Адъюванты-разбавители для живых вакцин от болезней свиней

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS). Способ включает вакцинирование свиней с PRRS с обеспечением уменьшения длительности гипертермии и защиты целостности легких. При этом вакцина получена способом, включающим смешение живой вакцины, приготовленной для немедленного введения, с адъювантом-разбавителем (AD). Указанный адъювант-разбавитель представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую на 100% своей массы: от 99 до 50% масс. воды и от 1 до 50% масс. масляного адъюванта. Масляный адъювант содержит на 100% своей массы: от 1 до 95% масс. по меньшей мере одного минерального масла и от 1 до 80% масс. по меньшей мере одного ПАВ. Минеральное масло представляет собой масло типа Marcol или Draekol. ПАВ представляет собой сложный эфир, полученный конденсацией жирной кислоты с сорбитом или маннитом. 6 з.п. ф-лы, 9 табл., 1 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения пригодной для инъекций вакцинной композиции, предназначенной для борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS).

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) является вирусной инфекцией, которая затрагивает в основном домашних свиней, но которая уже также была диагностирована у диких свиней. Природа и тяжесть заболеваний зависит от возраста, пола, условий, в которых выращиваются свиньи, а также от штамма вируса.

Большой ущерб, вызванный PRRS, связан в основном с нарушениями репродуктивной способности и с поражениями легких, характерными для этой болезни.

Характерными симптомами PRRS являются временное повышение температуры и проблемы с дыханием, вызванные пневмонией. Недостаток кислорода, вызванный затруднением дыхания, может спровоцировать цианоз на уровне ушей, брюха и конечностей. Веки опухают, и наблюдается истечение жидкости из глаз.

В откормочных хозяйствах больше всего проблем вызывает низкая эффективность откорма из-за пневмонии, тогда как на фермах по разведению животных на первый план выходят, естественно, расстройства репродуктивной способности. В последнем случае до 50% приплода может подвергнуться значительным потерям.

Вирусы, попавшие в организм при вдыхании или глотании, сначала распространяются в клетках легкого и носоглоточных миндалин, а затем во всем организме. Затем вирусы могут выделяться самыми разными путями: носовой секрет, экскременты, моча, сперма, мертворожденный приплод. В свинарнике болезнь распространяется при прямом контакте с зараженным материалом или воздушно-капельным путем. Распространение происходит намного быстрее в случае стресса и в условиях большого количества животных. Так как возбудитель инфекции может долгое время сохраняться живым в инфицированном животном, свиньи остаются заразными даже после выздоровления. Вирус может также распространяться птицами, насекомыми, как, например, мухи, или людьми (одежда, немытые руки, оборудование и т.д.).

Для применения на свиноматках и поросятах были разработаны как живые, так и инактивированные вакцины.

Вакцинация состоит в прививке виду, который требуется защитить, некоторого количества мертвых патогенов

(инактивированная вакцина) или сделанных непатогенными (ослабленная живая вакцина), чтобы инициировать биологический ответ у хозяина, защищая его при позднейшем появлении болезни.

Живые вакцины обычно достаточно эффективны, чтобы не требовать использования адъювантов.

Адъювант вакцины является наполнителем, который усиливает биологический ответ на антиген, с которым он ассоциирован. Используют, например, гидроксид алюминия, масляные адъюванты, продающиеся под названием Montanide™ фирмой SEPPIC. Эти адъюванты имеют различную природу. Они могут равным образом состоять из липосом, эмульсии, содержащих по меньшей мере одну масляную фазу и по меньшей мере одну водную фазу, типа адъювантов, называемых "Freund", или, чаще, из минеральных солей, нерастворимых в воде. Из минеральных солей, использующихся в качестве адъювантов в составах вакцин, можно назвать, например, гидроксид алюминия, нитрат церия, сульфат цинка, коллоид гидроксида железа или хлорид кальция. Наиболее широко применяющимся адъювантом является гидроксид алюминия. Эти минеральные соли, использующиеся в качестве адъювантов в составах вакцин, описаны, в частности, в статье Rajesh К. Gupta et al "Adjuvants, balance between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, vol. 11, issue 3, 1993, pages 993-306.

