Ингаляционная лекарственная форма полисиалированной дезоксирибонуклеазы i человека и способ ее получения

Изобретение относится к биотехнологии. Описана лиофилизированная лекарственная форма гликопротеина дезоксирибонуклеазы I человека для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что указанный гликопротеин представляет собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека с аминокислотной последовательностью, представленной в описании, получаемую в микроорганизме Е. coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи. Гликопротеин используется в качестве активного вещества в количестве 45,0±5,0 мас.%. В качестве вспомогательных веществ используются магния хлорид 3,5±0,5 мас.%, кальция хлорид 4,0±0,5 мас.% и лактоза 45,0±5,0 мас.%. Предложен способ получения указанной лекарственной формы, отличающийся тем, что к водному раствору синтетического гликопротеина формулы I добавляют водный раствор, содержащий магния хлорид, кальция хлорид, лактозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: гликопротеин формулы I (45,0±5,0), магния хлорид (3,5±0,5), кальция хлорид (4,0±0,5), лактоза (45,0±5,0); перемешивают, затем стерильно разливают во флаконы боросиликатного стекла, лиофилизируют, заполняют флаконы стерильным азотом, стерильно укупоривают флаконы пробками и обжимают колпачками. Изобретение позволяет получить препарат полисиалированной рекомбинантной ДНКазы I человека, пригодный для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицине и конкретно к препаратам, улучшающим реологические свойства мокроты при лечении муковисцидоза и другой патологии легких, при которых наблюдается затруднение процесса эвакуации мокроты.

Накопление вязкого гнойного секрета (мокроты) в дыхательных путях больных муковисцидозом, бронхитами, пневмониями различной этиологии играет роль в уменьшении функциональной способности легких и в обострениях инфекционного процесса. Мокрота представляет собой гель, образованный молекулами гликопротеинов, соединенных между собой поперечными дисульфидными, кальциевыми, водородными и электростатическими связями. Вязкость бронхиального секрета обусловлена содержанием двух макромолекул: мукоидных гликопротеидов и ДНК. Главным источником ДНК являются распадающиеся полиморфно-ядерные нейтрофилы, которые скапливаются в дыхательных путях в ответ на хроническую бактериальную инфекцию, а также биопленки микробных агентов, в особенности Р.Aeruginosa. Вязкая мокрота обнаруживается при муковисцидозе, бронхиальной астме. При хронических неспецифических заболеваниях легких выявлена зависимость между величиной вязкости мокроты и содержанием в ней мукополисахаридов, ДНК, нейтрофилов и других продуктов воспалительной реакции. Так, вязкость слизисто-гнойной и гнойной мокроты существенно выше, чем слизистой.

Для улучшения реологичесих свойств мокроты применяют различные группы препаратов - так называемых муколитиков, которые делятся на муколитики непрямого действия и муколитики прямого действия. Муколитики непрямого действия изменяют секрецию и адгезию слизи, а муколитики прямого действия разрушают упомянутые выше полимеры слизи и представляют наибольший клинический интерес. К прямым муколитикам относят тиолы (цистеин, N-ацетилцистеин); ферменты, разрушающие протеогликаны мокроты (трипсин, α-химотрипсин, стрептокиназа), ферменты, разрушающие ДНК-дезоксирибонуклеазы (ДНКазы); а также группу разнородных препаратов, к которым относятся аскорбиновая кислота, гипертонический раствор натрия хлорида, неорганические иодиды [Braga PC, Allegra L. Dmgs in Bronchial Mucology. Raven Press, 1989].

В свою очередь в группу препаратов, разрушающих высокополимерную ДНК мокроты (ДНКаз или, по иному, дорназ), относят стрептодорназу (ДНКазу, выделенную из стрептококков), человеческую рекомбинантную ДНКазу (ДНКазу I и ДНКазу II) и бычью дезоксирибонуклеазу, выделенную из поджелудочной железы крупного рогатого скота.

