Способ выделения смеси днк и белков из эпимастиготных форм trypanosoma cruzi


 


Владельцы патента RU 2558235:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выделения смеси ДНК и белков из эпимастиготных форм штамма TPAP/MX/2002/Albarrada культуры Trypanosoma cruzi. Охарактеризованный способ включает получение биомассы культуры указанного штамма. Далее отмывку полученной биомассы, концентрирование ее до содержания не менее 6×108 клеток в 1 мл, введение в полученную концентрированную биомассу синтетического препарата дефензина α-1 человека с молекулярной массой 3,4 кДа в количестве 20 мкг/мл до конечной его концентрации 3,97 мкМ и выдержку до образования пор в дилипидных мембранах. Далее встряхивают полученную взвесь на шейкере с последующей выдержкой при комнатной температуре в течение не менее 24 часов, затем проводят центрифугирование полученной среды с выделением смеси ДНК и белков в жидкой фазе. Изобретение позволяет получить продукт с пониженным содержанием белковых компонентов и может быть использовано при дальнейшем получении препаратов. 1 з.п. ф-лы, 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для экстрагирования биологически активных веществ.

Известно, что простейшее TRYPANOSOMA CRUZI ингибирует развитие некоторых форм рака (см., например, Противораковый антибиотик круцин. Раздел П. Действие круцина на злокачественные опухоли экспериментальных животных и человека. Под ред. проф. Л.Б. Левинсона и Н.Г. Клюевой. Изд-во Московского университета, 1968, стр. 146-256). Описано действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы T. cruzi in vitro (см. КЛЕЩЕНКО Ю.Е., КАРПЕНКО Л.П., ВИЛЛАЛТА Ф. БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ, Издательство РАМН, т. 149, №6, с. 670-672, 2010). Установлено, что дефензин α-1 проявляет трипаноцидное действие на T. cruzi и инициирует фрагментацию ДНК паразита, что приводит к гибели трипаносом и снижению инвазирования культивируемых опухолевых клеток человека.

В этой связи важным является выделение из Т. cruzi субстанций на предмет изучения их онкопротекторной активности. Ключевым в решении этого вопроса является разработка метода экстракции активных биополимеров из клеток трипаносом.

В области биотехнологии известны различные способы экстрагирования целевых продуктов. Так, описан способ экстрагирования биологически активных веществ путем дезинтеграции биомассы многократным замораживанием и оттаиванием (см. RU 2381276 С2, СИДДХАНТА и др., 10.02.2010). Способ включает гомогенизацию сырья с получением экстракта, вакуумную фильтрацию экстракта, замораживание фильтрата с образованием массы и оттаивания полученной массы. Для удаления оттаявшей жидкости осуществляют сжатие продукта, полученного на стадии замораживания-оттаивания, и последующий отжим. Повторяют стадию замораживание-оттаивание и сжатие-отжим продукта. Полученный продукт растворяют в воде и сушат распылением для получения тонкодисперсного порошка.

Известен способ получения аналога рекомбинантного интерферона-γ человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli MH-1/pIFD10, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного дебриса и хроматографию на колонке с сорбентом (RU 2326944 С2, Мирошников и др., 20.06.2008).

Недостатком таких и подобных методов является то, что в экстракт при полном разрушении биомассы поступает большое количество балластных компонентов, а кроме этого часть компонентов может инактивироваться.

Более щадящим способом экстракции является обработка микробной биомассы ферментом, разрушающим клеточную стенку. В случае бактерий - это лизоцим, разрушающий основной структурный компонент пептидогликан (Янковский Д.С.и др. Использование метода полимеразной цепной реакции для идентификации бактериального состава мультикомпонентных пробиотиков. Современная педиатрия, 6(46)/2012, стр. 65-68 - ближайший аналог). Недостатком метода является то, что он применим только в случае получения лизата из бактерий.

Наиболее близким к патентуемому является способ выделения лизатов, обладающих противораковой активностью, из эпимастиготных форм Trypanosoma cruzi, выращенных на питательной среде NNN (автор ЦЭЦЭГСАГЖАН БАТМОНХ. Противораковая активность in vivo лизированных эпимастигот Trypanosoma cruzi различных генетических линий. Автореферат дисс. к.м.н., М.: 2005. с. 1-17). Этот способ включает получение лизатов путем обработки клеток эпимастиготных форм трипаносом дистиллированной водой, что приводит к лизису благодаря низкому осмотическому давлению, однако полученные лизаты характеризуются повышенным содержанием белкового компонента.

Настоящее изобретение направлено на разработку новой технологии выделения биополимеров из эпимастиготных форм Т. cruzi.

