Штамм escherichia coli bl21(de3)gold/petmin-cypa - продуцент рекомбинантного циклофилина а человека



Штамм escherichia coli bl21(de3)gold/petmin-cypa - продуцент рекомбинантного циклофилина а человека
Штамм escherichia coli bl21(de3)gold/petmin-cypa - продуцент рекомбинантного циклофилина а человека
Штамм escherichia coli bl21(de3)gold/petmin-cypa - продуцент рекомбинантного циклофилина а человека

 


Владельцы патента RU 2557305:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцента рекомбинантного циклофилина А человека. Охарактеризованный штамм получен путем трансформации клеток штамма BL21(DE3)Gold плазмидой pETmin-CypA. Плазмида имеет размер 5865 пар нуклеотидов и содержит фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), несущего ген устойчивости к ампициллину ampR, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7 и полилинкер. По сайтам XhoI-NdeI клонирован фрагмент, полученный с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазмиды pCyPAwt/pGEX-2TK с клонированным фрагментом гена рчЦфА размером 498 п.н. Предложенный штамм высокопродуктивен, не требует сложной системы очистки и может быть использован в противоопухолевой терапии. 2 ил.

 

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и генной инженерии и касается нового штамма-продуцента рекомбинантного циклофилина А человека (рчЦфА).

Применение противоопухолевой химиотерапии ведет к подавлению гемопоэза и создает риск возникновения инфекционных осложнений, что препятствует проведению своевременного лечения. В связи с этим существует необходимость использования средств, поддерживающих кроветворную функцию костного мозга.

Циклофилин А (ЦфА) - белок с молекулярной массой 18 кД, находится во всех тканях млекопитающих, участвует в процессах внутриклеточного транспорта белков, регуляции клеточной пролиферации и проведении сигнала от рецептора в Т-лимфоцитах [Fischer G, Bang Н, Mech С. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. Biomed. Biochim. Acta. 1984; 43(10): 1101-1111; Colgan J, Asmal M, Yu B, Luban J. Cyclophilin A-deficient mice are resistant to immunosuppression by cyclosporine. Journal of immunology. 2005; 174(10): 6030-6038]. Секреторный ЦфА формирует очаг воспаления, привлекая туда зрелые макрофаги, нейтрофилы и активированные Т-лимфоциты [Sherry В, Yarlett N, Strupp A, Cerami А. Identification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product of lipopolysaccharide-activated macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992; 89(8): 3511-3515].

ЦфА усиливает миграцию стволовых клеток и предшественников из костного мозга на периферию, что позволяет рассматривать данный белок как фактор регенерации [Khromykh LM, Kulikova NL, Anfalova TV, et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. Cell Immunol. 2007; 249 (1): 46-53].

ЦфА является фактором дифференцировки стволовых клеток миелоидного ряда и способствует созреванию дендритных клеток, что позволяет рассматривать его в качестве гемопоэтического фактора, способного участвовать в восстановлении иммунной системы.

Для всестороннего изучения биологических свойств ЦфА, особенно в системах in vivo, требуется значительное количество этого белка.

Известен штамм Escherichia coli (E.coli), продуцирующий рчЦфА в виде белка с полигистидиновой последовательностью [В. Sherry, G. Zybarth, М. Alfano, L. Dubrovsky, R. Mitchell, D. Rich, P. Ulrich, R. Bucala, A. Cerami, M. Bukrinsky. Role of cyclophilin A in the uptake of HTV-1 by macrophages and T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, 95, pp.1758-1763].

Недостатки: рчЦфА продуцируется в виде белка, отличного от нативного, содержащего в своем составе полигистидиновую последовательность; невысокое содержание полученного конечного продукта (белка); необходимость дополнительных стадий очистки.

Известен штамм E.coli, продуцирующий рчЦфА без дополнительных полипептидных последовательностей [Liu J, Albers MW, Chen CM, Schreiber SL, Walsh CT. Cloning, expression, andpurification of human cyclophilin in Escherichia coli and assessment of the catalytic role of cysteines by site-directed mutagenesis. ProcNatlAcadSciUSA, 1990 Mar; 87(6): 2304-2308].