Как ДНКазу быка, так и рекомбинантную ДНКазу I человека применяют в виде ингаляции для снижения вязкости мокроты и таким образом облегчения ее эвакуации при лечении муковисцидоза, хронического бронхита [Машковский М.Д. Лекарственные средства, пособие для врачей, том 2, Москва, Изд. «Медицина»], [Ильенкова Н.А., Чикунов В.В., Алексеева О.В., Герасимова Т.А. Эффективность применения дорназы-альфа (пульмозим) у больных с хроническим бронхитом в Красноярском крае, Современные технологии в педиатрии и детской хирургии: тез. докл. V рос. конгр. - М., 2009. - С.214-215]. Пульмозим (человеческая дорназа альфа) представляет собой фосфорилированную гликозилированную рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I, идентичную выделенной из мочи дезоксрибонуклеазе человека, и состоит из 260 аминокислот, имея молекулярную массу 37 КDa, и производится путем ферментации рекомбинантного штамма клеток яичника китайского хомячка. Лечебная эффективность препарата основывается на его способности гидролизовать высокомолекулярную ДНК мукоальвеолярного секрета больных, улучшая тем самым реологические свойства секрета.

Основным недостатком препаратов любой нативной (немодифицированой) ДНКазы является быстрое снижение ферментативной (дезоксирибонуклеазной) активности в мокроте, что обусловлено как системной абсорбцией в трахеобронхиальном дереве и протеолизом протеиназами бактерий и лейкоцитов, так и подавлением ферментативной активности продуктами деградации клеточного цитоскелета (актином), содержащимся в мукоальвеолярном секрете в больших количествах, особенно у больных муковисцидозом. Например, G-форма актина связывается с дорназой альфа человека в основном в области Tyr65-Val66-Val 67 и подавляет гидролитическую активность фермента [Fujihara J., et. al., Actin-inhibition and folding of vertebrate deoxyribonuclease I are affected by mutations at residues 67 and 114. Comparative Biochemistry and Physiology, Part В 143 (2006) 70-75]. При этом характерный для рекомбинатной дорназы альфа профиль N-гликозилирования не предотвращает инактивации фермента актином и протеолиз, опосредованный бактериальными и лейкоцитарными протеиназами.

Кроме того, известно, что наличие или отсутствие двувалентных ионов, в частности ионов кальция и магния, влияет на активность, стабильность и соответственно клиническую эффективность ДНКаз различного происхождения. Так, например, присутствие ионов кальция защищает панкреатическую бычью ДНКазу от разрушающего воздействия трипсина [Poulos, Т.L., Price P.A._Some Effects of Calcium Ions on the Structure of Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease A, J. Biol. Chem., 1972, V.247, 2900-4].

Удаление ионов кальция из среды приводило к резкому уменьшению активности и увеличению деамидированных форм как лиофилизированной, так и растворенной человеческой рекомбинантной дезоксирибонуклеазы I. [Bei Chen, Henry R. Costantino, Jun Liu, Chung C. Hsu, Steven J. Shire, Influence of calcium ions on the structure and stability of recombinant human deoxyribonuclease I in the aqueous and lyophilized states, J. Phann. Sci., 1999, V 88 (4), pp.477-82] Более того, было показано, что у больных муковисцедозом, не отвечающих на терапию рекомбинантной человеческой дезоксирибонуклеазой, конценатрация ионов магния в мокроте гораздо ниже, чем у пациентов, отвечающих на эту терапию (2.0 mM против 1.3 mM). При этом добавление магния хлорида в мокроту «не отвечающих» пациентов приводило к тому, что вязкость мокроты под действием ДНКазы резко снижалась, т.е. активность ДНКазы значительно возрастала. При этом эффект соли магния реализовывался через снижение способности актина подавлять ферментативную активность ДНКазы.

Проблему устойчивости к актину пытались решить путем создания мутантных форм человеческой рекомбинантной ДНКазы I - LS-DNAse [заявка США №US 2005/053994Ц Патент США №6348343], или ДНКазы II человека - DLAD [заявка США №US2004/0157239 A1], устойчивых к инактивации G-актином. Однако применение таких мутантные формы ДНКаз закономерно приводит к появлению иммунного (в том числе антительного ответа) на такой чужеродный антиген и возникновению аллергических реакций или нейтрализации (антительному связыванию) фермента.

Другой проблемой, связанной с клиническим использованием готовых лекарственных форм препаратов ДНКаз, является потеря энзиматической активности ДНКазы в растворе вследствие дезамидации при его хранении и транспортировании в стеклянной первичной (потребительской) упаковке (ампулах и флаконах) [см., например, патент США №5783433].

Это приводит к необходимости производства готовой ингаляционной лекарственной формы рекомбинантной человеческой ДНКазы I в нестеклянных (полимерных) флаконах.

