Пептиды горохового белка с анти-helicobacter pylori активностью
Изобретение касается применения композиции, включающей гидролизат горохового белка и/или пептид для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции Helicobacter pylori (варианты), а также таких композиций (варианты). Охарактеризованные композиция включают липидную, белковую и углеводную составляющую, в которой белковая составляющая включает источник белка, состоящий из гидролизата горохового белка, полученный гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин, или из пептидов, выбираемых из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Хаа независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10, где пептид содержится в гидролизате горохового белка, или из того и другого. Представленные изобретения позволяют лечить или предотвращать заболевания, вызванные инфекцией Helicobacter pylori, и/или заболевания, ассоциированные с инфекцией Helicobacter pylori у млекопитающих. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к лечению и профилактике инфекций желудочно-кишечными патогенами, в частности Helicobacter pylori.
Предшествующий уровень техники изобретения
Инфекции желудочно-кишечного тракта являются серьезной проблемой у многих людей и, в частности, у детей и пациентов с нарушениями иммунной системы или заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Формирующиеся заболевания могут быть угрожающими жизни. Инфекции желудочно-кишечного тракта часто вызывают Escherichia coli, Salmonella, Campylobacter, Porphyromonas gingivalis, Clostridium, Enterobacter и Helicobacter, например, Helicobacter pylori.
Helicobacter pylori (H. pylori) представляет собой грамотрицательную, микроаэрофильную жгутиковую бактерию, которая при инфицировании колонизирует слизистую оболочку желудка человека. Инфекция H. pylori ассоциирована с тяжелыми заболеваниями желудка, такими как гастрит, пептическая язва и рак желудка. Всемирная Организация Здравоохранения классифицирует H. pylori как канцероген I группы. Инфекция H. pylori обычно является хронической и, как правило, не излечивается без специфической терапии.
Инфекция H. pylori преимущественно приобретается в раннем детстве. Большинство детей инфицируется в течение первых 5 лет жизни. К возрасту 10, общая частота составляет более чем 75% в развивающихся странах, тогда как в развитых странах инфицированы 10%, но частота может возрастать до 30-40% у детей из низших социоэкономических групп.
В связи с проблемами лечения антибиотиками и профилактики путем вакцинации необходимо предотвращать адгезию к слизистой желудка и, следовательно, инфицирование H. pylori, в идеале путем пищевого перорального вмешательства.
Для эрадикации инфекции H. pylori требуется три или четыре препарата с антибиотиками. Лечение является очень дорогим и также существует риск увеличения антибиотикорезистентности бактериальных штаммов и реинфицирования после неудачного лечения. Лечение детей может быть наиболее экономически выгодным методом снижения частоты инфицирования и заболеваемости и смертности, ассоциированной с заболеваниями, связанными с H. pylori. К настоящему времени не существует руководств по необходимости лечения детей. До настоящего времени недоступна человеческая вакцина. Профилактика и терапевтическая вакцинация были успешными в моделях на животных, но переход к человеческим вакцинам остается затрудненным, частично из-за того, что иммунология желудка все еще недостаточно изучена.
В связи с проблемами лечения антибиотиками и профилактики путем вакцинации, необходимо предотвращать адгезию H. pylori к слизистой оболочке желудка. Без адгезии бактерии риск связанного воспаления, приводящего к гастриту или возможно раку, может быть минимизирован. Доказано, что диетические модификации могут быть применимыми в поддержании лечения или профилактики инфекции H. pylori in vivo и in vitro.
EP 1178104 относится к пищевой композиции, включающей специфическое эфирное масло и/или специфическое чистое соединение, выделенное из эфирного масла, для профилактики или лечения инфицирования микроорганизмом, подобным Helicobacter. Пищевая композиция также может содержать источник углеводов, источник жира и/или источник пищевого белка, гороховый белок является одним из них.
В JP 2005255679 описан полипептид, полученный путем обработки пахты протеазой, имеющий не только эффект ингибирования адгезии Helicobacter pylori к слизистой оболочке желудка, но также эффект открепления Helicobacter pylori от слизистой оболочки желудка носителей Helicobacter pylori.
В JP 2001335504 описан ингибитор пролиферации Helicobacter pylori, который включает в качестве активного ингредиента ферментативный гидролизат соевых белков.
В WO 2008/043424 описана композиция для лечения и/или профилактики инфекции желудочно-кишечными патогенами, в частности Helicobacter pylori, и/или инфекций, ассоциированных с инфицированием указанным желудочно-кишечным патогеном у млекопитающих. Композиция включает гидролизат горохового белка, интактный гороховый белок и/или гидролизат белка верблюжьего молока. Описан гидролизат горохового белка, полученный гидролизом посредством химотрипсина и трипсина.
В DE 10317935 описано применение казеина для получения композиции для профилактики или лечения инфекции Helicobacter и для профилактики заболеваний, вызванных инфекцией Helicobacter.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению композиции, включающей специфические пептиды горохового белка для лечения и/или профилактики инфекций желудочно-кишечными патогенами и/или заболеваний, ассоциированных с инфекциями, указанными желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающих, особенно инфекций желудочно-кишечными патогенами, выбираемыми из группы, состоящей из Helicobacter, Escherichia coli, Salmonella, Porphyromonos gingivalis, Campylobacter, Clostridium и Enterobacter. Изобретение, кроме того, относится к применению специфического гидролизата горохового белка, не получаемого путем гидролиза химотрипсином, для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции или заболевания, указанных выше.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что специфический гидролизат горохового белка способен ингибировать адгезию H. pylori к клеткам слизистой оболочки желудка. Ингибирование адгезии делает такие белковые компоненты особенно подходящими для применения в способе для лечения и/или профилактики инфекции Helicobacter. Гидролизат горохового белка получают гидролизом изолята горохового белка посредством трипсина. Выделили и идентифицировали пептиды, ответственные за ингибирование адгезии. Обнаружили, что пептиды по настоящему изобретению Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg (SEQ ID NO: 1) и Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg (SEQ ID NO:2), образующие часть горохового легумина A и вицилина, ингибируют адгезию H. pylori к клеткам желудка. Так как эти пептиды имеют участок расщепления химотрипсином, гидролизат горохового белка может быть получен путем гидролиза протеазами, предпочтительно трипсином, с условием, что протеазой не является химотрипсин, или с помощью препаратов протеаз, предпочтительно препаратов трипсина, которые по существу не обладают активностью химотрипсина.
Настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка могут быть легко добавлены в детские смеси, детские продукты и продукты для молодых людей. Простое и безопасное применение такого белкового компонента делает настоящее изобретение особенно важным, поскольку для лекарственных препаратов обычно имеют место проблемы побочных эффектов, и срывается дорогое лечение множеством лекарственных препаратов. Настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка также могут соответствующим образом быть использованы взрослыми. Настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка нет необходимости вводить отдельно (например, детям), но можно вводить совместно с пищевыми композициями.
Так как увеличенная продолжительность исключительно грудного вскармливания в младенчестве может обладать длительным защитным эффектом против хронической инфекции H. pylori и, следовательно, риска карциномы желудка, особенно желательно также защищать от инфекции H. pylori младенцев, которые получают детские смеси.
Подробное описание
Следовательно, настоящее изобретение касается способа для лечения и/или профилактики и/или уменьшения риска инфицирования желудочно-кишечными патогенами и/или заболеваний, ассоциированных с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающих, указанный способ включает введение указанному млекопитающему композиции, включающей гидролизат горохового белка, с условием, что указанный гидролизат горохового белка не получали гидролизом протеазой химотрипсином. Предпочтительно, гидролизат горохового белка получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин.
Изобретение также может быть сформулировано как применение композиции, включающей гидролизат горохового белка для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающих, с условием, что указанный гидролизат горохового белка не получают гидролизом протеазой химотрипсином.
Изобретение также может быть сформулировано как композиция, включающая гидролизат горохового белка для применения в лечении и/или профилактике инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами у млекопитающих, с условием, что указанный гидролизат горохового белка не получают гидролизом протеазой химотрипсином.
В одном аспекте изобретение касается способа для лечения и/или профилактики и/или уменьшения риска инфицирования желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающего, указанный способ включает введение указанному млекопитающему композиции, включающей по меньшей мере один пептид, выбираемый из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10.
Изобретение также может быть сформулировано как применение композиции, включающей пептид, для получения композиции для лечения и/или профилактики инфицирования желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающего, где пептид выбирают из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10.
Изобретение также может быть сформулировано как композиция, включающая по меньшей мере один пептид, выбираемый из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10, для применения в лечении и/или профилактике лечения инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающего.
В следующем аспекте изобретение также касается композиции, содержащей липидные, белковые и углеводные составляющие, где липидная составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий и углеводная составляющая обеспечивает от 15 до 90% суммарного ежедневного потребления калорий, где белковая составляющая включает (i) по меньшей мере, один источник белка, состоящий из гидролизата горохового белка, с условием, что гидролизат горохового белка не получен гидролизом протеазой химотрипсином и (ii) по меньшей мере, один источник азота, выбираемый из группы, состоящей из молочных белков, гидролизата молочного белка, яичных белков, гидролизата яичного белка, соевого белка, гидролизата соевого белка, белка пшеницы, гидролизата белка пшеницы, рисового белка, гидролизата рисового белка, свободных аминокислот и их смесей.
В еще одном аспекте изобретение касается композиции, содержащей липидную, белковую и углеводную составляющую, где липидная составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий и углеводная составляющая обеспечивает от 15 до 90% суммарного ежедневного потребления калорий, где белковая составляющая включает (i) по меньшей мере, один пептид, выбираемый из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10 и, (ii) по меньшей мере, один источник азота, выбираемый из группы, состоящей из молочных белков, гидролизата молочных белков, яичных белков, гидролизата яичного белка, соевого белка, гидролизата соевого белка, белка пшеницы, гидролизата белка пшеницы, рисового белка, гидролизата рисового белка, свободных аминокислот и их смесей.
Белок
Настоящее изобретение обеспечивает композицию и ее применение для настоящего лечения, содержащую гидролизат горохового белка, полученный протеазами, иными, чем химотрипсин. Предпочтительно гидролизат горохового белка получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин, более предпочтительно гидролизат горохового белка получают гидролизом трипсином. Более предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает специфические пептиды деградации горохового белка, получаемые гидролизом трипсином, а именно Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10. Следовательно, n и m независимо могут быть 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В предпочтительном варианте осуществления изобретения каждый из пептидов Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam имеет расчетную молекулярную массу между 1 кДа и 2,5 кДа, предпочтительно между 1 кДа и 2 кДа, предпочтительно между 1 и 1,5 кДа. В одном варианте осуществления изобретения n и m равны 0. Так как такие пептиды имеют участки расщепления химотрипсином, и так как было обнаружено, что более мелкие фрагменты таких пептидов являются неактивными, гидролизат горохового белка не может быть получен гидролизом химотрипсином или трипсином плюс химотрипсин. При потреблении таких пептидов, они будут дополнительно разрушаться в кишечном тракте человека. Однако, так как химотрипсин и другие ферменты, как карбокси и аминопептидазы, высвобождаются только в двенадцатиперстной кишке, пептиды все еще присутствуют в их активной форме в желудке, месте, где преимущественно присутствует H. pylori. Так как было обнаружено, что такие пептиды получают из горохового белка легумина A или вицилина, гидролизат горохового белка предпочтительно представляет собой гидролизат горохового легумина A и/или горохового вицилина, полученный протеазами, иными, чем химотрипсин, предпочтительно трипсином. Коммерческие препараты протеаз, иных, чем химотрипсин, могут содержать минимальные загрязнения химотрипсином и, следовательно, могут проявлять некоторую химотрипсиновую активность. Это приемлемо для получения настоящих гидролизатов. Минимальная химотрипсиновая активность не приводит к существенному гидролизу в пептидах SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:2. Некоторая остаточная химотрипсиновая активность в препаратах протеаз, в частности препаратах трипсина, расценивается только как влияющая на выход пептидов в гидролизате, включающем последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:2. Методы для гидролиза горохового белка известны в области техники. Следовательно, предпочтительно пептиды SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:2 происходят из горохового белка, он также может быть обеспечен различными источниками. Следовательно, в одном варианте осуществления изобретения пептиды SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO:2 обеспечивают в форме белка пищевого качества. В одном варианте осуществления изобретения пептиды SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO:2 обеспечивают в форме гидролизата горохового белка.
