Способ получения экзосом из крови



Способ получения экзосом из крови
Способ получения экзосом из крови
Способ получения экзосом из крови

 


Владельцы патента RU 2556825:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения экзосом из крови. Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию. Далее клеточную фракцию крови подвергают последовательной двухстадийной обработке сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Обрабатывают клетки равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS с последующим центрифугированием и сбором супернатанта. Плазму и полученные супернатанты из клеточной фракции объединяют, удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 15000-17000 g в течение 10-20 минут. Удаляют примесь частиц неэкзосомального происхождения путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут. Предложенное изобретение позволяет повысить выход и чистоту целевого продукта, а также сократить длительность и снизить трудоемкость способа. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области биохимии и диагностической медицины, а именно к способам получения экзосом из крови, являющихся источником опухолеспецифичных маркеров для ранней диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.

Экзосомы представляют собой микровезикулы размером 30-100 нм, активно секретируемые через каскад экзоцитоза, обычно используемый для разгрузки рецептора и внутриклеточных перекрестных сигналов. В дополнение к белкам главного комплекса гистосовместимости (МНС I, МНС II) и белкам, вовлеченным в представление антигена, экзосомы могут содержать мембранные и цитозольные белки, вовлеченные во множество клеточных функций. Экзосомы секретируются в определенных физиологических условиях из различных типов клеток, таких как дендритные клетки (DC), лимфоциты, тучные клетки и эпителиальные клетки.

В настоящее время ведутся исследования в области разработки тестов, основанных на использовании циркулирующих в крови экзосом, поскольку кровь непосредственно контактирует со всеми органами/тканями, и ряд процессов, в частности развитие опухолей, сопровождается изменением состава циркулирующих экзосом даже на самых ранних этапах развития этих процессов.

Ранее было показано, что экзосомы, выделенные из плазмы крови, могут быть удобным источником опухолеспецифичных мРНК (1), микроРНК (2) и белков (3).

Известен способ получения экзосом из сыворотки крови (4), включающий: сбор крови с последовательным центрифугированием для осаждения клеток, дебриса, а затем ультрацентрифугирование при 160000 g в течение 1 часа. Для определения концентрации микроРНК суммарную РНК выделяли из экзосом с помощью реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, СА) по протоколу производителя и проводили обратную транскрипцию (ОТ) с использованием набора TaqManH MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, СА). Количественную ПЦР проводили с использованием коммерческих специфических праймеров (TaqMan MicroRNA Assay, Applied Biosystems) и реакционной смеси (TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems) по протоколу, рекомендованному производителем (4).

Недостатками способа являются высокое содержание в целевом продукте частиц неэкзосомального происхождения (диаметром более 100 нм), ограниченное количество экзосом, выделенных из сыворотки крови, примесь балластных нуклеиновых кислот из разрушенных в процессе формирования тромба форменных элементов крови. Как следствие, полученные результаты о содержании микроРНК в составе экзосом являются недостоверными.

Известен способ получения экзосом из плазмы крови (5), заключающийся в следующем. Образцы плазмы фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,220 мкм для удаления клеточного дебриса и более крупных частиц и разделяли компоненты плазмы при помощи белковой жидкостной хроматографии. Фракции объединяли и концентрировали путем центрифугирования с помощью 3 кДа-отсекающих фильтров (Millipore). Затем сконцентрированный препарат наносили на сахарозный градиент (0.2-2.5 М в 20 мМ трис, pH 8.0) и ультрацентрифугировали (175000 g, 16 ч). Частицы, находящиеся в диапазоне концентрации сахарозы 1.08-1.15 г/мл, объединяли, отмывали раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, pH 7,5) и осаждали при помощи ультрацентрифугирования (175000 g, 2 ч). Ассоциированные с экзосомами белки разделяли при помощи 4-12% ПАА-SDS-диск электрофореза, гель разрезали на части, трипсинолиз и экстракцию пептидов из геля проводили по стандартной схеме (5). С помощью масс-спектрометрии в составе экзосом было идентифицировано 66 белков.

Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта (примесь микрочастиц диаметром 100-220 нм), трудоемкость и длительность выделения экзосом (более 23 ч), ограниченное количество экзосом, выделенных из плазмы крови. Как следствие, не все из идентифицированных белков входят в состав экзосом.

