Пептид, обладающий лечебным действием против болезни альцгеймера


 


Владельцы патента RU 2558242:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептидным терапевтическим средствам, и может быть использовано в медицине. Получен биологически активный пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера и состоящий из последовательности аминокислот Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala. Изобретение позволяет использовать полученный пептид для создания препарата, эффективного в терапии болезни Альцгеймера. 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему лечебным действием против болезни Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для терапии болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгейметра (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.

Наиболее широко применяемым классом препаратов являются ингибиторы холинэстераз (ИХЭ). ИХЭ увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к увеличению холинергической иннервации. Эффективность применения ИХЭ существенно снижается на поздних стадиях БА. ИХЭ характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других побочных эффектов [Watkins, P. B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998]. Известен препарат другого класса для симптоматического лечения БА - модулятор глутаматэргической системы, мемантин [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148 (5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его применение у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа, вместе с тем, препарат не обеспечивает полного излечивания БА. Важным недостатком компенсаторной терапии является то, что разрабатываемые внутри данного направления методы не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, способные не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.

Одна из современных гипотез предполагает, что пептиды β-амилоидного ряда, в частности βА-(1-42) в результате нарушения обменных процессов способны образовывать скопления в центральной нервной системе в виде амилоидных бляшек, что приводит к разрушению мозговой ткани [Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 2002. V. 297 (5580). P. 353-356].

В последние годы активно разрабатывались иммунотерапевтические методы предотвращения развития БА, направленные на коррекцию содержания в организме βА. Инъекции препаратами на основе βА вызывают образование специфических антител, которые способствуют удалению βА из мозга [Shenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. // Nature. 1999. V. 400( 6740). P. 173-177]. Ведущими западными фирмами разработано несколько препаратов [www.affiris.com/press_releases/press_release_mimoVAX_dec_11_06.pdf; www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00411580], однако, ни один из них не прошел успешно клинические испытания. Исследования были приостановлены в связи с тем, что у 6% пациентов, которые получали инъекцию бета-амилоида, обнаружился асептический менингоэнцефалит [Shenk D. Amyloid-β immunotherapy for Alzheimer′s disease: the end of the beginning. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3 (10). P. 824-828; Senior K. Dosing in Phasell trial of Alzheimer′s vaccine suspended. Lancet. Neurol. 2002. V. 1 (1). P. 3; Orgogozo J.M., Gilman S., Dartigues J.F., Laurent В., Puel M., Kirby L.C., Jouanny P., Dubois В., Eisner L., Flitman S., Michel B.F., Boada M., Frank A., Hock C. Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ1-42 immunization. Neurology. 2003. V. 61 (1). P. 46-54]. Данные результаты ставят под сомнение безопасность использования препаратов на основе βА в качестве иммунотерапевтических средств.

Принципиально новым подходом является использование фрагментов белка рецептора конечных продуктов гликозилирования (RAGE) для лечения БА. Рецептор RAGE характеризуется многофункциональностью, способен специфически связываться со многими лигандами, участвует в процессах роста клеток нервной системы, а при гиперэкспрессии в пожилом возрасте способствует развитию ряда патологий, таких как сахарный диабет, рост опухолей, болезнь Альцгеймера. Предполагают, что связывание рецептора RAGE с β-амилоидом способствует проникновению последнего через гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и накоплению в виде амилоидных бляшек - основной причины болезни Альцгеймера [Leclerc Е., Sturchler Е., Vetter S. The S100B/RAGE Axis in Alzheimer′s Disease. Cardiovasc. Psychiatry Neurol. 2010. V. 2010. P. 1-11]. Помимо RAGE, закрепленного в мембране и связывающегося с бета-амилоидом на поверхности нейронов мозга, в крови имеется также растворимая форма RAGE, состоящая из внеклеточной части белка. Растворимый RAGE, связывая бета-амилоид и препятствуя его проникновению в мозг, проявляет протективное действие и восстанавливает состояние пространственной памяти у экспериментальных животных. [Deane R., Du Yan S, Submamaryan RK, LaRue B, Jovanovic S, Hogg E, Welch D, Manness L, Lin C, Yu J, Zhu H, Ghiso J, Frangione B, Stern A, Schmidt AM, Armstrong DL, Arnold B, Liliensiek B, Nawroth P, Hofman F, Kindy M, Stern D, Zlokovic B. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nature medicine. 2003. V. 9. P. 907-913]. Эти данные служат теоретическим обоснованием нашей гипотезы о том, что введенный в организм фрагмент RAGE будет способен восстанавливать пространственную память животных с экспериментально индуцированной формой болезни Альцгеймера.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера.

