Способ анализа рнк
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов. Способ включает проведение электрофореза с указанной РНК. Определяют, удовлетворяет ли указанная РНК следующему уравнению: В/А≤1, где А представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, а В представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом. Если указанная РНК, экстрагированная из ткани или клетки (клеток), удовлетворяет указанному уравнению, то она пригодна для анализа экспрессии генов. Предложенное изобретение позволяет быстро и с высокой эффективностью определить пригодность РНК для анализа экспрессии генов. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 11 табл., 7 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу анализа РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированной(ых) с помощью фиксатора.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В последние годы существенно возросла потребность в разработке техник анализа генов в большом числе образцов, которые хранятся в больницах и научно-исследовательских институтах в виде тканей или клеток, фиксированных с помощью фиксатора, таких как фиксированные в формалине залитые в парафин (FFPE) ткани. Поскольку было накоплено большое количество полученных ранее данных по заболеваниям, особенно в виде тканей FFPE, разработка техники, которая позволяет экстрагировать и анализировать экспрессию генов, экстрагированных из тканей FFPE, дает возможность проводить ретроспективные исследования, используя ткани, хранившиеся в течение длительного периода, в значительной степени содействуя разработке перспективного лечения и профилактики заболеваний.
Тем не менее, поскольку при обычных условиях фиксации и хранения происходит деградация и фрагментация РНК, экстрагированных из фиксированных тканей и фиксированных клеток, таких как образцы FFPE, полагали, что анализ экспрессии генов с помощью такой РНК затруднителен. Кроме того, формальдегид (формалин), который наиболее часто используется в качестве фиксатора, иногда вызывает перекрестное связывание РНК-РНК или РНК-белок или добавление к РНК формальдегида или модификацию РНК формальдегидом. В случаях, когда РНК находится в таком состоянии, ферментативные реакции и/или химические реакции протекают с трудом, что приводит к проблематичности анализа экспрессии генов. Поэтому существовала потребность в технологии, посредством которой может быть осуществлен анализ экспрессии генов с участием образца РНК, у которого наблюдается обширная деградация и/или фрагментация, или с участием образца РНК, в котором происходит перекрестное связывание, добавление и/или модификация. Кроме того, она может в значительной степени помочь оценить перед анализом экспрессии генов такого образца РНК качество образца РНК, определив степени деградации/фрагментации, перекрестного связывания и добавления/модификации, чтобы определить, возможен или нет анализ, для осуществления точного анализа экспрессии генов и анализа экспрессии миРНК, и поэтому была необходима техника, которая дает возможность такой оценки.
В патентных документах 1-4 описаны техники, относящиеся к способам, в которых анализ экспрессии генов осуществляют после амплификации деградированной РНК.
В патентном документе 1 предлагается способ, композиция и набор, относящиеся к амплификации полинуклеотида-мишени для продукции большого числа его копий. Фактор амплификации мРНК на каждое время реакции амплификации обычно составляет от 50 до 100 или до 250; от 500 до 1000; или от 500 до не меньше чем 2000; и из суммарной РНК получают как можно больше амплифицированной РНК в количестве меньше нанограмма. Тем не менее, в случаях использования такого способа, в котором амплифицируют как можно больше РНК из небольшого количества РНК, фактор амплификации варьирует среди генов, то есть возрастает систематическая погрешность амплификации, так что можно утверждать, что уровень экспрессии каждого гена не может быть проанализирован точно.
Патентный документ 2 относится к способу применения фрагментированной РНК или подобного материала, такого как содержащийся в сохраненном материале зафиксированной залитой в парафин ткани, в полном анализе экспрессии генов, и предлагается способ получения образца, который дает возможность полной амплификации даже из образца, составленного из очень малой или предельно фрагментированной РНК. Тем не менее, этот способ содержит стадию полиаденилирования фрагментированной РНК, и в результате вариативность реакции на этой стадии может значительно повлиять на профиль экспрессии генов. Кроме того, в патентном документе 2 описан новый способ амплификации линейной РНК. В этом способе синтезируют двухцепочечную кДНК, имеющую якорную последовательность на 5'-конце и промоторную последовательность для РНК-полимеразы на 3'-конце, и с кДНК синтезируют кРНК зависимо от промоторной последовательности РНК-полимеразы с последующим праймингом якорной последовательности для повторного синтеза кДНК с этой кРНК, таким образом, амплифицируя небольшое количество РНК, полученное из небольшого количества клеток/ткани, полученных посредством лазерной захватывающей микродиссекции или сортировки клеток, чтобы супрессировать делецию региона кДНК или кРНК, соответствующего 5'-региону мРНК, которая возникает каждый раз при повторении цикла синтез кДНК-синтез кРНК, что было проблематичным в известных способах амплификации.
Способы и патентного документа 1 и патентного документа 2 описаны в качестве способов, в которых не наблюдается систематической ошибки при амплификации, и полагают, что систематическая ошибка на каждый цикл меньше, чем в принятых способах. Тем не менее, поскольку они фокусируются на амплификации как можно большего количества РНК из небольшого количества РНК, фактор амплификации весьма велик. Поэтому систематические ошибки могут накапливаться, что приводит к появлению большой систематической ошибки амплификации.
Патентный документ 3 относится к способу применения фрагментированной РНК или подобного материала, такого как содержащийся в сохраненном материале зафиксированной залитой в парафин ткани, в полном анализе экспрессии генов, и предлагается способ получения образца, который дает возможность полной амплификации даже из образца, составленного из очень малой или предельно фрагментированной РНК. Тем не менее, этот способ содержит стадию полиаденилирования фрагментированной РНК, и в результате вариативность реакции на этой стадии может существенно влиять на профиль экспрессии генов.
В патентном документе 4 описаны композиция и способ амплификации мишени в образце деградированной нуклеиновой кислоты, к которому относится способ измерения качества нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновой кислоты, а также описан способ получения профиля экспрессии генов, используя образец деградированной РНК. Эффективности амплификации ампликонов (продуктов амплификации), обладающих различными размерами, полученных из одного и того же гена, используют как показатели оценки качества, принимая во внимание, что эффективность амплификации ампликона, обладающего большим размером, снижается, поскольку происходит деградация образца. В этом способе осуществляют ПЦР большого числа размеров почти каждого из от десяти до двадцати с лишним генов. При появлении деградации РНК прохождение амплификации становится менее вероятным, поскольку увеличивается размер ПЦР-зонда, так что полагают, что степень деградации может быть определена до некоторой степени. Тем не менее, поскольку на один образец РНК требуется ПЦР-амплификация в целом нескольких десятков генов, полагают, что этот способ затруднителен для реального осуществления.
В патентном документе 5 описан способ, в котором на чип для анализа нуклеиновых кислот загружают зонды, представляющие собой нуклеиновые кислоты, позволяющие определить индекс деградации, созданные на основе нуклеиновых последовательностей РНК, которые содержатся в длинноцепочечной фракции, если они не разрушаются, и образец РНК, полученный фракционированием коротких цепей суммарной РНК, гибридизуют с чипом для анализа нуклеиновых кислот с последующим измерением на основе наличия/отсутствия сигналов от нуклеиновых кислот-зондов для определения индекса деградации степени деградации образца РНК; и техника связана с чипом нуклеиновых кислот для измерения степени деградации РНК. Тем не менее, поскольку чип нуклеиновых кислот создан для короткоцепочечных РНК, таких как микроРНК (миРНК), полагают, что применение чипа для анализа экспрессии генов затруднительно. Кроме того, в случаях экстракции РНК из фиксированной ткани или фиксированной(ых) клетки(клеток), таких как FFPE, количество РНК, которое может быть получено, часто мало в отличие от случаев экстракции РНК из клетки(клеток) или замороженной ткани, и при таких условиях невозможно осуществить эксперимент, используя образец в количестве от нескольких до нескольких десятков микрограммов лишь для подтверждения качества образца РНК. С учетом стоимости также полагают, что этот способ никогда не сможет быть предпочтительным способом.
В патентном документе 6 существует описание способа измерения степени фрагментации нуклеиновой кислоты. Заявители этого патентного документа продают набор для решения, возможен или нет анализ образца РНК, причем решение принимают, измерив количества 2 видов рибосомальной РНК (18S и 28S), чтобы определить соотношение 28S/18S. Полагают, что при разрушении РНК сначала деградирует 28S и после этого деградирует 18S. В этом наборе в случаях, когда 28S/18S составляет не больше чем 0,1, полагают, что качество РНК неудовлетворительно. Тем не менее, относительно РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированных с помощью фиксатора, в процессе фиксации РНК обычно разрушается, и более того, поскольку фиксированные ткани и клетки обычно хранятся при комнатной температуре, РНК дополнительно разрушается со временем. Поэтому в РНК, экстрагированной из фиксированной формалином залитой в парафин (FFPE) ткани, вышеописанные 2 вида рибосомальной РНК часто не могут быть детектированы, и в таких случаях согласно описанному выше стандарту оценки качества образца РНК большинство образцов определяют как не анализируемые. Таким образом, очень проблематично использовать набор для осуществления ретроспективного исследования, используя фиксированную ткань или фиксированную(ые) клетку(клетки), хранившиеся в течение длительного периода.
Патентный документ 7 представляет собой способ анализа РНК, в котором миРНК в сохраненной ткани, содержащей деградированную мРНК, причем миРНК связывается с RISC (индуцированным РНК комплексом сайленсинга) и не деградирует, высвобождается с помощью обработки нагреванием или подобным с последующим определением миРНК посредством ПЦР-амплификации. Поскольку для высвобождения миРНК из RISC необходима обработка при высокой температуре 95°С, нельзя исключить возможность деградации в этом процессе, и в этом документе не упоминается способ подтверждения качества РНК.
Кроме того, в случаях использования системы капиллярного электрофореза (например, “Bioanalyzer”, продукция фирмы Agilent Technologies) в качестве индекса деградации РНК рассчитывают RIN (число целостности РНК), которое представляет собой стандарт измерения, разработанный фирмой Agilent Technologies. RIN рассчитывают, исходя из полной электрофореграммы образца РНК, подвергнутого электрофорезу, и оно варьирует в диапазоне от 0 до 10 (непатентный документ 1). Биоанализатор, производимый фирмой Agilent Technologies, представляет собой прибор, широко используемый для оценки качества нуклеиновой кислоты, и в случаях использования этого прибора RIN представляет собой индекс, широко используемый для представления качества РНК. Тем не менее, при анализе РНК, экстрагированных из фиксированных тканей или фиксированных клеток, с помощью биоанализатора даже у РНК с четко отличающимися электрофореграммами и большим числом показателей деградации наблюдаются практически одинаковые величины RIN между 2 и 3. Поэтому существовала вероятность того, что RIN не обязательно отражал действительное состояние РНК. Способы оценки, может ли РНК, экстрагированная из большого числа тканей или клеток, фиксированных с помощью фиксатора, быть подвергнута анализу, в действительности ограничены.
ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентные документы
[Патентный документ 1] японская выложенная переведенная патентная заявка РСТ № 2006-520603.
[Патентный документ 2] JP 2005-224172 A.
[Патентный документ 3] японская выложенная переведенная патентная заявка РСТ № 2007-515964.
[Патентный документ 4] японская выложенная переведенная патентная заявка РСТ № 2008-541699.
[Патентный документ 5] JP 2008-35779 A.
[Патентный документ 6] JP 2008-43332 A.
[Патентный документ 7] японская выложенная переведенная патентная заявка РСТ № 2009-501531.
