Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению мутантов инфестина 4, и может быть использовано для диагностических целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов. Полипептид характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB SEQ ID NO: 1. При этом указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида. Изобретение позволяет получить высокоселективный ингибитор фХIIа, селективность или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15. Полипептид используют для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта для увеличения времени хранения образца. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 4 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности гематологии, и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии и в фундаментальных биологических исследованиях.

Предшествующий уровень техники

Плазменное свертывание крови

Свертывание крови - защитный процесс организма; одна из основных составляющих этого процесса - образование фибринового сгустка. Фибриновый сгусток образуется в результате активации ферментативного каскада факторов свертывания; многие из факторов свертывания являются сериновыми протеазами (VIIa, XIIa, XIa, IXa, Xa, тромбин IIa). Также в работе ферментативного каскада свертывания участвует активированный протеин С (аРС) - протеаза, которая активируется тромбином и инактивирует кофакторы свертывания VIIIa и Va. Активация ферментативного каскада происходит по «внешнему» пути, за который отвечает фактор VIIa (фVIIa) и тканевый фактор (ТФ, или тромбопластин), или по «внутреннему» пути, который начинается с контактной активации фактора XII (фХII, или фактора Хагемана) (Mann et al. 1990, Blood 76:1-16; Hoffman и Monroe. 2001, Thromb. Haemost. 85:958-965). Контактная активация представляет собой самоактивацию фХП при контакте плазмы крови с отрицательно заряженными поверхностями. фХП присутствует в плазме крови в неактивном состоянии, в комплексе с высокомолекулярным кининогеном (HMWK) и плазменным пре-калликреином он превращается в активную протеазу фактор XIIa (фXIIa). Поверхностями, приводящими к активации фХII, могут быть любые чужеродные поверхности, в т.ч. стенки пластиковых или стеклянных пробирок, поверхности стентов, катетеров и т.д. фXIIa протеолитически активирует прекалликреин в его активную форму калликреин, фермент, в т.ч. отвечающий за активацию системы фибринолиза, и фактор «внутреннего» пути свертывания XI в его активную форму фактор XIa (фXIa) (Ichinose et al. 1986, J. Biol. Chem. 261:3486-3489; Schmaier. 2008, J. Clin. Invest. 118:3006-3009).

Подавление контактной активации

Важной проблемой является подавление свертывания по контактному пути, которое возникает при контакте образца крови или плазмы (цельной крови или плазмы крови, в том числе богатой, бедной или освобожденной от тромбоцитов плазмы) с чужеродной поверхностью и препятствует использованию образца для хранения, трансфузии и исследования (Sperling et al. 2009, Biomaterials 30:4447-4456; Streller et al. 2003, J. Biomed. Mater. Res. В Appl. Biomater. 66:379-390). Активация фХПа происходит при извлечении крови из сосудистого русла организма, например: 1) при заборе крови в пробирку от поверхностей иглы, трубочек и стенок пробирки; 2) при хранении плазмы крови в замороженном виде и последующем оттаивании плазмы; или 3) при использовании аппарата искусственного (экстракорпорального) кровообращения, в частности при трансфузии крови или плазмы. Контактная активация при заборе крови или оттаивании замороженной плазмы может инициировать свертывание в пробирке, которое препятствует получению образца и исследованию свертывания (Smith et al. 2010, Blood Coagul. Fibrinolysis. 21:692-702; Suontaka et al. 2005, Vox. Sang. 88:172-180). При аутотрансфузии или повторном вливании крови активация контактного пути приводит к увеличению риска тромбозов. Для блокирования свертывания крови при использовании аппарата искусственного кровообращения трубочки и другие поверхности аппарата покрываются ингибиторами фХа и тромбина, такими как гепарин, бензамидин и т.д. (Hsu. 2001, Perfusion 16:417-428; Gouzy et al. 2006, Biointerphases 1:146-155). Недостаток такого способа блокирования свертывания заключается в том, что добавление ингибиторов фХа и тромбина не препятствует наработке фXIIa, который может инициировать свертывание после вливания крови или плазмы в сосудистое русло организма.

Наиболее распространенным способом подавления свертывания при заборе крови служит предварительное добавление в пробирку, в которую забирается кровь, хелатора ионов кальция (например, цитрата натрия, ЭДТА и т.д.). Хелатирование ионов кальция блокирует мембранно-зависимые реакции активации фХ и тромбина (Fischer. 2007, Hemodial. Int. 11:178-189). При проведении исследования свертывания в исследуемый образец, содержащий хелатор, добавляется активатор свертывания (в частности, ТФ или активатор контактного пути) и плазма рекальцифицируется (добавляется избыток ионов кальция), далее исследуются параметры образования фибринового сгустка. Способ подавления свертывания путем добавления хелатора обладает некоторыми недостатками. В работе Mann et al. 2007, J. Thromb. Haemost. 5:2055-2061 было показано, что хелатирование ионов кальция при заборе крови и последующая рекальцификация образца изменяют динамику образования фибринового сгустка, наработки тромбина и агрегации тромбоцитов по сравнению с образцами без добавления хелатора. Добавление хелатора не приводит к подавлению реакций активации фХI и фIХ, которые инициируются фXIIa, образующимся при проведении забора крови и хранении образца (Nossel et al. 1968, J. Clin. Invest. 47:1172-1180; Oiler et al. 1976, J. Surg. Res. 20:333-340). Поэтому при исследовании свертывания, в частности ТФ-инициированного свертывания по «внешнему» пути (который считается физиологическим и отвечающим за свертывание в нормальном состоянии организма), из-за образовавшегося фXIIa также происходит свертывание по контактному пути, которое вносит нежелательные искажения в результаты исследования. Свертывание по контактному пути в таком исследовании является артефактом, который может препятствовать адекватной оценке эффектов физиологического свертывания, приводить к увеличению ошибки и несоответствию результатов исследования, а также к потере чувствительности в отношении патологических состояний свертывания. Чтобы подавить контактную активацию, избежать появления артефактов и улучшить качество исследования свертывания, необходимо использовать ингибитор фXIIa при заборе крови или подготовке плазмы (Luddington и Baglin. 2004, J. Thromb. Haemost. 2:1954-1959). Используемый ингибитор контактной активации должен быть высокоселективным: когда концентрация добавленного к образцу ингибитора достаточна для эффективного подавления контактного пути свертывания, ингибитор не оказывает влияния на ТФ-инициированное образование фибринового сгустка, т.е. не ингибирует фXIa, фIХа, фХа и другие.