Способ выделения биополимеров из эпимастиготных форм Т. cruzi, включает следующие операции:

- получение биомассы культуры Trypanosoma cruzi в эпимастиготной форме из штамма TPAP/MX/2002/Albarrada («Бюллетень экспериментальной биологии и медицине», т. 156, №7, 2013, стр. 82-84) путем выращивания на жидкой питательной среде NNN при температуре 29(±0,5)°С;

- отмывку полученной биомассы и концентрирование ее до содержания не менее 6×108 клеток в 1 мл;

- введение в полученную концентрированную биомассу дефензина α-1 человека - синтетический препарат с аминокислотной последовательностью ACYCRIPACI AGERRYGY CIYQGRLW AFCC с молекулярной массой пептида 3,4 кДа в концентрации 20 мкг/мл до конечной его концентрации 3,97 мкМ и выдержку до образования пор в дилипидных мембранах, которая составляет около 24 часов;

- встряхивание полученной взвеси на шейкере с последующей выдержкой при комнатной температуре в течение не менее 24 часов;

- центрифугирование полученной среды с выделением биополимера в жидкой фазе.

Способ может характеризоваться тем, что перед введением дефензин α-1 человека в количестве 20 мкг разводят в 4 мкл 99,5% раствора диметилсульфоксида с последующим добавлением 0,5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР) pH=7,2.

Технический результат изобретения состоит в получении экстракта из объекта, относящегося к представителям простейших, при этом экстрагирование биополимеров производят селективно без разрушения клеточной структуры, вследствие чего полученный экстракт характеризуется пониженным содержанием белкового компонента.

Отличие от ближайшего аналога состоит в том, что после выращивания исходной биомассы Т. cruzi она обрабатывается дефензином α-1 человека по рекомендуемому режиму с последующим выделением искомого биополимера в жидкой фазе. Для этого полученная путем культивирования биомасса Т. cruzi центрифугируется, промывается ЗФР, ресуспендируется и доводится до концентрации не менее 6×108 клеток в 1 мл. Дефензин α-1 человека 20 мкг разводится в 4 мкл 99,5% раствора диметилсульфаксида и затем добавляется 0,5 мл ЗФР pH=7,2. Раствор дефензина добавляют к 1 мл биомассы до конечной его концентрации 3,97 мкМ, выдержку до образования пор в дилипидных мембранах, которая составляет около 24 часов. После встряхивания на шейкере взвесь оставляют на 24 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют и получают искомый биополимер в жидкой фазе.

Полученный экстракт тестируют на содержание белка и нуклеиновой кислоты. Ниже приведены также аналогичные результаты для описанных в аналогах рутинных методов экстрагирования активного компонента.

Пример. Для получения биологически активной субстанции проводилось экстрагирование из Trypanosoma cruzi штамма TPAP/MX/2002/Albarrada. Сравнивали три метода экстракции: многократное замораживание и оттаивание, ультразвуковую дезинтеграцию биомассы и патентуемую обработку дефензином α-1 человека.

Культура Т. cruzi в эпимастиготной форме получена на жидкой питательной среде NNN модифицированной М681 при температуре 29°C. Полученная биомасса отмыта и сконцентрирована до 6,26×108 клеток в 1 мл.

При получении экстракта путем замораживания и оттаивания биомассу помещали на 30 мин в морозильную камеру с температурой -70°C. Оттаивание проводили в паровой бане при температуре 37°C в течение 40 минут. Процедуру повторяли пятикратно.

Ультразвуковую дезинтеграцию культуры проводили в приборе Branson Digital Sonifler Model 250 при следующем режиме: амплитуда волн - 60% от максимальной проектной мощности прибора; количество пульсаций - 2; продолжительность пульсаций - 59 сек; интервал между пульсациями - 1 сек.

Получение экстракта проводили с использованием синтетического препарата дефензина α-1 человека с аминокислотной последовательностью: ACYCRIPACI AGERRYGY CIYQGRLW AFCC и молекулярной массой 3,4 кДа в рабочей концентрации 20 мкг/мл.

Процедуру экстрагирования осуществляли согласно описанной выше методике. После обработки биомассы материал микроскопировали. Установлено, что полная фрагментация клеток достигалась при обработке их ультразвуком, частичная - при замораживании и оттаивании. Обработка же дефензином изменяла только морфологию клеток. После такой обработки ширина амастигот увеличивалась более чем в три раза, с 0,84±0,13 до 3,31±0,67 мкм.

Пример. Для анализа содержания белка и ДНК использовали микроспектрофотометр NanoDrop 2000 с, Thermo Scientific с диапазоном длин волн 190-840 нм, предусматривающий методику пьедестального анализа, не требующего кювет и капилляров. Образец объемом 2 мкл наносили на неподвижный модуль прибора -пьедестал. Сверху на каплю опускали эмиссионный считывающий световой модуль прибора, в результате чего из образца формировался столбик жидкости. Прибор подсоединяли к компьютеру с установленным программным обеспечением The Thermo Software IQ program, с помощью которого анализировали полученные измерения.