Посредством гель-фильтрационной хроматографии, хроматографической методики, основанной на сшитой матрице агарозы/декстрана, определяли диапазон молекулярной массы большинства антихеликобактерных адгезивных пептидов и/или глюкоконъюгатов в настоящем гидролизате белка. Было обнаружено, что эффективные антихеликобактерные адгезивные пептиды располагаются в диапазоне 300-10000 Да. Предпочтительно эффективные антихеликобактерные адгезивные пептиды располагаются в диапазоне 500-5000 Да. Следовательно, настоящий белковый гидролизат предпочтительно содержит по меньшей мере 1 масс.% пептидов и/или глюкоконъюгатов, предпочтительно пептидов, в расчете на общую массу настоящего гидролизата пептидов, с молекулярной массой от 300 до 10000 Да, предпочтительно по меньшей мере 5 масс.%, более предпочтительно по меньшей мере 50 масс.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 75 масс.%. Более предпочтительно настоящий белковый гидролизат включает по меньшей мере 1 масс.% пептидов и/или глюкоконъюгатов, предпочтительно пептидов, в расчете на общую массу настоящего белкового гидролизата, с молекулярной массой от 500 до 5000 Да, предпочтительно по меньшей мере 5 масс.%, более предпочтительно по меньшей мере 50 масс.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 75 масс.%. Если не указано иначе, молекулярные массы, упомянутые в настоящем описании, определяют гель-фильтрационной хроматографией.
Настоящий гидролизат горохового белка предпочтительно вводят в количестве от 0,1 до 100 грамм в сутки, предпочтительно в количестве от 0,5 до 10 грамм в сутки. Настоящие пептиды горохового белка можно вводить в более низкой дозе, а именно в количестве от 0,005 до 50 грамм в сутки, предпочтительно в количестве от 0,05 до 5 грамм в сутки.
Наиболее предпочтительно гороховые пептиды по настоящему изобретению вводят в форме гидролизата горохового белка. Альтернативно, гороховые пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы или экспрессированы посредством генетически модифицированных (микро)организмов.
Предпочтительно композиция включает гидролизат горохового белка, более предпочтительно фракцию гидролизата горохового белка менее чем 10 кДа, более предпочтительно менее чем 7,5 кДа, когда введение гидролизата является наиболее активным в профилактике адгезии H. pylori. Предпочтительная фракция гидролизата горохового белка имеет среднюю молекулярную массу около 2 кДа. Предпочтительная фракция гидролизата горохового белка имеет высокую концентрацию в диапазоне от 1 кДа до 2,5 кДа. Следовательно, предпочтительно используют гороховые пептиды, полученные гидролизом трипсином, с размером между 1 и 2,5 кДа. Предпочтительно гидролизат горохового белка включает более 35 масс.%, более предпочтительно более 40 масс.% пептидов размера от 1 кДа до 2,5 кДа в расчете на общую массу гидролизата горохового белка.
Желудочно-кишечные патогены
Настоящий способ относится к лечению и/или профилактике инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией указанными желудочно-кишечными патогенами у млекопитающего, особенно лечению и/или профилактике инфекций желудочно-кишечными патогенами, которые выбирают из группы, состоящей из Helicobacter, Escherichia coli, Salmonella, Porphyromonas gingivalis, Campylobacter, Clostridium и Enterobacter и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией указанным желудочно-кишечным патогенном, у млекопитающих.
Настоящее изобретение обеспечивают для лечения и/или профилактики инфекций Helicobacter и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией Helicobacter у млекопитающих. Helicobacter предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii, H. salomonis, Helicobacter heilmannii и Helicobacter felis. Предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает лечение и/или профилактику инфекций Helicobacter pylori (H. pylori) и/или заболеваний, ассоциированных с инфекцией Helicobacter pylori у млекопитающих.
Пищевые композиции
Было обнаружено, что настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка могут преимущественно применяться в пищу, такую как детское питание и клиническое питание, особенно питание младенцев. Настоящая питательная композиция предпочтительно включает липидную составляющую, белковую составляющую и углеводную составляющую.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к питательной композиции, включающей настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка, и ее применению в настоящем способе, где липидная составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 5 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий, углеводная составляющая обеспечивает от 15 до 90% суммарного ежедневного потребления калорий. Настоящую композицию предпочтительно используют в детских смесях, где липидная составляющая обеспечивает от 35 до 50% суммарного ежедневного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 7,5 до 12,5% суммарного ежедневного потребления калорий и углеводная составляющая обеспечивает от 40 до 55% суммарного ежедневного потребления калорий. Для расчета % суммарного ежедневного потребления калорий для белковой составляющей необходимо брать общее количество белков, пептидов и аминокислот.
Кроме того, настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка настоящей композиции предпочтительно содержат дополнительный источник азота для питательных целей. Дополнительный источник азота предпочтительно выбирают из группы, состоящей из белка, пептида, аминокислот и их смесей. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения белковый компонент по настоящему изобретению включает: (i) по меньшей мере, один источник белка, выбираемый из гидролизата горохового белка, не полученного путем гидролиза химотрипсином, и/или пептидов горохового белка; и (ii) по меньшей мере, источник азота, выбираемый из группы, состоящей из молочных белков, яичных белков, соевого белка, пшеничного белка, рисового белка, свободных аминокислот и их смесей. Предпочтительно настоящая композиция включает (i) гидролизат горохового белка, не полученный путем гидролиза химотрипсином, и/или пептиды горохового белка и, (ii) по меньшей мере, один источник азота, выбираемый из группы гидролизованной сыворотки коровьего молока, негидролизованной сыворотки коровьего молока, гидролизованного казеина коровьего молока и негидролизованного соевого белка. Предпочтительно гидролизат горохового белка получают путем гидролиза трипсином.
Когда настоящий белковый компонент и, в частности, настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка вводят в комбинации с дополнительным источником азота, настоящая композиция предпочтительно включает между 0,1 и 50 масс.% настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка и, в частности, между 1 и 10 масс.% настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка в расчете на общую массу белка.
Когда настоящий белковый компонент и, в частности, настоящий гидролизат горохового белка вводят в комбинации с дополнительным источником азота, настоящая композиция предпочтительно включает между 1 и 50 масс.% настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка и, в частности, между 1 и 10 масс.% настоящего гидролизата горохового белка в расчете на общую массу белка.
Когда настоящий белковый компонент и, в частности, настоящие пептиды горохового белка вводят в комбинации с дополнительным источником азота, настоящая композиция предпочтительно включает между 0,1 и 50 масс.% настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка и, в частности, между 0,1 и 10 масс.% настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка в расчете на общую массу белка.
