Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae



Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae
Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсрнк) из клеток дрожжей saccharomyces cerevisiae

 


Владельцы патента RU 2558256:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") (RU)

Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 включает разрушение клеток дрожжей в буфере с pH 7,4, содержащем 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl, обработку додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% 20-25 мин при 20°C и хлороформом в концентрации до 25% 20-25 мин при 20°C. Полученную смесь центрифугируют при 6000 об/мин 20 мин. Концентрирование дсРНК проводят в 7-8%-ном растворе ПЭГ 6000 не менее 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием при 6000 об/мин 20 мин и растворением полученного осажденного концентрата в воде. Отделяют оцРНК от дсРНК в 2 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием смеси при 6000 об/мин 20 мин и сбором водной фазы. Осаждают дсРНК из водной фазы в 3,5 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием при 6000 об/мин 20 мин с получением осадка и растворением его в воде. Очистку и осаждение дсРНК из раствора осуществляют 55%-ным раствором этанола. Изобретение обеспечивает увеличение выхода дсРНК с более высокой чистотой и интерферон-индуцирующей активностью. Выход дсРНК составляет не менее 90%, а титр интерферона в сыворотке крови с использованием препарата на основе раствора дсРНК составляет через 24 ч 1280±60 ед./мл. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к способам получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из дрожжей и может быть использовано в биотехнологии, фармацевтической промышленности и ветеринарии для производства противовирусных и иммуномодулирующих препаратов.

Известен способ получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий разрушение клеток, осаждение суммарных нуклеиновых кислот из клеточного экстракта этанолом, фракционирование и осаждение дсРНК в растворах хлористого лития, очистку дсРНК в водном растворе с помощью хлороформа или смеси хлороформа с изоамиловым спиртом и выделение целевого продукта этанолом (Дужак А.Б., Костомаха А.Н., Лобова Н.Н., Подгорный В.Ф., Носик Н.Н., Ершов Ф.И. Антибиотики и медицина // Биотехнология. 1985. - Т. 30, № 1. - С. 19-21) [1].

Для более полной очистки дсРНК авторы рекомендуют многократное фракционирование хлоридом лития, что приводит к технологическим потерям и снижению выхода целевого продукта. Кроме того, при коцентрациях LiCl 2 моль/белки не осаждаются, а при концентрациях выше 3,5 моль/л осаждаются вместе с дсРНК. А примеси белков и липополисахаридов вызывают пирогенные и аллергенные эффекты при применении препаратов в медицине и ветеринарии. Предусматриваемый известной технологией значительный расход этанола, особенно на стадии осаждения нуклеиновых кислот из клеточного экстракта, обуславливает необходимость принятия специальных мер для обеспечения пожаробезопасности производства, что ведет к увеличению себестоимости продукта.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения дсРНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Патент РФ № 2302464, МПК С12Р 12/34, дата публикации 10.07.2007) [2]. Способ предусматривает обработку клеток дрожжей культуральной жидкостью Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С в течение 15-20 ч, депротоинизацию термообработкой при температуре 75-90°С в течение 5-20 мин, диафильтрацию на разделительном аппарате с полыми волокнами АР-2 с пределом отсечения 100 кДа, фракционирование растворами LiCl (2 и 4 моль/л), обработку хлороформом, осаждение дсРНК в 65%-ном растворе этанола и промывку 96%-ным раствором этанола.

Однако использование в технологии получения дсРНК таких жестких условий, как прогревание при температуре 75-90°С, приводит к «расплетанию» цепей РНК, а механические воздействия при диафильтрации (контакт с большой поверхностью и продавливание через поры под давлением) приводят к деформации структуры дсРНК и нестабильности ее при хранении. Кроме того, прогревание больших объемов до 75-90°С в течение 5-20 мин может приводить к значительным локальным перепадам температур и трудновоспроизводимости процесса получения дсРНК. В связи с вышеизложенным в технологии-прототипе обеспечиваются недостаточный выход дсРНК и его низкая интерферон-индуцирующая активность, а также длительность получения конечного продукта и высокие затраты на его производство.