Недостатки: невысокое содержание конечного продукта и сложная схема очистки.

Задачей заявляемого изобретения является создание штамма E.coli - продуцента рчЦфА с высоким содержанием белка, структурно максимально приближенного к нативному и не требующего сложной системы очистки.

Поставленная задача решается путем трансформации компетентных клеток E.coli BL21(DE3)Gold плазмидой pETmin-CypA

Технический результат изобретения: получен штамм E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцент рекомбинантного циклофилина А, структурно максимально приближенный к нативному и не требующий сложной системы очистки.

Для получения плазмиды pETmin-CypA проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами (5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC), используя в качестве матрицы плазмиду pCyPAwt/pGEX-2TK. Полученный в результате реакции фрагмент длиной 515 п.н. и вектор рЕТ-22b(+) расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI и NdeI. После этого ферменты инактивировали при t=65°C в течение 20 мин и проводили реакцию лигирования. Штамм E.coli ТОР10 трансформировали лигазной смесью (вода, трансформируемый вектор, буфер для лигазы, лигаза, полиэтиленгликоль). Отбирали устойчивые к ампициллину клоны, выделяли плазмиды и проводили их рестрикционный анализ.

Физическая карта полученной плазмиды представлена на фиг.1.

Структуру клонированного гена в отобранных клонах подтверждали определением нуклеотидной последовательности с использованием набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (v. 3.1). В результате получали экспрессионную плазмиду pETmin-CypA (фиг.1). Плазмида pETmin-CypA содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: PstI - 4726, EcoRV - 1937, BgIII - 765.

Плазмида pETmin-CypA имеет размер 5865 пар нуклеотидов (п.н.) и содержит: фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), несущего ген устойчивости к ампициллину ampR, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7 и полилинкер, в котором по сайтам XhoI-NdeI клонирован фрагмент, полученный с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазмида pCyPAwt/pGEX-2TK с клонированным фрагментом гена рчЦфА размером 498 п.н. (М. Bukrinsky Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, США):

Способ получения штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

Компетентные клетки E.coli BL21(DE3)Gold трансформировали плазмидой pETmin-CypA и после выращивания рекомбинантных клонов на агаризированной среде LB, содержащей 150 мг/л ампициллина при t=37°C, получали штамм-продуцент полипептида рчЦфА.

Выращивание заявляемого штамма в ферментере.

Единичную колонию заявляемого штамма инокулировали в 5 мл бульона ТВ, содержащего 150 мг/л ампициллина, и выращивали в течение 18 ч при перемешивании со скоростью 180 об/мин и t=37°C. Инокулят для ферментации готовили, пересевая адаптированную культуру в 500 мл вновь приготовленной среды, культивировали в условиях аэрации в течение 18 ч и вносили в ферментер.

Ферментацию культуры проводили после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при pH 7,0-7,4; t=37°C и аэрации 150 об/мин. Культуру выращивали в течении 2 ч, затем вносили индуктор изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5 мМ, культивировали в течение 4 ч. Клетки собирали центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин и хранили при t=-20°C. Содержание рчЦфА в биомассе рекомбинантного штамма-продуцента составляло до 20% от суммарного содержания белка штамма-продуцента или до достижения 100 мг/литр бактериальной культуры.

Полученный штамм E.coli BL21(DE3)Gold/ pETmin-CypA характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на стандартных питательных средах. Время генерации составляет до 30 мин в жидкой LB-среде. При росте на агарезированной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые, край ровный; диаметр колоний составляет 2-3 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде LB характеризуется равномерным помутнением. Культуральную жидкость после охлаждения подвергали центрифугированию.

Физиолого-биохимические признаки: клетки росли в диапазоне температур 20-42°C, при значении pH 6,8-7,2.

Устойчивость штамма к антибиотикам: клетки устойчивы к ампициллину, что обусловлено наличием в плазмиде pETmin-CypA гена ampR.