Известные ингибиторы контактной активации

Известен ряд ингибиторов фXIIa, в частности плазменные ингибиторы свертывания, например С 1-ингибитор, альфа2-макроглобулин. (Davis et al. 2008, Mol. Immunol. 45:4057-4063). Также известны белковые ингибиторы трипсина, которые ингибируют фХПа и были выделены из различных организмов, например, из бактерии E.coli (Ulmer et al. 1995, FEBS Lett. 365:159-163), из семян растений (Wynn и Laskowski. 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 166:1406-1410). К числу ингибиторов из семян растений относится кукурузный ингибитор трипсина или КТИ (Hojima et al. 1980, Thromb. Res. 20:149-162), а также ингибиторы из семейства тыквенных: Cucurbita maxima trypsin inhibitor, CMTI-III (Krishnamoorthi et al. 1990, FEBS Lett. 273:163-167), Luffa cylindrica trypsin inhibitor, LCTI-III (Ling et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:810-814), и другие. Известны также небелковые ингибиторы фXIIa (Woodruff et al. 2013, J. Thromb. Haemost. 11:1364-1373). Однако большинство из перечисленных ингибиторов являются неселективными, кроме фXIIa, они ингибируют также другие факторы свертывания, что делает невозможным их применение при исследовании образования фибринового сгустка.

Наиболее селективным из существующих ингибиторов считается КТИ. Известно применение КТИ для ингибирования контактной активации при исследовании ТФ-инициированного свертывания в образце крови или ее компонента (US 6,403,381, кл. G01N 33/86, опубл. 11.06.2002), в т.ч. в глобальных тестах гемостаза, например в тесте генерации тромбина. Однако существуют данные о недостаточной селективности КТИ, так как известно его влияние на систему свертывания крови и другие системы, взаимодействующие со свертыванием. Так, КТИ задерживает фибринолиз, предположительно, путем ингибирования тканевого активатора плазминогена (Nielsen. 2009, Blood Coagul. Fibrinolysis 20:191-196).

Известен также ингибитор фХПа инфестин 4 (домен 4 белка инфестин из желудка кровососущего насекомого Triatoma infestans), он относится к семейству ингибиторов типа Казаля (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577:512-516). Аминокислотная последовательность инфестина 4 (Inf4) и пространственная структура приведены в публичной базе данных Protein Data Bank (http://www.rcsb.org), номер записи 2ERW.

Известные применения инфестина 4 и недостатки существующих вариантов инфестина 4

В работе Hagedorn, Schmidbauer et al. 2010, Circulation 121:1510-1517 было показано, что инфестин 4 является селективным ингибитором фXIIa, блокирующим активность фXIIa в модели тромбоза in vivo и предотвращающим эмболию сосудов, при этом он не изменяет параметры гемостаза. Применение инфестина 4 в виде слитного белка с альбумином для лечения и профилактики болезней, связанных с тромбозами, раскрыто в патенте US 8,283,319, кл. A61K 38/16, опубл. 09.10.2012. Однако недостатком инфестина 4 является его ингибирующая активность по отношению к фХа (константа ингибирования Ki 53 нМ).

Известен мутант инфестина 4 Inf4Mutl5 (Mutl5), который обладает повышенной селективностью к фXIIa, т.к. не ингибирует фХа (Campos, Souza et al. 2012, Acta Cryst. D68:695-702). Упомянутый мутант был выбран ближайшим аналогом заявляемого решения. Из уровня техники неизвестна селективность ингибирования указанным мутантом фXIIa, т.е. неизвестно, обладает ли он ингибирующей активностью к фXIa, фIХа, фVIIa, тромбину и аРС. Применение Mutl5, в том числе, в наборе для диагностики геморрагических и тромболитических заболеваний путем определения концентрации фХПа в крови пациента, известно из патента BRPI 0602496-3, кл. A61K 38/36, опубл. 26.02.2008, однако указанное применение не связано с диагностикой заболеваний путем измерения параметров свертывания. Таким образом, из уровня техники не известен высокоселективный ингибитор фXIIa для блокирования контактной активации при исследовании ТФ-инициированного свертывания крови.

Задачей настоящего изобретения является создание высокоселективного ингибитора фXIIa для блокирования контактной активации при проведении исследований свертывания крови или плазмы, в частности инициированного ТФ, а также при заборе и хранении крови или плазмы.

Сущность изобретения

Одним из аспектов настоящего изобретения является создание полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, который является высокоселективным ингибитором фXIIa и обладает активностью и селективностью выше, чем у нативного инфестина 4, ингибирования контактной активации в тестируемом образце.

Под определением «полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB» подразумеваются полипептиды, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. Однако такое определение включает также полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, если эти полипептиды существенно сохраняют активность «немодифицированного» полипептида. Например, такие модификации могут представлять собой изменения N- или С-концов последовательности, делеции или вставки одного или нескольких аминокислотных остатков, а также консервативные аминокислотные замены, а именно замены, выполненные в пределах группы аминокислот с аналогичными характеристиками, например (1) малых, (2) кислых, (3) полярных, (4) основных, (5) гидрофобных и (6) ароматических аминокислот.

Полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, может быть получен путем химического синтеза или в виде рекомбинантного белка, в том числе в виде слитного белка с белком-партнером. Его получение в виде рекомбинантного белка может быть осуществлено путем создания экспрессионной плазмидной ДНК, трансформации ее в клетку-хозяина, экспрессии полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, который кодируется указанной ДНК, выделения и очистки указанного полипептида. Участок ДНК, который кодирует, по существу, тот же белок, может быть получен, в частности, путем модификации нуклеотидной последовательности указанной выше плазмидной ДНК, например посредством метода сайт-направленного мутагенеза.

Под «активностью ингибитора» здесь следует понимать функциональную активность ингибирования свертывания крови, инициированного по контактному пути. Так, например, активность ингибитора можно детектировать в коагулометрическом тесте «активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)».

Под «селективностью ингибирования» здесь следует понимать свойство ингибитора фXIIa, заключающееся в ингибировании фХПа с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы фXIa, фIХа, фХа, фVIIa, тромбин и аРС. Известно, что нативный инфестин 4 ингибирует фХа с константой 53 нМ (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577:512-516). При этом заявляемый полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, так же эффективно ингибирует фXIIa, как и нативный ингибитор, но не ингибирует фХа. Таким образом, заявляемый полипептид обладает повышенной селективностью к фXIIa по сравнению с нативным инфестином 4.