Полученные экстракты сравнивались по содержанию в них белка и ДНК. При этом оказалось, что по уровню ДНК образцы существенно не отличались, в то время как по содержанию белка экстракт, полученный с использованием дефензина, имел более низкие показатели (23,58 мг/мл), чем экстракты, полученные двумя другими способами (30,25 мг/мл и 30,8 мг/мл). Если принять, что все экстракты содержали биологически активную субстанцию, то можно признать, что из трех образцов действие должно быть более выражено в том, где содержится меньшая доза белкового компонента, т.е. образец, полученный с использованием дефензина α-1 человека и подвергнутый селективной экстракции при фильтрации через поры в цитоплазматической мембране.

Таким образом, приведенные экспериментальные данные подтверждают, что патентуемый способ позволяет обеспечить достижение технического результата, а именно получить экстракт биополимера из эпимастиготных форм Trypanosoma cruzi с пониженным содержанием белкового компонента.

1. Способ выделения смеси ДНК и белков из эпимастиготных форм штамма TPAP/MX/2002/Albarrada культуры Trypanosoma cruzi, включающий
получение биомассы культуры Trypanosoma cruzi штамма TPAP/MX/2002/Albarrada;
отмывку полученной биомассы;
концентрирование ее до содержания не менее 6×108 клеток в 1 мл;
введение в полученную концентрированную биомассу синтетического препарата дефензина α-1 человека с аминокислотной последовательностью ACYCRIPACI AGERRYGY CIYQGRLW AFCC с молекулярной массой 3,4 кДа в количестве 20 мкг/мл до конечной его концентрации 3,97 мкМ и выдержку до образования пор в дилипидных мембранах;
далее встряхивают полученную взвесь на шейкере с последующей выдержкой при комнатной температуре в течение не менее 24 часов;
затем проводят центрифугирование полученной среды с выделением смеси ДНК и белков в жидкой фазе.

2. Способ по п.1, в котором перед введением дефензина α-1 человека в количестве 20 мкг разводят в 4 мкл 99,5% раствора диметилсульфоксида с последующим добавлением 0,5 мл забуференного физиологического раствора рН=7,2.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ деструкции рибонуклеиновых кислот.

Изобретение касается набора флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов для типирования штаммов Burkholderia mallei. Входящие в состав набора зонды имеют структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладают комплементарностью к продуктам реакции амплификации с праймерами.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к набору олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации Burkholderia mallei и дифференциации его от Burkholderia pseudomallei.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к паразитологии и касается способа видовой ДНК-дифференциации гельминтов - возбудителей церкариального дерматита человека. Дифференциацию четырех видов Trichobilharzia: Т.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу молекулярно-генетического типирования штаммов Bordetella pertussis. Способ включает выделение ДНК из штаммов B.pertussis, проведение полимеразной цепной реакции с одновременным введением специфических праймеров PF-PR для получения ампликонов фрагмента промотора коклюшного токсина ptxP, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазами KpnI и MluI и электрофорезу продуктов рестрикции в агарозном геле.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации вируса Эбола-Заир методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов для видоспецифической экспресс-идентификации вируса Эбола-Судан методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров и способа их использования для выявления Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus в заквасочных культурах.
Изобретение относится к области переработки биомассы. Предложен способ извлечения липидов из биомассы.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности веществ, обладающих способностью встраиваться в биологические мембраны клеточных стенок с нарушением функционирования клеток.
Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для иммунизации животного против кокцидиоза и способу иммунизации животного. Охарактеризованная вакцина содержит от приблизительно 10 до приблизительно 1000 ооцист из первого штамма Eimeria и от приблизительно 100 до приблизительно 10000 ооцист второго штамма указанного вида, причем первый и второй штаммы имеют асинхронные эндогенные периоды и первый штамм представляет собой неослабленный штамм Eimeria, а второй штамм представляет собой ранний штамм Eimeria.
Изобретение относится к области микробиологии, а именно к применению экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum. Экзометаболиты, выделенные из морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum путем экстракции этилацетатом культуральной жидкости, получаемой в процессе выращивания морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum с последующим удалением растворителя из этилацетатного экстракта и сушкой этилацетатного экстракта до постоянного веса, применяются в качестве стимулятора роста Yersinia pseudotuberculosis.
Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и биотехнологии и касается вакцины для профилактики кокцидиоза. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования микроорганизмов в искусственных питательных двухфазных средах. .
Изобретение относится к области медицины, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано, в частности, для определения чувствительности трихомонад к лекарственным препаратам с последующим подбором их концентраций, необходимых для уничтожения паразита.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике трихомонадной инфекции. .

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis путем секвенирования вариабельных участков трех генов Chlamydia trachomatis, таких как ompA, tsf, pmpF, полученных из бактериальной ДНК Chlamydia trachomatis, выделенной из клинического материала пациентов с урогенитальным хламидиозом, подвергнутых амплификации с последующим восстановлением последовательностей анализируемых генов, выравниванием и сравнительным анализом нуклеотидных последовательностей.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Применяют экстракт рибосомального белка (RPE) вида Leishmania для диагностики лейшманиоза у индивидуума, причем RPE содержит, по меньшей мере, два рибосомальных белка.
Наверх