Мутантная растительная формиатдегидрогеназа (варианты)

Изобретение относится к области генной инженерии и представляет собой две новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ), обладающие повышенной термостабильностью по сравнению с исходным белком. В мутантных белках природный остаток аланина в положении, соответствующем положению 267 в исходной последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток метионина. Кроме того, в одном из мутантов доподнительно природный остаток изолейцина в положении 272 заменен на остаток валина. Изобретение позволяет получить формиатдегидрогеназы с повышенной температурной стабильностью. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в процессах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

Получены две новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ), обладающие повышенной термостабильностью по сравнению с исходным ферментом. Во всех из предложенных мутантных белков природный остаток аланина в положении, соответствующем положению 267 в последовательности исходной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток метионина. Кроме того, в одном из мутантов природный остаток изолейцина в положении 272 заменен на остаток валина. Данные замены могут быть использованы в комбинации с другими мутациями, обеспечивающими приобретение формиатдегидрогеназами новых или улучшенных свойств.

Данное изобретение относится к новому белку, в частности к мутантным формиатдегидрогеназам из растений, которые обладают повышенной термостабильностью по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа, к ДНК, кодирующей мутантные формы формиатдегидрогеназы, к применению данных ферментов в системах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, для детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

НАД⁺-зависимая формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до углекислого газа при сопряженном восстановлении NАД⁺ до НАДН.

ФДГ обладает высокой специфичностью к формиату, поэтому этот фермент успешно применяют для определения формиата в сложных смесях.

Реакция окисления формиат-иона является необратимой, продуктом является углекислый газ, который можно легко вывести из сферы реакции. Также ФДГ обладает широким рН-оптимумом активности. Поэтому формиатдегидрогеназа может быть эффективно использована для регенерации NADH в процессах синтеза оптически активных соединений с использованием дегидрогеназ. В качестве примера можно привести крупномасштабный процесс получения терт-L-лейцина из триметилпирувата с использованием лейциндегидрогеназы с системой регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida boidinii (Bommarius A.S., Schwarm M., Stingi K., Kottenhahn M., Huthmacher K. and Drauz K., Synthesis and Use of Enantiomerically Pure tert-Leucine, Tetrahedron Asymmetry, 1995, v.6, p.2851-2888). Также применяют способ, в котором процесс синтеза и регенерацию осуществляют непосредственно в бактериальной клетке. В одной из первых работ ген ФДГ из бактерий Mycobacterium vaccae N10 был экспрессирован в клетках E.coli совместно с одним из ферментов - или лейциндегидро-геназой, или аланиндегидрогеназой, или фенилаланиндегидрогеназой. Такие клетки E.coli были использованы для синтеза L-лейцина, L-валина, L-норлейцина, L-метионина, L-фенилаланина и L-тирозина с выходом более 80% и оптической чистотой до 100% (Galkin,A., Kulakova, L., Yoshimura, T., Soda, K., & Esaki, N. Synthesis of optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coli cells expressing heterologous genes. Appl. Environ. Microbiol., 1997, v.63, p.4651-4656). Недавно ген ФДГ из дрожжей Candida boidini был экспрессирован в E.coli совместно с кеторедуктазой и такой биокатализатор был использован в процессах синтеза ксилитола из ксилозы и 5-1-(2-хлорфенил) этанола из о-хлорацетофенона (Madje K., Schmolzer K., Nidetzky В., Kratzer R. Host cell and expression engineering for development of an E.coli ketoreductase catalyst: Enhancement of formate dehydrogenase activity for regeneration of NADH. Microb. Cell Fact. 2012 v.11, p.11-17). Одним из распространенных приемов для работы с ферментами является их иммобилизация на твердых носителях. Авторами (Demir A.S., Talpur F.N., Betui Sopaci S., Kohring G.W., Celik A. Selective oxidation and reduction reactions with cofactor regeneration mediated by galactitol-, lactate-, and formate dehydrogenases immobilized on magnetic nanoparticles. J Biotechnol., 2011, v.10, p.176-183.) была проведена иммобилизация формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida methylica, а также других ферментов на наночастицы с проведением синтеза 5-1,2-пропандиола высокой степени оптической чистоты.