Известен способ получения экзосом из плазмы крови (6), заключающийся в следующем. Клетки и дебрис удаляли путем последовательного центрифугирования периферической крови, супернатант фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Экзосомы плазмы крови выделяли с помощью коммерческого набора ExoQuickтм Exosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA). Суммарную РНК из экзосом выделяли с помощью коммерческого набора Qiagen miRNeasy Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) по протоколу производителя и проводили ОТ по стандартной схеме (7). Количественную ПЦР проводили с использованием коммерческой реакционной смеси SYBR® Premix Ex Taqтм II, Perfect Real Time (TaKaRa, Dalian, China) по протоколу, рекомендованному производителем.

Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта (примесь микрочастиц диаметром 100-200 нм), длительность выделения экзосом (более 10 ч), высокая стоимость коммерческого набора для выделения экзосом, ограниченное количество экзосом, выделенных из плазмы крови. Как следствие, полученные результаты о содержании микроРНК в составе экзосом являются недостоверными.

Наиболее близким к заявленному способу - прототипом - является способ получения экзосом из крови (8), включающий следующие стадии: (1) получение сыворотки крови путем трех последовательных центрифугирований в течение 20 мин при 300 g, 3000 g и 10000 g; (2) получение фракции экзосом путем ультрацентрифугирования (100000 g, 2,5 ч) сыворотки, разведенной в буферном растворе PBS, через подушку из 40% сахарозы; (3) концентрирование экзосом путем ультрацентрифугирования (100000 g, 2,5 ч) после отмывания PBS-ом от сахарозы. Нуклеиновые кислоты из полученных препаратов экзосом выделяли при помощи коммерческого набора АllРrер DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) по протоколу, рекомендованному производителем. ОТ и количественную ПЦР проводили по протоколу, рекомендованному производителем (Applied Biosystems).

Недостатками способа являются длительность выделения экзосом (более 6 часов), ограниченное количество экзосом, выделенных из сыворотки крови, низкий выход экзосом, наличие примеси балластных нуклеиновых кислот из разрушенных в процессе формирования тромба форменных элементов крови. Как следствие, полученные результаты о содержании микроРНК в составе экзосом являются недостоверными.

Задачей изобретения является увеличение выхода экзосом, повышение чистоты целевого продукта и сокращение длительности способа.

Техническим результатом является повышение выхода и чистоты целевого продукта, а также сокращение длительности и снижение трудоемкости способа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Проводят сбор периферической крови в вакутейнер или другие пробирки для сбора и консервирования крови (например, Cell-Free DNA ВСТ, Streck, США). Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию крови подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 М NaCl, pH 7,5), содержащим 5 мМ ЭДТА (5 мин инкубация с последующим центрифугированием 20 минут при 300 g, сбор супернатанта №1); затем обработке клеток равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS (5 минут инкубация, добавление ингибитора трипсина, перемешивание с последующим центрифугированием 20 минут при 300 g, сбор супернатанта №2). Плазму и полученные супернатанты (1,2) из клеточной фракции, содержащие экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, объединяют и используют в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови. Для этого из объединенного образца удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 15000-20000 g в течение 10-20 минут, частицы неэкзосомального происхождения удаляют путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, экзосомы осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут.

В результате получают суммарный пул экзосом крови, который включает экзосомы плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, что позволяет повысить выход целевого продукта и в последующем повысить чувствительность диагностических систем путем увеличения количества диагностического материала (мРНК, микроРНК и белков) в анализе.

Для дальнейшего использования в диагностических тестах в препаратах экзосом выявляют белки либо выделяют мРНК или микроРНК любым пригодным методом выделения нуклеиновых кислот, а именно: методом, основанном на экстракции фенол-хлороформом (9); гуанидин-фенольным методом (10); методом выделения нуклеиновых кислот при помощи мелкодисперсного стекла или стекловолокнистых фильтров в присутствии хаотропных солей (11).