«Тестируемый образец» представляет собой цельную кровь или ее продукты, например, богатую тромбоцитами плазму, бедную тромбоцитами плазму, освобожденную от тромбоцитов плазму. Также таким продуктом может быть фракционированная плазма, из которой удален один или несколько белков, в т.ч. при помощи метода аффинной хроматографии. Образец может быть получен от здоровых субъектов или от субъектов, которые могут страдать или страдают от нарушения свертывания крови, в частности субъектов с геморрагиями или тромбозами, имеющих нарушения или дефицита системы гемостаза. Также образец может быть получен у пациентов при хирургических вмешательствах или при осуществлении антикоагулянтной, прокоагулянтной, антиагрегантной, фибринолитической или антифибринолитической терапии и т.д. Образец может быть свежеполученным или может находиться в замороженном состоянии. Также образец может находиться в лиофилизованной форме. Образец может содержать природные или рекомбинантные белки, а также другие препараты или реагенты, в том числе такие, которые обладают гемостатической или фибринолитической активностью.

Другим аспектом изобретения является применение указанного полипептида для исследования свертывания тестируемого образца, которое включает, по крайней мере, один из следующих шагов, преимущественно, все шаги: приготовление образца, приведение его в контакт с указанным полипептидом и инкубацию полученной смеси, приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, содержащим указанный полипептид, и измерение параметров свертывания образца.

Приготовление образца может осуществляться путем забора крови в пробирку, содержащую или не содержащую антикоагулянт, в т.ч. цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина, ингибитор фХа и другие, и последующего получения образца из взятой крови. Процесс получения образца из крови может содержать стадии очистки крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов, таких как эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, микровезикулы и т.д. Стадии очистки могут состоять из фильтрации или центрифугирования. Полученный образец может быть заморожен для хранения и далее разморожен перед проведением исследования свертывания. Также перед проведением исследования образец может пройти стадию рекальцификации.

Полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, может приводиться в контакт с тестируемым образцом в пробирке, в частности в пробирке для забора крови, или в аналитической кювете. Указанный полипептид может быть в растворенной форме, в высушенной или лиофилизованной форме, также указанный полипептид может быть адсорбирован на поверхностях, с которыми кровь или плазма субъекта контактирует при заборе крови, при приготовлении или проведении исследования свертывания тестируемого образца. Кроме того, полипептид может быть предварительно растворен в растворе, который содержит соль, буферное вещество, в частности, 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), экципиент или стабилизатор, в частности поливинилпирролидон (ПВП). Для эффективного растворения указанного полипептида в образце полученная смесь образца и полипептида может инкубироваться при температуре от +20°С до +40°С, преимущественно, при +37°С, в течение времени, более чем 3 минуты, преимущественно более 10 минут. Для эффективного ингибирования контактной активации свертывания достаточное количество указанного полипептида может быть определено посредством измерения активности полипептида в образце, полученном от здорового донора, например, при помощи теста АЧТВ. Так, достаточным для эффективного ингибирования контактной активации будет такое количество полипептида, при котором АЧТВ увеличено более чем в 2 раза, преимущественно более чем в 3 раза, по сравнению с АЧТВ образца без полипептида. Также достаточное количество указанного полипептида может быть определено при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2» [RU 123166 В от 16.08.2012 класс G01N 33/86; USPTO Pat. app. No.20100261211], в частности, по отсутствию сгустков вдали от активатора свертывания в образце, полученном от здорового донора, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.

Приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, содержащим указанный полипептид, может осуществляться путем добавления в указанный образец раствора, содержащего активатор свертывания, или путем наслоения указанного раствора на образец без перемешивания. Также образец может быть приведен в контакт с поверхностью, на которой иммобилизован активатор свертывания, при этом образец не перемешивается с активатором (Фадеева и др. 2010, Биохимия 75:827-838). Активатором свертывания может являться тканевый фактор, в частности ре-липидированный тканевый фактор. Тканевый фактор может быть получен в виде рекомбинантного белка или путем выделения из органов или тканей, таких как мозг, плацента, легкие, некоторых млекопитающих, например, человека, быка, кролика. Также активатором может являться один из факторов свертывания, таких как VIIa, Xa, IIa, IXa, XIa, XIIa.

Измерение параметров свертывания тестируемого образца может осуществляться, в частности, посредством теста генерации тромбина, теста тромбоэластографии, известных из уровня техники, или лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2». В качестве указанных параметров свертывания могут быть определены: время задержки начала свертывания, время свертывания, и время задержки наработки тромбина, время достижения максимума тромбина, максимальная концентрация тромбина, угол наклона тромбоэластограммы, скорость роста сгустка, размер сгустка в фиксированный момент времени, наличие сгустков вдали от активатора свертывания, скорость лизиса сгустка и другие.

Другим аспектом изобретения является применение полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, в качестве антикоагулянта, блокирующего контактную активацию, путем приведения в контакт с указанным полипептидом образца для забора и увеличения времени хранения образца.

Полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, может приводиться в контакт с образцом в пробирке, в частности, в пробирке для забора крови. Указанный полипептид может быть в растворенной форме, в высушенной или лиофилизованной форме, также указанный полипептид может быть адсорбирован на поверхностях, с которыми кровь или плазма субъекта контактирует при заборе крови или при приготовлении образца. Кроме того, полипептид может быть предварительно растворен в растворе, который содержит соль, буферное вещество, в частности, 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), экципиент или стабилизатор, в частности, поливинилпирролидон (ПВП).

Для эффективного растворения указанного полипептида в образце, полученная смесь образца и полипептида может инкубироваться при температуре от +20°С до +40°С, преимущественно, при +37°С, в течение времени, более чем 3 минуты, преимущественно более 10 минут. Для эффективного ингибирования контактной активации свертывания достаточное количество указанного полипептида может быть определено посредством измерения активности полипептида в образце, полученном от здорового донора, например, при помощи теста АЧТВ. Так, достаточным для эффективного ингибирования контактной активации будет такое количество полипептида, при котором АЧТВ увеличено более чем в 2 раза, преимущественно, более чем в 3 раза, по сравнению с АЧТВ образца без полипептида. Также достаточное количество указанного полипептида может быть определено при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2», в частности, по отсутствию сгустков вдали от активатора свертывания в образце, полученном от здорового донора, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.