Формиатдегидрогеназа найдена в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. Впервые формиатдегидрогеназная активность в растениях была обнаружена в 1921 г. (Thunberg Т. Sur la presence de certains ferments oxydants dans les grains de Phaseolus vulgaris. Arch.int.PhysioL, 1921, v.l8, pp.601-606). В растениях ФДГ - это фермент стресса, синтез которого резко возрастает при таких стрессовых воздействиях, как засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температуры, нехватка кислорода и т.п. (Hourton-Cabassa С., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small C.C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.627-635; Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.725-732; Thompson P., Bowsher C.G., and Tobin A. K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099; Andreadeli A., Flemetakis E., Axarii I., Dimou M., Udvardi M.K., Katinakis P., and Labrou N.E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim.Biophys.Acta, 2009, v.1794, pp.976-984; David P., des Francs-Small C.C., Sevignac M., Thareau V., Macadre C., Langin Т., and Geffroy V. Three highly similar formate dehydrogenase genes located in the vicinity of the B4 resistance gene cluster are differentially expressed under biotic and abiotic stresses in Phaseolus vulgaris. Theor. Appl Genet., 2010, v.121, pp.87-103). Подробный обзор по физиологической роли, получению и свойствам ФДГ из растений был опубликован в 2011 году (Алексеева А.А., Савин C.C., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую формиатдегидрогеназу, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например, бактерий E.coli. Полученный рекомбинантный штамм используют для экспрессии желаемого ферментного продукта.

Для растительных формиатдегидрогеназ характерны низкие значения констант Михаэлиса по сравнению с ферментами из других источников. Одной из наиболее перспективных для практического применения формиатдегидрогеназ из растений является формиатдегидрогеназа из сои Glycine max (SoyFDH). Этот фермент был получен в активной и растворимой форме (Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Ясный И.Е., Воинова Н.С., Алексеева А.А., Петров А.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои: экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. Вестн.Моск.Ун-та.Сер.2.Химия, 2006, т.47, N1, с.31-34) и он имеет самые низкие значения констант Михаэлиса по сравнению со всеми изученными формиатегидрогеназами на настоящий момент (Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56). Характерной особенностью растительных формиатдегидрогеназ является наличие нескольких изоферментов, которые кодируются отдельными генами. В случае формиатдеигдрогеназы сои в литературе описано 6 изоферментов (Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56). В нашем распоряжении имеется еще один ген изофермента сои. Аминокислотная последовательность этого изофермента представлена в данной заявке в виде последовательности Seq_ID №1.

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных формиатдегидрогеназ из растений дикого типа является невысокая температурная стабильность этих ферментов. Таким образом, для успешного применения формиатдегидрогеназы из сои на практике необходимо повысить стабильность этого фермента. Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.

Для бактериальных и дрожжевых ферментов в литературе описано много примеров успешного улучшения свойств методами белковой инженерии. Для повышения термостабильности формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseFDH) были использованы подходы, основанные на гидрофобизации α-спиралей (замены остатков Ser в α-спиралях на Ala) (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188), увеличении гидрофобности белковой глобулы (замены остатков Ala на Val в области контактов α-спиралей) (Fedorchuk V.V., Galkin A.G., Yasny I.E., Kulakova L.B., Rojkova A.M., Filippova A.A., and Tishkov V.I. Influence of interactions between amino acid residues 43 and 61 on thermal stability of bacterial formate dehydrogenases. Biochemistry (Mosc.), 2002, v.67, pp.1145-1151) и снятия конформационных напряжений в полипептидной цепи (замены объемных Asn и Tyr на Gly) (Serov A.E. and Tishkov V.I. Role of Pro residues in stability of prokaryotic and euacaryotic formate dehydrogenases. Вестн.Моск.Ун-та. сер.2. Химия, 2002, v.43, pp.345-349; Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., and Tishkov V.I. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2005, v.70, pp.804-808). Поиск положений для мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа и сравнении аминокислотных последовательностей ФДГ из разных источников. В результате единичной замены эффект стабилизации был небольшим - от 10 до 50%, но практически во всех случаях - аддитивным (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, p.183-188; Serov A.E., Odintzeva E.R., Uporov I.V., and Tishkov V.I. Use of Ramachandran plot for increasing thermal stability of bacterial formate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc.), 2005, v.70, pp.804-808).

Мутации, повышающие операционную и температурную стабильность, были объединены в мутанте PseFDH GAV. В результате такого объединения сродство к NAD⁺ увеличилось в 2 раза, а температурная стабильность - в 2,5 раза, а операционная - более, чем в 1000 раз по сравнению с PseFDH дикого типа. Получение мутантных PseFDH с улучшенной термостабильностью позволило ввести в процесс очистки рекомбинантного фермента стадию термообработки. Нагревание бесклеточного экстракта при 60°С в течение 20-30 мин приводит к повышению чистоты препарата PseFDH GAV с 50 до 80-85% без потери ферментативной активности (Tishkov V.I. and Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng, 2006, v.23, pp.89-110).