К питательной композиции может быть добавлен источник перевариваемых углеводов. Настоящая композиция предпочтительно содержит лактозу.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антиинфекционное средство против желудочно-кишечного патогена настоящего белкового компонента и, в частности, настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка улучшают путем совместного введения растворимого, неусвояемого, сбраживаемого олигосахарида. Введение таких олигосахаридов стимулирует рост молочнокислых бактерий, таких как бифидобактерии и лактобациллы, предотвращая колонизацию и инфицирование желудочно-кишечными патогенами. Следовательно, настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка и настоящий олигосахарид в этом отношении действуют синергически.
Предпочтительно настоящая композиция включает неусваиваемые олигосахариды со степенью полимеризации ((СП) (DP)) между 2 и 50, более предпочтительно 3 и 60. Неусваиваемый олигосахарид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов (таких как инулин), галактоолигосахаридов (таких как трансгалактоолигосахариды или бета-галактоолигосахариды), глюкоолигосахаридов (таких как гентио-, нигеро- и циклодекстрин-олигосахариды), арабино-олигосахаридов, маннан-олигосахаридов, ксило-олигосахаридов, фуко-олигосахаридов, арабиногалакто-олигосахаридов, глюкоманно-олигосахаридов, галактоманно-олигосахаридов, олигосахаридов, включающих сиаловую кислоту, и олигосахаридов уроновой кислоты. Предпочтительно композиция включает гуммиарабик в комбинации с неусваиваемым олигосахаридом.
Предпочтительно настоящая композиция включает фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и/или олигосахариды галактуроновой кислоты, более предпочтительно галактоолигосахариды, наиболее предпочтительно трансгалактоолигосахариды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция включает смесь трансгалактоолигосахаридов и фруктоолигосахаридов. Предпочтительно настоящая композиция включает галактоолигосахариды с СП 2-10 и/или фруктоолигосахариды с СП 2-60. Галактоолигосахарид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из трансгалактоолигосахаридов, лакто-N-тетраозы (LNT), лакто-N-неотетраозы (нео-LNT), фукозил-лактозы, фукозилированной LNT и фукозилированной нео-LNT. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящий способ включает введение трансгалактоолигосахаридов ([галактоза]n-глюкоза; где n представляет собой целое число между 1 и 60, т.е. 2, 3, 4, 5, 6,...., 59, 60; предпочтительно n выбирают из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10). Трансгалактоолигосахариды (TOS), например, продают под торговым наименованием Vivinal™ (Borculo Domo Ingredients, Netherlands). Предпочтительно сахариды трансгалактоолигосахаридов являются β-связанными.
Фруктоолигосахарид представляет собой неусваиваемый олигосахарид, включающий цепь β-связанной фруктозы с СП или средней СП 2-250, более предпочтительно 10-100. Фруктоолигосахариды включают инулин, леван и/или смешанный тип полифруктана. Особенно предпочтительным фруктоолигосахаридом является инулин. Фруктоолигосахарид, подходящий для применения в композициях, также является коммерчески доступным, например, Raftiline®HP (Orafti).
Олигосахариды уроновой кислоты предпочтительно получают из продуктов разрушения пектина. Олигосахариды уроновой кислоты предпочтительно представляют собой олигосахариды галактуроновой кислоты. Следовательно, настоящая композиция предпочтительно включает продукты разрушения пектина с СП между 2 и 100. Предпочтительно продукты деградации пектина получают из яблочного пектина, свекольного пектина и/или цитрусового пектина. Предпочтительно композиция включает трансгалактоолигосахариды, фруктоолигосахариды и продукты деградации пектина. Массовое соотношение трансгалактоолигосахарида:фруктоолигосахарида:продукта деградации пектина составляет предпочтительно (20-2):1:(1-3), более предпочтительно (12-7):1:(1-2).
Предпочтительно олигосахарид уроновой кислоты имеет одну, предпочтительно две терминальные единицы уроновой кислоты, которые могут быть свободными или этерифицированными. Предпочтительно терминальные единицы уроновой кислоты выбирают из группы, состоящей из галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, гулуроновой кислоты, идуроновой кислоты, маннуроновой кислоты, рибуроновой кислоты и алтруроновой кислоты. Такие единицы могут быть свободными или этерифицированными. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения терминальная гексозная единица (т.е. уроновая кислота) имеет двойную связь, которая предпочтительно расположена между C4 и C5 положениями терминальной гексозной единицы. Предпочтительно одна из терминальных гексозных единиц включает двойную связь. Группы карбоновой кислоты таких единиц уроновой кислоты могут быть свободными или (частично) этерифицированными и являются предпочтительно по меньшей мере частично метилированными.
Олигосахариды уроновой кислоты, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получают из пектина, пектата, альгината, хондроитина, гиалуроновых кислот, гепарина, гепарана, бактериальных углеводов, сиалогликанов, фукоидана, фукоолигосахаридов или каррагенана, более предпочтительно из пектина и/или альгината. Олигосахариды уроновой кислоты предпочтительно получают ферментативным перевариванием лизазой, лиазой и/или эндополигалактуроназой. Предпочтительно используют гидролизат или лизат пектина. Настоящий олигосахарид уроновой кислоты предпочтительно получают ферментативным расщеплением пектина с помощью пектин лизазы, пектин лиазы, эндополигалактуроназы и/или пектиназы.
Такие олигосахариды уроновой кислоты предотвращают адгезию кишечных патогенных микроорганизмов. Композиции, включающие пептиды/гидролизат горохового белка по настоящему изобретению и олигосахарид уроновой кислоты, будут обладать улучшенным анти - H. pylori эффектом.
Предпочтительным олигосахаридом является сиалиллактоза, более предпочтительно 3'-сиалиллактоза, так как такой олигосахарид также влияет на адгезию H. pylori. Композиции по настоящему изобретению, дополнительно включающие сиалиллактозу, предпочтительно 3' сиалиллактозу, следовательно, будут обладать улучшенным анти H. pylori эффектом.
Предпочтительно композиция включает от 80 мг до 2 г неусваиваемых олигосахаридов на 100 мл, более предпочтительно от 150 мг до 1,50 г, еще более предпочтительно от 300 мг до 1 г на 100 мл. В расчете на сухую массу композиция предпочтительно включает от 0,25 масс.% до 20 масс.%, более предпочтительно от 0,5 масс.% до 10 масс.%, еще более предпочтительно от 1,5 масс.% до 7,5 масс.%.