Непатентный документ
[Непатентный документ 1] Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, Leiber M, Gassmann M, Lightfoot S, Menzel W, Granzow M, Ragg T: The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements; BMC Molecular Biology 7:3 (2006).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ
При необходимости анализа РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором, в предшествующем уровне техники не оказалось доступного способа оценки, простой и с высокой вероятностью, подходит ли экстрагированная РНК для анализа, и поэтому было трудно оценить адекватность данных, полученных с помощью анализа.
СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
В связи с описанной выше проблемой, авторы настоящего изобретения тщательно проанализировали ее, обнаружив, что при осуществлении анализа экспрессии генов, исходя из РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором, могут быть получены в высокой степени адекватные и воспроизводимые данные, отражающие исходное количество РНК, при проведении перед анализом электрофореза РНК и оценки, подходит ли РНК для анализа, исходя из паттерна электрофореза, с последующим проведением анализа в случаях, когда решали, что РНК подходит для анализа, таким образом, завершив настоящее изобретение.
Кроме того, авторы настоящего изобретения также обнаружили, что в случаях, когда при амплификации РНК берется фактор амплификации от 2 до 20 по отношению к исходному количеству РНК, систематическая ошибка вследствие амплификации может быть снижена, и поэтому могут быть получены в высокой степени адекватные и воспроизводимые данные, отражающие исходное количество РНК, таким образом, завершая настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение определяется пунктами с (1) по (7) ниже.
(1) Способ анализа РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором, причем способ содержит стадию, на которой определяют, удовлетворяет ли РНК следующему уравнению:
Уравнение: В/А ≤1
[где А представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, и В представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом].
(2) Способ анализа РНК по (1), причем способ дополнительно содержит стадию, на которой оценивают, составляет ли соотношение А (%) не меньше чем 25%.
(3) Способ анализа РНК по (1) или (2), в котором анализируют продукт амплификации, полученный амплификацией оцененной РНК с фактором амплификации от 2 до 20.
(4) Способ анализа РНК по (1) или (2), в котором оцененную РНК анализируют без амплификации.
(5) Способ анализа РНК по (4), в котором РНК представляет собой миРНК.
(6) Способ анализа РНК по любому из п.п. с (1) по (5), в котором фиксатор содержит формальдегид и/или параформальдегид.
(7) Способ анализа РНК по любому из п.п. с (1) по (6), в котором ткань или клетку(клетки), фиксированные фиксатором, заливают в парафин или заливают в соединение ОСТ.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
С помощью способа по настоящему изобретению для анализа РНК возможен анализ, точно отражающий исходное количество гена даже с РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором, и предпочтительный эффект может быть получен особенно в анализе на микрочипе. Кроме того, с помощью способа по настоящему изобретению для анализа РНК может быть оценено до анализа, подходит ли для анализа РНК, экстрагированная из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором, и таким образом заранее может быть предотвращена трата реагентов и подобное.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показана диаграмма, полученная определением массового соотношения (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов (А) и массового соотношения (%) РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов (В), эти соотношения определяли, используя биоанализатор, для большого числа РНК, и отмечая А на оси абсцисс и В/А на оси ординат.
На фиг.2 показана диаграмма, на которой отмечали величины RIN и количества амплификации большого числа РНК.
На фиг.3 показана диаграмма рассеивания, полученная при двукратном осуществлении анализа экспрессии для тканей FFPE мозга и печени мышей, используя микрочип, таким образом измеряя интенсивность сигнала для каждого гена в каждом из первых и вторых анализов с последующим нанесением на график соотношений мозг/печень, определенных, исходя из этих анализов.
ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение далее будет описано более конкретно.
Под «тканью или клеткой(ами), фиксированными фиксатором» по настоящему изобретению понимают ткань или клетку(клетки), подвергнутые обработке для сохранения биологического образца в насколько возможно природном состоянии путем погружения ткани или клетки(клеток) в раствор, названный фиксатором, то есть обработке фиксацией. К предпочтительным примерам фиксатора, использованного в этой обработке, относятся растворы формальдегида; растворы параформальдегида; растворы, содержащие спирт, такой как этанол или метанол, ацетон или хлороформ; фиксаторы, содержащие кислоту, такую как пикриновая кислота или бихромат калия (например, фиксатор Боуина, фиксатор Замбони или фиксатор Орта); и растворы, содержащие металл, такие как ацетат цинка, хлорид цинка или сульфат цинка. Кроме того, также предпочтительно используются смеси 2 или больше видов вышеуказанных растворов, такие как фиксатор Карноя, который составлен из этанола, хлороформа и уксусной кислоты; и фиксатор метакарн, который составлен из метанола, хлороформа и уксусной кислоты.
По настоящему изобретению в качестве фиксатора более предпочтительно используется раствор, содержащий формальдегид или параформальдегид. Раствор формальдегида может быть получен разбавлением коммерчески доступного формалина (формальдегид в концентрации 37%) водой или также может быть предпочтительно получен доведением величины рН водного раствора до нейтральной с помощью карбоната кальция, карбоната магния или подобного или разбавлением формальдегида фосфатным буфером для доведения величины рН до нейтрального значения. Кроме того, может быть использован раствор формалина после удаления его дурного и вызывающего раздражение запаха и доведения его концентрации (торговое наименование: Maskedform). Содержание формальдегида в растворе формальдегида предпочтительно составляет от 1 до 30%, более предпочтительно от 2 до 20%. Раствор параформальдегида может быть получен растворением порошка параформальдегида в воде, фосфатном буфере или подобном, или растворением порошка параформальдегида в воде и небольшом количестве гидроксида натрия и затем доведением величины рН фосфатным буфером или подобным до нейтрального значения; или может быть использован коммерчески доступный раствор параформальдегида. Концентрация предпочтительно составляет от 1 до 10%, более предпочтительно от 2 до 8%.
Фиксированная ткань или клетка(клетки) может(могут) быть залита(ы) в парафин. В случаях заливки фиксированной ткани или клетки(клеток) в парафин процедура может быть осуществлена согласно широко используемой технике, известной специалистам в данной области. А именно, фиксированную ткань или клетку(клетки) подвергают замещению спиртом для обезвоживания ткани или клетки(клеток) с последующим замещением ксилолом, бензолом или подобным. После чего в форму, в которую наливали парафин, расплавленный нагреванием, помещают ткань или клетку(клетки) и заливают для получения парафинового блока. При экстракции РНК из ткани или клетки(клеток), залитых в парафин, перед применением ткань или клетку(клетки) нарезают, используя микротом, такой как ротационный микротом или санный микротом. Толщина каждого тонкого среза не ограничивается и предпочтительно составляет от 1 до 100 мкм, более предпочтительно от 2 до 50 мкм. Альтернативно, вместо парафина может быть использовано соединение ОСТ (оптимальная температура нарезания), которое используют в основном для получения срезов замороженной ткани. Также предпочтительно используют способ, заключающийся в экстракции РНК из ткани, извлеченной посредством микродиссекции или подобного, в котором парафиновый блок нарезают и прикрепляют к предметному стеклу, и часть ее собирают путем лазерной захватывающей микродиссекции (LCM), применения скальпеля или подобного для сбора анализируемой ткани. В случаях осуществления LCM ткань или клетка(клетки) может(могут) быть окрашена(ы) для повышения возможности их визуального контроля при получении анализируемой ткани или клетки(клеток). В качестве красителя для применения в этой обработке могут быть использованы крезилвиолет, гематоксилин-эозин (НЕ), ядерный прочный красный (NFR) или подобное.
«РНК, экстрагированная из ткани или клетки(клеток), фиксированной(ых) фиксатором» по настоящему изобретению представляет собой РНК, которую экстрагируют из ткани или клетки(клеток), фиксированной(ых), используя вышеуказанный фиксатор, путем расщепления белков в ткани или клетке(ах) с помощью фермента. К их примерам относятся мРНК, рРНК, тРНК и миРНК, и РНК предпочтительно представляет собой мРНК или миРНК, более предпочтительно миРНК. Поскольку экстракт может быть контаминирован примесями, такими как ДНК и белки, после экстракции предпочтительно осуществляют процедуру очистки. Способ очистки, используемый в этой процедуре, не ограничивается, и к его примерам относятся способ, в котором используют колонку, имеющую кремниевую мембрану, анионообменную смолу или подобное, способ, в котором используют жидкостную хроматографию, такую как обратнофазовая хроматография, способ, в котором РНК осаждают, используя органический растворитель, способ, в котором к раствору, содержащему РНК, добавляют раствор ацетата аммония в высокой концентрации для избирательного осаждения РНК, и способ, в котором используют магнитные шарики. В вышеуказанных экстракции и очистке может быть предпочтительно использован набор для экстракции РНК для фиксированных формалином залитых в парафин тканей, такой как «набор для выделения суммарной нуклеиновой кислоты для тканей FFPE RecoverAll (торговое наименование)» (продукция фирмы Ambion), «набор для тканей FFPE RNeasy» (продукция фирмы Qiagen), «набор ISOGEN PB» (продукция фирмы Nippon Gene Co., Ltd), «набор для очистки РНК из тканей FFPE» (продукция фирмы Norgen), «набор для выделения РНК из тканей FFPE PureLink (торговое наименование)» (продукция фирмы Invitrogen), «High Pure FFPE RNA Micro» (продукция фирмы Roche Applied Science), «набор Agencourt FormaPure (торговое наименование)» (продукция фирмы Beckman Coulter) или «набор для экстракции из тканей FFPE QuickExtract (торговое наименование)» (продукция фирмы Epicentre).
Поскольку компоненты фиксатора могут вызывать деградацию и/или перекрестное связывание/модификацию РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), фиксированной(ых) вышеописанным фиксатором, во многих случаях было затруднительно подвергать образец анализу, пользуясь межмолекулярным взаимодействием с веществом, которое может непосредственно или косвенно и избирательно связываться с РНК (далее в настоящем документе обозначаемым как избирательно связывающееся вещество). Поэтому предварительная оценка, подходит ли образец для анализа, оказалась технически сложно осуществимой. Как описано в последующих примерах и подобном, авторы настоящего изобретения обнаружили, что подходит ли РНК, экстрагированная из ткани или клетки(клеток), для анализа на микрочипе, можно оценить путем осуществлении стадии определения массового соотношения РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, и массового соотношения РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, для того, чтобы заранее устранить образцы РНК, содержащие высокие соотношения низкомолекулярной РНК в качестве индекса деградации и фрагментации РНК и/или высокомолекулярной РНК в качестве индекса перекрестного связывания и добавления/модификации РНК. Под «подходящим для анализа» в настоящем документе понимают состояние, когда при анализе РНК, используя межмолекулярное взаимодействие между РНК и избирательно связывающимся веществом, информация, сохраненная образцом, может быть точно считана. Как описано выше, при анализе РНК в случаях высоких степеней деградации и фрагментации или большого количества продуктов из-за наличия перекрестного связывания или добавки/модификации межмолекулярное взаимодействие с избирательно связывающимся веществом может быть ингибировано, при амплификации может не продуцироваться достаточное количество продукта или может возникнуть систематическая ошибка, так что существует большая вероятность того, что точный анализ может быть не осуществим.