В случае PRRS были разработаны вакцины как живые, так и инактивированные для применения на свиноматках и поросятах.

a) Инактивированные вакцины обычно предназначены для вакцинации свиноматок.

b) Живые вакцины используются главным образом на поросятах, откармливаемых на мясо, против дыхательных расстройств, но недавно была также получена регистрация для лечения репродуктивных расстройств у свиноматок.

Некоторые живые вакцины размножаются в течение длительного времени в легких вакцинированных поросят, и некоторые штаммы живых вакцин могут вызвать трансплацентарную инфекцию. Таким образом, понятно, что имеется опасность вакцинации беременных свиноматок, которые никогда прежде не были в контакте с вирусом PRRS. Однако нередко живые вакцины применяются, чтобы стимулировать заражение ослабленным вирусом, чтобы вызвать коллективный иммунитет в младенческом возрасте (поросята возрастом 3-4 недели) и/или сделать однородным иммунный статус небеременных свиноматок.

Из разработанных и выпускаемых промышленно живых вакцин для борьбы с PRRS можно назвать, например, вакцину AMERVAC-PRRS/A3, производства Hipra Lab., вакцину INGELVAC PRRS Modified Live Virus, производства Boehringer Ingelheim, вакцину PORCILIS PRRS производства Intervet.

Перед лицом вспышки эпидемии, устойчивой к использованию классических живых вакцин, как в случае PRRS, испытывались различные адъювантные методы, чтобы:

- повышение интенсивности защитной реакции, позволяющей обеспечить лучший уровень защиты;

- увеличение продолжительности защиты, придаваемой дозой вакцины, обеспечивая более длительную защиту животных на фермах в течение всего периода их выращивания;

- обеспечение достаточной защиты с единственной обработкой там, где были необходимы две обработки в отсутствие этих усилителей иммунного ответа. Выигрыш в таком случае состоит в числе доз, которые требуется ввести (в два раза меньше), манипуляций с животными (труд) и в стрессе, возникающем при манипуляциях с животными (также в два раза меньше);

- получение при меньшей дозе антигена эффективности, эквивалентной эффективности, которую дает полная доза, использующаяся без адъюванта. Таким образом, оборудование по производству вакцин при той же производительности будет способно давать большее число доз вакцины. Равным образом, существующие упаковки могут предлагаться для вакцинации большего числа животных.

Существует потребность в разработке разбавителей, которые обладают также функцией адъюванта, позволяющего улучшать иммунный ответ, как описано выше. Эти композиции называются адъювантами-разбавителями (AD).

Основная трудность, возникающая при разработке AD, состоит в обеспечении способности указанного адъюванта-разбавителя (AD) сохранять живущей живую вакцину, чтобы она сохраняла свои иммуногенные свойства.

Важным элементом разработки адъювантов для живых вакцин является особенность адъювантных композиций не убивать живые микроорганизмы, из которых состоят вакцинальные антигены, при их контакте перед инъекцией. AD имеются в продаже (как, например, ацетат токоферола от компании Intervet, содержащийся в Diluvac Forte®), и рекомендуются для некоторых живых вакцин.

Кроме того, живая вакцина известна из заявки на патент Франции FR 2385401.

Однако эта живая вакцина была получена без добавления адъювантов. До настоящего времени считалось несомненным, что более сильный иммунный ответ с живой вакциной может быть получен, например, путем повышения содержания вируса или путем использования более иммуногенного штамма.

Согласно настоящему изобретению был найден способ получения вакцины с живым вирусом, который отличается тем, что живую вакцину готовят посредством применения адъюванта типа эмульсии со сплошной водной фазой, например эмульсия или микроэмульсия "масло в воде".

Неожиданно было обнаружено, что применение эмульсии "масло в воде" (Н/Е) в качестве "разбавителя" для живых вакцин оказывает положительный эффект на серологический и иммунный ответ у вакцинированных животных. В этой эмульсии "масло в воде" внешняя водная фаза позволяет быстро растворить вакцину (обычно лиофилизованную).

Другим аспектом изобретения является то, что применение эмульсии "масло в воде" в качестве адъюванта-разбавителя для живых вакцин вызывает очень высокий серологический ответ у молодых животных, еще обладающих материнским иммунитетом. Этот неожиданный эффект может быть вызван защитным действием эмульсии на живой вирус от нейтрализации антителами, присутствующими у животного.

Целью настоящего изобретения является устранить все или часть указанных выше недостатков уровня техники.