Следовательно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение касается композиции, включающей неусваиваемый олигосахарид, выбираемый из группы, состоящей из трансгалактоолигосахарида, фруктоолигосахаридов, олигосахарида уроновой кислоты и сиалиллактозы и
a) гидролизат горохового белка, с условием, что указанный гидролизат горохового белка не получают гидролизом протеазой химотрипсином, или предпочтительно гидролизат горохового белка, который получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин; и/или
b) по меньшей мере, один пептид, выбираемый из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Xaa независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10.
Нарушения стула (например, твердый стул, недостаточный объем стула, диарея) являются определенной проблемой у многих детей и больных пациентов, которые страдают от или имеют риск инфекции H. pylori. Такие пациенты часто получают жидкую пищу. Было обнаружено, что проблемы со стулом могут быть уменьшены путем введения настоящего компонента гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка в жидкой пище, которая имеет осмолярность между 50 и 500 мОсм/кг, более предпочтительно между 100 и 400 мОсм/кг. Предотвращение проблем со стулом является особо важным, когда настоящий гидролизат горохового белка и/или пептиды горохового белка используют вместе или после лечения антибиотиками. В свете вышеуказанного также важно, чтобы жидкая пища не имела избыточной калорийности, однако, все еще обеспечивала достаточное количество калорий для пациента. Следовательно, жидкая пища предпочтительно имеет калорийность между 0,1 и 2,5 ккал/мл, еще более предпочтительно калорийность между 0,5 и 1,5 ккал/мл, наиболее предпочтительно между 0,6 и 0,8 ккал/мл.
Применение
Настоящее изобретение обеспечивает композицию для и способ лечения и/или профилактики инфекции желудочно-кишечными патогенами (особенно H. pylori) и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами (особенно H. pylori), у млекопитающего, предпочтительно человека, указанный способ включает введение настоящего гидролизата горохового белка и/или пептидов горохового белка млекопитающему или человеку. Заболевания, ассоциированные с инфекцией желудочно-кишечными патогенами у людей, включают персистирующий хронический гастрит, диарею, боль в животе, язвы и/или рак желудка. Заболевания, ассоциированные с инфекцией H. pylori у людей, включают персистирующий хронический гастрит, язвы и/или рак желудка. Настоящее изобретение также обеспечивает для лечения и/или профилактики таких заболеваний у млекопитающих, предпочтительно человека, имеющего риск развития, или нуждающегося в их лечении.
Настоящее изобретение относится к лечению и/или профилактике у млекопитающего, предпочтительно человека или домашнего животного, более предпочтительно людей. Настоящую композицию преимущественно вводят a) детям в возрасте между 0 и 5 годами, предпочтительно детям от 0 до 2 лет, и/или b) пациентам, страдающим от гастродуоденальных заболеваний, особенно пациентов, страдающих от пептической язвы.
Настоящее изобретение также является особенно подходящим для предотвращения реинфекции желудочно-кишечными патогенами, особенно H. pylori, после лечения млекопитающего одним или более антибиотиками.
Пример 1: Фракции гидролизата горохового белка ингибируют адгезию H. pylori к слизистой оболочке желудка.
1.1: Исследование анти-адгезии
Helicobacter pylori ATCC 700824 (J99) культивировали в течение двух или трех пассажей для минимизации риска переменного по фазе переключения генов OMP. H. pylori инкубировали в течение 48 ч в микроаэрофильных условиях при 37°C на триптическом соевом агаре (Becton Dickinson, Germany), дополненном 5% дефибринизированной овечьей крови (Oxoid, UK). Человеческие клетки эпителия желудка (AGS cells) выращивали в RPMI 1640 с L-глютамином (PAA, Germany), дополненной 10% FCS, на чашках для культивирования тканей (75 см2, Sarstedt, USA) и 6-луночных планшетах (Sarstedt, USA) в 5% CO2.
Выращенную на агаре H. pylori собирали и ресуспендировали в стерильном карбонатном буфере (pH 9,0) до плотности около 1,0×108 бактерий на мл. 10 мкл раствора FITC (1% в ДМСО) добавляли и инкубировали с бактериями в течение 45 мин. Флуоресцентную метку терминировали путем осаждения бактерий центрифугированием (3150×g, 5 мин). Бактерии промывали дважды в PBS для удаления избытка FITC и аккуратно ресуспендировали для дальнейшего применения. In vitro исследование антиадгезивной активности тестируемых соединений относительно FITC-меченной H. pylori на AGS клетки осуществляли методом поточной цитометрии (Niehues & Hensel, 2009 J. Pharm. Pharamcol. 61: 1303-1307).
1.2 Фракционирование, направляемое биологическими пробами гидролизата горохового белка.
50 грамм изолята горохового белка (Nutralys® F85F, 84% масс./масс. белка от Roquette Freres (Lestrem, France) растворяли в 1,5 л дистиллированной воды при 50°C. Гидролиз начинали путем добавления 0,56 г трипсина (Novo PTN 6. OS, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark). pH контролировали как 7,0 путем добавления NaOH. Реакции позволяли продолжаться в течение 2 ч. Процесс останавливали тепловой инактивацией фермента при 85°C в течение 5 мин. Осажденный материал осаждали центрифугированием при 3800×g в течение 20 мин при 20°C и надосадочную жидкость ультрафильтровали с помощью устройства планшета и рамки с использованием 700 см2 мембраны 10 кДа NMWCO PES (UltranLab, Schleicher&Schuell, Dassel, Germany). Ретентат лиофилизировали и использовали для последующего разделения гороховых пептидов.
Активность относительно H. pylori определяли, как описано в 1.1. Гороховый белок как таковой не проявлял какой-либо антиадгезивной активности в отношении H. pylori. После ультрафильтрации обнаружили, что антиадгезивная активность гидролизата горохового белка (56% адгезии бактерий с 0,5 мг/мл) находится в рамках фракции ретентата и не во фракции пермеата.
Ретентат 10 кДа фракционировали путем эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием 42×5,0 см колонки ID, упакованной с Toyopearl® HW-50S (Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany). Гидрокарбонат аммония 0,1 M, содержащий 2% (об./об.) 2-пропанола, использовали в качестве подвижной фазы. Колонку обрабатывали со скоростью тока 4 мл/мин при 4°C. Элюируемые соединения исследовали при УФ 220 нм, фракции собирали с интервалами 7 мл и объединяли для получения четырех основных фракций, а именно F1-F4. F1 является объемом элюции около 0-220 мл и проявляет адгезию 76% при 0,5 мг/мл, F2 является объемом элюции около 220-310 мл и проявляет активность адгезии 94% при 0,5 мг/мл, F3 является объемом элюции около 310-500 мл и проявляет активность адгезии 25% при 0,5 мг/мл и F4 является объемом элюции 500-720 мл и проявляет активность адгезии 118% при 0,5 мг/мл.