В отношении РНК, экстрагированной из ткани или клетки(клеток), к примерам способа определения массового соотношения РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, и массового соотношения РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, относится способ, в котором РНК сортируют, исходя из молекулярной массы и оценки количественного соотношения РНК в каждом диапазоне молекулярной массы. К конкретным примерам электрофореза в качестве способа сортировки образца РНК, экстрагированной из фиксированной ткани, клетки(клеток) или подобного, исходя из молекулярной массы, для определения распределения по молекулярной массе, относятся электрофорез в агарозном геле, электрофорез в полиакриламидном геле, капиллярный электрофорез и электрофорез на чипе. К примерам способов оценки количественного соотношения РНК в определенном диапазоне нуклеотидов относятся в случаях гель-электрофореза способы, в которых для оцифровки интенсивности полос используют большое число денситометров или устройств для формирования изображения, таких как “Typhoon” (продукция фирмы GE Healthcare), известных специалистам в данной области. В случаях осуществления электрофореза на чипе, используя систему для проведения электрофореза, такую как «биоанализатор Agilent 2100» (продукция фирмы Agilent Technologies), количественное соотношение РНК в конкретном диапазоне молекулярных масс может быть подходящим образом рассчитано путем осуществления анализа пятен, включенного в специальное программное обеспечение. Необходимо отметить, что в случаях анализа электрофорезом не деградированной РНК (интактной РНК) может появляться 28S рибосомальная РНК, которая, как полагают, имеет около 4700 нуклеотидов, в виде полосы, имеющей пик на молекулярной массе, соответствующей молекулярной массе РНК, имеющей несколько меньше чем 4000 нуклеотидов. Как полагают, это связано с тем, что каждая молекула 28S содержит большое число двухцепочечных регионов и поэтому обладает компактной структурой, что приводит к большей скорости миграции, чем ожидаемая, исходя из действительной молекулярной массы. Сходное описание этого явления можно найти в часто задаваемых вопросах (FAQ), представленных на домашней странице фирмы Agilent Technologies. Поэтому по настоящему изобретению 28S рибосомальная РНК рассматривается как находящаяся при электрофорезе по существу в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов. Кроме того, поскольку молекулярная масса 18S соответствует массе 1874 нуклеотидов и полоса 18S при электрофорезе появляется в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, то 18S, конечно, включается в диапазон.
По настоящему изобретению конкретный способ оценки, подходит ли для анализа РНК, экстрагированная из фиксированной ткани или клетки(клеток), представляет собой способ, в котором для оценки, может ли образец подходящим образом быть подвергнут анализу, определяют, является ли А, массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, меньше или таким же как В, массовое соотношение (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, то есть подтверждают, выполняется ли формула В/А≤1. Полагают, что фракция, содержащая РНК длиннее, чем 4000 нуклеотидов, содержит перекрестно сшитую РНК, которая может быть неспособна гибридизоваться с зондом. Поэтому в случаях анализа образца РНК, в котором соотношение В больше, чем соотношение А, количественно оцененная величина имеет тенденцию быть меньше, чем количество в действительности существующей мРНК или миРНК, и существует даже случай, когда мРНК или миРНК не может быть определена даже при ее существенной экспрессии. Таким образом, перед осуществлением анализа РНК, экстрагированной из фиксированной ткани или клетки(клеток), можно быстро оценить, подходит ли РНК для анализа, путем определения, не больше ли величина В/А РНК чем 1.
В случае наличия РНК, соответствующей В/А≤1, может быть получена высокая корреляция с результатами анализа на микрочипах не деградированной (интактной) РНК, экстрагированной из той же ткани или клетки(клеток). Под коэффициентом корреляции в настоящем документе понимают индекс, количественно представляющий силу взаимосвязи между 2 данными, и он варьирует между -1 и 1. Положительная величина представляет позитивную корреляцию; отрицательная величина представляет негативную корреляцию, и значение ноль представляет отсутствие корреляции. В целом, в случаях, когда абсолютная величина составляет не меньше чем 0,5, можно полагать, что корреляция существует; в случаях, когда абсолютная величина составляет меньше чем 0,5, можно полагать, что корреляция отсутствует; и чем значительнее степень корреляции между 2 данными, тем ближе абсолютная величина к 1. Для расчета коэффициента корреляции с помощью «Microsoft Office Excel» (продукция фирмы Microsoft) может быть использована функция «correl». По настоящему изобретению при определении коэффициента корреляции для генов, экспрессию которых обнаруживали одновременно в двух образцах, величина предпочтительно составляет не меньше чем 0,7, более предпочтительно не меньше чем 0,8, еще более предпочтительно не меньше чем 0,9.
Кроме того, в РНК, экстрагированной из фиксированной ткани или клетки(клеток), чем выше величина А, массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, тем ближе РНК к интактному состоянию с отсутствием деградации, в этом случае велика вероятность получить показатели экспрессии генов или миРНК, сходные с таковыми у интактной РНК. В частности, находится ли РНК в состоянии, близком к интактному состоянию, можно быстрее оценить в случаях, когда соотношение А предпочтительно составляет не меньше чем 15%, более предпочтительно не меньше чем 20%, еще более предпочтительно не меньше чем 25%.
Кроме того, меньшая величина (А+В), которая представляет собой сумму А, массового соотношения (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, и В, массового соотношения (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом (0≤(А+В)≤100) указывает на более высокое массовое соотношение РНК, меньшей чем 1000 нуклеотидов, то есть большее количество деградированной РНК. В случаях большого количества деградированной РНК может быть высока вероятность возникновения явления, названного перекрестной гибридизацией, при котором с зондом связывается РНК, отличная от РНК, гибридизация которой изначально ожидается, особенно в случаях осуществления анализа на микрочипе короткоцепочечной миРНК. В таких случаях полученный результат может указывать на более сильную экспрессию РНК, чем предполагалось, исходя из реального количества РНК, или может указывать на большее количество экспрессированной РНК, чем ее реальное количество. По настоящему изобретению величина А+В предпочтительно составляет (А+В)≥15, более предпочтительно (А+В)≥20, еще более предпочтительно (А+В)≥25.
Кроме того, также предпочтительно для более подробной оценки, может ли РНК быть проанализирована, определять наличие/отсутствие конкретного гена в РНК, экстрагированной из фиксированной ткани или клетки(клеток). При осуществлении этой процедуры с более высокой степенью достоверности можно оценить, возможен ли анализ. В таком случае путем обратной транскрипции РНК синтезируют кДНК, и кДНК используют в качестве матрицы для амплификации конкретного гена с помощью ПЦР. Полученный продукт амплификации затем оценивают посредством электрофореза, и в случаях, когда наличие конкретного гена может быть распознано, РНК оценивают как анализируемую. В качестве конкретного гена в настоящем документе предпочтительно выбирают ген, у которого, как полагают, теоретически маловероятно, чтобы наблюдалась вариативность среди образцов, такой как ген, названный ген домашнего хозяйства, или внутренний контроль. К примерам гена относятся глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, β-актин, β2-микроглобулин, гипоксантинрибозилтрансфераза, порфобилиногендезаминаза, фосфоглицераткиназа, циклофилин А и β-глюкуронидаза.
Настоящее изобретение не ограничено при условии, что в анализе используется межмолекулярное взаимодействие между РНК и избирательно связывающимся веществом, и к предпочтительным примерам средства для осуществления анализа относятся микрочипы.
Микрочип получают иммобилизацией большого числа типов избирательно связывающихся веществ на субстрате, составленном из неорганического(их) материала(ов), такого(их) как стекло, керамика и/или силикон; металла(ов), такого(их) как нержавеющая сталь и/или золото (позолота); и/или макромолекулярного(ых) материала(ов), такого(их) как полиэтилентерефталат, полиметилметакрилат (РММА), ацетат целлюлозы, поликарбонат, полистирол, полидиметилсилоксан и/или силоксановый каучук; и используют в качестве средства анализа для определения наличия/отсутствия связывания между иммобилизованным большим числом типов избирательно связывающихся веществ и тестируемым веществом и вместе с тем уровней связывания тестируемого вещества. К примерам избирательно связывающихся веществ, иммобилизованных на микрочипе, относятся нуклеиновые кислоты и другие антигенные соединения. К примерам нуклеиновых кислот относятся дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеиновая кислота (РНК), пептидная нуклеиновая кислота (PNA), комплементарная ДНК (кДНК) и комплементарная РНК (кРНК). К примерам других антигенных соединений относятся низкомолекулярные соединения. Особенно предпочтительным избирательно связывающимся веществом является нуклеиновая кислота. Такое избирательно связывающееся вещество может быть коммерчески доступно, может быть синтезировано или может быть получено из природного источника, такого как биологическая ткань или клетки.
Микрочип не ограничен, и к его предпочтительным примерам относятся микрочипы, имеющие на поверхности субстрата нерегулярный(е) участок(и), где сверху выступающего(их) участка(ов) дополнительно может быть создано покрытие. В таком случае покрытие предпочтительно имеет один или несколько проникающих внутрь каналов, сообщающихся с полостью(ями). Эти каналы предназначены для введения жидкости(ей), такой(их) как раствор нуклеиновой кислоты и/или буфер для связывания и в то же время для поддержания давления внутри субстрата на уровне атмосферного давления. Предпочтительно существует большое число проникающих внутрь каналов на одну полость, и количество каналов особенно предпочтительно составляет от 3 до 6 с учетом простоты заполнения раствором образца. Способ продукции вышеописанного покрытия не ограничен, и к предпочтительным примерам способа относятся литье под давлением, горячее тиснение и машинная обработка в случае смолы; пескоструйная обработка в случае стекла или керамики; и способы, используемые в известных полупроводниковых процессах в случае силикона. Кроме того, посредством инкапсулирования микрочастиц между микрочипом и покрытием после внесения в полость(и) раствора образца возможно применить вибрацию раствора образца, создавая энергичное передвижение инкапсулированных микрочастиц в растворе. В результате эффективность перемешивания заметно возрастает, и создается эффект усиления реакции гибридизации, который предпочтителен. Материал микрочастиц в настоящем документе не ограничен, и к предпочтительным примерам материала относятся стекло, керамика (например, цирконий, стабилизованный иттрием), металлы (например, нержавеющая сталь), полимеры (например, найлоны и полистиролы) и магнитные частицы. Среди них предпочтительно используют керамические микрочастицы, поскольку они физически и химически устойчивы и обладают большим специфическим удельным весом. Эффективность перемешивания может быть дополнительно усилена путем дополнительного применения способа, в котором субстрат вращают, чтобы микрочастицы осаждались в направлении силы тяжести, способа, в котором субстрат встряхивают, способа, в котором используют магнитные микрочастицы и микрочастицы перемещаются при приложении магнитной силы, или подобное в сочетании.
По настоящему изобретению РНК, экстрагированная из ткани или клетки(клеток), фиксированных фиксатором (далее в настоящем документе также обозначаемая как тестируемое вещество), может быть подвергнута анализу без амплификации (продукт без амплификации) или может быть подвергнут анализу продукт амплификации РНК. Способ выбирают подходящим образом в зависимости от типа тестируемого вещества. Например, при анализе миРНК предпочтителен анализ без амплификации. При анализе мРНК тестируемое вещество может представлять собой либо продукт без амплификации, либо продукт амплификации, но в случаях анализа тестируемого вещества, требующего предотвращения систематической ошибки амплификации, предпочтительно анализируют продукт без амплификации или продукт амплификации, полученный амплификацией с фактором амплификации от 2 до 20, как указано ниже.
При анализе продукта амплификации способ амплификации РНК не ограничен, и могут быть использованы наборы для амплификации, коммерчески доступные у большого числа компаний, которые применимы к тканям FFPE. При использовании коммерчески доступного набора к предпочтительным примерам набора относятся «набор для амплификации РНК из тканей FFPE ExpressArt» (продукция фирмы AmpTec), «WT-Ovation FFPE System V2» (продукция фирмы NuGen) и «Arcturus Paradise Plus Reagent System» (продукция фирмы MDS Analytical technologies). Кроме того, для синтеза смысловой РНК также предпочтительно использовать наборы «SenseAMP Plus», «RumpUp» или «RumpUp Plus» (продукция фирмы Genisphere) с последующим синтезом антисмысловой РНК способом, известным специалистам в данной области.