Забор крови может производиться в пробирку, дополнительно содержащую или не содержащую антикоагулянт, в т.ч. цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина, ингибитор фХа и другие. Получение образца из крови может включать стадии очистки крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов.

Хранение образца может производиться в замороженном виде при отрицательных температурах ниже 0°С, преимущественно ниже -50°С, или в жидком виде при положительной температуре вблизи 0°С или при температуре от +20°С до +40°С. Также процесс хранения может включать одну или более стадий замораживания и размораживания образца. Время хранения образца может составлять от 10 минут и более, в частности, от одного дня и более, преимущественно, более одной недели.

Краткое описание фигур

На Фиг.1 представлен график зависимости АЧТВ (сек) от концентрации ингибитора (мкМ), MutB, Mutl5 или Inf4 в плазме крови. Приведены средние значения и стандартные отклонения. Для MutB и Inf4 число повторов n=4; для Mutl5 n=2.

Фиг.2 иллюстрирует фибриновые сгустки, образованные от активатора и от стенок кюветы, полученные через 30 минут после активации нормальной замороженной плазмы без добавления ингибитора контактной активации.

Фиг.3 иллюстрирует фибриновые сгустки, полученные через 30 минут после активации образцов нормальной замороженной плазмы с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (4 повтора для каждого образца).

На Фиг.4 представлен график зависимости от времени (мин) площади вдали от активатора, занимаемой фибриновыми сгустками в нормальной замороженной плазме с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (% от площади кюветы) (4 повтора для каждого образца).

На Фиг.5 представлен график зависимости от времени (мин) площади вдали от активатора, занимаемой фибриновыми сгустками в гиперкоагуляционной плазме, с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (% от площади кюветы) (4 повтора для каждого образца).

Фиг.6 A-D иллюстрируют влияние ингибиторов контактной активации MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ) на рост фибринового сгустка от активатора в нормальной замороженной и гипокоагуляционной плазме.

На Фиг.7 представлены данные о времени свертывания (сек) цельной крови, которая была взята у 3 здоровых доноров в пробирку, содержавшую MutB (10 мкМ), КТИ (5 мкМ) или не содержавшую ингибитор контактной активации (2-4 повтора для каждого донора).

Подробное описание изобретения

Описание нового высокоселективного ингибитора контактной активации

Заявляемый полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, представляет собой высокоселективный ингибитор контактной активации. Аминокислотная последовательность MutB представлена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Механизм ингибирования фХПа предполагается конкурентным, он состоит в том, что MutB взаимодействует с активным центром фХПа посредством ингибирующей петли, в которую входит участок ингибитора Thr9 - Ala14, аминокислотная последовательность которого приведена в Таблице 1. Также в Таблице 1 приведены соответствующие последовательности нативного инфестина 4 (Inf4) и известного мутанта инфестина 4 (Mutl5). Внутри указанного участка ингибирующей петли находится реактивный сайт Arg10-Asn11, который расщепляется в активном центре фХПа. В Таблице 1 аминокислотные остатки, входящие в состав этого участка, пронумерованы в соответствии с их положением относительно реактивного сайта. MutB был создан путем введения следующих аминокислотных замен в участке ингибирующей петли нативного инфестина 4: Thr9Phe, Phel2Tyr и AlaHPro.

Таблица 1
Белок Последовательность ингибирующей петли (Р2 Р1 Р1′ Р2′ Р3′ Р4′)
MutB TRNFVA
Inf4 FRNYVP
Mutl5 TRRFVA

Селективность нового ингибитора по отношению к фXIIa

Для оценки селективности ингибирования фXIIa полипептидом, включающим мутант инфестина 4 MutB, была определена его ингибирующая активность в буферном растворе по отношению к очищенным факторам свертывания. Для сравнения с полипептидом были взяты известные ингибиторы фXIIa: КТИ, инфестин 4, мутант на основе инфестина 4 Mutl5, LCTI-III. В Таблице 2 приведены средние значения констант ингибирования (Ki) указанными белками некоторых очищенных протеаз свертывания (фXIIa, фXIa, фХа и аРС). Стандартное отклонение составило около 50% от среднего значения; для каждого значения проведено 2-3 повтора.

Таблица 2
Белок фXIIa фXIa фХа аРС
MutB 1 нМ N.I. N.I. N.I.
КТИ 1 нМ 15 мкМ N.I. 20 мкМ
Inf4 1нМ N.I. 2 мкМ N.I.
Mutl5 1 нМ N.I. N.I. 25 мкМ
LCTI-III 15 нМ 30 мкМ N.I. N.I.
где «N.I.» (- от «not inhibit») - не ингибирует активность фермента.

Из данных Таблицы 2 следует, что КТИ, нативный инфестин 4 и его мутанты одинаково эффективно ингибируют активность протеазы фXIIa в буферном растворе. Было установлено, что в высоких концентрациях, порядка десятков микромоль на литр, КТИ обладает ингибирующей активностью к фXIa и аРС, т.е. не является высокоселективным ингибитором фXIIa. Нативный инфестин 4 и его мутанты MutB и Mutl5 не ингибируют фХ1а. Также, мутанты инфестина 4 MutB и Mutl5 не ингибируют фХа, в отличие от нативного инфестина 4. Однако Mutl5, как и КТИ, обладает ингибирующей активностью по отношению к аРС, т.е. тоже не является высокоселективным. Из приведенной выше Таблицы 2 видно, что из всех указанных ингибиторов фХПа, MutB обладает наибольшей селективностью ингибирования фXIIa, поскольку не обладает ингибирующей активностью к другим указанным факторам.

Оценка ингибирующей активности нового ингибитора по подавлению контактной активации в плазме крови

Оценка активности полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, по ингибированию контактной активации свертывания, рассматривается далее со ссылкой на фиг.1. В три отдельных образца свободной от тромбоцитов плазмы (PFP) здорового донора добавлялись, соответственно, нативный инфестин 4, мутанты MutB и Mutl5, и измерялось время свертывания при активации по контактному пути посредством теста АЧТВ. По результатам тестов были построены графики зависимостей АЧТВ (сек) от концентрации добавленного ингибитора (мкМ), из которых следует, что АЧТВ увеличилось до 120 секунд при добавлении в образец 10 мкМ MutB, 10 мкМ нативного инфестина 4 или 20 мкМ Mutl5, при этом без добавления ингибитора контактной активации АЧТВ составило 45 сек. Таким образом, было установлено, что MutB обладает примерно в 2 раза большей активностью в плазме крови, чем Mutl5.