Последующую очистку F3 достигали хроматографией с обратной фазой (RPC) с использованием колонки 11,8×1,0 см ID, упакованной со смолой Amberchrom® CG-161S (Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany). Используемыми подвижными фазами были 0,1% (об./об.) ТФУ в дистиллированной воде (A) и 0,1% (об./об.) ТФУ в 2-пропаноле (B). Элюцию осуществляли по линейному градиенту, начиная с 5% B до 60% B в 7 объемах колонки, скорость тока 0,85 мл/мин, УФ 220 нм. Получали фракции, каждая по 4 мл, и объединяли для получения трех основных фракций: F3.1 до F3.3. Фракции лиофилизировали перед последующим анализом.
F3.1, имеющая объем элюции около 3 до 33 мл, показала активность адгезии 109% при 0,5 мг/мл, F3.2, имеющая объем элюции около 33 до 54 мл, показала активность адгезии 112% при 0,5 мг/мл, и F3.3, имеющая объем элюции 54 до 85 мл, показала активность адгезии 40% при 0,5 мг/мл, 70% при 0,2 мг/мл и 78% при 0,1 мг/мл.
Распределение по размеру молекул, как определено с помощью Calibration Superdex Peptide 10/300 GL (Amersham Biosciences 5Cat. No. 17-5176-01). Образец 2% масс./об. (надосадочная жидкость после центрифугирования) разводили в 0,1% ТФУ в 30% ACN/воде. Пептиды определяли УФ при 214 нм. Распределение по размеру (процент общей площади) было следующим:
| Диапазон ММ | GPC F1 (A0622) | GPC F2 (A0623) | GPC F3 (A0624) | GPC F4 (A0625) |
| > 10 кДа | 3,7 | 16,4 | 0,0 | 0,0 |
| 10 кДа <>7,5 кДа | 3,9 | 15,2 | 0,2 | 0,1 |
| 7,5 кДа <>5 кДа | 11,6 | 16,9 | 1,4 | 0,4 |
| 5 кДа <> 2,5 кДа | 29,0 | 16,3 | 23,9 | 4,3 |
| 2,5 кДа <> 1 кДа | 29,8 | 17,3 | 46,3 | 21,0 |
| 1 кДа <> 0,5 кДа | 11,3 | 9,8 | 16,2 | 23,6 |
| <0,5 кДа | 10,7 | 8,2 | 11,9 | 50,6 |
Следовательно, средняя молекулярная масса фракции F3 была около 2 кДа с наибольшим количеством пептидов в диапазоне от 1 кДа до 2,5 кДа.
1.3 Идентификация пептидов
Для однозначной идентификации активных пептидов, фракции F3.1, F3.2 и F3.3 исследовали посредством тандемного МС анализа MALDI-TOF-TOF. Сигналы пептидов, присутствующие в активных фракциях, но не обнаруживаемых в неактивных смесях, специфически выбирали для последующего тандемного секвенирования аминокислот на основании МС. Шесть пептидных последовательностей (S1-S6) определяли таким методом (последовательности даны в табл. 1) и однозначно идентифицировали с помощью программного обеспечения ProteinPilot™ с интегрированным алгоритмом Paragon™ (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany). Следующие параметры выбирали для возможности оценки аминокислот по данным MALDI-tandem-MS-data посредством алгоритма Paragon™: тип образца: идентификация; алкилирование цистеина: нет; переваривание: трипсин; прибор: 4800; специальные факторы: нет; виды: нет ограничений; ID-фокус: биологические модификации; база данных: Uniprot/Swiss-Prot (версия 23 Января 2007, включая базу данных загрязнителей, обе в формате FASTA); усилия поиска: тщательно.
Пептиды S1-S6 идентифицировали как пептидные фрагменты из горохового легумина А или вицилина. Впоследствии соответствующие пептиды синтезировали для дополнительного однозначного исследования антиадгезивных свойств (Thermo Fisher Scientific (Ulm, Germany). Было обнаружено, что ундекапептид S3 является наиболее активным соединением, снижающим бактериальную адгезию H. pylori достоверно до 81 и 83% соответственно (75 соотв. 150 мкМ, соответствующие 0,1 соотв. 0,2 мг/мл). Также S5, который ингибировал адгезию на 6-17% (75 отв. 150 мкмоль), оценивали два из активных пептидов, полученных при переваривании горохового белка трипсином.
Таблица 1: Последовательности пептидов S1-S6, из синтетических пептидов S3A-S3H, со средней адгезией (±SEM) FITC-меченной H. pylori к клеткам AGS после предварительной обработки бактерий соответствующими пептидами. Данные относятся к необработанному контролю H. pylori (=100%). Положительный контроль: 3'сиалиллактоза (15 мМ).
| Тестируемое соединение | Последовательность аминокислоты | Отн. адгезия в [%] (±SEM; n=3) | |
| 75 мкМ | 150 мкМ | ||
| S1 | Leu-Asp-Ala-Leu-Glu-Pro-Asp-Asn-Arg-Ile-Glu-Ser-Glu-Gly-Gly-Leu-Ile-Glu-Thr-Trp-Asn-Pro-Asn-Asn-Lys (SEQ ID NO:3) | 95±10 | 104±7 |
| S2 | Leu-Asn-Ile-Gly-Pro-Ser-Ser-Ser-Pro-Asp-Ile-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ala-Gly-Arg (SEQ ID NO:4) | 93±8 | 94±6 |
| S3 | Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg (SEQ ID NO: 1) | 81±3 | 83±6 |
| S4 | Trp-Glu-Arg-Glu-Glu-Asp-Glu-Glu-Gln-Val-Asp-Glu-Glu-Trp-Arg (SEQ ID NO:5) | 98±2 | 107±2 |
| S5 | Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg (SEQ ID NO:2) | 94±2 | 85±2 |
| S6 | Gly-Asp-Phe-Glu-Leu-Val-Gly-Gln-Arg (SEQ ID NO:6) | 94±3 | 97±2 |
| S3A | Asp-Phe-Leu-Glu-Asp (SEQ ID NO:7) | 102±3 | 108±6 |
| S3B | Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg (SEQ ID NO: 8) | 97±4 | 104±1 |
| S3C | Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg (SEQ ID NO:9) | 95±5 | 100±4 |
| S3D | Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg (SEQ ID NO: 10) | 89±4 | 89±3 |
| S3E | Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val (SEQ ID NO: 11) | 91±4 | 91±4 |
| S3F | Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe (SEQ ID NO: 12) | 85±3 | 90±5 |
| S3G | Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val (SEQ ID NO: 13) | 93±2 | 94±3 |
| S3H | Asp-Ala-Phe | 104±6 | 105±1 |
| Необработанный контроль | - | 100±2 | 100±2 |
| Положительный контроль | - | 70±5 | 70±5 |
Подобный эксперимент проводили, как описано в примере WO 2008/043424. Коротко, гидролизат горохового белка микрофракционировали посредством нанохроматографии с обращенной фазой (C 18) и каждую фракцию наносили online на цель MALDI. Каждое из 832 пятен оценивали в отношении присутствия заявленных пептидов S3 (m/z 1339) и S5 (m/z 1418) посредством масс-спектрометрии MALDI-TOF. В заключении пептид S5 совершенно не смогли идентифицировать. Пептид S3 был обнаружен только в следовых количествах.