Поэтому объектом настоящего изобретения является способ получения пригодной для инъекций вакцинной композиции, предназначенной для борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS), включающий по меньшей мере этап:

- смешивания приготовленной для немедленного введения живой вакцины с адъювантом-разбавителем (AD),

отличающийся тем, что указанный адъювант-разбавитель представляет собой эмульсию типа "масло в воде" или микроэмульсию типа "масло в воде", или водный раствор, содержащий воду и по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из гидроксида алюминия, нитрата церия, сульфата цинка, коллоида гидроксида железа или хлорида кальция, солей двухвалентных или трехвалентных металлов или же из симпатомиметических соединений.

Под разбавителем понимается вещество, которое добавляют к другому, чтобы уменьшить его титр, его содержание или его процентную долю.

Кроме того, варианты осуществления изобретения могут содержать одну или несколько из следующих характеристик:

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что адъювант-разбавитель (AD) содержит адъювант, водную фазу и, факультативно, полимер семейства полиакрилатов натрия;

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что вирус, содержащийся в указанной живой вакцине, лиофилизуют до этапа а);

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что указанный адъювант-разбавитель является эмульсией типа "масло в воде", содержащей на 100% своей массы:

- от 99 до 50% масс. воды, в частности от 99 до 75% масс. воды, и еще более конкретно от 90 до 80% масс. воды;

- от 1 до 50% масс. масляного адъюванта, в частности от 1 до 25% масс. масляного адъюванта, и еще более конкретно от 5 до 19% масс. масляного адъюванта,

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что адъювант-разбавитель содержит, кроме того, от 0,25 до 5% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, в частности от 0,2 до 4% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, и еще более конкретно от 0,3 до 3% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия;

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что указанный адъювант-разбавитель является микроэмульсией типа "масло в воде", содержащей на 100% своей массы:

- от 99 до 50% масс. воды, в частности от 99 до 75% масс. воды, и еще более конкретно от 90 до 8 0% масс. воды;

- от 1 до 50% масс. масляного адъюванта, в частности от 1 до 25% масс. масляного адъюванта, и еще более конкретно от 5 до 19% масс. масляного адъюванта;

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что адъювант-разбавитель содержит, кроме того, от 0,25 до 5% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, в частности от 0,2 до 4% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, и еще более конкретно от 0,3 до 3% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия;

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что указанный масляный адъювант содержит на 100% своей массы:

- от 1 до 95% масс. по меньшей мере одного минерального масла, в частности от 10 до 90% масс. по меньшей мере одного минерального масла, и более конкретно от 20 до 90% масс. по меньшей мере одного минерального масла;

- и от 1 до 80% масс. по меньшей мере одного ПАВ, в частности от 2 до 7 0% масс. по меньшей мере одного ПАВ, еще более конкретно от 10 до 45% масс. по меньшей мере одного ПАВ;

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что указанный адъювант-разбавитель является водным раствором, содержащим на 100% своей массы:

- от 99,5 до 95,0% масс. воды, в частности от 99,5 до 97,0% масс. воды, и еще более конкретно от 99,0 до 97,0% масс. воды;

- от 0,5 до 5,0% масс. минеральных солей, в частности от 0,5 до 3,0% масс. минеральных солей, и еще более конкретно от 1,0 до 3,0% масс. минеральных солей; и

- способ, какой определен выше, отличающийся тем, что водный раствор содержит на 100% своей массы:

- от 1 до 15% масс., в частности от 1 до 10% масс., более конкретно от 1 до 5% масс. по меньшей мере одного ПАВ;

- от 1 до 25% масс., в частности от 1 до 10% масс. еще более конкретно от 1 до 5% масс. по меньшей мере одного минерального масла;

- 40 до 97% масс. воды, в частности от 50 до 95% масс. воды, и еще более конкретно от 75 до 90% масс. воды;

- от 0,1 до 5% масс. минеральных солей, в частности от 0,2 до 4% масс. минеральных солей, и еще более конкретно от 0,5 до 3% масс. минеральных солей.

Живые вакцины обычно хранят лиофилизованными, и они должны переводиться в суспензию в водной фазе непосредственно перед применением. Восстановленная таким образом вакцина должна использоваться в пределах нескольких часов после добавления разбавителя.