Количественный анализ мРНК или микроРНК крови также проводят любым известным методом исследования нуклеиновых кислот, как то: количественная ПЦР и ОТ-ПЦР, метод измерения концентрации нуклеиновых кислот при помощи флуоресцентных красителей (RiboGreen, SYBR Green II и т.д.). Для определения белков используют как исходный препарат экзосом, так и препараты экзосом, обработанные детергентами. Измерения белков выполняют при помощи иммунохимических методов, методов масс-спектрометрического анализа или цитофлуорометрии.

Определяющим отличием предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что после разделения исходного образца крови на плазму и клеточную фракцию последнюю подвергают последовательной обработке буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, затем обрабатывают клетки 0,15-0,35% раствором трипсина, клетки осаждают центрифугированием, а супернатанты используют в качестве дополнительного источника экзосом. Проведение последовательной двухстадийной элюции экзосом, неспецифически связанных с поверхностью клеток крови (нековалентными взаимодействиями), так и находящихся в комплексах с белками клеточной поверхности, позволяет количественно выделять экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов крови и повысить выход суммарного пула экзосом.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

- обеспечивает получение дополнительного количества экзосом из того же объема крови;

- позволяет увеличить количество экзосом как минимум вдвое по сравнению с выделением экзосом исключительно из плазмы крови;

- позволяет почти в 3 раза снизить требуемый для измерения маркерных молекул объем донорской крови, что уменьшает трудозатраты, связанные с забором крови, уменьшает неудобства, доставляемые пациенту;

- уменьшить длительность способа с 6 до 4 часов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

В группе здоровых доноров (n=10) было проведено выделение экзосом способом-прототипом и предлагаемым способом. У всех здоровых доноров-добровольцев было взято по 8 мл периферической крови.

Собранную кровь разделили на плазму и клеточную фракцию крови путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. Клеточную фракцию, содержащую экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов крови, последовательно обрабатывали буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, с последующим инкубированием в течение 5 минут. Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и собирали супернатант №1. Затем клетки обрабатывали равным объемом 0,15% раствора трипсина в PBS, добавляли ингибитор трипсина, перемешивали, клетки осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и собирали супернатант №2. Плазму, супернатант №1 и супернатант №2 объединяли и использовали в качестве исходного материала для получения суммарного пула экзосом крови. Для этого из объединенного образца удаляли клеточный дебрис и частицы неэкзосомального происхождения центрифугированием при 20000 g в течение 10 минут с последующей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а экзосомы осаждали ультрацентрифугированием при 160000 g в течение 60 минут.

Для оценки количества выделенных экзосом с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа была измерена концентрация белка с использованием коммерческого набора NanoOrange Quantification Kit (Invitrogen, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Результаты исследования представлены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход экзосом в среднем в 3 раза.

Размер частиц в препаратах оценивали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Для этого экзосомы фиксировали добавлением глутарового альдегида до 2,5%, сорбировали на медную сетку, покрытую формварной пленкой, в течение 30 с и контрастировали 0,5 М уранилацетатом в течение 20 с, сетки изучали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM 1400 (Jeol, Япония), снимки делали с помощью цифровой камеры Veleta. Показано, что в препаратах экзосом, полученных по способу-прототипу, 10±4% частиц имеют диаметр более 0,1 мкм, а значит не являются экзосомами. В препаратах экзосом, полученных предлагаемым способом, доля микрочастиц диаметром более 0,1 мкм составляет 0,3±0,05%. На фиг. 1 изображена электронная микрофотография экзосом крови, полученных способом прототипом (А, Б) и предлагаемым способом (В). Длина масштабной линии соответствует 200 нм, стрелками выделены экзосомы, овалами - микрочастицы неэкзосомального происхождения и клеточный дебрис. Из фиг. 1 видно, что использование предлагаемого способа позволяет получать препараты экзосом, свободные от клеточного дебриса и частиц неэкзосомального происхождения (размером более 0,1 мкм).

Таким образом, из примера 1 видно, что предлагаемый способ позволяет получать препараты экзосом без примеси крупных микрочастиц (диаметром более 0,1 мкм) и в 3 раза увеличить количество экзосом, выделяемых из крови по сравнению с экзосомами, выделенными из плазмы/сыворотки крови (прототип).

Пример 2.