1.4 Ингибирование адгезии H. pylori in situ
Для подтверждения полученных результатов фракцию F3, а также пептид S3 оценивали в отношении антиадгезивной активности в исследовании in situ на ткани человеческого желудка. Эксперименты in situ с гистологическими сечениями слизистой оболочки желудка человека и FITC-меченной H. pylori проводили в соответствии с Lengsfeld et al, 2004, J. Agricul. Food Chem: 52, 1495-1503 и оценивали флуоресцентной микроскопией. Адгезию FITC-меченной H. pylori к эпителию оценивали флуоресцентной микроскопией и визуализацией. Количество бактерий, прилипших к эпителиальной поверхности, оценивали в двойных слепых условиях. Максимальную адгезию выражали как общая 100% адгезия. Интенсивность площади флуоресценции рассчитывали посредством программного обеспечения ImageJ® (Olympus, Germany), стандартизируя площадь флуоресценции отрицательного контроля как 100%.
H. pylori, предварительно обработанная фракцией F3 (1,0 мг/мл), показала существенно нарушенную адгезию в такой системе исследования (около 70% ингибирования). Также S3 (300 мкΜ существенно снижали адгезию бактерий (около 40% ингибирования). Полученные данные четко подтверждают антиадгезивную активность F3 и S3. С другой стороны фракционирование по биопробам также показало вид нелинейной активности профилирования: антиадгезивные эффекты стабильно не увеличивались в течение стадий очистки белка, но становились меньше для отдельных выделенных и исследуемых пептидов. Это четкое указание присутствия других активных соединений в смеси, влияющих на антиадгезивные свойства синергическим образом.
1.5 Взаимоотношения структуры-активности
Для взаимоотношения структурной активности синтезировали различные активные фрагменты ундекапептида S3, отличающиеся по длине (S3A-S3H, см. табл. 1). Функциональное исследование продемонстрировало общую потерю ингибирующей силы по сравнению с нативным пептидом S3.
Только пептиды S3D, E, F и G немного блокировали адгезию (около 10% снижения). При сравнении с последовательностью аминокислот S3 может быть идентифицирован гомологичный мотив с терминальной и интегральной трипептидной последовательностью, а именно Asp-Ala-Phe. Следовательно, синтезированный трипептид (Asp-Ala-Phe) S3H исследовали и показали, что он неактивен, что возможно обозначает, что такая последовательность может быть только функционализирована, если встроена в более длинную пептидную цепь. Авторы допустили, что наиболее вероятно полная последовательность пептида из по меньшей мере 11 аминокислот, как обнаруживается в S3, необходима для его ингибирующей активности в отношении бактериальной адгезии, из-за возможного образования трехмерных складок пептида, необходимых для взаимодействия с целевым рецептором.
Существование определенной вторичной структуры и трехмерных складок белка может изменять функциональность пептидов. Для таких предварительных экспериментов конформационного моделирования, с программным обеспечением молекулярной операционной среды (MOE), различных пептидов показали высокую степень складчатости ундекапептида S3, что четко отсутствовало в низкомолекулярных пептидных фрагментах S3A-S3H (данные не показаны).
1.6 Специфичность предотвращения адгезии
Специфичность активных пептидов в отношении белков наружной мембраны H. pylori (OMP) была показана посредством точечно-блоттингового анализа глюкоконъюгатов в соответствии с ранее описанными методами [Walz, et al2005, Glycobiology, 15, 700-708; Valkonen et al., 1994, 62 (9), 3640-3648].
Мембраны поливинилиденфторида (PVDF) с размером отверстий 0,2 мкм помечали с помощью 2 мкл раствора, содержащего 1 мкг гликопротеинов и неогликопротеинов.
Характерный выбор типичных лигандов для адгезинов H. pylori, используемых для таких экспериментов, были Lewisb и антигенные конъюгаты H типа I группы крови, взаимодействующие с OMP BabA, 3'-сиалиллактоза, взаимодействующая специфически с OMP HpaA, сиалил-Lewis и ламинин, известные в отношении взаимодействия с OMP SabA, и фибронектин с еще неопределенной афинностью к бактериальным адгезинам. Кроме того, человеческий альбумин сыворотки (HSA) и бычий альбумин сыворотки (BSA) использовали в качестве контроля для исключения неспецифического связывания H. pylori с нанесенными на мембране соединениями. Кроме того, 6'-сиалиллактозу использовали для демонстрации специфичности связывания HpaA с 3'-сиалиллактозой. Измеряли флуоресценцию прилипших заранее обработанных и необработанных меченных бактерий.
В случаях предварительной обработки H. pylori с помощью F3 наблюдали существенное снижение бактериального взаимодействия с конъюгатами Lewisb-, Η типа I-, и 3'-сиалиллактозы-HAS, а также с фибронектином. F3 также в меньшей степени влиял на связывание конъюгата сиалил-Lewisa, но не на нанесенный ламинин. Такие открытия четко показывают, что F3 взаимодействует специфически с адгезинами H. pylori BabA, HpaA, фибронектинсвязывающей активностью и менее сильно также с SabA.
В противоположность пептиды S3 и S5 проявляли только ингибирование адгезии, опосредованной Lewisb-HSA, предполагая ингибирование BabA адгезина, тогда как на другие адгезины существенно не влияли.