Применение нового ингибитора для подавления контактной активации при проведении исследования ТФ-инициированного свертывания

Возможность применения указанного полипептида в качестве ингибитора контактного пути была показана при проведении теста свертывания плазмы крови посредством лабораторной диагностической системой «Регистратор тромбодинамики Т-2». При этом тест включал следующие шаги: оттаивание замороженного образца PFP, добавление в него ингибитора контактной активации и инкубацию полученной смеси, рекальцификация образца и размещение его в канале измерительной кюветы, приведение его в контакт с ТФ, иммобилизованном на торце специальной вставки-активатора, и регистрация возникновения и роста фибриновых сгустков в режиме последовательной фотосъемки. Замороженный образец PFP был приготовлен предварительно путем забора крови в пробирки с цитратом натрия у нескольких (по меньшей мере, пяти) здоровых доноров, последующих двух стадий центрифугирования и заморозки полученной плазмы при -80°С. При проведении теста происходил рост фибринового сгустка от вставки-активатора, а также было возможно появление дополнительных сгустков в области кюветы вдали от активатора, как показано на фиг.2. Сгустки в области кюветы вдали от активатора могут быть следствием гиперкоагуляционного состояния образца либо артефактами контактной активации образца со стенками кюветы (артефактные сгустки), которые необходимо подавить, чтобы указанный тест позволял различать нормальное и гиперкоагуляционное состояние системы свертывания. Для этого, перед активацией образца путем приведением его в контакт с ТФ, в образец добавляли эффективное количество ингибитора контактной активации, в нашем случае это полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB-Для сравнения эффективности действия заявляемого полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, с известным из уровня техники ингибитором контактной активации КТИ, в два отдельных образца нормальной замороженной PFP добавлялись указанные ингибиторы. Использовались такие концентрации данных ингибиторов, при которых АЧТВ увеличивается примерно в 4 раза: 20 мкМ в случае MutB и 15 мкМ в случае КТИ. В качестве отрицательного контроля, в третий образец плазмы не добавляли никакого ингибитора контактной активации. Для каждого образца проводили 4 повторные исследования. Через 30 минут после начала исследования были получены изображения фибринового сгустка в измерительных кюветах, по 4 кюветы для каждого образца, показанные на фиг.3. На фиг.3 видно, что добавление или полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, или КТИ, приводит практически к полному подавлению контактной активации и предотвращает возникновение артефактных сгустков.

По 4 повторным экспериментам для каждого ингибитора были определены площади кюветы, занятые артефактными сгустками (в % от общей площади кюветы), для трех образцов нормальной замороженной плазмы в отдельные моменты времени и были построены графики зависимости указанной площади от времени (фиг.4, усредненные значения в каждый момент времени). Без добавления ингибитора контактной активации артефактные сгустки в области кюветы вдали от активатора появляются примерно через 15 минут после активации и полностью занимают всю площадь кюветы через 30 минут. Однако при добавлении КТИ или MutB такие сгустки занимают не более 15% площади кюветы через 30 минут после активации.

Для того чтобы оценить влияние ингибиторов контактной активации на появление сгустков вдали от активатора, вызванных гиперкоагуляцией, а не контактной активацией образца со стенками кюветы, в два отдельных образца гиперкоагуляционной PFP добавлялись MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ). Гиперкоагуляционная PFP была приготовлена из нормальной замороженной PFP путем добавления 100 пМ фХ1а. В качестве отрицательного контроля, в третий образец плазмы не добавляли никакого ингибитора контактной активации. На фиг.5 показаны усредненные по 4 повторным экспериментам, временные зависимости площади кюветы, занятой сгустками вдали от активатора (в % от общей площади кюветы), для трех образцов плазмы. На фиг.5 видно, что в образцах гиперкоагуляционной плазмы без добавления ингибитора контактной активации и с добавлением MutB сгустки вдали от активатора возникают примерно через 5-8 минут после активации, в то время как в образце с КТИ они возникают через 10-15 минут. Таким образом, авторами было установлено, что добавление MutB или КТИ приводит практически к полному подавлению контактной активации и предотвращает возникновение артефактных сгустков в нормальной плазме. Однако в гиперкоагуляционной плазме добавление MutB не влияет на появление сгустков вдали от активатора, которые возникают не вследствие контактной активации фXIIa, в то время как добавление КТИ задерживает появление сгустков вдали от активатора, предположительно, вследствие ингибирования фXIa, и может уменьшить чувствительность диагностической системы к гиперкоагуляции.

Следовательно, полипептид, включающий мутант инфестина 4 MutB, возможно применять для эффективного блокирования контактной активации и свертывания по контактному пути.

Влияние ингибиторов контактной активации на динамику образования фибринового сгустка, инициированного ТФ

Влияние ингибиторов контактной активации на динамику свертывания может быть показано на примере роста фибринового сгустка от поверхности с иммобилизованным ТФ. Динамика роста фибринового сгустка от активатора может быть охарактеризована следующими параметрами: время задержки образования сгустка после контакта плазмы с тканевым фактором -лаг-тайм (Tlag, мин); средняя скорость роста сгустка в диапазоне 2-6 минут после начала свертывания - начальная скорость (Vin, мкм/мин); и средняя скорость роста сгустка в диапазоне 15-25 минут после начала свертывания - стационарная скорость (Vst, мкм/мин) (Balandina et al. 2011, Biophys. J. 101:1816-1824; Dashkevich et al. 2012, Biophys. J. 103:2233-2240). По указанным параметрам можно определить состояние свертывания крови у субъектов, у которых был взят тестируемый образец («Практическая коагулология» Пантелеев М.А., Васильев С.А., Синауридзе Е.И. с соавт. - Под ред. А.И. Воробьева. М. Изд. «Практическая медицина», 2011, 192 стр., ISBN: 978-5-98811-165-8). Так при гипокоагуляционных состояниях различной природы (дефицита факторов VII, V, X, тромбина, гемофилии А, В и С, при терапии антикоагулянтами, такими как нефракционированный и низкомолекулярный гепарин, антагонисты витамина K, антитромбин III) лаг-тайм увеличен, а начальная и/или стационарная скорости роста сгустка уменьшены относительно значений нормы для здоровых доноров (Parunov et al. 2011, J. Thromb. Haemost. 9:1825-1834). При гиперкоагуляционных состояниях различной природы возникают сгустки в области кюветы вдали от активатора, а также увеличены начальная и/или стационарная скорости относительно значений нормы. При использовании ингибитора контактной активации предпочтительным является такой ингибитор, который не оказывает влияния на возникновение сгустков вдали от активатора в образце гиперкоагуляционной плазмы и не влияет на динамику роста фибринового сгустка от активатора в любом образце плазмы.