В группе здоровых женщин (n=19) и больных раком молочной железы (n=20) на I-II стадиях заболевания была собрана кровь и выделены экзосомы из крови заявляемым способом и из плазмы. В препаратах выделенных экзосом было проведено сравнительное исследование содержания 28S рРНК, концентрация которой является отражением содержания экзосом в препарате.

У всех пациентов была взята кровь во время первичного установления диагноза. Собранную кровь здоровых доноров и онкологических больных разделили на плазму и клеточную фракцию крови при помощи центрифугирования в течение 10 мин при 300 g. Экзосомы крови получали аналогично примеру 1, за исключением того, что клеточную фракцию крови обрабатывали 0,35% раствором трипсина, а из объединенного образца удаляли клеточный дебрис и частицы неэкзосомального происхождения центрифугированием при 15000 g в течение 20 минут с последующей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а экзосомы осаждали ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 90 минут.

Для выделения экзосом плазмы, из плазмы удаляли клеточный дебрис и частицы неэкзосомального происхождения центрифугированием при 17000 g в течение 20 мин с последующей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а экзосомы осаждали ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 90 мин.

Выделение РНК из экзосом плазмы и из экзосом крови проводили с помощью набора для выделения РНК («Биосилика», Россия) по протоколу, рекомендованному производителем. Образцы выделенной РНК инкубировали с 2 единицами активности ДНКазы, не содержащей РНКаз (Fermentas, EN0531), в течение 1 ч при 37°С. Реакцию ОТ проводили с использованием набора для обратной транскрипции (Биосан, Россия) по протоколу производителя.

Для оценки концентрации 28S рРНК проводили ПЦР в режиме реального времени с использованием следующих праймеров и флуоресцентной пробы:

Прямой праймер: 5′-AAGCGGGTGGTAAACTCCAT-3′

Обратный праймер: 5′-TTCACGCCCTCTTGAACTCT-3′

Проба: 5′-TAMRA-TACCGGCACGAGACCGATAGTCAA-BHQ-3′

Амплификацию проводили в реакционной смеси объемом 30 мкл, содержащей буфер для Taq-полимеразы (65 мМ трис-HCl pH 8,8, 16 мМ (NH4)2SO4, 0,05% Tween-20), 0,3mM dNTP, 8MM MgCl2, 1 e.a. Taq-полимеразы, пo 0,6 мкМ праймеров, пробы до конечной концентрации 0,3 мкМ, 5 мкл раствора ДНК-матрицы. Измерение образцов проводили в дублях. В качестве негативного контроля использовали воду. Для построения калибровочной кривой использовали ПЦР-продукт длиной 114 п.н. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе с оптическим модулем iCycler5 (Bio-Rad, США) согласно протоколу: 95°C - 3 мин; затем 40 циклов: 95°C - 15 с, 60°C - 45 с. Данные анализировали при помощи программного обеспечения iQ5 (Bio-Rad, США).

Результаты анализа по концентрации копий 28S рРНК в составе экзосом плазмы и экзосом крови у здоровых женщин и больных раком молочной железы представлены на фиг. 2. На фиг. 2 видно, что средняя концентрация 28S рРНК у здоровых женщин составила в плазме 45·105 копий/мл и в крови 305·105 копий/мл, у больных раком молочной железы - 125·105 копий/мл и 325·105 копий/мл крови соответственно. Данный пример показывает, что использование предлагаемого способа получения экзосом позволяет не менее чем в 3 раза повысить эффективность выделения экзосом из образца крови как здоровых доноров, так и онкологических больных. Увеличение количества выделенных экзосом позволит в дальнейшем повысить эффективность выявления опухолевых маркеров в составе экзосом крови.

Пример 3.

У больного Р., 1935 г.р., поступившего в онкологический диспансер с подозрением на рак предстательной железы, была определена концентрация опухолевых микроРНК (miR-200a и miR-141) в составе экзосом плазмы, полученных аналогично примеру 2 и экзосом крови, полученных аналогично примеру 1, за исключением того, что клеточную фракцию крови обрабатывали 0,25% раствором трипсина.