Минеральные масла, использующиеся для приготовления масляных адъювантов, выбраны из группы, состоящей из минеральных масел, углеводородов, полученных перегонкой нефти и обработкой на следующих стадиях, таких, например, как десульфирование, деасфальтирование, экстракция ароматических соединений, экстракция восков и другие стадии окончательной обработки (можно назвать например, масла типа MARCOL 52, MARCOL 82, DRAKEOL 5 и DRAKE0L 6 и т.д.).

ПАВы, присутствующие в масляных адъювантах, являются эмульгирующими ПАВами, имеющими гидрофильные свойства, характеризующиеся значением ГЛБ от 8 до 19, в частности от 8 до 15.

Такой ПАВ может состоять из алкилполигликозида или смеси алкилполигликозидов; сапонинов; лецитинов; полиоксиэтилированных алканолов; полимеров, содержащих блоки полиоксиэтилена и полиоксипропилена; сложных эфиров, полученных конденсацией жирной кислоты, предпочтительно жирной кислоты, жидкой при 20°С, с сахаром, сорбитом, маннитом или глицерином. Указанный сахар может состоять из глюкозы или сахарозы или, предпочтительно, маннита. В качестве предпочтительных сложных эфиров можно назвать эфиры жирных кислот, как, например, олеиновая кислота, стеариновая кислота, пальмитиновая кислота, лауриновая кислота, и сорбита или маннита, полученные этерификацией жирной кислоты с сорбитом или маннитом, или же этерификацией с продуктами, полученными в результате отщепления воды от полигидроксильной цепи сорбита или маннита, которые циклизуются в позиции 1-4 или в позиции 2-6, или же этерификацией с сорбитом или маннитом и с продуктами отщепления воды от полигидроксилированной цепи сорбита или маннита, который циклизуется в положении 1-4 или в положении 2-6. В качестве особенно предпочтительных сложных эфиров маннита можно назвать олеаты маннита, олеаты маннитана, олеаты маннита, этоксилированные 5 молями, или 10 молями, или 15 молями, или 20 молями оксиэтилена, олеаты маннитана, этоксилированные 5 молями, или 10 молями, или 15 молями, или 20 молями оксиэтилена. Могут также применяться производные сложных эфиров, сахаров и полиэтиленгликоля, сорбита или глицерина. Другими типами предпочтительных ПАВов являются этоксилированные растительные масла, как, например, этоксилированные кукурузные масла, содержащие от 3 до 40 молей оксиэтилена, этоксилированные рапсовые масла, содержащие от 3 до 40 молей оксиэтилена, этоксилированные касторовые масла, содержащие от 3 до 60 молей оксиэтилена.

ПРИМЕРЫ

Совместимость адъювантных композиций с жизнеспособностью лиофилизованных вакцин связана с составом этих адъювантных композиций и с количеством, в котором они используются. Проводили выбор биосовместимых составляющих, комбинируемых в пропорциях, обеспечивающих хорошее применение и потенциал адъюванта, и этот выбор оценивали затем в протоколах количественных исследований. Затем оценивали эффект адъюванта на популяции свиней, контактировавших с болезнью, причем разные группы получали разные вакцины; защитный эффект измеряли путем количественного определения:

- титра специфичных антител анти-PRRS в пробах крови, взятых после вакцинации;

- поражений легких, характерных для бактериальных суперинфекций, связанных с патогенезом PRRS;

- устойчивости повышения температуры после заражения вирусом.

Опыт 1: Жизнестойкость живой вакцины

Количественное определение противовирусного эффекта проводится методом, позволяющим определить количество вируса, остающегося живым за период после повторного разбавления, подходящего для применения и соответствующего законодательным ограничениям (как, например, европейская или американская фармакопеи). Лиофилизат живых вакцин приводится в контакт на заданный период времени с АР, содержащим различные количества разных адъювантов. Количественное определение вируса после контактирования позволяет определить противовирусный характер AD.

Результаты опыта на вируцидность сравнивают с жизнеспособностью в тех же условиях суспензии лиофилизата в чистой воде. AD считается невируцидным, если отношение конечной концентрации вируса к его начальной концентрации меньше или равно 7. В нашем случае оно реально ниже 0,7, так как значения выражены в логарифмическом масштабе.

а) Продукты, являющиеся объектами исследования.

