 1989 год рождения, город Туймазы, Республика Башкортостан. Диагноз синдрома Ушера установлен в 1990 году. В настоящее время пациент использует слуховой аппарат. Сибс пациента также болен синдромом Ушера. При молекулярно-генетическом тестировании у больного, его брата и родителей было взято по 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией трех участков 18 экзонов гена MYO7A в 6 триплексных системах, содержащей 0,8 мкг геномной ДНК, соответствующие кол-ва каждого олигонуклеотида, 125 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 12,5 мкл однократного буфера для ПЦР. Затем провели электрофорез амплифицированных ПЦР-продуктов при постоянном напряжении 110 вольт. После окончания электрофореза гель окрасили последовательно раствором азотнокислого серебра и натрия гидрокарбоната в течение 15 минут и проанализировали. Исследование ДНК больного и его сибса выявило мутацию p.Leu16X в компаундгетерозиготном состоянии с мутацией p.Ala26Glu у пациента и его сибса. Мать пациента была носительницей мутации p.Leu16X, а отец имел мутацию p.Ala26Glu в гетерозиготном состоянии. Время исследования составило 4 дня.

В заключение необходимо отметить, что в связи с интенсивным накоплением знаний об основных этиологических, патогенетических механизмах на молекулярно-генетическом уровне, существенно расширяются возможности проведения дополнительных методов исследования, среди которых особенно актуальными становятся методы ДНК-диагностики. Поскольку они позволяют выяснить первопричину заболевания, открытие патогенетических механизмов которого в дальнейшем значительно облегчает терапию заболевания. Полученные в ходе данного исследования данные позволяют оценивать вероятность появления врожденной глухоты и синдрома Ушера у детей из семей с отягощенной наследственностью. Установление с помощью молекулярно-генетических методов необратимого наследственного повреждения слуха с самого рождения позволяет правильно проводить реабилитацию ребенка с повреждениями процесса звуковосприятия и снижать экономические затраты на проведение дорогостоящих диагностических процедур.

Способ выявления мутаций в гене MYO7A, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты или синдрома Ушера, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проведение полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов ДНК, содержащих различные мутации гена MYO7A, отличающийся тем, что амплифицируют одновременно восемнадцать участков гена MYO7A в шести триплексных системах олигонуклеотидов: экзонов с прилегающими сайтами сплайсинга с учетом картины распределения мутаций по экзонам, их локализации, функциональной значимости затрагиваемых доменов белкового продукта гена с последующей детекцией в денатурирующем акриламидном геле и секвенированием.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе.

Изобретение относится к области кардиологии и касается набора синтетических олигонуклотидов. Представленный набор используется для выявления мутаций кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к паре синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выделения ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек, и к способу диагностики вирусного иммунодефицита кошек с использованием данных праймеров.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации вируса лихорадки долины Рифт методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. Способ предусматривает выделение ДНК, проведение ПЦР с применением синтезированных праймеров для амплификации фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDF_0064-YPDSF_0065 исследуемого штамма.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа соматических мутаций в генах EGFR, KRAS и BRAF. Способ включает амплификацию фрагментов генов EGFR, KRAS и BRAF с помощью LNA-блокирующей мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется образец опухолевой ДНК.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики вагинита у женщин репродуктивного возраста. Во влагалищных соскобах измеряют уровни экспрессии мРНК генов TNF, IL18, GATA3 и TLR4.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к микроматричной геномной селекции (MGS). Устройство содержит:(a) по меньшей мере одну реакционную зону, содержащую микроматрицу, одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри реакционной зоны; (b) по меньшей мере одну нереакционную зону, содержащую одну или более единиц контроля и регуляции температуры для контроля и регуляции температуры внутри нереакционной зоны, которая соединена с возможностью переноса жидкости с реакционной зоной; и (c) по меньшей мере одно средство переноса, способное генерировать и/или регулировать поток жидкости между указанной реакционной зоной (а) и указанной нереакционной зоной (b).