Для сравнения влияния ингибиторов контактной активации MutB и КТИ на чувствительность к гипокоагуляции параметров роста фибринового сгустка от активатора, в два образца нормальной замороженной PFP и в два образца гипокоагуляционной PFP добавлялись MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ). Гипокоагуляционная PFP была приготовлена из нормальной замороженной PFP путем добавления 0,1 МЕ/мл нефракционированного гепарина. На фиг.6А показаны усредненные по 4 повторным экспериментам, зависимости от времени (мин.) размера фибринового сгустка вдоль направления его роста (мкм), для образцов гипокоагуляционной и нормальной плазмы с добавленными ингибиторами MutB и КТИ. Также на столбчатых диаграммах показаны средние значения +/- стандартное отклонение (S.D.) по 4 повторным экспериментам для параметров роста сгустка: лаг-тайм (фиг.6В), начальная скорость (фиг.6С) и стационарная скорость (фиг.6В). Для статистического сравнения был использован критерий Стьюдента. Статистическая значимость отличий параметров роста сгустка в гипокоагуляционной и нормальной плазме обозначена «р<0.001». Незначимые отличия обозначены «р>0.5».

На фиг.6А видно, что в образцах гипокоагуляционной и нормальной плазмы динамика роста фибринового сгустка сильно отличается друг от друга, при этом добавление MutB или КТИ не влияет на это различие. Параметр лаг-тайм (Tlag) не изменяется при добавлении в плазму гепарина (фиг.6В), однако при этом скорости роста сгустка уменьшаются примерно в два раза (фиг.6C, D).

Применение нового ингибитора в качестве антикоагулянта для забора и хранения цельной крови

Возможность применения полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, в качестве антикоагулянта при заборе и хранении образца цельной крови была показана путем измерения времени спонтанного свертывания крови в пробирке, содержавшей MutB (10 мкМ), КТИ (5 мкМ) или не содержавшей ингибитор контактной активации. Были использованы такие концентрации ингибиторов контактной активации, которые приводят к увеличению АЧТВ в нормальной плазме в 2,5 раза. Забор цельной крови производился у 3 здоровых доноров без добавления антикоагулянта, например, цитрата, кроме указанных ингибиторов контактной активации. Кровь, смешанная с указанными ингибиторами, перемешивалась при помощи ротатора при температуре +22°С, и измерялось время образования сгустков в крови.

На фиг.7 результаты измерения показаны значками, соответствующими каждому измерению; линией или прямоугольником показаны области положения медиан полученных значений времен свертывания. На фиг.7 видно, что применение ингибитора контактной активации MutB или КТИ при заборе крови без хелатора ионов кальция позволяет увеличить время хранения цельной крови в пробирке примерно в 2-3 раза.

Таким образом, было показано преимущество применения полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, нового высокоселективного ингибитора контактной активации, для предотвращения свертывания по контактному пути в образце плазмы и для увеличения чувствительности диагностической системы к отклонениям системы гемостаза от нормального состояния.

Аспекты настоящего изобретения описаны в следующих примерах, которые представлены только, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение и помочь обычному специалисту в данной области в его осуществлении и использовании. Примеры никаким образом не предназначены, чтобы в других случаях ограничивать объем изобретения.

Примеры

Здесь и далее настоящее изобретение иллюстрируют, но не ограничивают, посредством следующих примеров. Однако материалы, способы и т.п., описанные в настоящем описании, только иллюстрируют аспекты изобретения и никаким образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В силу этого материалы, методы и т.п., подобные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать для практического осуществления или тестирования настоящего изобретения.

Пример 1. Селективность MutB по отношению к фXIIa в буферном растворе

Для определения ингибирующей активности белков MutB, КТИ, Inf4, Mutl5 и LCTI-III по отношению к различным протеазам свертывания в буфере использовался хромогенный тест: смесь протеазы и ингибитора в лунках планшета инкубировалась в течение 15 минут при температуре +37°С, далее в смесь добавлялся раствор хромогенного субстрата указанной протеазы, и активность протеазы измерялась по скорости образования хромогенного продукта при +37°С. В Таблице 3 приведены названия и концентрации хромогенных субстратов и соответствующих протеаз.

Таблица 3
Протеаза Концентрация протеазы в тесте, нМ Субстрат Концентрация субстрата в тесте, мМ Км субстрата к протеазе, мМ
фXIIa 1 S-2302 0,2 0,2
фXIa ОД S-2366 0,5 1,0
фХа 0,5 S-2765 0,5 0,25
аРС 1 Spectrozyme pCa 0,2 0,4

Хромогенные субстраты включали р-нитроанилидную группу, которая отщеплялась соответствующими протеазами. После отщепления р-нитроанилидной группы от молекулы субстрата у группы меняется спектр поглощения, и изменение концентрации такого продукта во времени можно детектировать на длине волны света 405 нм при помощи планшетного спектрофотометра. Для построения зависимости активности протеазы от концентрации ингибитора, в несколько образцов с одинаковой концентрацией протеазы добавляли разные концентрации ингибитора. Далее определяли величину концентрации ингибитора, снижающую активность протеазы на 50% (IC50). Константа ингибирования Ki вычислялась по уравнению Ченга-Прусоффа (Ki=IC50/(1+S/KM)), в котором S - начальная концентрация субстрата, Км - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к протеазе. Результаты вычисления Ki приведены в Таблице 2.

Нативный инфестин 4 и его мутанты MutB и Mutl5 были в виде слитных белков с тиоредоксином I E.coli, содержащих полигистидиновые кластеры. КТИ представлял собой белок, выделенный из зерен кукурузы и очищенный хроматографически. LCTI-III был получен путем химического синтеза. Реакция расщепления субстрата проводилась в буфере 50 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, рН 8,3.

Пример 2. Оценка ингибирующей активности MutB по подавлению контактной активации в плазме крови

Плазму крови здоровых доноров готовили в соответствии со стандартными правилами забора крови для коагулологических тестов (Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline Fifth Edition by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) H21-A5 Vol.28 No.5). Для блокирования ионов в кровь добавили 0,38% цитрата натрия.