МикроРНК из экзосом плазмы и экзосом крови были выделены при помощи набора MirVana (США) по протоколу, рекомендованному производителем. ОТ проводили с использованием набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (США) по протоколу, рекомендованному производителем. Концентрация микроРНК (определенная методом 2-дельта-Ct, нормированная на U6) в составе экзосом была определена при помощи количественного ПЦР с использованием специфических праймеров TaqMan MicroRNA assay (США) и TaqMan Universal PCR Master Mix (США). Измерение образцов проводили в дублях. В качестве негативного контроля использовали воду. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе с оптическим модулем iCycler5 (Bio-Rad, США), данные анализировали при помощи программного обеспечения iQ5 (Bio-Rad, США). Было обнаружено, что miR-200a в составе экзосом плазмы не детектируется, концентрация miR-141 составила 2 условные единицы. Концентрация микроРНК в составе экзосом крови составила 4 и 8 условных единиц для miR-200a и miR-141 соответственно. Данный пример иллюстрирует повышение вероятности выявления онкологического заболевания с использованием известных опухолевых маркеров за счет использования предложенного способа выделения экзосом крови.

Использование предлагаемого способа позволит повысить выход экзосом из исходного объема крови как минимум в 2 раза, с одновременным снижением трудозатрат и длительности получения экзосом, а также обеспечить возможность уменьшения объема крови для получения того же количества экзосом или повышения количества анализируемых маркеров из одного и того же объема крови.

Источники информации

1. Pant S., Hilton H., Burczynski M.E. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities // Biochemical pharmacology. 2012. V. 83. P. 1484-1494.

2. Salido-Guadarrama I., Romero-Cordoba S., Peralta-Zaragoza O., Hidalgo-Miranda A., Rodriguez-Dorantes M. MicroRNAs transported by exosomes in body fluids as mediators of intercellular communication in cancer // Onco Targets Ther. 2014. V. 7. P. 1327-1338.

3. Choi D.-S., Kim D.-K., Kim Y.-K., Gho Y.S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes // Proteomics. 2013. V. 13. P. 1554-1571.

4. Gallo A., Tandon M., Alevizos I., Illei G.G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes // PLoS ONE. 2012. V. 7. P. e30679.

5. Looze C, Yui D., Leung L., Ingham M., Kaler M., Yao X., Wu W.W., Shen R.-F., Daniels M.P., Levine S.J. Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPAR as an exosome-associated protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 378. P. 433-438.

6. Ge Q., Zhou Y., Lu J., Bai Y., Xie X., Lu Z. miRNA in plasma exosome is stable under different storage conditions // Molecules. 2014. V. 19. P. 1568-1575.

7. Mestdagh P., Feys Т., Bernard N., Guenther S., Chen C, Speleman F., Vandesompele J. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. el43.

8. Rupp A.-K., Rupp C, Keller S., Brase J.C., Ehehalt R., Fogel M., Moldenhauer G., Marmé F., Sültmann H., Altevogt P. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage // Gynecologic Oncology. 2011. V. 122. P. 437-446.

9. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995. P. 4-4-4-5.

10. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V.10. P. 221-224.

11. Boom R., Sol C.J.A. Rapid and simple method for purification nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.

1. Способ получения экзосом из крови, включающий разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрацентрифугирования, отличающийся тем, что кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию, затем клетки крови последовательно, в две стадии, обрабатывают сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, затем равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS, далее плазму и полученные супернатанты объединяют, удаляют клеточный дебрис и примеси неэкзосомального происхождения путем центрифугирования при 15000-20000 g в течение 10-20 минут и фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА осуществляют в течение 5 минут с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку 0,15-0,35% раствором трипсина в PBS осуществляют в течение 5 минут с последующим добавлением ингибитора фермента, перемешиванием, осаждением клеток крови центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано в производстве химерных антител к фактору некроза опухоли человека.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток или выделенных фрагментов ткани, содержащих указанные эпителиальные стволовые клетки, включающий обеспечение внеклеточного матрикса, инкубирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани, содержащего указанные эпителиальные стволовые клетки, с внеклеточным матриксом, культивирование эпителиальной стволовой клетки или выделенного фрагмента ткани в присутствии клеточной культуральной среды, содержащей базальную среду для клеток животного или человека, в которую добавлены ингибитор морфогенетического белка кости (BMP) и 5- 500 нг/мл митогенного фактора роста, а также клеточная культуральная среда, ее применение, способ культивирования трехмерного органоида, способ его получения, трехмерный органоид и его применение.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыт способ выращивания эмбриональных стволовых клеток человека.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток фиброзированных легких в фибробластные клетки, характеризующийся тем, что из правой доли фиброзированных легких выделяют клетки с фенотипом мезенхимальных стволовых клеток (CD44+, CD73+, CD90+, CD106+, CD31-, CD34-, CD45-), способные самообновляться in vitro в течение 60 дней, затем при добавлении в культуру мезенхимальных стволовых клеток фактора роста фибробластов 2 мкг/мл получают фибробластные клетки.
Изобретение относится к области биотехнологии. ВНК-21/13-13 - перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка задепонированна в Российской коллекции клеточных культур (РКК) в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.