Условия хранения штамма: среда LB с 15% содержанием глицерина, t=-70°C в криовиалах.

Штамм E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИИ Генетика, регистрационный номер ВКПМ В-11722.

Способ получения рчЦфА осуществляли следующим образом. Культивирование штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA осуществляли при t=37°C в питательной среде на основе бульона ТВ (Terrific Broth) при pH 7,2; культуральную жидкость после охлаждения центрифугировали. Полученную биомассу разрушали ультразвуковым дезинтегратором. Растворимую фракцию подвергали ионообменной хроматографии на колонке с Fractogel TSKDEAE-650(S); несвязавшуюся фракцию пропускали через ионообменную колонку с CM Sepharose Fast Flow. Очистку конечного продукта от эндотоксинов проводили на колонке с Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel.

Разрушение биомассы проводили с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson Sonifier 250 в лизирующем буфере 20 мМ TrisCl, pH 8,0 в течение 5 мин. Температуру суспензии поддерживали в пределах от 2 до 8°C при частоте колебаний наконечника, составляющей 22 КГц, амплитуде 14-16 мкм и мощности дезинтеграции 100 Вт. Полученный лизат центрифугировали при 50000 g в течение 15 мин.

Растворимую фракцию клеток наносили на колонку, содержащую Fractogel TSKDEAE-650(S) и уравновешенную буфером 20 мМ TrisCl pH 8,0 со скоростью 3 мл/мин. В данных условиях рчЦфА не связывался с сорбентом. Фракцию, содержащую рчЦфА, доводили до значения pH 6,2, добавляя 10% уксусную кислоту. Разделение фракции проводили на колонке, заполненной катионообменным сорбентом CM Sepharose Fast Flow и уравновешенной 20 мМ натрий-фосфатный буфером, pH 6,2 (буфер С) при скорости протока 5 мл/мин. После нанесения фракции колонку промывали буфером С до выхода оптической плотности протекающего раствора при 280 нм к значению, близкому к нулю. Элюцию проводили линейным градиентом от буфера С до буфера 20 мМ Na2CO3, 250 мМ NaCl, pH>10, объемом 150 мл.

Для удаления липополисахаридов использовали сорбент Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel (Thermo Scientific), который помещали в хроматографическую колонку ХК16/20 и уравновешивали пропусканием 50 мл фосфатно-солевого буфера. Далее через колонку пропускали раствор очищенного рчЦфА в фосфатно-солевом буфере при скорости потока 2 мл/мин. Максимальное суммарное количество белка, наносимого за один раз, составляло 200 мг, а объем раствора - 50 мл. Контроль процесса осуществляли путем проточного измерения оптической плотности раствора при длине волны 280 нм. Полученный продукт полностью удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим рекомбинантным препаратам по содержанию примесных бактериальных белков E.coli и эндотоксинов.

Способ позволяет получить 70-100 мг белка на 1 л бактериальной культуры.

Хроматографическое разделение рчЦфА методом электрофореза представлено на фиг.2.

Условные обозначения:

М - маркеры.

А - растворимая фракция лизата штамма E.coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA.

В - фракция, полученная после флеш-хроматографии.

С - фракция, не связавшаяся с катионообменной колонкой.

1, 2, 3 - фракции, полученные при градиентной элюции катионообменной колонки.