Кроме того, как указано выше, предпочтительно анализируют продукт амплификации, полученный амплификацией с фактором амплификации от 2 до 20. Полагают, что в случаях, когда фактор амплификации при получении продукта амплификации из РНК составляет всего лишь меньше чем 2, у РНК наблюдается обширная деградация и фрагментация, и она составлена из очень коротких цепей РНК, или реакция амплификации ингибируется перекрестным связыванием, возникающим между молекулами РНК или между РНК и белком, или добавлением/модификацией вследствие связывания вещества фиксатора, такого как формальдегид, с РНК в процессе фиксации, что приводит к отсутствию амплификации или недостаточной реакции амплификации. В результате точный анализ может быть невозможен. Кроме того, в случаях получения продукта амплификации с фактором амплификации больше чем 20 может существовать большая вероятность появления заметной систематической ошибки амплификации, причем, например, с большей вероятностью будет амплифицироваться РНК, менее подвергшаяся деградации или подобному, тогда как РНК с существенной деградацией амплифицируется с трудом.
Продукт амплификации может представлять собой либо ДНК, полученную посредством RT-PCR или подобного, либо РНК, синтезированную с помощью РНК-полимеразы или подобного, и продукт амплификации предпочтительно представляет собой РНК по настоящему изобретению. Кроме того, в случаях, когда продукт амплификации представляет собой РНК, РНК не ограничена и может представлять собой либо смысловую, либо антисмысловую РНК. Поскольку большинство существующих микрочипов имеют зонды, применимые к антисмысловой РНК, при использовании имеющегося на сегодняшний день микрочипа РНК предпочтительно амплифицируют в антисмысловую РНК.
К примерам способа достижения фактора амплификации от 2 до 20 относится способ, в котором для оптимизации состава реагента повышают и/или снижают концентрации фермента, праймера, субстрата и/или подобного, использованных для проведения амплификации РНК. Кроме того, для достижения фактора амплификации от 2 до 20 также существует способ доведения времени проведения реакции. Например, при амплификации образца РНК, экстрагированного из ткани или клетки(клеток), используя реагент, который приводит к относительно высокому фактору амплификации, время проведения реакции предпочтительно короче, чем предварительно определенное время. Количество циклов амплификации предпочтительно составляет один раз. При повторении реакции амплификации 2 или больше раз появление даже малой систематической ошибки продукта амплификации после первой амплификации может приводить к значительному повышению систематической ошибки во второй или более поздней амплификации. Для определения массы РНК в растворе на этой стадии, осуществляют, например, спектрофотометрическое измерение раствора РНК, используя кювету, имеющую оптическую длину пути 10 мм, при длине волны 260 нм, и исходя из полученного значения и объема раствора производят расчет согласно формуле А ниже.
Формула А: (значение при 260 нм) × 40 (нг/мкл) × объем раствора (мкл)
Для подтверждения, составляет ли фактор амплификации в результате амплификации РНК от 2 до 20, масса РНК в растворе после амплификации может быть рассчитана согласно формуле А выше, исходя из измеренного с помощью спектрофотометра значения, используя кювету, имеющую оптическую длину пути 10 мм, при длине волны 260 нм, и объема раствора с последующим расчетом фактора амплификации согласно формуле В ниже.
Формула В: (масса РНК после амплификации)/(масса РНК до амплификации)
Тестируемое вещество предпочтительно метят с помощью известного вещества для мечения нуклеиновой кислоты и более предпочтительно метят флуоресцентной меткой. При мечении тестируемого вещества флуоресцентной меткой оно может быть осуществлено либо до, либо после связывания тестируемого вещества с избирательно связывающимся веществом. В случаях, когда тестируемое вещество представляет собой продукт без амплификации, вещество предпочтительно метят непосредственно, и к примерам реагента для прямого мечения, используемого в настоящем документе, относятся «набор для мечения нуклеиновых кислот PlatinumBright» (продукция фирмы Kreatech; Флуоресцентные красители серии Dyomics (продукция фирмы Dyomics)), «набор для мечения микроРНК ULS (торговое наименование)» (продукция фирмы Kreatech; флуоресцентные красители представляют собой Су3 и Су5), «эффективный набор для мечения миРНК miRCURY LNA (торговое наименование)» (продукция фирмы Exiqon; флуоресцентные красители представляют собой Ну3 и Ну5) и «набор для мечения РНК FlashTag» (продукция фирмы Genesphere; флуоресцентные красители представляют собой Oyster-550 и Oyster-650). С другой стороны, в случаях анализа продукта амплификации к участку нуклеотидтрифосфатов (NTP) (аденозинтрифосфату (АТР), гуанозинтрифосфату (GTP), цитидинтрифосфату (СТР) и уридинтрифосфату (UTP)), например, участку UTP, который используют для реакции амплификации, могут быть присоединены аминоаллил, биотин или подобное, и полученный продукт может быть использован для встраивания в продукт амплификации реакционно-способной группы, такой как аминоаллил или биотин, что предпочтительно, поскольку амплифицированный продукт может быть без труда помечен флуоресцентной меткой. При встраивании аминоаллила реакция сочетания легко проходит с флуоресцентным красителем, имеющим на своем конце N-гидроксисукцинимид (NHS). К примерам флуоресцентного красителя, используемым в настоящем документе, относятся Су3, Су5 и Hyper 5 (продукция фирмы GE Healthcare) и серия «Alexa Fluor» (зарегистрированное торговое наименование) (продукция фирмы Molecular Probes). Альтернативно, в отсутствие встраивания реакционно-способной группы, такой как аминоаллил, реагент для непосредственного фруоресцентного мечения амплифицированной РНК может быть использован таким же образом, как в случае продукта без амплификации, и в таком случае предпочтительно могут быть использованы вышеописанные реагенты для прямого мечения.
Флуоресцентно меченное тестируемое вещество подвергают реакции связывания с избирательно связывающимися веществами, иммобилизованными на носителе, таком как микрочип. В качестве способа связывания тестируемого вещества с избирательно связывающимися веществами, иммобилизованными на носителе, используют способ, известный специалистам в данной области, и особенно когда избирательно связывающиеся вещества представляют собой нуклеиновые кислоты, для связывания может быть использован способ гибридизации, известный специалистам в данной области. Кроме того, для реакционного раствора, использованного для связывания нуклеиновой кислоты с избирательно связывающимися веществами, может быть использована композиция, известная специалистам в данной области, и особенно в случаях, когда избирательно связывающиеся вещества представляют собой нуклеиновые кислоты, может быть использован буфер для гибридизации, известный специалистам в данной области. В отношении способа определения, связывается ли каждое избирательно связывающееся вещество, иммобилизованное на носителе, с тестируемым веществом, и для определения массы связавшегося тестируемого вещества может быть осуществлена детекция/измерение, используя устройство сканирования флуоресценции, известное специалистам в данной области, для считывания интенсивности флуоресценции вещества, которым метят нуклеиновую кислоту.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее будет описано более подробно путем эталонных примеров и примеров ниже. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается примерами ниже.
Эталонный пример 1
(Определение выхода РНК в процедуре флуоресцентного мечения)
При осуществлении анализа на микрочипе, используя «чип с олигонуклеотидами человека 25к 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.), может быть предпочтительно получен 1 мкг флуоресцентно меченной антисмысловой РНК (аРНК). Таким образом, изучались условия, при которых может быть получено не меньше чем 1 мкг флуоресцентно меченной аРНК. С РНК, экстрагированной из замороженной ткани желудка человека, используя обратную транскриптазу («SuperScript (зарегистрированное торговое наименование) III» (продукция фирмы Invitrogen)), синтезировали первую цепь кДНК, и затем к ней добавляли ДНК-полимеразу для синтеза второй цепи кДНК, которая комплементарна первой цепи ДНК. После очистки синтезированной кДНК, используя кварцевую колонку, осуществляли транскрипцию in vitro (IVT), используя РНК-полимеразу Т7, при 42°С в течение 8 часов для возможности проведения реакции амплификации аРНК. Эту реакцию осуществляли 5 раз для синтеза в целом 50 мкг аРНК. Необходимо отметить, что в смесь NTP (ATP, GTP, CTP и UTP), используемую в реакции IVT, включали UTP, к которому присоединяли аминоаллильную группу (АА) (АА-UTP), для встраивания группы АА в процессе синтеза аРНК. Процедуру мечения 1 мкг, 2 мкг, 3 мкг или 4 мкг синтезированной АА-аРНК с помощью Су5 (продукция фирмы GE Healthcare) осуществляли 3 раза, соответственно. Количество, полученное из каждого образца после введения метки, показано в таблице 1. Было показано, что 1 мкг флуоресцентно меченной аРНК для полного анализа генов, используя микрочип, может быть получен из не меньше чем 2 мкг немеченой амплифицированной аРНК.
| [Таблица 1] | |||||
| Количество АА-аРНК до введения метки (мкг) | 1,0 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | |
| Выход меченной аРНК (мкг) | Первое введение метки | 0,5 | 1,2 | 1,9 | 2,7 |
| Второе введение метки | 0,5 | 1,1 | 2,1 | 2,7 | |
| Третье введение метки | 0,4 | 1,2 | 2,0 | 2,9 |
Пример 1
(Экстракция РНК из фиксированной ткани)
Из каждого из 32 образцов, полученных из образцов FFPE тканей желудка человека, делали тонкие срезы толщиной 10 мкм, и срезы помещали в пробирку объемом 1,5 мл. В эту пробирку добавляли 1 мл ксилола и полученную смесь перемешивали до растворения парафина. После центрифугирования при 16000×g в течение 5 минут ксилол удаляли, используя пипетку, чтобы ткань не впитывала. После этого в пробирку добавляли 1 мл этанола и полученную смесь перемешивали с последующим центрифугированием смеси при 16000×g в течение 2 минут и удалением этанола в достаточной степени, чтобы ткань не впитывала. Эту процедуру осуществляли дважды. Пробирку высушивали на воздухе при открытой крышке в течение 10 минут для удаления этанола, содержавшегося в ткани. После добавления 100 мкл раствора протеиназы К (в концентрации 500 мкг/мл) ткань суспендировали и затем оставляли при 37°С в течение 16 часов. Пробирку центрифугировали при 16000×g в течение 2 минут для удаления осадка, и РНК затем очищали, используя кварцевую колонку. В таблицах 2 и 3 показаны выход и степень очистки (соотношение между 260 нм и 280 нм), измеренные, используя спектрофотометр (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование) продукция фирмы Thermo Scientific); массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массовое соотношение (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, рассчитанные с помощью «биоанализатора Agilent 2100» (продукция фирмы Agilent Technologies) (далее в настоящем документе обозначаемого как биоанализатор); и отношение В/А, определенное из величин А и В для каждого образца. На фиг.1 показана диаграмма, полученная нанесением на график значений А по оси абсцисс и нанесением на график значений В/А по оси ординат, где каждый образец, удовлетворяющий уравнению В/А≤1, представляют как «Ο» и каждый образец, удовлетворяющий уравнению В/А >1, представляют как «×».
(Амплификация РНК)
Из 1 мкг каждого из 18 образцов, удовлетворяющих уравнению В/А≤1, используя обратную транскриптазу («SuperScript (зарегистрированная торговая марка) III» (Invitrogen)), синтезировали первую цепь кДНК, и затем добавляли к ней ДНК-полимеразу для синтеза второй цепи кДНК, которая комплементарна первой цепи ДНК. После очистки синтезированной кДНК, используя кварцевую колонку, осуществляли транскрипцию in vitro (IVT), используя РНК-полимеразу Т7, при 42°С в течение 8 часов для возможности проведения реакции амплификации аРНК. В этой реакции для встраивания аминоаллильных групп в процессе амплификации аРНК использовали АА-UTP тем же способом как в эталонном примере 1. Амплифицированную аРНК очищали, используя кварцевую колонку. Как показано в таблице 2, фактор амплификации, рассчитанный, исходя из выхода после амплификации, во всех образцах оказался не меньше чем 2, и было выявлено, что образец, удовлетворяющий условию В/А≤1, подходит для анализа РНК способом по настоящему изобретению.