Настоящее изобретение касается способа получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности и маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована в лабораторной диагностике как тест-система и способ определения антивирусной активности интерферона альфа (ИФН-α) в сыворотке крови человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для лечения инфекционного перитонита в эксперименте. Для этого крысам внутривенно вводят суспензию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток из расчета 1,5×106 на 100 г массы животного в 2 мл физиологического раствора.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выращиванию колоний клеток. Система культивирования плюрипотентных стволовых клеток состоит из соединенных между собой системы управления и блока культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Раскрыт способ промотирования регенеративных процессов в культуре ткани или культуре клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описано применение специфических молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, для транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты. Указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекулы, можно применять для лечения, профилактики, ослабления и/или уменьшения интенсивности заболевания и/или нарушения, в котором принимают участие лейкоциты. Описаны также способ получения указанных молекул-конъюгатов, которые являются транспортерами карго-молекул, способ транспортировки представляющей интерес субстанции в лейкоциты и лейкоциты, содержащие указанные молекулы-конъюгаты, которые являются транспортерами карго-молекул. Изобретение может быть использовано в медицине. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, 34 ил., 5 табл., 29 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка. Питательная среда содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль с активностью 0,09×105-1,1×105, канамицина сульфат с активностью 0,09×105-1,1×105, нистатин с активностью от 6×104 до 6,5×104 ЕД/л, холина хлорид, янтарную кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить качество получаемого продукта. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лечения нарушения кровотока в мозге. Для этого указанному индивидууму вводят эффективное количество изолированной популяции клеток, включающей человеческие адгезивные плацентарные клетки, которые представляют собой CD10+, CD34-, CD105+ и CD200+, где по меньшей мере 70% указанных плацентарных клеток в указанной популяции клеток являются нематеринскими по происхождению. Использование данного способа демонстрирует безопасность и эффективность внутривенного введения изолированных плацентарных клеток с фенотипом CD10+, CD34-, CD105+ и CD200+ для лечения симптомов, ассоциированных с нарушениями мозгового кровотока в мозге. 44 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано при лечении полнослойных локальных остеохондральных дефектов суставов. Для этого проводят артроскопию крупного сустава, определяют локализацию и размер остеохондрального или хондрального дефекта, удаляют свободный фрагмент и выполняют абразивную хондропластику и микрофрактуринг. Для восстановления дефектов гиалинового хряща в зону дефекта хрящевой ткани вводят смесь клеток стромальной сосудистой фракции (ССФ) одновременно с фибриновым клеем с использованием системы дуплоджект. После проведения артротомии пораженный сустав выдерживают 5 минут, после чего выполняют 8-10 циклов пассивных сгибательно-разгибательных движений. В менее крупные суставы - голеностопный или локтевой - вводят клетки ССФ под контролем электронно-оптического преобразователя без вскрытия сустава под анестезией. Изобретение позволяет проводить восстановление дефектов гиалинового хряща суставных поверхностей смесью клеток стромальной сосудистой фракции в сжатые сроки и без нанесения дополнительной травмы. 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено трансгенное животное, представляющее собой мышь или крысу, в геном которого встроена нуклеиновая кислота, кодирующая перестроенную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина человека, функционально связанную с константной областью иммуноглобулина указанного животного и функционально связанную с промотором, обеспечивающим экспрессию трансгенной легкой цепи в В-клетках млекопитающего, таким образом, что она образует пары с различными эндогенными тяжелыми цепями, обеспечивая получение антител. Также рассмотрены способы получения антител с использованием трансгенного животного, В-клетка трансгенного животного, применение животного и его В-клетки для получения антител и способ получения трансгенного животного по изобретению. Данное изобретение позволяет продуцировать антитела, содержащие легкую цепь с вариабельной областью иммуноглобулина человека в паре с различными тяжелыми цепями иммуноглобулинов животного. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 27 ил., 11 табл., 22 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) в присутствии антигенпредставляющих клеток (АПК), несущих HLA-A*2402, и представляющий собой фрагмент белка FOXM1. Также рассмотрены: выделенный полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению; композиция для индуцирования ЦТЛ и фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего FOXM1, и/или предупреждения его послеоперационных рецидивов, содержащие в качестве активного начала пептид по изобретению; способы индуцирования АПК и ЦТЛ; выделенная АПК со способностью индуцировать ЦТЛ; а также способ индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего FOXM1, у субъекта. Данное изобретение обеспечивает индуцирование иммунного ответа против клеток, экспрессирующих FOXM1, что может найти дальнейшее применение в терапии различных заболеваний, в том числе злокачественных, связанных с повышенной экспрессией белка FOXM1. 8 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ введения целевых молекул в клетки. Способ включает закрепление на культуральной подложке в питательной среде массива рабочих клеток, а также введение целевых молекул в массив рабочих клеток путем прокола клеточной мембраны. Целевые молекулы попадают в рабочие клетки через поры, созданные в клеточных мембранах с помощью массива игл. Изобретение обеспечивает повышение производительности способа. 19 з.п. ф-лы, 2 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен In vitro способ получения нейральных стволовых клеток (НСК), включающий получение соматических клеток, выбранных из группы фибробластов, кератиноцитов или адипоцитов, и репрограммирование указанных соматических клеток в НСК с помощью введения в указанные соматические клетки по меньшей мере двух генов, Bmi1 и Sox2; и культивирования указанных соматических клеток в питательной среде, содержащей ростовые факторы, выбранные из группы FGF2, EGF и BDNF и малой молекулы ингибитора ROCK. Также предложены применение нейральных стволовых клеток в качестве модели заболеваний ЦНС in vitro, терапевтическая композиция и биобанк для применения в регенеративной медицине. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 16 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к изолированной амниотической адгезивной клетке человека, к популяции и композиции, которые содержат такие клетки, а также к способам получения таких клеток и способам использования этих клеток в лечении индивидуумов. Указанная клетка адгезивна к пластику для тканевых культур. Указанная клетка является ОСТ-4- (октамерсвязывающий белок 4) по данным ОТ-ПЦР. Указанная клетка представляет собой CD49f+, CD90+ и HLA-G- по данным проточной цитометрии. Указанная клетка является ангиогенной. Предложенное изобретение позволяет получить новую ангиогенную изолированную амниотическую адгезивную клетку человека. 11 н. и 20 з.п. ф-лы, 18 ил., 8 табл., 6 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, представляющий собой фрагмент белка CDC45L и обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты в форме комплекса с молекулой HLA-A*2402 или HLA-A*0201. Также рассмотрены полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению; композиция для индуцирования цитотоксического лимфоцита (CD8-положительной Т-клетки, ЦТЛ) в присутствии антигенпредставляющей клетки (АПК); фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики CDC45L-экспрессирующих раков и/или предупреждения их послеоперационных рецидивов; способы индуцирования АПК и ЦТЛ; выделенная АПК, которая представляет на своей поверхности комплекс HLA-антигена и пептида по изобретению; способ индуцирования иммунного ответа против CDC45L-экспрессирующего рака у субъекта; вектор для экспрессирования пептида по изобретению и трансформированная или трансфицированная им клетка-хозяин; а также применение пептида по изобретению и АПК в изготовлении фармацевтической композиции для лечения или предупреждения CDC45L-экспрессирующего рака. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии онкологических заболеваний. 14 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл.
Наверх