Поставленная задача решается за счет пептида, обладающего лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы

Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

Сущностью изобретения является новый пептидный фрагмент белка RAGE формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (I), получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Предлагаемый препарат относится к терапевтическим средствам лечения БА. При интраназальном введении заявляемый синтетический пептид связывается с β-амилоидом и препятствует формированию комплекса, способного проникать через гематоэнцефалический барьер. Техническим результатом изобретения является отсутствие побочных эффектов при использовании пептида, высокая терапевтическая эффективность.

Интраназальное введение заявляемого препарата (I) препятствует ухудшению пространственной памяти у числа животных с экспериментально индуцированной формой БА. Вместе с тем введение данного пептида не приводит к ухудшению пространственной памяти у контрольных животных.

В качестве модели БА используют мышей, перенесших операцию удаления обонятельных луковиц головного мозга (ольфакторной бульбэктомии), после которой у животных развиваются морфологические и поведенческие признаки БА.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием алкоксибензильного полимера. Конденсации осуществляют при помощи гексафторфосфата бензтриазол-1-ил-N-окси-бис(диметиламино)урония. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Пример 1. Синтез пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.

Операция 1.

0,3 г алкоксибензильного полимера с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.

Операция 2. Получение Fmoc-Ala - полимера (I).

В 4 мл диметилформамида растворяют 0,467 г (1,5 ммоль) Fmoc-Ala-OH, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N′-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°C. Через 10 мин раствор добавляют к алкоксибензильному полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании 12 часов. Полученный Fmoc-Ala-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют. Содержание Fmoc-Ala в продукте составляет 1,05 ммоль на 0,3 г полимера.

Операция 3. Получение Fmoc-Val-Ala-полимера (II).

а) Полученный Fmoc-Ala - полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 4. Получение Fmoc-Ser(But)-Val-Ala-полимера (III).

а) Fmoc-Val-Ala-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(But)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 5. Получение Gmoc-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (IV).

а) Ser(But)-Val-Ala-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,185 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asp(But)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 6. Получение Fmoc-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (V).

а) Fmoc-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полученный полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 7. Получение Fmoc-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (VI).

а) Fmoc-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,152 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 8. Получение Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (VII).

а) Fmoc-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 9. Получение Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (VIII).

а) Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 10. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (IX).

а) Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,134 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) JV-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 11. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (X).

a)Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 12. Получение Fmoc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (XI).

а) Fmoc-Gln-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,152 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 13. Получение Fmoc-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)Val-Ala - полимера (XII).

а) Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,172 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(But)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 14. Получение Fmoc-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (XIII).

а) Fmoc-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 15. Получение Fmoc-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (XIV).

а) From-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 16. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-SerBut)-Val-Ala - полимера (XV).

a) Fmoc-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 17. Получение Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (XVI).

a) Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 18. Получение H-Ala-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Тrp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимера (XVII).

a) Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala - полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,140 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 19. Получение целевого пептида Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (XVII). 0,3 г пептидил-полимера (XVI) обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ С18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт лиофилизуют.

Данные аминокислотного анализа Asp 1,0 (1), Ser 1,8 (2), Glu 1,1 (1), Pro 1,7 (2), Gly 3,3 (3), Ala 1,8 (2), Val 2,0 (2), Leu 1,0 (1), Lys 1,0(1).

По данным масс-спектрометрии MH+1755. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 23,65 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ С18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.

Пример 2. Проведение биологических испытаний. Эксперименты проводят на мышах NMRI весом 20-30 г.

а) Операцию ольфакторной бульбэктомии проводят в стерильных условиях под гексеналовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно) с применением 0,5% раствора новокаина для местного обезболивания при скальпировании. Двустороннее удаление обонятельных луковиц проводят путем аспирации через трепанационное отверстие. Контрольных животных подвергают аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельных луковиц.

б) Из пептида, полученного по изобретению, готовят раствор в концентрации 5 мг/мл в физрастворе и через две недели после операции ольфакторной бульбэктомии начинают вводить мышам интраназально в объеме 4 мкл на одно животное ежедневно.

в) Через 4 недели после операции ольфакторной бульбэктомии проводят обучение животных в водном лабиринте Морриса. Экспериментальная камера представляет собой пластиковый круглый бассейн с диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой с температурой 23°С. Площадь бассейна условно делится на четыре равных сектора, в одном из которых находится спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забеляется молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.