(Введение флуоресцентной метки и фрагментация амплифицированной РНК)
Раствор каждой амплифицированной аРНК концентрировали до около 1 мкл, используя центрифужный концентратор (MV-100; продукция фирмы Tomy Seiko Co., Ltd.). К полученному концентрату добавляли 5 мкл натрий-бикарбонатного буфера, который вложен в набор «буфер для гибридизации 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.), и полученную смесь перемешивали пипетированием с последующим добавлением к ней 5 мкл красителя Су5-NHS (продукция фирмы GE Healthcare), растворенного в DMSO, перемешиванием полученной смеси пипетированием и инкубированием смеси при 40°С в течение 1 часа для осуществления реакции сочетания. Для очистки каждого реакционного раствора удаляли непрореагировавший Су5, используя спин-колонку для гель-фильтрации (продукция фирмы Bio-Rad), и к очищенному раствору добавляли свободную от нуклеаз воду для получения конечного объема 32 мкл. К полученному раствору добавляли 8 мкл «5-кратного буфера для фрагментации», который входит в набор «буфер для гибридизации 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, inc.), и полученную смесь без усилий перемешивали пипетированием с последующей обработкой при 94°С в течение 15 минут. Каждый образец быстро охлаждали на колотом льду в течение 3 минут и очищали с помощью центрифужного концентратора «Microcon YM-10» (продукция фирмы Millipore).
(Гибридизация)
Для каждого из 18 образцов, удовлетворяющих условию В/А≤1, меченую и очищенную аРНК подвергали анализу на микрочипе по следующей процедуре. Раствор, содержащий 1000 нг каждой РНК, получали с помощью свободной от нуклеаз воды до конечного объема 16 мкл, и к нему добавляли 2 мкл «буфера для гибридизации А» в буфере для гибридизации “3D-Gene” (зарегистрированное торговое наименование) (продукция фирмы Toray Industries, Inc.) с последующей обработкой полученной смеси нагреванием при 95°С в течение 5 минут. Смесь быстро охлаждали на колотом льду в течение 3 минут и к ней добавляли 232 мкл «буфера для гибридизации В» с последующим перемешиванием полученной смеси осторожным пипетированием, таким образом, получая 250 мкл раствора образца. Раствор образца дегазировали при пониженном давлении, и 210 мкл раствора наносили на «чип с полногеномной ДНК мыши 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.). Каналы в 4 позициях на покрытии запаивали, и чип помещали в камеру для гибридизации (TX711, продукция фирмы Takara Bio Inc.), закрепленную на верхней панели биошейкера (MMS-210, продукция фирмы Tokyo Rikakikai). Температуру в камере устанавливали на 37°С, и образцы перемешивали поворотным движением при 250 об/мин для проведения реакции в течение 16 часов.
(Измерение величин флуоресцентных сигналов)
После отмывки чипа по окончании реакции для подсчета количества эффективных пятен с помощью сканера «Сканер 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование) (продукция фирмы Toray Industries, Inc.))» измеряли величины флуоресцентных сигналов. В результате, как показано в таблице 2, количество эффективных пятен оказалось одинаково большим. Кроме того, тот же эксперимент осуществляли с РНК, экстрагированной из замороженных образцов той же ткани, и рассчитывали коэффициент корреляции для эффективных пятен, присутствующих и с каждой РНК из образца FFPE. Коэффициент корреляции в настоящем документе представляет собой индекс, количественно отражающий степень взаимосвязи между двумя данными, и он варьирует в диапазоне между -1 и 1, где положительное значение представляет положительную корреляцию; отрицательное значение представляет негативную корреляцию, и значение ноль представляет отсутствие корреляции. В целом, в случаях, когда абсолютная величина составляет не меньше чем 0,5, можно полагать, что корреляция существует; в случаях, когда абсолютная величина составляет меньше чем 0,5, можно полагать, что корреляция отсутствует; и чем более сильная степень корреляции между двумя данными, тем абсолютная величина ближе к 1. Для расчета коэффициента корреляции с помощью программного обеспечения «Microsoft Office Excel» (продукция фирмы Microsoft) может быть использована функция «correl», данное программное обеспечение также использовалось в настоящем примере. Коэффициент корреляции для каждого образца представлен в таблице 2, и высокая положительная корреляция с РНК из замороженной ткани подтверждалась для всех образцов.
Сравнительный пример 1
Из 1 мкг каждого из 14 образцов, удовлетворяющих условию В/А>1, амплифицировали аминоаллил-модифицированную аРНК (АА-аРНК) тем же способом, как описанный выше. Как показано в таблице 3, фактор амплификации, рассчитанный, исходя из выхода после амплификации, в большинстве образцов составил меньше чем 2, что указывает на недостаточное мечение РНК. То есть было выявлено, что с высокой вероятностью образец, удовлетворяющий условию В/А>1, проблематично подвергать анализу РНК.
| [Таблица 2] | ||||||||||
| (а) | ||||||||||
| Ткань | FFPE-ткань желудка человека | |||||||||
| (1) | (2) | (3) | (4) | (5) | (6) | (7) | (8) | (9) | (10) | |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,93 | 1,93 | 1,99 | 2,01 | 2,04 | 1,95 | 1,81 | 1,89 | 2,00 | 1,97 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], A (%) |
27 | 23 | 29 | 27 | 37 | 23 | 19 | 20 | 45 | 30 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
26 | 19 | 16 | 4 | 8 | 9 | 3 | 16 | 15 | 9 |
| В/А | 0,96 | 0,83 | 0,55 | 0,15 | 0,22 | 0,39 | 0,16 | 0,80 | 0,33 | 0,30 |
| Фактор амплификации | 8,1 | 2,1 | 3,7 | 5,5 | 5,0 | 3,2 | 5,8 | 3,5 | 4,3 | 4,6 |
| Количество детектированных генов | 15480 | 13391 | 14423 | 16079 | 15549 | 14970 | 15989 | 14439 | 14777 | 15010 |
| Коэффициент корреляции | 0,95 | 0,88 | 0,91 | 0,92 | 0,92 | 0,90 | 0,94 | 0,90 | 0,95 | 0,93 |
| (b) | ||||||||
| Ткань | FFPE-ткань желудка человека | |||||||
| (11) | (12) | (13) | (14) | (15) | (16) | (17) | (18) | |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,97 | 2,00 | 1,99 | 1,95 | 1,98 | 1,94 | 1,99 | 1,95 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], A (%) |
39 | 39 | 34 | 40 | 32 | 38 | 19 | 19 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
3 | 4 | 4 | 10 | 2 | 4 | 5 | 8 |
| В/А | 0,08 | 0,10 | 0,12 | 0,25 | 0,06 | 0,11 | 0,26 | 0,42 |
| Фактор амплификации | 4,6 | 5,2 | 6,6 | 5,5 | 6,6 | 6,7 | 2,7 | 2,1 |
| Количество детектированных генов | 16801 | 17209 | 17560 | 17090 | 16778 | 17236 | 13809 | 13294 |
| Коэффициент корреляции | 0,95 | 0,94 | 0,93 | 0,96 | 0,90 | 0,91 | 0,90 | 0,88 |
| [Таблица 3] | ||||||||||
| (c) | ||||||||||
| Ткань | FFPE-ткань желудка человека | |||||||||
| (19) | (20) | (21) | (22) | (23) | (24) | (25) | (26) | (27) | (28) | |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,91 | 1,93 | 1,90 | 1,97 | 1,89 | 1,93 | 1,86 | 1,95 | 1,90 | 1,95 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], A (%) |
9 | 15 | 13 | 23 | 15 | 16 | 10 | 18 | 9 | 17 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
29 | 38 | 38 | 34 | 41 | 30 | 36 | 31 | 19 | 20 |
| В/А | 3,22 | 2,53 | 2,92 | 1,48 | 2,73 | 1,88 | 3,60 | 1,72 | 2,11 | 1,18 |
| Фактор амплификации | 0,4 | 1,3 | 1,3 | 1,7 | 1,3 | 1,7 | 1,9 | 0,6 | 1,0 | 2,0 |
| (d) | ||||
| Ткань | FFPE-ткань желудка человека | |||
| (29) | (30) | (31) | (32) | |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,87 | 1,92 | 1,95 | 1,92 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], A (%) |
8 | 10 | 17 | 26 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов] В (%) |
32 | 30 | 34 | 29 |
| В/А | 4,00 | 3,00 | 2,00 | 1,12 |
| Фактор амплификации | 1,9 | 1,9 | 1,6 | 1,8 |
Пример 2
(Экстракция РНК из FFPE)
Блоки фиксированных формалином залитых в парафин (FFPE) мозга и печени, которые получали от мышей (в возрасте 7 недель, самцов, Slc:ICR) при большом числе условий и хранили в течение различных периодов времени, получали, как показано в таблице 5. Из каждого блока FFPE, используя микротом, делали по 10 тонких срезов толщиной 10 мкм и помещали в пробирки объемом 1,5 мл так, чтобы в каждой пробирке содержалось по 5 тонких срезов. В каждую пробирку добавляли 1 мл ксилола и полученную смесь перемешивали на вортексе в течение 10 секунд для растворения парафина. После центрифугирования при 16000×g в течение 5 минут ксилол удаляли, используя пипетку, так чтобы ткань не впитывала. После этого в пробирку добавляли 1 мл этанола и полученную смесь перемешивали на вортексе в течение 10 секунд с последующим центрифугированием смеси при 16000×g в течение 2 минут и осторожным удалением этанола, используя пипетку, так чтобы ткань не впитывала. Эту процедуру повторяли. Пробирку высушивали на воздухе при открытой крышке в течение 10 минут для удаления этанола, содержавшегося в ткани. После добавления 100 мкл раствора протеиназы К (концентрацией 500 мкг/мл) ткань суспендировали и затем оставляли при 37°С в течение 16 часов. Пробирку центрифугировали при 16000×g в течение 2 минут для осаждения и удаления осадка, и РНК затем очищали, используя кварцевую колонку. В каждой из таблиц 4(а) и 4(b) представлены результаты измерения выхода и степени очистки (соотношение между 260 нм и 280 нм), используя спектрофотометр (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование), продукция фирмы Thermo Scientific); результаты расчета массового соотношения (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массового соотношения (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, этот расчет осуществляли с помощью биоанализатора; и величины В/А.
(Амплификация РНК)
Из 1 мкг каждого образца РНК тем же способом, как в примере 1, амплифицировали аминоаллил-модифицированную аРНК (АА-аРНК). Одновременно тем же способом амплифицировали и РНК, экстрагированные из замороженных тканей мозга и печени мышей. Факторы амплификации, рассчитанные, исходя из выходов после амплификации, представлены в таблице 4. В противоположность образцам В/А≤1, у которых во всех случаях наблюдались факторы амплификации не меньше чем 2, у образцов В/А>1 наблюдались факторы амплификации меньше чем 2.
(Введение флуоресцентной метки и фрагментация)
Описанные выше аРНК, полученные с факторами амплификации не меньше чем 2, подвергали флуоресцентному мечению и фрагментации тем же способом, как в примере 1. Выходы аРНК после введения метки и очистки представлены в таблице 4.