В заключение, такое ингибирование предполагает или выраженную мимикрию, или дополнительные сайты связывания пептидов из F3 с известными рецепторными структурами BabA, HpaA, SabA и с еще не идентифицированным адгезином с афинностью к ECM белку фибронектину. Очищенные пептиды были существенно менее активными, чем более комплексные фракции, что обусловлено одновалентным ингибированием единственного бактериального адгезина очищенным пептидом. Наоборот, применение комплексной гетерогенной смеси способно взаимодействовать с OMP H. pylori в многоцелевой стратегии и, следовательно, приводит к блокаде нескольких белков, ответственных за бактериальную адгезию. Это четко демонстрирует, что в сценарии различных важных OMP для процесса адгезии, комплексные смеси, вероятно, могут быть использованы гораздо более эффективно, чем высокоочищенные отдельные соединения.
Настоящие результаты примера 1 являются показательными для преимуществ применения гидролизата горохового белка и/или гороховых пептидов для лечения и/или профилактики инфекций H. pylori и/или заболеваний, ассоциированных с инфекцией H. pylori у млекопитающих.
1. Применение композиции, включающей гидролизат горохового белка для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающих, где гидролизат горохового белка получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин, где желудочно-кишечный патоген представляет собой Helicobacter pylori.
2. Применение по п. 1, где гидролизат горохового белка получают гидролизом горохового белка легумина А или вицилина.
3. Применение по п. 1 или 2, где гидролизат горохового белка получают гидролизом протеазой трипсином.
4. Применение по п. 1 или 2, где гидролизат горохового белка содержит более 35 масс. % пептидов с размером между 1 и 2,5 кДа в расчете на общую массу гидролизата горохового белка.
5. Применение композиции, включающей пептид, для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции желудочно-кишечными патогенами и/или заболевания, ассоциированного с инфекцией желудочно-кишечными патогенами, у млекопитающего, где пептид выбирают из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Хаа независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10, где пептид содержится в гидролизате горохового белка и где желудочно-кишечный патоген представляет собой Helicobacter pylori.
6. Применение по п. 1 или 5, где заболевание, ассоциированное с инфекцией, выбирают из группы, состоящей из гастрита, пептической язвы и рака желудка.
7. Применение по п. 1 или 5, где млекопитающим является (i) ребенок в возрасте между 0 и 5 годами или (ii) пациент, страдающий от гастродуоденальных заболеваний.
8. Применение по п. 1 или 5 для предотвращения реинфекции патогеном после лечения млекопитающего с помощью одного или более антибиотиков.
9. Композиция для лечения и/или предупреждения инфекций Helicobacter pylori, содержащая липидную, белковую и углеводную составляющую, где липидная составляющая обеспечивает от 5 до 50% ежедневного среднесуточного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 5 до 50% ежедневного среднесуточного потребления калорий и углеводная составляющая обеспечивает от 15 до 90% ежедневного среднесуточного потребления калорий, отличающаяся тем, что белковая составляющая включает: (i) по меньшей мере один источник белка, состоящий из гидролизата горохового белка, где гидролизат горохового белка получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин, и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбираемый из группы, состоящей из молочных белков, гидролизата молочного белка, яичных белков, гидролизата яичного белка, соевого белка, гидролизата соевого белка, пшеничного белка, гидролизата пшеничного белка, рисового белка, гидролизата рисового белка и их смесей, и где композиция содержит между 0.1 и 50 масс. % гидролизата горохового белка по отношению к общей массе белка.
10. Композиция по п. 9, где гидролизат горохового белка получают путем гидролиза протеазой трипсином.
11. Композиция для лечения и/или предупреждения инфекций Helicobacter pylori, содержащая липидную, белковую и углеводную составляющие, где липидная составляющая обеспечивает от 5 до 50% ежедневного среднесуточного потребления калорий, белковая составляющая обеспечивает от 5 до 50% ежедневного среднесуточного потребления калорий и углеводная составляющая обеспечивает от 15 до 90% ежедневного среднесуточного потребления калорий, отличающаяся тем, что белковая составляющая включает: (i) по меньшей мере, один источник белка, состоящий из пептидов, выбираемых из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Хаа независимо может быть любой аминокислотой и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимся от 0-10, и где пептид содержится в гидролизате горохового белка, и (ii) по меньшей мере один источник азота, выбираемый из группы, состоящей из молочных белков, гидролизата молочного белка, яичных белков, гидролизата яичного белка, соевого белка, гидролизата соевого белка, пшеничного белка, гидролизата пшеничного белка, рисового белка, гидролизата рисового белка и их смесей, и где композиция содержит между 0,1 и 50 масс. % пептидов горохового белка по отношению к общей массе белка.
12. Композиция по любому из пп. 9-11, включающая по меньшей мере один компонент, выбираемый из группы, состоящей из гидролизованной сыворотки коровьего молока, негидролизованной сыворотки коровьего молока, гидролизованного казеина коровьего молока, негидролизованного казеина коровьего молока, гидролизованного соевого белка и негидролизованного соевого белка.
13. Композиция по любому из пп. 9-11, включающая растворимый, неперевариваемый, ферментированный олигосахарид.
14. Композиция для лечения и/или предупреждения инфекций Helicobacter pylori, включающая неусвояемый олигосахарид, выбираемый из группы, состоящей из трансгалактоолигосахарида, фруктоолигосахаридов, олигосахаридов уроновой кислоты и сиалиллактозы и
a. гидролизат горохового белка, который получают гидролизом протеазой, иной, чем химотрипсин; и/или
b. по меньшей мере один пептид, выбираемый из группы, состоящей из Xaan-Asp-Phe-Leu-Glu-Asp-Ala-Phe-Asn-Val-Asn-Arg-Xaam и Xaan-Glu-Leu-Ala-Phe-Pro-Gly-Ser-Ala-Gln-Glu-Val-Asp-Arg-Xaam, где каждый Хаа независимо может быть любой аминокислотой, и n и m являются целыми числами, независимо варьирующимися от 0-10, и где пептид содержится в гидролизате горохового белка.
15. Композиция по любому из пп. 9-11 или 14 с осмолярностью между 50 и 500 мОсм/кг.
16. Композиция по любому из пп. 9-11 или 14 в форме питательной или фармацевтической композиции.
17. Композиция по любому из пп. 9-11 или 14 для применения в лечении и/или профилактике инфекции H. pylori и/или заболеваний, ассоциированных с инфекцией H. pylori.