Техническим результатом заявляемого изобретения является увеличение выхода дсРНК с более высокой чистотой и интерферон-индуцирующей активностью при одновременном снижении времени и затрат на его производство.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, согласно изобретению клетки дрожжей разрушают в буфере с рН 7,4, содержащим 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl последовательной обработкой додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% в течение 20-25 мин при 20-25°С и хлороформом в концентрации до 25% в течение 20-25 мин при 20-25 С; полученную смесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, отделяют надосадочную жидкость и ее обрабатывают додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% в течение 20-25 мин при 4-6°С, повторно центрифугируют полученную смесь при 6000 об/мин в течение 20 мин с отделением надосадочной жидкости; концентрирование дсРНК из надосадочной жидкости проводят в 7-8%-ном растворе ПЭГ 6000 в течение не менее 5 ч при 4°С с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин и растворением полученного осажденного концентрата в воде; фракционирование нуклеиновых кислот осуществляют в 2 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 4°С с последующим центрифугированием смеси при 6000 об/мин в течение 20 мин и сбором водной фазы; осаждение дсРНК из водной фазы проводят в 3,5 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 4°С с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин с получением осадка и растворением его в воде, а окончательную очистку и осаждение дсРНК из раствора осуществляют 50-55%-ным раствором этанола. Полученный дсРНК лиофильно высушивают.

В качестве клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae используют штамм ВКПМ Y-448 указанных дрожжей.

Вариант практического осуществления предлагаемого способа иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1. Выбор способа разрушения клеток дрожжей и получения раствора дсРНК

В отличие от ДНК плазмид структура дсРНК киллерных дрожжей менее устойчива к действию деградирующих факторов, таких как изменения значений рН, температуры. Поэтому для разрушения клеток дрожжей было исследовано влияние детергентов и растворителей при температурах не выше 20°С и нейтральных значениях рН используемых буферных растворов. При этом критерием эффективности процесса являлась полнота извлечения дсРНК и оцРНК при наименьшем ее загрязнении белками и липидами клеток.

Клеточную массу суспендировали в буфере А (10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl, рН 7,4) из расчета на 1 г клеток 2 мл раствора, делили на аликвоты, добавляли ингредиенты и проводили лизис в течение 20 минут (Процедура 1, условия приведены в табл.1). Для оценки влияния различных концентраций детергента использовали исходный 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS) и хлороформ в расчетных необходимых количествах, а также последовательности их введения в суспензию дрожжей. После внесения реактивов растворы тщательно перемешивали, не допуская ценообразования. По истечении времени лизиса (Процедура 1) часть проб центрифугировали, отбирали водные растворы и добавляли дополнительно додецилсульфат натрия (SDS) или хлороформ (Процедура 2). Пробы 4-6 перед внесением хлороформа не центрифугировали. Пробы вновь тщательно перемешивали, не допуская ценообразования, и затем центрифугировали. Выход ПК и белков в полученные растворы из клеточного материала исследовали при помощи электрофореза: нуклеиновых кислот - в 1%-ном геле агарозы, белков - в 13%-ном ПААГ. Результаты обрабатывали с использованием компьютерной программы Gel-pro31.

Примечание: ц/ф - центрифугирование 6000 об/мин, 20 мин.

Результаты исследований по переходу в раствор клеточного содержимого представлены на фиг. 1 в виде электрофореграмм образцов растворов после лизиса клеток (табл. 1). Верхний гель (А) - 1%-ная агароза (окраска бромистым этидием); нижний гель (Б) - 13%-ный ПААГ (окраска по Кумасси), справа - маркеры молекулярных масс белков, кДа.

На электрофореграммах видно, что обработка суспензии клеток хлороформом (25%) приводит к их разрушению и частичному выходу в раствор дсРНК и белков (дорожки № 1-3). Повторная обработка раствора, полученного после центрифугирования, хлороформом не способствовала удалению из него белков (дорожка № 2). Обработка того же раствора SDS (до 1%) приводила к удалению части белков, особенно белка с молекулярной массой 30±2 кДа (дорожка № 3). Обработка идентичной суспензии клеток SDS (1%) также вызывала разрушение и выход в раствор дсРНК в количествах, аналогичных, как при обработке хлороформом (дорожки № 7-8). Количество белков, особенно с молекулярными массами выше 30 кДа, в этом случае наблюдалось больше. При повторной обработке раствора, полученного после разрушения клеток SDS и центрифугирования, хлороформом также не наблюдалось удаления из него белков (дорожки № 7 и 8), но при этом наблюдалось удаление низкомолекулярных (ниже 20 кДа) примесей.