Для опытов отбирают мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить спасательную платформу. В течение 5 дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно. В результате всех животных обучают находить спасательную платформу менее, чем за 10 сек. Затем в течение одной минуты у животных тестируют уровень пространственной памяти при отсутствии спасательной платформы. Состояние пространственной памяти каждого животного оценивают по его способности помнить отсек обучения и выделять его из 3-х других отсеков. В течение 1 минуты учитывают время пребывания животных в каждом отсеке. Обучившимися считают животных, время нахождения которых в отсеке обучения достоверно превышает время нахождения в каждом из других отсеков.

Результаты биологических испытаний заявляемого препарата приведены на рис. 1.

В ходе биологических испытаний показано, что бульбэктомированные мыши, интраназально получавшие дозу исследуемого пептида (I) выделяли (находили) сектор со спасательной платформой (сектор 3) достоверно чаще по сравнению с бульбэктомированными мышами, не получавшими дозу пептида (I). Аналогичные результаты получены при измерении времени нахождения животных в секторе 3. Также показано, что интраназальное введение пептида (I) не ухудшает пространственную память ложнооперированным мышам.

г) Токсичность полученного пептида исследуют на экспериментальных животных в системе in vivo. Исследование проводят на линейных мышах линии Balb/c весом 20 г с использованием максимальной дозы пептида 1 мг, вводимой подкожно. Животных держат под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности исследуемого препарата не выявлено.

Таким образом, получен новый пептид формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala, который обладает лечебным действием против болезни Альцгеймера.

Пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы:
Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к комбустиологии, и может быть использовано для стимуляции регенерации кожи. Для этого применяют синтетический аналог природного антимикробного пептида индолицидин, имеющего формулу H-Lys-Lys-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Lys-Lys-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к одиночному вариабельному домену, направленному против IL-6R, к полипептиду и конструкции, направленным против IL-6R, содержащим указанный одиночный вариабельный домен, а также к способам их получения.

Изобретение относится к полипептидам, имеющим гидролизуемые ковалентные связи с терапевтическими агентами, для доставки лекарственных средств. Эти полипептидные конъюгаты могут быть использованы в качестве векторов для транспортировки терапевтических препаратов через гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ) или для доставки в четко определенные виды клеток, такие как яичники, печень, легкие или почки.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для регулирования проницаемости метан-продуцирующей клетки. Получают полипептид, который способен проникать в метан-продуцирующую клетку и повышать ее проницаемость, характеризующийся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:117, 118 или 119 или по меньшей мере 90% идентичностью к указанной последовательности или по меньшей мере 15 последовательно расположенными аминокислотами указанной последовательности.

Изобретение относится к способу очистки даптомицина, включающий стадии а) загрузки частично очищенного даптомицина в анионообменную хроматографическую колонку и последующие стадии очистки б) и в) в обращено-фазовых хроматографических колонках, где элюирующий буфер на стадии а) представляет собой раствор одновалентной соли и элюирующий буфер на стадии б) и в) представляет собой водный спирт.

Изобретение относится к пептидным производным общей формулы (I), их стереоизомерам, их смесям и/или их фармацевтически приемлемым солям, к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к применению их для лечения, предупреждения и/или диагностики тех состояний, расстройств и/патологий, при которых экспрессируются соматостатиновые рецепторы sstr1, sstr2, sstr3, sstr4 и/или sstr5.
Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве.

Изобретение относится к применению пептида, имеющего последовательность, имеющую происхождение из аминокислотной последовательности белка SNAP-25, для лечения боли и/или воспаления.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду со способностью связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина, который выбран из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой X14 или X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту, варианта указанного пептида и его фармацевтически приемлемой соли.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложены соединения лабиринтопептинов А1, А2, или А3 формулы (I), где {A}, {B}, {C}, R1-R6, m и n имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Изобретение относится к гексапептиду формулы Thr-Gly-Glu-Asn-His-Arg-NH2, обладающему нейропротекторной и ноотропной активностью. Предложен новый состав фармацевтической композиции на основе пептида, который высокоэффективен в низких дозах и используется в виде капель в нос.

Изобретение относится к новой водорастворимой калиевой соли N-(4-ацетоксибензоил)глицина указанной ниже формулы, которая обладает церебропротективным действием. Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности для получения эффективных церебропротективных средств.