Также в литературе имеются данные по увеличению стабильности ФДГ из дрожжей С.boidini. В работе (Slusarczyk Н., Felber S., Kula M.R., and Pohl M. Novel mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii. US Patent Application Publication, 2003, US 2003/0157664) получен химически более стабильный мутант CboFDH SM с заменой Cys23Ser, который был гораздо устойчивее фермента дикого типа в растворах 150 мМ Н₂О₂ и 50 мкМ CuSO₄, однако его термостабильность уменьшилась в 6,7 раз (уменьшение T_m на 5°С). Для компенсации потери стабильности использовали метод направленной эволюции. Были найдены 4 мутации, дающий наибольший эффект стабилизации (Glu151Asp, Arg178Ser, Lys306Arg, Thr315Asn), которые повысили термостабильность мутанта CboFDH_SM в 36 раз (увеличение T_m на 10°С), а по сравнению с ферментом дикого типа - в 5,7 раз.

В случае рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои (SoyFDH) описаны мутанты с точечными заменами остатка Phe290 на остатки Asp, Asn и Ser (Alekseeva A.A. et al. Protein Eng. Des. Sel., 2012, v.25, N11, p.781-788), у которых константа скорости инактивации при 56°С была снижена от 2,5 (замена Ala267Met) до 42 раз (замена Phe290Asp) по сравнению с таковой для фермента дикого типа. В то же время исходная рекомбинантная ФДГ сои имеет такую же химическую стабильность при инкубации с пероксидом водорода, что и мутантная ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 с заменой двух остатков цистеина Cys145Ser и Cys255Ala (Савин С.С., Тишков В.И. Инактивация пероксидом водорода как метод оценки стрессовой стабильности формиатдегидрогеназы in vivo. Acta Naturae, 2010, т.2, №1(4), с.80-84. Однако полученные мутантные SoyFDH уступают по стабильности ФДГ из бактерий и дрожжей.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении мутантной формы формиатдегидрогеназы из сои Glycine max с повышенной температурной стабильностью по сравнению со стабильностью фермента дикого типа.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в повышении температурной стабильности полученной мутантной формы формиатдегидрогеназы из сои Glycine max по отношению к термостабильности фермента дикого типа.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать рекомбинантную растительную формиатдегидрогеназу, в которой в качестве основы использована аминокислотная последовательность формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, указанная в Seq_ID №1. Отличительной особенностью данной последовательности является наличие в ней 1 положении на N-конце остатка Ala, в то время как в активном ферменте дикого типа в этом положении находится остаток Ser. Данная замена позволяет повысить скорость биосинтеза и стабильность рекомбинантной формиатдегидрогеназы при экспрессии в клетках E.coli.

В дальнейшем получение и преимущества полученной мутантных растительных формиатдегидрогеназ будут рассмотрены с использованием примеров получения и реализации этого фермента.

Пример 1

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Ala267 заменен на остаток Met.

Направленный мутагенез проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pSoyFDH. Плазмида pSoyFDH получена из коммерчески доступной плазмиды рЕТ21а (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI встроена кДНК исходной формиатдегидрогеназы сои Glycine max.

Для введения мутации Ala267Met в ген растительной формиатдегидрогеназы с использованием ПЦР применяли универсальные праймеры Т7 for и Т7 rev:

T7For 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′

T7rev 5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′,

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене soyfdh остаток Met в положении 267:

SoyA267Mfor 5′-GAGGGGCAATTATGGACACCCAAGCAATTGCA-3′

SoyA267Mrev 5′-TTGGGTGTCCATAATTGCCCCTCGAGCATTGTT-3′.

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Ala267Met.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл («SSI», США). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°С и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°С, 60 с; 2-стадия - 56°С, 60 с и 3-я стадия - 72°С, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°С. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5° ниже T_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица I):

Таблица 1
Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Количество	Компонент
2,5 мкл	10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва)
2 мкл	смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМ
1 мкл	ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мкл
2 мкл	праймер 1, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол, Россия)
2 мкл	праймер 2, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол, Россия)
0,5 мкл	PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Fermentas, Литва)
до 25 мкл	деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) T7For + SoyA267Mrev и 2) SoyA267Mfor + T7Rev. В качестве матрицы использовали плазмиду pSoyFDH. Полученные продукты ПНР, фрагмент 1 и фрагмент 2 очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с применением предназначенных для этого наборов, например, GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Затем проводили третью, объединяющую ПЦР с праймерами T7For и T7Rev, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.