Последовательная (и совместная) обработка суспензии клеток SDS и хлороформом приводила к более полному разрушению клеток и выходу в раствор РНК и белков (дорожки №4-6). Отмечено, что при концентрациях раствора SDS 0,5% и 1% выход по дсРНК практически одинаковый, но при 1% концентрации SDS в растворе наблюдалось больше белкового материала и оцРНК.

Примечательно, что при таких относительно быстрых способах разрушения клеток молекулы ДНК в растворе практически не обнаруживаются (отсутствует флуоресцирующий материал в карманах геля агарозы при электрофорезе и последующей окраске бромистым этидием, фиг. 1).

Использование такого способа лизиса обеспечивает эффективную деструкцию клеток без привлечения энергоемкого технологического оборудования для механической дезинтеграции биомассы [1] и без длительной инкубации с культуральной жидкостью Arthrobacter luteus ATSS 21606 [2], что, в свою очередь, снижает затраты на производство продукта.

Пример 2. Выбор концентрации полиэтиленгликоля для концентрирования дсРНК

Для исследования распределения компонентов в растворах полиэтиленгликоля (ПЭГ) к лизату клеток, полученному по способу 5, добавляли сухой ПЭГ, перемешивали 20 мин до полного растворения, выдерживали 5 ч при 6°С для формирования осадка и центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин. Анализ содержимого осадков исследовали после растворения их в буфере. Результаты анализа представлены на фиг. 2 в виде электрофореграмм образцов после фракционирования в растворах ПЭГ(5-10%). Верхний гель - 1%-ная агароза, нижний - 13%-ный ПААГ.

На фиг. 2 видно, что дсРНК исчезает из надосадочной фракции и обнаруживается в осадке при концентрации ПЭГ выше 7%, тогда как основная масса одноцепочечных РНК продолжает находиться в растворе и лишь при концентрации ПЭГ 10% начинает обнаруживаться в осадке. Белки при этом также обнаруживаются в растворе, и лишь при концентрации ПЭГ 10% в осадке наблюдались белковые полосы, преимущественно с молекулярной массой около 26 и 30 кДа.

Пример 3. Выбор концентраций хлористого лития для фракционирования дсРНК

Для исследования распределения компонентов в растворах LiCl, чтобы исключить влияние других солей, использовали осадок, полученный после обработки 10%-ным раствором ПЭГ (фиг. 2), растворенный в воде. К водному раствору добавляли охлажденный раствор LiCl (8 моль/л), перемешивали и выдерживали 5 ч при 6°С для формирования осадка, затем центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин. Анализ содержимого осадков исследовали после растворения их в воде. Результаты анализа представлены на фиг. 3 в виде электрофореграмм образцов после фракционирования в растворах LiCl (1-4 моль/л). Верхний гель-1%-ная агароза, нижний - 13%-ный ПААГ.

На фиг. 3 видно, что дсРНК исчезает из надосадочной фракции и обнаруживается в осадке при концентрациях LiCl выше 2,5 моль/л. Белки начинают обнаруживаться в осадке в следовых количествах при концентрации LiCl 3 моль/л и с увеличением концентрации соли они количественно переходят в осадок.

Пример 4. Выбор концентрации этанола для осаждения дсРНК

Для исследования распределения компонентов в растворах спирта к лизату клеток добавляли охлажденный этанол, перемешивали и выдерживали 5 ч при минус 20°С для формирования осадка, затем центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин. Анализ содержимого осадков исследовали после растворения их в воде. Результаты анализа представлены на фиг. 4 в виде электрофореграмм образцов после фракционирования в растворах этанола (15-70%). Верхний гель - 1%-ная агароза, нижний - 13%-ный ПААГ.

На фиг. 4 видно, что дсРНК начинает обнаруживаться в осадке уже при концентрации этанола 15% и исчезает из надосадочной фракции в 40%-ном растворе этанола. Аналогично ведет себя и одноцепочечная РНК. Распределение белков а данном эксперименте не исследовали. По результатам этого эксперимента можно сделать вывод о том, что на стадии фракционирования этанолом дсРНК от одноцепочечной не отделяется.

Пример 5. Выделение и очистка дсРНК

На основании вышеприведенных экспериментальных данных была составлена следующая схема выделения и очистки дсРНК (табл. 2).