(Анализ на микрочипе)
Раствор, содержащий 1000 нг каждой РНК, получали до конечного объема 16 мкл с помощью свободной от нуклеаз воды, и к нему добавляли 2 мкл «буфера для гибридизации А» в «буфере для гибридизации 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.) с последующей обработкой полученной смеси нагреванием при 95°С в течение 5 минут. Смесь быстро охлаждали на колотом льду в течение 3 минут и к ней добавляли 232 мкл «буфера для гибридизации В плюс» с последующим перемешиванием полученной смеси путем осторожного пипетирования, таким образом, получая 250 мкл раствора образца. Раствор образца дегазировали при пониженном давлении, и 210 мкл раствора наносили на «чип для анализа полногеномной ДНК мыши 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.). Каналы в 4 позициях на покрытии запаивали, и чип помещали в камеру для гибридизации (TX711, продукция фирмы Takara Bio Inc.), закрепленный на верхней панели биошейкера (MMS-210, продукция фирмы Tokyo Rikakikai). Температуру в камере устанавливали на 37°С и образец перемешивали поворотным вращением при 250 об/мин для проведения реакции в течение 16 часов.
(Измерение величин флуоресцентных сигналов)
После прохождения реакции покрытие чипа для анализа отделяли, и субстрат отмывали и высушивали. Субстрат помещали в сканер (GenePix (зарегистрированное торговое наименование) 4000В, продукция фирмы Axon Instruments) для ДНК-чипов и величину сигнала (интенсивность флуоресценции) каждой флуоресцентно меченой РНК, подвергнутой реакции гибридизации, и фоновый шум измеряли при следующих условиях: выходная мощность лазера 33%; и настройка напряжения фотоумножителя 500. Для измерения величины фоновой флуоресценции среди всех пятен 1750 пятен рассматривали в качестве пятен отрицательного контроля, и из величины каждого сигнала вычитали значение фонового сигнала для расчета верной величины сигнала для каждого пятна. При положительном значении сигнала от пятна пятно признавали «эффективным пятном». В результате, как показано в таблице 4(а) и 4(b), количество эффективных пятен среди образцов оказалось почти одинаковым.
| [Таблица 4] | ||||||
| (а) | ||||||
| Ткань | FFPE-мозг мыши | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Толщина и количество использованных срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов |
| Выход после экстракции (мкг) | 2,0 | 2,2 | 3,0 | 2,1 | 1,8 | 2,0 |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 2,05 | 2,06 | 2,05 | 2,07 | 2,10 | 2,07 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А (%) |
39 | 38 | 52 | 3 | 56 | 4 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
3 | 4 | 3 | 2 | 4 | 2 |
| В/А | 0,08 | 0,11 | 0,06 | 0,67 | 0,07 | 0,50 |
| Фактор амплификации | 7,2 | 6,4 | 10,2 | 2,1 | 11,1 | 2,0 |
| Выход после введения метки (мкг) | 4,3 | 3,7 | 6,3 | 0,8 | 6,5 | 0,6 |
| Количество эффективных пятен | 12200 | 12350 | 12900 | 10430 | 12950 | 10080 |
(b)
| Ткань | FFPE-печень мыши | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Толщина и количество использованных срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов |
| Выход после экстракции (мкг) | 7,4 | 8,0 | 12,5 | 6,9 | 10,9 | 6,3 |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,99 | 2,01 | 2,04 | 1,82 | 1,97 | 1,85 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А (%) |
47 | 45 | 64 | 12 | 26 | 14 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
5 | 6 | 5 | 25 | 16 | 28 |
| В/А | 0,11 | 0,13 | 0,08 | 2,08 | 0,62 | 2,00 |
| Фактор амплификации | 4,8 | 4,9 | 8,3 | 1,0 | 3,3 | 1,2 |
| Выход после введения метки (мкг) | 2,9 | 3,1 | 4,8 | - | 1,8 | - |
| Количество эффективных пятен | 12460 | 12300 | 13000 | - | 12100 | - |
Эталонный пример 2
РНК, экстрагированную из каждого FFPE-образца мозга, печени и почки мыши и мозга и печени крысы таким же образом, как в примере 1, подвергали электрофорезу с помощью биоанализатора для расчета RIN. Взаимосвязь между RIN и выходом после амплификации 1 мкг каждого образца РНК суммируется на фиг.2 и в таблицах с 5(а) по 5(с). В результате между RIN и выходом было обнаружено отсутствие корреляции. Кроме того, для части образцов значение RIN не могло быть рассчитано (представлено в таблице 5 как «N/A»). Таким образом, было показано, что в случае РНК, экстрагированной из фиксированной ткани или фиксированной(ых) клетки(клеток), такой(их) как FFPE, проблематично оценить, исходя из RIN, подходит ли образец для анализа РНК.
| [Таблица 5] | ||||||||||
| (а) | ||||||||||
| Ткань | FFPE-мозг мыши | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| RIN | 2,6 | 2,6 | 3,2 | 2,3 | 6,3 | 2,3 | 3,0 | 6,5 | 5,7 | 6,4 |
| Выход после амплификации (мкг) | 2,0 | 2,2 | 3,0 | 2,1 | 1,8 | 2,0 | 5,8 | 6,3 | 6,7 | 1,9 |
| (b) | ||||||||||
| Ткань | FFPE-печень мыши | FFPE-почка мыши | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 1 | 2 | |
| RIN | N/A | N/A | 7,2 | 8,0 | 6,2 | 7,3 | 7,5 | N/A | 7,7 | 7,9 |
| Выход после амплификации (мкг) | 7,4 | 8,0 | 12,5 | 6,9 | 10,9 | 6,3 | 15,2 | 10,8 | 3,8 | 6,1 |
| (с) | ||||||||||
| Ткань | FFPE-мозг крысы | FFPE-печень крысы | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| RIN | N/A | 2,3 | 2,3 | 2,3 | 5,7 | 8,2 | N/A | N/A | 2,3 | N/A |
| Выход после амплификации (мкг) | 2,1 | 1,0 | 2,4 | 2,5 | 8,3 | 4,2 | 2,0 | 0,3 | 1,7 | 1,2 |
Пример 3
(Экстракция РНК из фиксированной ткани)
Блоки фиксированной формалином залитой в парафин (FFPE) печени, которые получали от мышей (в возрасте 7 недель, самцов, Slc:ICR) с помощью 10% нейтрального забуференного формалина при большом числе условий и хранили в течение различных периодов времени, получали, как показано в таблице 6 (образцы с (А) по (D)). Из каждого блока, используя микротом, делали по 2 тонких среза толщиной 10 мкм, и срезы помещали в пробирку объемом 1,5 мл. В пробирку добавляли 1 мл ксилола, и полученную смесь перемешивали до растворения парафина. После центрифугирования при 16000×g в течение 5 минут ксилол удаляли, используя пипетку, так чтобы ткань не впитывала. После этого добавляли 1 мл этанола и полученную смесь перемешивали с последующим центрифугированием смеси при 16000×g в течение 2 минут и осторожным удалением этанола, используя пипетку, так чтобы ткань не впитывала. Эту процедуру осуществляли дважды. Пробирку высушивали на воздухе при открытой крышке в течение 10 минут для удаления этанола, содержавшегося в ткани. После добавления 100 мкл раствора протеиназы К (концентрацией 500 мкг/мл) ткань суспендировали и затем оставляли при 37°С в течение 16 часов. Пробирку центрифугировали при 16000×g в течение 2 минут для удаления осадка, и РНК затем очищали, используя кварцевую колонку. В таблице 7 представлены результаты измерения выхода и степени очистки РНК (соотношение между 260 нм и 280 нм), используя спектрофотометр (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование, Thermo Scientific)); результаты расчета массового соотношения (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массового соотношения (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, этот расчет осуществляли с помощью биоанализатора; и величины В/А и А+В. В качестве контроля использовали РНК, экстрагированную из свежезамороженной ткани печени мыши (в возрасте 7 недель, самца, Slc:ICR).
(Флуоресцентное мечение РНК)
Из FFPE-печени мыши, такой же, как и в примере 1, РНК экстрагировали тем же способом, и 500 нг каждой экстрагированной РНК подвергали обработке CIP и затем ферментативной реакции для мечения красителем Ну5, используя «набор для мечения miRCURY LNA microRNA Array Power» (продукция фирмы EXIQON) согласно протоколам, вложенным в набор.
(Анализ на микрочипе)
Раствор, содержащий 500 нг каждой меченой РНК, доводили до конечного объема 15,4 мкл с помощью свободной от нуклеаз воды и к нему добавляли 0,6 мкл блокирующего реагента в «буфере для гибридизации миРНК 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.) и 105 мкл буфера для гибридизации миРНК с последующим перемешиванием полученной смеси. Смесь затем дегазировали при пониженном давлении и 110 мкл смеси наносили на «чип для анализа миРНК мыши 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.). Каналы по 4 позициям на покрытии запаивали, и чип помещали в камеру для гибридизации (TX711, продукция фирмы Takara Bio Inc.), закрепленную на верхней панели биошейкера (MMS-210, продукция фирмы Tokyo Rikakikai). Температуру в камере устанавливали на 32°С, и образец перемешивали поворотным вращением при 250 об/мин для проведения реакции в течение 16 часов.
После прохождения реакции покрытие чипа отделяли, и субстрат отмывали и высушивали. Субстрат помещали в сканер (GenePix (зарегистрированное торговое наименование) 4000В, продукция фирмы Axon Instruments) для ДНК-чипов и значение сигнала (интенсивность флуоресценции) каждой флуоресцентно меченой РНК, подвергнутой реакции гибридизации, и фоновый шум измеряли при следующих условиях: выходная мощность лазера 33%; и настройка напряжения фотоумножителя 500. Среди всех пятен 24 пятна рассматривали в качестве пятен отрицательного контроля для измерения величины фонового (BG) сигнала, и из величины каждого сигнала вычитали величину сигнала BG для расчета верной величины сигнала для каждого пятна. В случае наблюдения у пятна положительного значения сигнала пятно признавали «эффективным пятном». В результате, как показано в таблице 7, количество эффективных пятен оказалось почти равно или даже выше в образцах, удовлетворяющих условию В/А≤1, по сравнению с контролем. С другой стороны, в образцах, удовлетворяющих условию В/А>1, число эффективных пятен оказалось меньше, чем в контроле, и поэтому полагали, что существовали недетектируемые миРНК. Таким образом, было показано, что возможность проведения анализа может быть определена, исходя из величины В/А.