Изобретение относится к соединениям структурной формулы I, которые обладают ингибирующей секрецию Аβ42 активностью. В формуле I гетарил I представляет собой пяти- или шестичленную гетероарильную группу, содержащую 1-3 гетероатома, выбранных из О, S или N, гетарил II представляет собой пяти- или шестичленную гетероарильную группу, содержащую 1-3 гетероатома, как определено выше для гетарила I, или представляет собой бициклическую кольцевую систему, содержащую 1-4 гетероатома, выбранных из S, О или N, где по меньшей мере одно кольцо является ароматическим по своей природе, R1 представляет собой C1-7-алкил, C1-7-алкокси, C1-7-алкил, замещенный галогеном, или галоген; R2 представляет собой галоген, C1-7-алкил, C1-7-алкокси, гидрокси, C1-7-алкил, замещенный галогеном, C1-7-алкил, замещенный гидрокси, или бензо[1,3]диоксолил или представляет собой -(СНR)р-фенил, возможно замещенный галогеном, C1-7-алкилом, C1-7-алкокси, S(O)2-C1-7-алкилом, циано, нитро, C1-7-алкокси, замещенным галогеном, диметиламино, -(СН2)p-NHC(O)O-C1-7-алкилом или C1-7-алкилом, замещенным галогеном.

Группа изобретений относится к медицине и касается применения по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей SEFKHG(С), TLHEFRH(С), ILFRHG(С), TSVFRH(C), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SPNQFRH(С), ELFKHHL(С), THTDFRH(С), DEHPFRH(С), QSEFKHW(С), ADHDFRH(С), YEFRHAQ(С) и TEFRHKA(С), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.

Данное изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложена гибридомная клеточная линия FP12H3-C2, депонированная под номером DSM ACC2750, продуцирующая антитело против бета-амилоида.

Группа изобретений относится к фармацевтической композиции на основе соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, где X является S или O, и если X является S, R1 является OH или NH2; и если X является O, R1 является OH, NH2 или NHMe.
Изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения бессонницы. Указанная композиция включает корень горца многоцветкового и/или его экстракты, семя зизифуса колючего и/или его экстракты, плод шелковицы и/или его экстракты, ганодерму и/или его экстракты, луковицу лилии и/или ее экстракты, корневище анемаррены и/или его экстракты, корень шалфея многокорневищного и/или его экстракты, цветок хризантемы и/или его экстракты, порию и/или ее экстракты и цветок альбиции и/или его экстракты.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным пиразолопиридина формулы (I), а также к его таутомерам, геометрическим изомерам, энантиомерам, диастереомерам, рацематам и фармацевтически приемлемым солям, где G1 представляет собой Н; G2 представляет собой -CHR1R2; R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из Н; С1С6-алкокси-С1С6-алкила; C1-С6-алкила; необязательно замещенного фенила; необязательно замещенного фенил-С1-С6-алкила; необязательно замещенного морфолин-С1-С6-алкила; или -CHR1R2 вместе образуют кольцо, выбираемое из необязательно замещенного С3-С8-циклоалкила и замещенного пиперидина; G3 выбирают из необязательно замещенного С1С6-алкокси-С1-С6-алкила; C1-С6-алкила; замещенного фенила; замещенного фенил-С1С6-алкила; G4 выбирают из замещенного ацил-С1С6-алкила, где ацил предсталяет собой группу -CO-R и R означает Н или морфолин; необязательно замещенного C1-С6-алкила; необязательно замещенного фенила или индена; замещенного фенил-С1-С6-алкила; необязательно замещенного пиридин- или фуранил-С1С6-алкила; морфолин- или пиперидин-С1-С6-алкила; G5 представляет собой Н; где термин «замещенный» обозначает группы, замещенные от 1 до 5 заместителями, выбираемыми из группы, которая включает ″C1-С6-алкил,″ ″морфолин″, ″C1-С6-алкилфенил″, ″ди-С1-С6-алкиламино″, ″ациламино″, который означает группу NRCOR′, где R представляет Н и R′ представляет C1-С6-алкил, ″фенил″, ″фтор-замещенный фенил″, ″C1-С6-алкокси″, ″C1-С6-алкоксикарбонил″, ″галоген″.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к циклическому пептиду, способному индуцировать антительный ответ. Пептид состоит из формулы X2X3VGSNK-Z или X3VGSNKG-Z, где Х2 представляет собой E, G, Q или K, X3 представляет собой D или N и Z представляет собой агент, стабилизирующий изгиб, присутствующий внутри последовательности пептида, при этом пептид циклизован путем ковалентного связывания N-концевой аминокислоты с Z, где Z представляет собой пептидный фрагмент YNGK.

Изобретение относится к новым соединениям формулы I, в которой R1 и R2 являются одинаковыми или разными и выбраны из алкильной или алкенильной углеводородной цепи, значения группы R3, которая отщепляется липазой, определены в формуле изобретения.

Изобретение относится к области иммунологии. Рассмотрено применение пептида с аминокислотной последовательностью GLAGGSAQSQRAPDRVL для отбора СεmX-специфических антител и антигенсвязывающих фрагментов таких антител.
Наверх