Адъюванты (ADJ), использующиеся для приготовления масляных AD, имеют следующий массовый состав (в расчете на 100% их массы):

ADJ 1;

Олеат маннитана = 4 0% масс.

Marcol 52 = 60% масс.

ADJ 2:

Олеат сорбитана = 30% масс.

Marcol 52 = 70% масс.

ADJ 3:

Олеат маннитана = 15% масс.

Marcol 52 = 85% масс.

ADJ 4:

Олеат сорбитана = 15% масс.

Marcol 52 = 85% масс.

Разные протестированные адъюванты (массовые доли каждого составляющего на 100% массы АР):

Полимер, использованный для приготовления вышеуказанных AD, является полиакрилатом натрия, который может присутствовать в форме порошка или же обратного латекса, какой находится в композициях, выпускаемых в продажу под названием MONTANIDE™GEL.

Результаты на вируцидность различных адъювантов-разбавителей представлены в таблице 6.

Результаты опытов на вируцидность из таблицы 6 сравнивают с живучестью в тех же условиях композиции, полученной суспендированием в чистой воде лиофилизата антигена (рассматриваемый лиофилизат представляет собой лиофилизованный вирус PRRS). Количество вируса, введенного инъекцией при вакцинации без адъюванта, составляет 104 TCID 50 на дозу 2 мл (доза заражения 50% культуры ткани/доза вируса, модифицирующая 50% клеток в стандартизованных испытаниях in vitro).

Интерпретация:

AD11, AD12, AD13, AD14, AD15, AD16, AD21, AD22, AD23, AD24, AD25, AD26, содержащие от 5 до 25% адъюванта 1 и 2, AD51 и AD52, содержащие от 5 до 15% полимеров, оказались невируцидными.

Опыт 2: Эффективность вакцин с адъювантами по отношению к свиньям

Свиней, не зараженных PRRS, прививали вакцинами с разными AD, сохраняя тот же лиофилизат живой вакцины (вирус PRRS). Этот лиофилизат соответствует стандартной покупной вакцине, которую нужно разбавлять водой.

Эти вакцины готовят с дозой вируса всего 50%, но в присутствии AD.

Группы численностью 10 свиней получали инъекцию вакцины в возрасте 4 недели.

Заражение вирусом путем контакта с патогенным вирусом PRRS осуществляли в возрасте трех месяцев. Животных забивали через три недели после заражения вирусом. Эффективность вакцин определяли количественно следующим образом:

- мониторинг титра специфических антител анти-PRRS в пробах крови, взятых после вакцинации;

- продолжительность лихорадки, вызванной заражением вирусом;

- поражения, обнаруженные в легких после аутопсии.

Для испытаний были приготовлены адъюванты-разбавители AD-I и AD-II.

DA I (массовый состав):

- Адъювант 1 (ADJ 1) = 15%

- Вода = 85%

DA II (массовый состав):

- Адъювант 1 (APJ 1) = 1%

- Вода = 95%

- Карбопол 971 (полиакрилат натрия) = 4%

Результаты для групп, вакцинированных АР-I (группа I) и АР-II (группа II), сравнивали с результатами, полученными в тех же условиях, что и для группы, вакцинированной вакциной, суспендированной в воде без адъюванта (группа T), с группой, которую не вакцинировали, на заражали (группа NV), и с индикаторной группой, которая не получала вакцины и не была заражена вирусом, чтобы удостовериться, что эпидемия не исказит испытание (группа SE).

Результаты мониторинга титров специфических антител анти-PRRS в пробах крови, взятых после вакцинации:

Результаты по титрам антител через 90 дней после вакцинации представлены в таблице 7. Все вакцинированные животные испытали сероконверсию, и титры антител близки для всех групп, без какого-либо существенного различия. Индикаторная группа и контрольная, невакцинированная группа избежали заражения.

Результаты по длительности повышения температуры, вызванной заражением вирусом:

- При заражении вирусом обычно наблюдается пик повышения температуры. Защищенные вакцинированные животные обычно быстрее возвращаются к нормальной температуре благодаря иммунитету, выработанному заранее благодаря вакцинации.

Невакцинированная группа (группа NV) имеет продолжительность лихорадки около 10 дней.