(Сравнение с данными по РНК, экстрагированной из замороженной ткани)
Кроме того, РНК, экстрагированную из замороженного образца той же ткани, подвергали тому же эксперименту, и коэффициент корреляции рассчитывали для эффективных пятен, присутствующих с каждой РНК, полученной из образца FFPE. Результаты показаны в таблице 7. В случаях В/А≤1 была обнаружена высоко положительная корреляция с РНК, полученной из замороженной ткани. Кроме того, в образце (С), для которого соблюдалось условие В/А≤1 и величина А оказалась не меньше чем 25%, корреляция со свежезамороженным образцом той же ткани составила не меньше чем 0,9, указывая на очень высокую корреляцию. Таким образом, было показано, что возможность осуществления анализа может быть определена, исходя из величины В/А.
| [Таблица 6] | ||||
| Образец | (А) | (В) | (С) | (D) |
| Период фиксации (дни) | 2 | 2 | 2 | 14 |
| Температура хранения | Комнатная температура (от 20 до 25°С) | Комнатная температура (от 20 до 25°С) | Комнатная температура (от 20 до 25°С) | Холодильник (4°С) |
| Период хранения (месяцы) | 36 | 12 | 6 | 3 |
| [Таблица 7] | |||||
| Образец | (А) | (В) | (С) | (D) | Замороженная ткань |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,95 | 1,97 | 1,94 | 2,02 | 2,01 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А (%) | 2 | 16 | 39 | 28 | 90 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) | 1 | 1 | 4 | 52 | 2 |
| В/А | 0,50 | 0,06 | 0,10 | 1,86 | 0,02 |
| А+В | 3 | 17 | 43 | 80 | 92 |
| Число эффективных пятен | 344 | 295 | 277 | 203 | 257 |
| Число эффективных пятен, присутствующих и с РНК, полученной из замороженной ткани | 202 | 197 | 179 | 120 | - |
| Коэффициент корреляции с РНК, полученной из замороженной ткани | 0,81 | 0,85 | 0,95 | 0,64 | - |
Пример 4
(Получение микрочипа)
Используя способ LIGA (литография, гальваника, формовка), который является известным способом, получали форму для литьевого формования, и субстрат РММА, имеющий форму, описанную ниже, получали литьевым формованием. Средняя молекулярная масса РММА, использованного в настоящем примере, составляла 50000, и в РММА включали черный уголь (продукция фирмы Mitsubishi Chemical Corporation, #3050B) в соотношении 1% по массе для создания черного субстрата. Измеряли спектральный коэффициент отражения и спектральный коэффициент пропускания этого черного субстрата, и в результате спектральный коэффициент отражения при любой длине волны в видимом регионе (длина волны между 400 нм и 800 нм) оказался не больше чем 5%, и спектральный коэффициент пропускания в том же диапазоне длин волн оказался не больше чем 0,5%. Ни у спектрального отражения, ни у спектрального пропускания не наблюдалось определенного спектрального паттерна (например, пика), и спектры оказались равномерно плоскими. Спектральный коэффициент отражения измеряли с помощью зеркального отражения от субстрата, используя устройство (CM-2002, продукция фирмы Minolta Camera), обладающее оптической системой получения иллюминации/света, удовлетворяющей условию С стандарта JIS Z 8722.
В качестве субстрата использовали смоляной субстрат полиметилметакрилат (РММА) (далее в настоящем документе обозначаемый как «субстрат А»), имеющий наружные размеры: продольная длина 76 мм, боковая длина 26 мм и толщина 1 мм, этот субстрат в центре имел участок углубления продольной длиной 39,4 мм, боковой длиной 19,0 мм и глубиной 0,15 мм, этот участок углубления по 9248 позициям в нем имел выступающие участки, каждый из которых имел диаметр 0,1 мм и высоту 0,15 мм. В этом субстрате А различие по высоте между верхними поверхностями выступающих участков и верхней поверхностью плоской зоны (средняя величина относительно выступающих участков) составляла не больше чем 3 мкм. Разброс по высоте верхних поверхностей выступающих участков (различие между высотой верхней поверхности самого высокого выступающего участка и высотой верхней поверхности самого низкого выступающего участка) составил не больше чем 3 мкм. Частоту выступающих участков (расстояние между центром выступающего участка и центром соседнего с ним выступающего участка) устанавливали 0,5 мм.
Указанный выше субстрат А на 12 часов погружали в 10 N водный раствор гидроксида натрия при температуре 70°С. Субстрат А затем отмывали последовательно с помощью чистой воды, 0,1 N водного раствора HCl и чистой воды для получения на поверхности субстрата карбоксильных групп.
На полученном таким образом субстрате А иммобилизовали смысловые олигонуклеотиды в качестве избирательно связывающихся веществ (ДНК-зондов). В качестве олигонуклеотидов использовали набор олигонуклеотидов для ДНК-микрочипов «Homo sapiens (Human) AROS V4.0 (каждый размером 60 нуклеотидов)», продукция фирмы Operon Biotechnologies. Эти олигонуклеотиды растворяли в чистой воде до концентрации 0,3 нмоль/мкл для получения матричных растворов. Перед нанесением матричных растворов в виде пятен на субстрат матричные растворы в 10 раз разбавляли с помощью PBS (полученного объединением 8 г NaCl, 2,9 г Na2HPO4·12Н2О, 0,2 г KCl и 0,2 г KH2PO4, растворением этих веществ в чистой воде до конечного объема 1 л и затем доведением величины рН полученного раствора до 5,5 за счет добавления соляной кислоты) до конечной концентрации ДНК-зонда 0,03 нмоль/мкл, и с целью конденсации между карбоксильными группами, созданными на поверхности субстрата РММА, и концевыми аминогруппами ДНК-зондов добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) до конечной концентрации 50 мг/мл. Полученные растворы в виде пятен наносили на верхние поверхности всех выступающих участков субстрата А, используя устройство для нанесения пятен (Gene Stamp-II, продукция фирмы Nippon Laser & Electronics Lab). После этого субстрат, на который наносили в виде пятен раствор, помещали в запаянный пластиковый контейнер и инкубировали при температуре 37°С и влажности 100% в течение около 20 часов. В заключение субстрат промывали чистой водой и высушивали центрифугированием, используя центробежную сушилку.
К субстрату А, на котором иммобилизовали избирательно связывающиеся вещества, присоединяли покрытие, как указано далее. Плоскую форму РММА размерами: продольная длина 41,4 мм, боковая длина 21 мм и толщина 1 мм - получали путем нарезания и использовали в качестве покрытия. В полученном покрытии создавали проникающие внутрь каналы и камеры для регуляции уровня жидкости. Диаметр каждого проникающего канала составлял 0,8 мм, и диаметр каждой камеры для регуляции уровня жидкости составлял 2,0 мм. Их располагали по четырем углам покрытия. Двухстороннюю клейкую ленту продольной длиной 41,4 мм, боковой длиной 21 мм, толщиной 1 мм и толщиной клеящего состава 25 мкм нарезали по размеру, с которым лента может быть размещена вдоль края покрытия, и ленту затем наслаивали из расчета толщины (зазора) 50 мкм и присоединяли к покрытию. После этого покрытие присоединяли к субстрату А.
В субстрате А, к которому присоединяли покрытие, как описано выше, 120 мг микрочастиц циркония диаметром 180 мкм заключали в полость, образованную субстратом А и покрытием (участок углубления нерегулярной структуры на поверхности субстрата А). Инкапсулирование микрочастиц осуществляли через проникающие внутрь каналы на покрытии. Полученный таким образом чип для анализа использовали в следующем исследовании.
(Экстракция РНК из фиксированной ткани)
Тем же способом, как в примере 3, получали тонкие срезы из блоков фиксированной формалином залитой в парафин (FFPE) печени, которую получали от мышей (в возрасте 7 недель, самцов, Slc:ICR) при большом числе условий и хранили в течение различных периодов времени, и из тонких срезов экстрагировали РНК. В таблице 8 представлены результаты измерения выхода и степени очистки (соотношение между 260 нм и 280 нм), используя спектрофотометр (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование), продукция фирмы Thermo Scientific); результаты расчета массового соотношения (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массового соотношения (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, этот расчет осуществляли с помощью биоанализатора; и величины В/А и А+В. В качестве контроля использовали РНК, экстрагированную из свежезамороженной ткани печени мыши (в возрасте 7 недель, самца, Slc:ICR).
(Флуоресцентное мечение РНК)
РНК, экстрагированную тем же способом, как в примере 3, флуоресцентно метили, используя «набор для мечения нуклеиновых кислот PlatinumBright (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы KREATECH). Для введения в мРНК метки с помощью красителя PlatinumBright 647 к 1 мкг каждой РНК добавляли свободную от нуклеаз воду до конечного объема 16 мкл и к полученному раствору добавляли 2 мкл реагента ULS и 2 мкл 10-кратного раствора для мечения с последующим проведением реакции при 85°С в течение 30 минут. Для удаления не прореагировавшего красителя использовали колонки «KREApure», включенные в набор.
(Анализ на микрочипе)
мРНК, содержавшуюся в каждой зафиксированной ткани, анализировали по следующей процедуре. К раствору, содержащему 1 мкг каждой меченой РНК, добавляли свободную от нуклеаз воду до конечного объема 16 мкл и к нему добавляли 2 мкл буфера для гибридизации А и 232 мкл буфера для гибридизации В в «буфере для гибридизации 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.) с последующим перемешиванием полученной смеси и дегазацией смеси при пониженном давлении. На полученный выше чип для анализа наносили 210 мкл смеси. Каналы по 4 позициям на покрытии запаивали, и чип помещали в камеру для гибридизации (TX711, продукция фирмы Takara Bio Inc.), закрепленную на верхней панели биошейкера (MMS-210, продукция фирмы Tokyo Rikakikai). Для проведения реакции температуру в камере устанавливали на 37°С и образцы перемешивали с помощью поворотного вращения при 250 об/мин в течение 16 часов.
(Измерение величин сигнала флуоресценции)
После прохождения реакции покрытие чипа для анализа снимали, и субстрат отмывали и высушивали. Субстрат помещали в сканер (GenePix (зарегистрированное торговое наименование) 4000В, продукция фирмы Axon Instruments) для ДНК-чипов, и величину сигнала (интенсивность флуоресценции) каждой флуоресцентно меченой РНК, подвергнутой реакции гибридизации, и фоновый шум измеряли при следующих условиях: выходная мощность лазера 33%; и настройка напряжения фотоумножителя 500. Для измерения величины фоновой флуоресценции среди всех пятен 32 пятна рассматривали в качестве пятен отрицательного контроля, и для расчета верной величины сигнала для каждого пятна из каждой величины сигнала вычитали величину фонового сигнала. В случае наблюдения у пятна положительной величины сигнала для каждого пятна. В случае наблюдения у пятна положительной величины сигнала пятно полагали «эффективным пятном». В результате, как показано в таблице 8, количества эффективных пятен в образцах, удовлетворяющих условию В/А≤1, не сильно отличались от количеств в эталонной РНК, экстрагированной из свежезамороженной ткани печени мыши, и это подтверждало, что существует тенденция к высокой корреляции в отношении одновременно присутствующих эффективных пятен. Кроме того, чем больше величина А, тем более заметна тенденция. С другой стороны, число эффективных пятен в образце, удовлетворяющем условию В/А>1, оказалось меньше, чем в эталонной РНК, и поэтому полагали, что в образце существует не детектируемая миРНК.