Проведение теста АЧТВ осуществлялось с использованием реагентов Коагуло-тест (НПО «Ренам», Москва, Россия) и различных концентраций ингибиторов контактной активации: нативный инфестин 4, MutB и Mutl5. Для этого 50 мкл плазмы крови здорового человека смешивали с 5,6 мкл десятикратного раствора ингибитора в разных концентрациях и инкубировали 15 минут при +37°С. Далее, в соответствии с руководством Коагуло-тест, 25 мкл смеси перемещали в кювету коагулометра Helena-С2 и добавляли 25 мкл каолин-кефалиновой смеси, активирующей фХII в плазме крови. После инкубации при +37°С в течение 3 минут добавляли 25 мкл раствора хлорида кальция в начальной концентрации 25 мМ, и фотометрически определяли время образования фибринового сгустка в кювете коагулометра.

Зависимости АЧТВ от концентрации нативного инфестина 4, MutB и Mutl5 представлены на фиг.1. Было установлено, что мутант инфестина 4 MutB обладает повышенной активностью в плазме крови, по сравнению с Mutl5 и нативным инфестином 4.

Пример 3. Влияние MutB на появление артефактных сгустков вследствие контактной активации и динамику роста фибринового сгустка, инициированного ТФ

Влияние полипептида, включающего мутант инфестина 4 MutB, на рост фибриновых сгустков в образцах гипокоагуляционной, нормальной и гиперкоагуляционной плазмы крови, исследовалось при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2» и «Диагностического набора для исследования тромбодинамики в плазме крови» (OOO «Гемакор», Москва, Россия) в соответствии с руководством к «Диагностическому набору для исследования тромбодинамики в плазме крови» (OOO «Гемакор», Москва, Россия). За 15 минут до проведения исследования измерительная кювета, вставка-активатор с иммобилизованным ТФ и реагенты, выдерживались при +37°С. Стандартная температура проведения исследования +37°С. За 15 минут до проведения исследования 120 мкл плазмы смешивались с исследуемыми веществами, MutB или КТИ для сравнения, и помещались в микропробирку. Производилось перемешивание плазмы с веществами, и после этого пробирка с плазмой помещалась на 15 минут в термостат при +37°С. Непосредственно перед проведением исследования проводилось рекальцифицирование плазмы: отбиралось 120 мкл смеси плазмы с исследуемыми веществами, добавлялось в микропробирку с Реагентом П (лиофильно высушенным раствором кальция ацетата с добавкой) и перемешивалось до полного растворения Реагента II. Далее 120 мкл смеси из микропробирки с Реагентом II немедленно переносилось в измерительную кювету. Далее вставка-активатор аккуратно опускалась в кювету так, чтобы поверхность с иммобилизованным тканевым фактором приходила в контакт с плазмой. Непосредственно после приведения в контакт активатора свертывания с плазмой крови запускалась фотосъемка процесса роста фибринового сгустка в плазме, помещенной в кювету. Вставка-активатор представляла собой пластину, на нижней торцевой поверхности которой иммобилизован активатор свертывания тканевой фактор (Фадеева и др. 2010, Биохимия 75:827-838). Расчет результатов исследования выполнялся автоматически программным обеспечением (руководство пользователя «Программное обеспечение системы диагностической лабораторной «Регистратор тромбодинамики Т-2», ООО «Гемакор», Москва, Россия).

Пример 4. Увеличение времени хранения цельной крови при заборе без хелатора кальция с использованием MutB

Забор крови производился из срединной вены локтя левой руки в стерильный шприц Master UN РЕ объемом 10 мл, с иглой 21G×1½"; 0,8×40 мм (ФармЛайн, США). В кровь не добавляли хелатор кальция или другой антикоагулянт, кроме ингибиторов контактной активации MutB или КТИ. Взятую кровь переливали в пробирку объемом 15 мл, перемешивали переворачиванием 2 раза и помещали по 0,7 мл крови в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки MaxyClear Snaplock (Axygen, США) объемом 1,5 мл, непосредственно после чего начинали отсчет времени при помощи секундомера. В указанные пробирки было предварительно добавлено по 78 мкл раствора MutB с концентрацией 100 мкМ, раствора КТИ с концентрацией 50 мкМ или раствора буфера 30 мМ Hepes pH 7,4. Пробирки, содержащие смесь цельной крови и указанных растворов, фиксировались в ротаторе и перемешивались переворачиванием со скоростью вращения 10 об./мин. Фиксировалось время появления сгустков или фибриновых нитей в цельной крови при перемешивании.

1. Полипептид для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB (SEQ ID NO : 1) и, по существу, соответствует ей, где указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида, являющегося высокоселективным ингибитором фХIIа, селективность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15, или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15.

2. Полипептид по п. 1, где модификации аминокислотной последовательности вне участка ингибирующей петли представляют собой изменения N- или С-концов последовательности SEQ ID NO: 1, делеции или вставки одного или нескольких аминокислотных остатков, а также консервативные аминокислотные замены.

3. Применение полипептида по п. 1 для исследования свертывания в тестируемом образце крови или ее продукта, которое включает:
a) получение образца для исследования свертывания,
b) подавление контактной активации свертывания в образце посредством приведения образца в контакт с упомянутым полипептидом и инкубации полученной смеси,
c) приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, подготовленным на стадии b); и
d) измерение параметров свертывания в образце.

4. Применение по п. 3, где получение тестируемого образца крови или ее продукта включает забор крови в пробирку, содержащую антикоагулянт, выбранный из группы: цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина или ингибитор фХа, и последующее блокирование антикоагулянта, в частности рекальцификация образца.

5. Применение по п. 4, где получение образца крови или ее продукта дополнительно включает очистку крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов, в частности, путем фильтрации или центрифугирования.

6. Применение по п. 3, где образец крови или ее продукта является свежеполученным, находится в лиофилизованной или замороженной форме, которую переводят в жидкую форму перед проведением исследования.

7. Применение по п. 6, где образец крови или ее продукта представляет собой цельную кровь или ее продукты, такие как богатая тромбоцитами плазма, бедная тромбоцитами плазма, освобожденная от тромбоцитов плазма, фракционированная плазма.

8. Применение по п. 3, где образец крови или ее продукта получен от здорового субъекта или от субъекта, который страдает нарушением свертывания крови, в частности от субъекта с геморрагиями или тромбозами, имеющего нарушения или дефициты системы гемостаза.