Группы (I) и (II), вакцинированные с 50% антигена, а также группа, вакцинированная коммерческой контрольной вакциной (группа T), имели продолжительность лихорадки примерно 6 дней.

Группы (I) и (II), вакцинированные со 100% антигена, имели сниженную продолжительность лихорадки: 4 дня для группы (I) и 5 дней для группы (II).

Индикаторная группа не имела гипертермии.

Результаты по поражениям, наблюдаемым в легких после аутопсии:

- Степени повреждений, обнаруженные в разных легких после аутопсии, представлены в таблице 9.

Невакцинированная группа (группа NV) имела наиболее высокую степень повреждения, 18%, со среднеквадратичным отклонением 22%, что указывает на сильные, но неоднородные поражения.

Группа Т, вакцинированная коммерческой вакциной, не содержащей адъюванта, дала степень поражения 12% со среднеквадратичным отклонением 18%.

Группы (I) и (II), вакцинированные с вирусной нагрузкой 50% антигена, дают степень поражения примерно 5% со среднеквадратичным отклонением 8%.

Группы (I) и (II), вакцинированные с вирусной нагрузкой 100% антигена, дают самые низкие показатели (около 2% со среднеквадратичным отклонением 2).

Низкое среднеквадратичное отклонение указывает на хорошую однородность ответа.

В случае групп (I) и (II), то есть групп, вакцинированных соответственно с адъювантами-разбавителями AD-I и AD-II, индивидуальная восприимчивость животных была снижена, что выравнивает уровни ответа. Этот момент очень важен, чтобы избежать ситуации, когда некоторые инфицированные животные сохраняют постоянный очаг распространения путем выделения вируса на всем протяжении выращивания.

Выводы из экспериментальных исследований:

Эти экспериментальные результаты четко демонстрируют, что применение адъювантов типа 1 и 2 для получения адъювантов-разбавителей типа AD-I и AD-II (с или без полимера) повышают эффективность вакцины по критериям длительности гипертермии и защиты целостности легких; эти результаты заметно лучше, чем у коммерческой вакцины, использующей воду в качестве разбавителя вместо AD, содержащего адъювант 1; результаты, полученные с всего 50% антигенного наполнителя, но с AD, лучше, чем у коммерческой вакцины.

1. Способ вакцинирования для борьбы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней (PRRS) с обеспечением уменьшения длительности гипертермии и защиты целостности легких, где вакцина получена способом, включающим по меньшей мере этап:
а) смешения живой вакцины, приготовленной для немедленного введения, с адъювантом-разбавителем (AD),
отличающийся тем, что указанный адъювант-разбавитель представляет собой эмульсию типа "масло в воде", содержащую на 100% своей массы:
- от 99 до 50% масс. воды;
- от 1 до 50% масс. масляного адъюванта,
где масляный адъювант содержит на 100% своей массы: от 1 до 95% масс. по меньшей мере одного минерального масла и от 1 до 80% масс. по меньшей мере одного ПАВ, где минеральное масло представляет собой масло типа Marcol или Draekol, а ПАВ представляет собой сложный эфир, полученный конденсацией жирной кислоты с сорбитом или маннитом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что адъювант-разбавитель (AD) содержит адъювант, водную фазу и полимер семейства полиакрилатов натрия.

3. Способ по одному из пп. 1 или 2, где указанная эмульсия типа "масло в воде" содержит от 99 до 7 5% масс. воды и еще более конкретно от 90 до 80% масс. воды.

4. Способ по одному из пп. 1 или 2, где указанная эмульсия типа "масло в воде" содержит от 1 до 25% масс. масляного адъюванта и еще более конкретно от 5 до 19% масс. масляного адъюванта.

5. Способ по одному из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что вирус, содержащийся в указанной живой вакцине, лиофилизуют перед этапом а).

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что адъювант-разбавитель дополнительно содержит от 0,25 до 5% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, в частности от 0,2 до 4% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия, еще более конкретно от 0,3 до 3% масс. полимеров семейства полиакрилатов натрия.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный масляный адъювант содержит на 100% своей массы: от 10 до 90% масс. по меньшей мере одного минерального масла, еще более конкретно от 20 до 90% масс. по меньшей мере одного минерального масла; и от 2 до 70% масс. по меньшей мере одного ПАВ, еще более конкретно от 10 до 45% масс. по меньшей мере одного ПАВ.