(Сравнение с данными по РНК, экстрагированной из замороженной ткани)
Кроме того, тому же эксперименту подвергали РНК, экстрагированную из замороженного образца той же ткани, и коэффициент корреляции рассчитывали для эффективных пятен мРНК, одновременно присутствующих у каждой РНК, полученной из FFPE-образца. Коэффициент корреляции для каждого образца представлен в таблице 8, и при соблюдении условия В/А≤1 могла быть подтверждена высокая корреляция с РНК, полученной из замороженной ткани. Кроме того, было показано, что в образце (С), в котором соблюдалось условие В/А≤1 и величина А оказалась не меньше чем 25%, имелась корреляция не меньше чем 0,9 со свежезамороженным образцом той же ткани, указывая на очень высокую корреляцию. Таким образом, было показано, что возможен или нет анализ, может быть определено, исходя из величины В/А.
| [Таблица 8] | |||||
| Образец | (А) | (В) | (С) | (D) | Замороженная ткань |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,95 | 1,97 | 1,94 | 2,02 | 2,01 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А (%) | 2 | 16 | 39 | 28 | 90 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) | 1 | 1 | 4 | 52 | 2 |
| В/А | 0,50 | 0,06 | 0,10 | 1,86 | 0,02 |
| А+В | 3 | 17 | 43 | 80 | 92 |
| Число эффективных пятен | 19877 | 17960 | 16121 | 11836 | 15782 |
| Число эффективных пятен, одновременно присутствующих у РНК, полученной из замороженной ткани | 14012 | 13749 | 13998 | 7298 | - |
| Коэффициент корреляции с РНК, полученной из замороженной ткани | 0,72 | 0,80 | 0,91 | 0,53 | - |
Пример 5
Из каждого образца FFPE мозга и печени мыши получали срезы толщиной 10 мкм и экстрагировали из них РНК тем же способом, как в примере 1. Для получения аРНК тем же способом, как в примере 2, осуществляли реакцию амплификации с 1 мкг РНК, а также РНК, экстрагированной из свежезамороженных тканей мозга и печени мыши. В таблице 9 показаны выход и степень очистки РНК; массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массовое соотношение (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, измеренные с помощью биоанализатора; и фактор амплификации. аРНК метили красителем Су3 (продукция фирмы GE Healthcare) и смешивали с буфером для гибридизации в «наборе для гибридизации для изучения экспрессии генов» (продукция фирмы Agilent Technologies) с последующей гибридизацией на «полногеномном олиго микрочипе мыши (4x44k)» (продукция фирмы Agilent Technologies) в течение 40 часов. После отмывки микрочипа изображение ДНК-микрочипа считывали с помощью «сканера для микрочипов Agilent» (продукция фирмы Agilent Technologies), и флуоресцентный сигнал от каждого пятна преобразовывали в цифровую форму с помощью «программного обеспечения Feature Extraction (v.9.5.3.1)». В результате, как представлено в таблице 9, было показано, что коэффициенты корреляции составляют для мозга до 0,88 и для печени до 0,85.
| [Таблица 9] | ||||
| Ткань | Мозг мыши | Печень мыши | ||
| FFPE | Замороженный | FFPE | Замороженная | |
| Толщина и количество использованных срезов | 10 мкм, 10 срезов | - | 10 мкм, 2 среза | - |
| Выход после экстракции (мкг) | 3,8 | - | 10,1 | - |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 1,98 | 2,08 | 1,99 | 2,07 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А(%) | 27 | 89 | 28 | 87 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В(%) | 16 | 2 | 19 | 3 |
| В/А | 0,59 | 0,02 | 0,68 | 0,03 |
| Фактор амплификации | 4,2 | 19,0 | 3,1 | 16,9 |
| Число детектированных генов | 9870 | 14985 | 9584 | 14391 |
| Коэффициент корреляции | 0,88 | 0,85 |
Пример 6
Используя РНК, полученные из FFPE-мозга и печени мышей, и РНК, полученные из замороженных тканей, экстрагированные в примере 5, для получения аРНК осуществляли реакцию амплификации с 5 мкг каждой РНК тем же способом, как в примере 1. На этом этапе вместо аминоаллильных групп встраивали биотиновые группы. Факторы амплификации представлены в таблице 10. Биотинилированную аРНК смешивали с предварительно определенным количеством контрольного олигонуклеотида, 20-кратных контролей гибридизации эукариотических клеток, 2-кратной смеси для гибридизации, DMSO и свободной от нуклеаз воды с последующей обработкой полученной смеси при 99°С в течение 5 минут и затем при 45°С в течение 5 минут. Кроме того, смесь центрифугировали при 16000×g в течение 5 минут и наносили на «чип для анализа генома мыши Affymetrix (зарегистрированное торговое наименование) 430 2.0» (продукция фирмы Affymetrix, Inc.) с последующим проведением реакции гибридизации в течение 16 часов. После отмывки и окрашивания чипа ранее определенными способами флуоресцентный сигнал от каждого пятна преобразовывали в цифровую форму с помощью «системы сканерирования GeneChip (зарегистрированное торговое наименование) 3000 7G» (продукция фирмы Affymetrix, Inc.). В результате, как показано в таблице 10, несмотря на тенденцию числа эффективных пятен в FFPE быть меньше по сравнению с замороженными тканями, коэффициенты корреляции между ними составляли для мозга 0,84 и для печени 0,82, так что могла быть подтверждена высокая корреляция.
| [Таблица 10] | ||||
| Ткань | Мозг мышей | Печень мышей | ||
| FFPE | Замороженный | FFPE | Замороженная | |
| Фактор амплификации | 4,1 | 17,3 | 3,0 | 15,5 |
| Число детектированных генов | 8248 | 12961 | 8060 | 12408 |
| Коэффициент корреляции | 0,84 | 0,82 |
Пример 7
(Экстракция РНК из фиксированных тканей)
Для фиксации мозг и печень извлекали из мышей (в возрасте 7 недель, самцов, Slc:ICR) и погружали в 10% фосфатно-забуференный раствор формалина (4% формальдегид) на 2 дня при комнатной температуре с последующей заливкой в парафин для получения FFPE-блоков. Из каждого FFPE-блока, используя микротом, собирали тонкие срезы толщиной 10 мкм, и РНК экстрагировали тем же способом, как в примере 1. В таблице 11 представлены результаты измерения выхода и степени очистки (соотношение между 260 нм и 280 нм), используя спектрофотометр (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование), продукция фирмы Thermo Scientific); результаты расчета массового соотношения (%)РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов, А, и массового соотношения (%) РНК в диапазоне больше чем 4000 нуклеотидов, В, этот расчет осуществляли с помощью биоанализатора; и величины В/А. Все образцы удовлетворяли условию В/А≤1.
(Амплификация РНК)
С 1 мкг каждой РНК, экстрагированной из мозга и печени мышей, амплификацию осуществляли тем же способом, как в примере 1, для получения аРНК, в которую встраивали аминоаллильные группы. Для расчета фактора амплификации с помощью спектрофотометра (“Nano Drop” (зарегистрированное торговое наименование), продукция фирмы Thermo Scientific) определяли выход, и результаты показаны в таблице 11. У всех образцов фактор амплификации находился в диапазоне от 2 до 20.
(Флуоресцентное мечение, фрагментация и анализ на микрочипе амплифицированной РНК)
Каждую амплифицированную аРНК подвергали флуоресцентному мечению и фрагментации тем же способом, как в примере 1, и анализ на микрочипе осуществляли по следующей процедуре. Раствор, содержащий 1000 нг каждой РНК, получали до конечного объема 16 мкл с помощью свободной от нуклеаз воды и к нему добавляли 2 мкл «буфера для гибридизации А» в буфере для гибридизации “3D-Gene” (зарегистрированное торговое наименование) (продукция фирмы Toray Industries, Inc.) с последующей обработкой полученной смеси нагреванием при 95°С в течение 5 минут. Смесь быстро охлаждали на колотом льду в течение 3 минут и к ней добавляли 232 мкл «буфера для гибридизации В» с последующим перемешиванием полученной смеси осторожным пипетированием, таким образом, получая 250 мкл раствора образца. Раствор образца дегазировали при пониженном давлении, и 210 мкл раствора наносили на «чип для анализа полногеномной ДНК мыши 3D-Gene (зарегистрированное торговое наименование)» (продукция фирмы Toray Industries, Inc.). Каналы по 4 позициям на покрытии запаивали, и чип помещали в камеру для гибридизации (TX711, продукция фирмы Takara Bio Inc.), закрепленную на верхней панели биошейкера (MMS-210, продукция фирмы Tokyo Rikakikai). Температуру в камере устанавливали на 37°С, и образец перемешивали поворотным вращением при 250 об/мин для проведения реакции в течение 16 часов.
(Измерение величин сигналов флуоресценции)
После проведения реакции покрытие чипа для анализа снимали, и субстрат отмывали и высушивали. Субстрат помещали в сканер («GenePix (зарегистрированное торговое наименование) 4000В, продукция фирмы Axon Instruments) для ДНК-чипов, и величину сигнала (интенсивность флуоресценции) каждой флуоресцентно меченой РНК, подвергнутой реакции гибридизации, и фоновый шум измеряли при следующих условиях: выходная мощность лазера 33%; и настройка напряжения фотоумножителя 500. Для измерения величины фоновой флуоресценции среди всех пятен 1750 пятен рассматривали в качестве пятен отрицательного контроля, и для расчета верной величины сигнала каждого пятна из каждого значения сигнала вычитали величину фонового сигнала. В случае положительной величины сигнала пятно полагали «эффективным пятном». Количества эффективных пятен показаны в таблице 11. Было показано, что разброс числа эффективных пятен в одной и той же ткани мал. На фиг.3 представлена диаграмма рассеивания, полученная на основе соотношений сигналов для соответствующих генов между мозгом и печенью (мозг/печень). Исходя из этого результата, было показано, что результаты, полученные двумя сериями экспериментов, коррелируют друг с другом в значительной степени.
| [Таблица 11] | ||||
| Ткань | FFPE-мозг мыши | FFPE-печень мыши | ||
| 1 | 2 | 12 | 2 | |
| Толщина и количество использованных срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 5 срезов | 10 мкм, 2 среза | 10 мкм, 2 среза |
| Выход после экстракции (мкг) | 2,0 | 2,2 | 7,4 | 8,0 |
| Степень очистки (OD260/OD280) | 2,05 | 2,06 | 1,99 | 2,01 |
| Соотношение 1000-4000 [нуклеотидов], А (%) |
31 | 29 | 40 | 39 |
| Соотношение больше чем 4000 [нуклеотидов], В (%) |
9 | 7 | 15 | 14 |
| В/А | 0,29 | 0,24 | 0,38 | 0,36 |
| Фактор амплификации | 7,2 | 6,4 | 4,8 | 4,9 |
| Число эффективных пятен | 12200 | 12350 | 12460 | 12300 |
ПРОМЫШЛЕННОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Используя способ по настоящему изобретению для анализа РНК, может быть получена точная информация относительно повышения/снижения экспрессии или наличия/отсутствия экспрессии генов в большом числе фиксированных тканей и клеток, таких как фиксированные в формалине залитые в парафин ткани, хранящиеся в больницах и научно-исследовательских институтах. Такая информация может найти широкое применение в разработке фармацевтических средств, техник генетического тестирования и генетической диагностики и подобного. Кроме того, за счет предварительной идентификации образцов, которые затруднительно проанализировать, и устранения этих образцов из процедуры анализа может быть снижена стоимость реагентов и подобное, так что настоящий способ можно с успехом использовать в промышленности.
1. Способ анализа пригодности РНК, экстрагированной из ткани или клетки (клеток), фиксированных с помощью фиксатора, для анализа экспрессии генов, причем указанный способ включает:
стадию подвергания указанной РНК электрофорезу и
стадию оценивания того, удовлетворяет ли указанная РНК следующему уравнению:
Уравнение: В/А ≤1,
где А представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне от 1000 до 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом, и В представляет массовое соотношение (%) РНК в диапазоне более чем 4000 нуклеотидов к общей массе РНК, что определено электрофорезом,
где, если указанная РНК, экстрагированная из ткани или клетки (клеток), удовлетворяет указанному уравнению, то она пригодна для анализа экспрессии генов.
2. Способ анализа РНК по п. 1, причем указанный способ дополнительно содержит стадию оценки того, составляет ли указанное соотношение А (%) не меньше чем 25%.
3. Способ анализа РНК по п. 1 или 2, в котором анализируют продукт амплификации, полученный амплификацией указанной оцененной РНК с фактором амплификации от 2 до 20.
4. Способ анализа РНК по п. 1 или 2, в котором указанную оцененную РНК анализируют без амплификации.
5. Способ анализа РНК по п. 4, в котором указанная РНК представляет собой миРНК.
6. Способ анализа РНК по п. 1 или 2, в котором указанный фиксатор содержит формальдегид и/или параформальдегид.
7. Способ анализа РНК по п. 1 или 2, в котором указанную ткань или клетку (клетки), фиксированные фиксатором, заливают в парафин или заливают в соединение ОСТ.