Продукт третьей ПЦР очищали аналогично фрагментам 1 и 2 и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Kpnl и EcoRI в течение двух часов при 37°С, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктаз в течение 20 минут при 65°С (использовали рестриктазы и буферные растворы фирмы Fermentas (Литва)). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием специального набора, например GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва), и легировали с фрагментом исходной плазмиды pSoyFDH, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции KpnI и EcoRI был удален фрагмент гена soyfdh из G. max дикого типа.

Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки Е. coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB) F′[traD36 proAB⁺ lac^q lacZΔM15]) и выращивали в течение ночи при 37°С на твердой агаризованной среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл (плазмида pSoyFDH содержит ген устойчивости к ампициллину).

Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, и растили при 37°С в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например, GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмидной ДНК в Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН). В результате из 5 выделенных плазмид все 5 содержали только требуемую замену Ala267Met. Таким образом, была получена плазмида pSoyFDH_A267M, которая обеспечивала получение новой формиатдегидрогеназы SoyFDH Ala267Met с заменой Ala267Met.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е. coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_A267M, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (150 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 2

Изучение температурной стабильности мутантной формиатдегидрогеназы SoyFDH с заменой Ala267Met и фермента дикого типа.

Для точной оценки эффекта изменения температурной стабильности за счет введенных замен мутантный фермент SoyFDH Ala267Met и формиатдегидрогеназу дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли зависимость остаточной активности от времени инкубации при 52, 54 и 56°С.

Методика получения высокоочищенных препаратов была одинакова как для мутантной SoyFDH Ala267Met, так и для фермента дикого типа.

Экспрессию SoyFDH дикого типа и ее мутантов проводили в клетках E.coli BL21 (DE3) CodonPlus/pLysS. Для приготовления посевного материала с чашки отбирали единичную колонию и культивировали в течение 7-9 ч при 30°С и 180 об/мин до достижения величины поглощения на длине волны 600 нм А₆₀₀≈0,6-0,8 в 5 мл среды 2YT (дрожжевой экстракт 10 г/л, бактотриптон 16 г/л, хлорид натрия 5 г/л, рН 7,0) в присутствии 150 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Затем содержимое пробирок переносили в конические качалочные колбы с отбойниками объемом 1 л, содержащими 200 мл среды 2YT и 150 мкг/мл ампициллина и клетки культивировали при 30°С и 80-90 об/мин до достижения величины поглощения на 600 нм, A₆₀₀=0,6-0,8. Далее проводили индукцию клеток, добавляя в среду для культивирования раствор лактозы (300 г/л) до конечной концентрации индуктора 20 г/л. После индукции температуру культивирования снижали до 20°С и клетки культивировали в течение 17 ч при 120 об/мин. Полученную биомассу осаждали на центрифуге Beckman J-21 (США) при 7500 об/мин в течение 20 мин при 4°С и после удаления культуральной жидкости клетки ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 8,0 в соотношении 1:4 (масс.). Полученную суспензию замораживали и хранили при -20°С.

Для выделения мутантной SoyFDH Ala267Met и фермента дикого типа 20% суспензию клеток в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 8,0 подвергали двум циклам заморозки-разморозки, и затем клетки разрушали с использованием ультразвукового дезинтегратора «Branson Sonifier 25 О» (Германия) при постоянном охлаждении. Осадок удаляли центрифугированием на центрифуге «Eppendorf 5804 R» (11000 об/мин, 30 мин).

Для очистки использовали модифицированную методику, разработанную для получения рекомбинантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188). Процедура очистки фермента включала высаживание балластных белков сульфатом аммония (45% от насыщения), осаждение целевого белка при концентрации сульфата аммония 85% от насыщения и его последующее перерастворение в растворе, содержащем 45% сульфат аммония в 0,1М фосфатном буфере, рН 7,0 (буфера А). Полученный супернатант использовали для гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) в нисходящем градиенте 45-0% концентрации сульфата аммония в буфере А и обессоливание на колонке с Сефадекс G-25 в том же буфере. Контроль чистоты полученных препаратов осуществляли с ипользованием аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецильсульфата натрия на приборе для электрофореза MiniProtean II фирмы «BioRad».