9. Применение по п. 3, где образец крови или ее продукта получен от пациента при хирургических вмешательствах или при осуществлении терапии.

10. Применение по п. 3, где образец крови или ее продукта содержит природные или рекомбинантные белки или другие препараты, которые обладают гемостатической или фибринолитической активностью.

11. Применение по п. 3, где указанный полипептид находится в высушенной форме или лиофилизованной форме, или адсорбирован на поверхности, с которой контактирует образец крови или ее продукта, или предварительно растворен в растворе, содержащем соль, буферное вещество, экципиент или стабилизатор.

12. Применение по п. 3, где смесь, полученная на стадии b), инкубируется при температуре от +20°C до +40°C, предпочтительно при +37°C, в течение времени, по меньшей мере, 3 минуты.

13. Применение по п. 3, где указанный полипептид берут в количестве, достаточном для эффективного блокирования контактной активации.

14. Применение по п. 13, где достаточным является количество указанного полипептида, при котором АЧТВ нормальной плазмы увеличено более чем в 2 раза, преимущественно более чем в 3 раза по сравнению с АЧТВ плазмы без полипептида.

15. Применение по п. 14, где достаточным является количество указанного полипептида, при котором отсутствуют артефактные сгустки вдали от активатора свертывания в образце нормальной замороженной плазмы, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.

16. Применение по п. 3, где приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом крови или ее продукта на этапе с) осуществляют путем добавления в указанный образец и последующего перемешивания активатора свертывания в растворенной форме.

17. Применение по п. 3, где активатор свертывания в растворенной форме наслаивают на образец крови или ее продукта без перемешивания, или образец приводят в контакт с активатором, который иммобилизован на поверхности.

18. Применение по п. 3, где активатор свертывания является тканевым фактором или одной из протеаз свертывания: VIIa, Ха, II, IXa, ХIа, ХIIа.

19. Применение по п. 3, где параметрами свертывания являются: время задержки начала свертывания, время свертывания, время задержки наработки тромбина, время достижения максимума тромбина, максимальная концентрация тромбина, угол наклона тромбоэластограммы, скорость роста сгустка, размер сгустка в фиксированный момент времени, наличие сгустков вдали от активатора свертывания, скорость лизиса сгустка.

20. Применение полипептида по п. 1 в качестве антикоагулянта, блокирующего контактную активацию, путем приведения в контакт с указанным полипептидом образца крови или ее продукта для забора и увеличения времени хранения образца.

21. Применение по п. 20, где указанный полипептид находится в высушенной форме или лиофилизованной форме, или адсорбирован на поверхности, с которой контактирует образец, или предварительно растворен в растворе, содержащем соль, буферное вещество, экципиент или стабилизатор.

22. Применение по п. 20, где забор крови осуществляется в пробирку, содержащую антикоагулянт, выбранный из группы: цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина или ингибитор фХа.

23. Применение по п. 20, где хранение образца крови или ее продукта производится в замороженном виде при отрицательных температурах ниже 0°C, преимущественно ниже -50°C, или в жидком виде при положительной температуре более 0°C, преимущественно от +20°C до +40°C.

24. Применение по п. 20, где время хранения составляет более 10 минут, преимущественно от одного дня и более, преимущественно более одной недели.

25. Применение по п. 20, где образец крови или ее продукта получен от субъекта, не имеющего нарушений свертывания крови, или от субъекта, который страдает нарушением свертывания крови, в частности от субъекта с геморрагиями или тромбозами, имеющего нарушения или дефициты системы гемостаза, или от субъекта при хирургических вмешательствах или при осуществлении терапии.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулогии, и может быть использовано для выявления лиц группы риска развития гемокоагуляционных осложнений. Сущность способа: проводят измерение амплитуды записи процесса свертывания крови в его начале, определяют показатели начала и конца процесса свертывания электрокоагулограммы крови и сравнивают их с одноименными показателями процесса свертывания крови в норме и при разнонаправленных отклонениях диагностируют нарушения функционального состояния системы гемостаза.

Изобретение относится к способу определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, причем агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения ≤6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1,0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистентности (ИР) по формуле, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов.

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей, включающий проведение теста на агрегацию тромбоцитов с индукторами на агрегометре «Multiplate», при этом в кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином, инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат, арахидоновая кислота, при этом скорость агрегации тромбоцитов изображается на экране прибора в виде кривой и автоматически рассчитывается площадь под кривой U, по значению площади U под кривой судят о состоянии агрегации трмбоцитов в сравнении с референсными значениями в группе здоровых детей и при повышении порогового значения площади U выше референсного судят о гиперагрегации тромбоцитов, а при понижении порогового значения площади U ниже референсного судят о гипоагрегации тромбоцитов.
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в биологической среде при любых патологических состояниях путем биохимического исследования.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к анализаторам для автоматического определения показателей гемостаза (коагуляторам). .
Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для оперативной оценки нарушений микроциркуляции. .
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическому способу определения концентрации компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ контроля аутоактивации фактора VII или его аналога и способ предотвращения расщепления активированного фактора VII или его аналога.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа определения активации плазминогена бактериями. Способ включает внесение протамина сульфата в подготовленный супернатант, инкубацию полученной смеси, осаждение клеток центрифугированием, инкубацию супернатанта с протамин сульфатом, осаждение белка и регистрацию активации плазминогена бактериями по количеству отщепившегося аргинина, содержание которого определяют методом Сакагуши по окрашиванию проб в красный цвет.

Изобретение относится к способу in vitro измерения активности тромбина в образце крови. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к иммунологии. .

Изобретение относится к диагностике и лечению таких заболеваний, как атеросклероз и тромбоз. .

Изобретение относится к полипептидам, имеющим гидролизуемые ковалентные связи с терапевтическими агентами, для доставки лекарственных средств. Эти полипептидные конъюгаты могут быть использованы в качестве векторов для транспортировки терапевтических препаратов через гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ) или для доставки в четко определенные виды клеток, такие как яичники, печень, легкие или почки.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению мутантов инфестина 4, и может быть использовано для диагностических целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов. Полипептид характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB SEQ ID NO: 1. При этом указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида. Изобретение позволяет получить высокоселективный ингибитор фХIIа, селективность или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15. Полипептид используют для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта для увеличения времени хранения образца. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 4 пр.

Наверх