Характеристики фракций при выделении и очистке дсРНК представлены на фиг. 5. Электрофореграммы образцов растворов при выделении и очистке дсРНК содержат:

- слева - 1%-ный агарозный гель, дорожки: 1- экстракт клеток; 2 - экстракт после дополнительной обработки SDS; 3 - раствор из осадка после фракционирования ПЭГ; 4 - конечный препарат;

- справа - 13%-ный ПААГ, дорожки: 1- экстракт клеток; 2 - экстракт после дополнительной обработки SDS; 3 - раствор из осадка после фракционирования ПЭГ; 4 - надосадочный раствор при фракционировании ПЭГ. Сбоку - маркеры молекулярных масс, кДа.

Как видно из фигуры 5, дополнительная обработка экстракта SDS приводит к удалению части белков, особенно белка с молекулярной массой 30±2 кДа (дорожки 2). Осаждение дсРНК в 8%-ном растворе ПЭГ способствует освобождению ее от остальной массы белков, которые остаются в растворе (дорожки 3 и 4 ПААГ) и значительной части оцРНК (дорожка 3 агарозного геля).

Известно, что часть одноцепочечных РНК начинает осаждаться при концентрациях LiCl выше 1 моль/л, поэтому перед тем как осадить дсРНК 3,5 моль/л LiCl, предварительно добавляли его до концентрации 2 моль/л, раствор выдерживали 5 ч при 6°C, центрифугировали и для дальнейшей очистки дсРНК отбирали надосадочную фракцию.

Использование 50-55%-ного раствора этанола вместо 65% и 96%-ного [прототип, 2] позволяет снизить его расход и пожаробезопасность процесса.

Выход дсРНК из 1 г клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 составлял не менее 90% от ее исходного содержания, 0,8-1,0 мг. Спектральные характеристики препаратов соответствовали: А260/А280=1,95±0,10, А260/А230=2,0±0,1, что свидетельствует о его высокой чистоте.

Пример 6. Определение интерферон-индуцирующей активности препарата

Определение интерферон-индуцирующей активности проводили на самцах белых беспородных мышей с массой тела 18-22 г по 5 голов в каждой группе, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Свежеприготовленный раствор препарата на основе дсРНК вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг дсРНК на кг массы тела в объеме 200 мкл/мышь. Контрольной группе животных вводили изотонический раствор в том же объеме. Через 6, 24 и 48 ч после введения препарата у мышей забирали кровь на анализ. Содержание интерферона определяли микрометодом (Ершов Ф.И., Сайиткулов A.M. Микрометод для изучения индукторов интерферона in vitro/Qonp. Вирусол. - 1984. - Т. 29, №6. - С. 756-757) [3] по подавлению цитопатогенного действия тест-вируса (вируса энцефаломиокардита, (ЕМС), штамм «Колумбия») в дозе 100 ЦПДзо в перевиваемой культуре клеток мышиных фибробластов L-929, выращенных в 96 луночных культуральных панелях (полистироловых планшетах с плоским дном). За титр сывороточного интерферона принимали обратную величину его большего разведения, при котором наблюдается 50% защита клеток от цитопатогенного действия тест-вируса.

Результаты исследования интерферон-индуцирующей активности представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что при введении мышам препарата получаемого дсРНК в дозе (10±2) мкг/животное титр интерферона в сыворотке через 6 ч достигал 640 UE, через 24 ч - 1280 UE, снижаясь до исходных значений к концу вторых суток после введения.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получать препарат индуктора интерферона - двуспиральные рибонуклеиновые кислоты дрожжевой клетки с высокой интерферон-индуцирующей активностью, с прочной вторичной структурой. Способ не содержит таких «жестких» процедур, как механическое разрушение, обработка повышенной температурой, и позволяет сохранить высокую биологическую активность препарата.

Кроме того, процедура занимает меньше времени, не требует сложного оборудования и расхода этанола.

1. Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм ВКПМ Y-448, характеризующийся тем, что клетки дрожжей разрушают в буфере с pH 7,4, содержащим 10 мМ Трис, 20 мМ ЭДТА и 0,5 М NaCl, обработкой додецилсульфатом натрия в концентрации от 0,5 до 1,0% в течение 20-25 мин при 20°C и хлороформом в концентрации до 25% в течение 20-25 мин при 20°C; полученную смесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, отделяют надосадочную жидкость; концентрирование дсРНК из надосадочной жидкости проводят в 7-8%-ном растворе ПЭГ 6000 в течение не менее 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин и растворением полученного осажденного концентрата в воде; отделение оцРНК от дсРНК осуществляют в 2 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием смеси при 6000 об/мин в течение 20 мин и сбором водной фазы; осаждение дсРНК из водной фазы проводят в 3,5 моль/л растворе LiCl в течение 5 ч при 6°C с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин с получением осадка и растворением его в воде, а окончательную очистку и осаждение дсРНК из раствора осуществляют 55%-ным раствором этанола.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученный дсРНК лиофильно высушивают.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к области биохимии. Заявлены варианты способа скрининга и мониторинга онкологических заболеваний, включающего забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию методом множественной обратной транскрипции полимеразой цепной реакции с последующим анализом амплифицированных продуктов.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения дрожжевого экстракта, содержащего биологически активную высокополимерную РНК.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения свободного от белка биологически активного препарата высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и диагностическому набору для диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша.
Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии для получения представляющих практический интерес белков, являющихся продуктами молчащих генов или генов с низким уровнем экспрессии.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими представляющими интерес нуклеотидными последовательностями.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения дрожжей, имеющих повышенное клеточное содержание серосодержащего соединения, выбранного из группы, состоящей из цистеина, γ-глутамилцистеина, глутатиона и цистеинилглицина, по сравнению с родительским штаммом дрожжей который демонстрирует ауксотрофию по аденину и имеет модификацию для усиления экспрессии гена МЕТ25, включающий подвергание родительского штамма обработке агентом для мутагенеза, распределение модифицированных дрожжей по питательной среде, имеющей содержание аденина 25 мг/л или менее, для образования колоний дрожжей, отбор колонии дрожжей, которая краснее по сравнению с родительским штаммом до модификации, и отбор дрожжей, имеющих повышенное клеточное содержание указанного серосодержащего соединения по сравнению с родительским штаммом.
Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения белкового ингредиента.

Изобретение относится к способу получения настоя чайного гриба. Способ предусматривает культивирование микроорганизма Medusomyces Gisevii Lindau в условиях аэрации при 23-25°C в углеводсодержащей среде, при этом в качестве источника углеводов и стимулятора роста используют высушенный гомогенат подмора пчел из расчета 8-10 г на 1 л питательной среды.

Штамм дрожжей Saccharomyces bayanus IMB Y-5022 для производства игристых вин резервуарным способом относится к производству игристых вин периодическим способом из белых, красных и розовых сортов винограда при вторичном брожении в акратофорах.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к области культивирования микроорганизмов для получения кормовых продуктов, и может быть использовано в промышленности для получения биомассы каротинсинтезирующих дрожжей как источника каротиноидов.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения α-кетоглутаровой кислоты предусматривает аэробное культивирование на питательной среде штамма дрожжей Yarrowia lipolytica BKM Y-2412.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены штаммы Cryptococcus flavescens 3C NRRL Y-50378 и Cryptococcus flavescens 4С NRRL Y-50379 для подавления и контроля фузариоза злаков, обладающие устойчивостью к протиоконазолу.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения порошкообразной селенсодержащей кормовой добавки из пивных дрожжей.

Изобретение относится к винодельческой промышленности. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae «Айвовый-Д» депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером Y-3973.

Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена рекомбинантная плазмида рСНВН для экспрессии в Pichia pastoris последовательности, кодирующей прокарбоксипептидазу Б, имеющая размер 10466 т.п.о и состоящая из XhoI/EcoRI - фрагмента ДНК вектора рР1С9К размером 9246 т.п.о.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения хитин-глюканового комплекса и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу. Способ включает ферментацию дрожжей Pichia pastoris DSMZ 70887 в культуральной среде, содержащей источник азота, отличный от дрожжевого экстракта или пептона, и источник углерода. В качестве источников углерода могут быть использованы чистый глицерин, чистый метанол, богатые глицерином или богатые метанолом смеси. При этом во время ферментации поддерживают pH в диапазоне 5,0 - 7,0 путем добавления щелочи, аммиака или соли аммония. Изобретение позволяет оптимизировать ферментацию Pichia pastoris для достижения высокой плотности клеток и высокого содержания хитина в клеточных стенках, а также полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу. 19 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Наверх