Активность ФДГ определяли спектрофотометрически по накоплению NADH на длине волны 340 нм (ε₃₄₀=6220 М^-1см^-1) на спектрофотометре «Schimadzu UV 1800 PC» при 30°С в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0. Концентрация формиата натрия и NAD⁺ в кювете составляла 0,6 М и 0,2 мг/мл соответственно.

Термостабильность фермента измеряли в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0. Для каждого эксперимента готовили серию из пластиковых пробирок объемом 0,5 мл по 100 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл) в каждой. Пробирки помещали в предварительно прогретый до необходимой температуры водный термостат (52-56°С, точность термостатирования ±0,1°С). В определенные моменты времени отбирали по одной пробирке и переносили в лед на 5 мин, после чего пробирку центрифугировали в течение 3 мин при 12000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415D». Остаточную активность ФДГ измеряли, как описано выше. Константу скорости термоинактивации km определяли как тангенс угла наклона прямой из графика зависимости натурального логарифма величины остаточной активности от времени (полулогарифмические координаты ln(A/A₀)-t) методом линейной регрессии, используя программу «Origin Pro 8.5».

В качестве параметра, характеризующего термостабильность, использовали константу скорости процесса термоинактивации. Результаты представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, введение мутации Ala267Met повышает стабильность формиатдегидрогеназы из сои в 4,9, 3,0 и 2,5 раз при температурах 52, 54 и 56°С соответственно.

Пример 3

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток А1а267 заменен на остаток Met, а остаток 11е272 заменен на остаток Val.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pSoyFDH_A267M (получение см. в примере 1), а в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Ile272Val, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

Soy_I272Vfor 5′-ACCCAAGCAGTTGCAGATGCTTGCTCCAGT-3′

Soy_I272Vrev 5′-AAGCATCTGCAACTGCTTGGGTGTCCATAATTGC-3′

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Ile272Val.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутации Ala267Met и Ile272Val, получила название pSoyFDH_(A267M,I272V).

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е. coli В F^- ompT hsdS (rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_(A267M,I272V), высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (150 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. выше).

Пример 4

Изучение температурной стабильности мутантной формиатдегидрогеназы SoyFDH с заменами Ala267Met и Ile272Val и фермента дикого типа.

Для точной оценки эффекта изменения температурной стабильности за счет введенных замен мутантный фермент SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val) и формиатдегидрогеназу дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли зависимость остаточной активности от времени инкубации при 52, 54 и 56°С.

Культивирование клеток, содержащих плазмиду pSoyFDH_(A267M, I272V), проводили согласно методике, описанной в примере 2.

Выделение, очистку, а также измерение активности и термостабильности мутантной формы формиатдегидрогеназы из сои SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val) проводили согласно методикам, описанным в примере 2.

В качестве параметра, характеризующего термостабильность, использовали константу скорости процесса термоинактивации. Результаты представлены в таблице 2. Как следует из таблицы 2, введение мутаций (Ala267Met, Ile272Val) повышает стабильность формиатдегидрогеназы из сои в 15, 8 и 5,6 раз при температурах 52, 54 и 56°С соответственно.

Таблица 2
Константы скорости термоинактивации формиатдегидрогеназы из сои дикого типа SoyFDH, а также мутантных форм SoyFDH Ala267Met и SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val)
Форма фермента	температура
	52	54	56
kin, мин-1	kin(wt)/kin(mut)	kin, мин-1	kin(wt)/kin(mut)	km, мин-1	kin(wt)/kin(mut)
SoyFDH дикого типа	(3,0±0,1)*10-2	1	(5,3±0,2)*10-2	1	(12,8±0,2)*10-2
SoyFDH Ala267Met	(0,63±0,02)*10-2	4,9	(1,78±0,04)*10-2	3,0	(5,16±0,07)*10-2	2,5
SoyFDH (Ala267Met, Ile272Val)	(0,21±0,01)*10-2	15	(0,65±0,01)*10-2	8	(2,26±0,08)*10-2	5,6

1. Мутантная растительная формиатдегидрогеназа с повышенной температурной стабильностью, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max (SEQ_ID №1), в которой остаток аланина в положении 267 заменен остатком метионина (SEQ_ID №2).

2. Мутантная растительная формиатдегидрогеназа с повышенной температурной стабильностью, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max (SEQ_ID №1), в которой остаток аланина в положении 267 заменен остатком метионина, а остаток изолейцина в положении 272 заменен остатком валина (SEQ_ID №3).