Штамм Escherichia coli BL21(DE3)Gold/pETmin-CypA - продуцент рекомбинантного циклофилина А человека, полученный путем трансформации клеток штамма BL21(DE3)Gold плазмидой pETmin-CypA, имеющей размер 5865 пар нуклеотидов и содержащей фрагмент XhoI-NdeI вектора рЕТ-22b(+), несущего ген устойчивости к ампициллину ampR, промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7 и полилинкер, в котором по сайтам XhoI-NdeI клонирован фрагмент, полученный с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров 5′-TTATACATATGGTCAACCCGACCGTGTTCTTC и 5′-TTTCTCGAGTTATTCGAGTTGTCCACAGTCAGC плазмиды pCyPAwt/pGEX-2TK с клонированным фрагментом гена рчЦфА размером 498 п.н.:
1 atggtcaacc ccaccgtgtt cttcgacatt gccgtcgacg gcgagccctt
51 gggccgcgtc tcctttgagc tgtttgcaga caaggtccca aagacagcag
101 aaaattttcg tgctctgagc actggagaga aaggatttgg ttataagggt
151 tcctgctttc acagaattat tccagggttt atgtgtcagg gtggtgactt
201 cacacgccat aatggcactg gtggcaagtc catctatggg gagaaatttg
251 aagatgagaa cttcatccta aagcatacgg gtcctggcat cttatcgatg
301 gcaaatgctg gacccaacac aaatggttcc cagtttttca tctgcactgc
351 caagactgag tggttggatg gcaagcatgt ggtgtttggc aaagtgaaag
401 aaggcatgaa tattgtggag gccatggagc gctttgggtc caggaatggc
451 aagaccagca agaagatcac cattgctgac tgtggacaac tcgaataa



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae 12-84, обладающий высоким уровнем синтеза комплекса протеиназ и пептидаз, нуклеаз, хитиназы, β-глюканазы, маннаназы и α-амилазы, депонирован в ГНУ ВНИИСХМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ под регистрационным номером Aspergillus oryzae RCAM01134.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм зеленой микроводоросли Acutodesmus obliquus Syko-A Ch-055-12, обладающий способностью снижать содержание загрязняющих веществ в сточной воде, депонирован в Коллекции Микроводорослей ИФР РАН (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS S-2016.

Изобретения относятся к области медицинской микробиологии и касаются способа дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор и тест-системы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Предложен штамм бактерии Bacillus subtilis ВКПМ B-11964 - высокоактивный продуцент пектолитических ферментов, мацерирующих растительную ткань.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и микробиологии. Предложены штамм Bacillus sp.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Microbacterium species BKM Ac-2614D для очистки загрязненных и хронически загрязненных пресноводных объектов в температурном диапазоне от +2ºC до +25ºC.

Изобретение относится к фотобиотехнологии. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris 711-54 обладает высокими показателями степени очистки сточных вод сельскохозяйственных и спиртовых производств, значительной продуктивностью и высоким содержанием ценных соединений в биомассе.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой генетически модифицированный штамм бактерии Streptomyces thermotolarences WSJ-IA, продуцирующий изовалерилспирамицин I.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен трансформированный микроорганизм - дрожжи Saccharomyces для получения этанола, где упомянутый микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и указанный микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, или указанный микроорганизм трансформирован промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве. .

Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов. .

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен полипептид D-лактатдегидрогеназы, который содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая характеризуется идентичностью по последовательности на уровне не менее 80% с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1 или 2, раскрытые в описании, где указанный полипептид обладает D-лактатдегидрогеназной активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлен трансформированный микроорганизм - дрожжи Saccharomyces для получения этанола, где упомянутый микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилозоизомеразу, и указанный микроорганизм трансформирован нуклеотидной последовательностью, кодирующей ксилулокиназу, или указанный микроорганизм трансформирован промотором, способным повышать экспрессию эндогенной ксилулокиназы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в гене матриксной металлопротеиназы ММР9-1562 C>Т (rs3918242).

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантные варианты рекомбинантной L-аспарагиназы, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности L-аспарагиназы бактерий Wolinella succinogenes, в которой аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток серина либо аминокислотный остаток валина в положении 23 заменен на остаток глутамина, а аминокислотный остаток лизина в положении 24 заменен на остаток треонина.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлена клетка-хозяин Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica или Bordetella parapertussis, которая используется в качестве адъюванта или для профилактики или лечения коклюша, имеющая сниженную активность эндогенной гликозилтрансферазы с по меньшей мере 98% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по сравнению с активностью гликозилтрансферазы соответствующего родительского штамма, где сниженная активность достигается применением инактивирующего вектора, который вызывает инактивацию экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, или приводит к сниженному уровню экспрессии последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, слиянием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликозилтрансферазу, со слабым или индуцибельным промотором.
Наверх