Далее, если же фермент подвергнуть лиофилизации, то при очередном растворении с целью последующего применения (ингаляции раствора) обнаруживается, что ДНКаза теряет от 10 до 50% своей ферментативной активности, имеющейся перед лиофилизацией.

Задачей изобретения является создание ингаляционной лекарственной формы лекарственного препарата на основе других вариантов ДНКаз, с одной стороны, не инактивируемых актином, а с другой стороны, не вызывающих иммунологического ответа организма и не теряющих энзиматическую активность при лиофилизации и дальнейшем растворении перед ингаляцией с оптимальным соотношением солей кальция и магния и содержащих в качестве криопротектора лактозу, обеспечивающего приемлемые реологические свойства раствора, как предназначенного для ингаляции.

Поставленная задача решается тем, что в качестве ингаляционной лекарственной формы препарата для снижения вязкости мокроты (муколититка) предлагается ингаляционная лекарственная форма синтетического гликопротеина, представляющего собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека, получаемую в микроорганизме E.coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи, следующей формулы:

(I)

содержащая гликопротеин формулы I в качестве активного вещества,

а в качестве вспомогательных веществ - магния хлорид, кальция хлорид и лактозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Синтетический гликопротеин формулы I	(45±5)
Магния хлорида	(3.6±0.5)
Кальция хлорида	(4.0±0.5)
Лактоза	(45±5)

а также способ ее получения.

При этом готовая лекарственная форма представляет собой лиофильно-высушенный порошок для приготовления раствора для ингаляций, помещенный в стеклянные флаконы или ампулы.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предлагается готовая ингаляционная лекарственная формы лекарственного препарата для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного вещества синтетический гликопротеин формулы I, а в качетве вспомогательных веществ соли двухвалентных катионов - калия хлорид и магния хлорид, а также лактозу в определенном соотношении.

Согласно настоящему изобретению также предлагается способ получения ингаляционной лекарственной формы препарата для снижения вязкости мокроты (муколититка) следующего состава:

Синтетический гликопротеин формулы I	(45±5)
Магния хлорид	(3.6±0.5)
Кальция хлорид	(4.0±0.5)
Лактоза	(45±5)

отличающийся тем, что к водному раствору синтетического гликопротеина формулы I добавляют водный раствор, содержащий магния хлорид, кальция хлорид, лактозу, перемешивают, затем стерильно разливают во флаконы боросиликатного стекла, лиофилизируют, заполняют флаконы стерильным азотом, стерильно укупоривают флаконы пробками и обжимают колпачками.

Полисиаловые кислоты (PSA) представляют собой природные неразветвленные полимеры сиаловой кислоты, вырабатываемые определенными штаммами бактерий и в определенных клетках у млекопитающих (Roth., 1993). Их можно получать с различной степенью полимеризации, от n = примерно 80 или более остатков сиаловой кислоты до n=2 путем кислотного гидролиза или расщеплением нейраминидазами или фракционированием природных вырабатываемых бактериями видов полимера. Состав различных полисиаловых кислот также изменяется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т.е. альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота, включающая капсульный полисахарид штамма K1 E.coli и В-группы менингококков, который также обнаруживают в эмбриональной форме молекулы клеточной адгезии нейрона (N-САМ). Также существуют гетерополимерные формы, такие как чередующаяся альфа-2,8 альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма К92 E.coli и полисахариды С группы N. meningitidis. Сиаловую кислоту также можно обнаружить в чередующихся сополимерах с мономерами, отличающимися от сиаловой кислоты, таких как группа W135 или группа Y N. meningitidis.

Полисиаловые кислоты обладают важным биологическим действием, включая уклонения патогенных бактерий от иммунной системы и системы комплемента. Альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота штамма Kl E.coli также известна как «коломиновая кислота» и ее (различной длины) используют в настоящем изобретении.

Среди бактериальных полисахаридов альфа-2,8 связанная форма полисиаловой кислоты представляет собой единственную неиммуногенную (не вызывающую ни ответа Т-клеток, ни образования антител у млекопитающих, даже при конъюгации с иммуногенными носителями белками). Более короткие формы полимера (до n=4) обнаруживают в ганглиозидах клеточной поверхности, которые широко распространены в организме и считаются эффективными для сообщения и поддержания иммунологической толерантности по отношению к полисиаловой кислоте.