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы. Охарактеризованный способ включает проведение ПЦР с использованием специфических праймеров к генам vc0497, vc0502 и vc0514 из острова пандемичности VSP-II. Охарактеризованная тест-система содержит компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР, включающие, в частности, смесь праймеров VSPIIreg-F - 5′-TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC-3′, VSPIIreg-R - 5′-CCCTGTTGATGATGTGATTTG-3′ на ген vc0497, VSPIIpilin-F - 5′-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3′, VSPIIpilin-R - 5′-GCGTAAACTGAGCCAATAAGC-3′ на ген vc0502, VSPIIchem-F - 5′-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3′, VSPIIchem-R - 5′-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3′ на ген vc0514, взятых в соотношении 1:1:1:1:1:1 соответственно. Изобретения позволяют быстро и достоверно дифференцировать токсигенные генетически измененные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор на геноварианты с низким и высоким эпидемическим потенциалом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Группа изобретений относится к области лизиса клеток. Предложен способ избирательного лизиса животных клеток, а также прибор для обнаружения микроорганизмов. Способ избирательного лизиса животных клеток в пробе воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, включает этапы обеспечения пробы воды с животными клетками, содержащей или, возможно, содержащей микроорганизмы, добавления в упомянутую пробу неионогенного детергента и буферного раствора для получения раствора со значением pH около 9,5 или выше, инкубации упомянутого раствора на протяжении периода, достаточного для лизиса животных клеток. Прибор для обнаружения микроорганизмов в пробе состоит из лизисной камеры для принятия пробы воды с животными клетками, сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH 9,5 или выше и неионогенным детергентом, или сосуда с щелочным буферным раствором со значением pH около 9,5 или более и сосуда с неионогенным детергентом, фильтра, соединенного с лизисной камерой для фильтрации пробы после лизиса животных клеток, камеры индикации для анализа присутствия ДНК микроорганизмов. Предложенные изобретения обеспечивают обработку образца без его значительного разбавления и без применения ферментативного расщепления ДНК или термической обработки, а также позволяют обрабатывать более значительные объемы образца и определять низкие концентрации болезнетворных микроорганизмов в образце. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов. Способ включает проведение электрофореза с указанной РНК. Определяют, удовлетворяет ли указанная РНК следующему уравнению: В/А≤1, где А представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, а В представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом. Если указанная РНК, экстрагированная из ткани или клетки (клеток), удовлетворяет указанному уравнению, то она пригодна для анализа экспрессии генов. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой эффективностью определить пригодность РНК для анализа экспрессии генов. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 11 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к интернализации терапевтических молекул внутрь клетки, и может быть использовано в медицине. Получают композицию для доставки молекул нуклеиновых кислот в клетки, содержащую по меньшей мере один пептид с по меньшей мере 92% идентичностью к GAAEAAARVYDLGLRRLRQRRRLRRERVRA (SEQ ID NO: 2); IREIMEKFGKQPVSLPARRLKLRGRKRRQR (SEQ ID NO: 3); или YLKVVRKHHRVIAGQFFGHHHTDSFRMLYD (SEQ ID NO: 4), присоединенный к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот. Изобретение позволяет повысить эффективность доставки молекул нуклеиновых кислот внутрь клетки млекопитающего за счет пептида, способного интернализироваться внутрь клетки млекопитающего с эффективностью, составляющей по меньшей мере 200% от эффективности интернализации пептида ТАТ, имеющего аминокислотную последовательность GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 1). 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 табл., 8 пр.

Изобретение относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения полиморфизма гена GP6 человека, кодирующего гликопротеин VI, по полиморфной позиции rs 1613662, основанный на снятии кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными пробами. Благодаря увеличению надежности определения вариабельных позиций и возможности проводить определение в одной пробирке на стандартном оборудовании способ может быть эффективно использован для диагностики наследственных предрасположенностей человека с регистрацией результатов ПЦР в реальном времени. 1 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia pseudomallei и дифференциации от возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией. Заявленное изобретение позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя мелиоидоза и дифференцировать его от возбудителя сапа в пробах чистых культур и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к ингибиторам сигнального пути AXL, и может быть использовано в медицине. Получают растворимый вариант полипептида AXL без трансмембранного домена AXL, который содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в положении номер n, где n выбран из 32, 72, 87, 92 или 127 или их сочетание, где n+7 соответствует нумерации SEQ ID NO: 1 - последовательности AXL дикого типа, в котором указанная модификация повышает сродство связывания полипептида AXL со специфически задерживающим рост белком 6 (GAS6), которое, по меньшей мере, примерно в 2 раза сильнее, чем сродство полипептида AXL дикого типа. Полипептид может быть слит с Fc фрагментом и использован в способе лечения, снижения или предотвращения метастазирования или инвазии опухоли у пациента-млекопитающего. Изобретение позволяет эффективно ингибировать сигнальные пути AXL/GAS6. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 6 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностике кардиомиопатий различной природы. Предложен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления мутаций кодирующей части гена десмина (DES), ассоциированных с кардиомиопатиями. Мутации выявляют путем определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части гена DES. Осуществляют амплификацию кодирующей части гена DES с помощью 7 пар синтетических олигонуклеотидов при одной температуре и времени отжига, с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации с помощью одной пары универсальных праймеров. Предложенное изобретение позволяет чувствительно и специфично определять мутации гена DES, при этом сокращаются время реакции амплификации, количество манипуляций, время внесения реактивов для реакции секвенирования и снижается вероятность ошибки при постановке реакции. 2 з.п. ф-лы, 1 ил.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации изменений в экспрессии генов, характерных для старения, в выбранной ткани. Выбранная ткань представляет собой сердечную, мышечную, мозговую или жировую ткань. Способ включает отбор одного или нескольких генов, дифференциально экспрессируемых в ткани старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, с применением двух критериев. Указанными критериями являются изменение экспрессии по меньшей мере в 50% линий, пород или этнических групп тестируемых видов на заранее определенном уровне значимости в р<0.10, а также по меньшей мере частичное обращение изменений в экспрессии генов путем ограничения в калорийности. Изобретение обеспечивает получение надежных тканеспецифических биомаркеров старения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 11 табл., 5 пр.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины, молекулярной биологии и биотехнологии. Предложен способ определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину, включающий определение уровня экспрессии генов MLH1, ERCC1, DDB2, AKR1B1, FTL в зависимости от IC50 цисплатина для известных клеточных линий, построение градуировочной прямой зависимости IC50 цисплатина для этих клеточных линий от полученного уровня экспрессии указанных генов и гибридизацию на микрочипе. Предложен также набор олигонуклеотидных зондов, представленных SEQ ID NO: 9-13. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные средства и методы для определения чувствительности клеток рака легкого к цисплатину. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.
Наверх