В последние годы биологические свойства полисиаловых кислот, в особенности биологические свойства альфа-2,8-связанной гомополимерной полисиаловой кислоты, были использованы для модификации фармакокинетических свойств белковых или низкомолекулярных молекул лекарственных веществ [Gregoriadis, 2001; Jain et al., 2003; US-A-5846951, WO-A-0187922].

Альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота (PSA) предлагает привлекательную альтернативу для модификации белков, представляя собой иммунологически невидимый биологически разрушаемый полимер, являющийся естественной частью человеческого организма и который разрушается тканевыми нейраминидазами до сиаловой кислоты, нетоксичного сахарида.

Выбор действующего вещества для предлагаемой в настоящем изобретении ингаляционной лекарственной формы основан на результатах исследований, проведенных авторами настоящего изобретения, обнаружившими способность рекомбинантной дезоксирибонуклеазы-1 человека, ковалентно связанной с гомополимерным полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи, в присутствии ионов кальция и магния в определенном соотношении, а также лактозы:

- существенно увеличивать продолжительность специфического (энзиматического) фармакологического действия;

- не инактивироваться G-актином;

- обладать повышенной устойчивостью при хранении к дезамидированию и образованию агрегатов как в сухом (лиофилизированном), так и в растворенном (перед ингаляцией) виде.

Синтетический ген, кодирующий дезоксирибонуклеазу человека и экспрессионный штамм, были сконструированы по методике описанной Worrall (Worrall AF, Connolly BA.The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNase I and its cloning and expression in Escherichia coli. J Biol Chem. 1990 Dec 15; 265(35):21889-95). Рефолдинг и очистка белка проводились по методике описанной Linardou (Linardou H, Epenetos AA, Deonarain MP. A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I. Int J Cancer. 2000 May 15; 86(4):561-9). Был получен негликозилированный белок с молекулярной массой 29KDa и аминокислотной последовательностью, полностью соответствующей аминокислотной последовательности дезоксирибонуклеазы I из мочи человека, но не имеющий N-связанной олигосахаридной группы. Удельная активность полученного белка составляла не менее 500 Ед/мг.

Синтетический гликопротеин

то есть конъюгат полисиаловой кислоты и рекомбинантной дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I), синтезировали, так как это описано в Примере 1.

В процессе работы над настоящим изобретением изучалось и оценивалось:

- влияние различного содержания солей двувалентных металлов (кальция и магния) на стабильность лекарственной формы, а также на устойчивость к действию G-актина;

- влияние различного содержания лактозы на изменение энзиматической активности до и после лиофилизации при приготовлении заявляемой лекарственной формы, а также на вязкость раствора, приготовленного из лиофилизата для последующей ингаляции.

Исходя из результатов экспериментов были выбраны оптимальные соотношения вспомогательных веществ (солей (хлоридов) магния, кальция и лактозы).

Сущность изобретения поясняется, но не ограничивается, примерами получения заявляемой ингаляционной лекарственной формы с таблицами, показывающими результаты отдельных сравнительных испытаний.

ПРИМЕР 1. Получение синтетического гликопротеина, представляющего собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека, ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом (полисиаловой кислотой), содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты

Приготовление ацетатного буферного раствора: в мерную колбу на 10 мл вносят 1,39 г натрия уксуснокислого трехводного, добавляют 4,0 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения осадка и добавляют с помощью пипетки на 0,1 мл 0,04 мл уксусной кислоты ледяной. Доводят до метки водой для инъекций, закрывают крышкой и перемешивают.

Приготовление раствора цианоборгидрида натрия: в мерную колбу на 10 мл вносят 0,53 г цианоборгидрида натрия, добавляют 4,0 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения, доводят до метки водой для инъекций, закрывают крышкой и перемешивают.

В мерную колбу на 100 мл вносят 10,0 г полисиаловой кислоты (Mm 14+/-1,4 кДа, чистота более 98%, Lipoxen PLC, Великобритания), добавляют 30,0 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения, доводят до метки водой для инъекций, закрывают крышкой и перемешивают.

Приготовление 1М раствора триэтиламмония ацетата: в мерный стакан на 250 мл вносят с помощью мерного цилиндра на 25 мл 21,6 мл триэтиламина, добавляют мерным цилиндром 100,0 мл воды для инъекций и пипеткой на 10 мл 8,9 мл уксусной кислоты ледяной, перемешивают и наливают мерным цилиндром на 50 мл 36,4 мл воды для инъекций.

Приготовление подвижной фазы А: в мерный стакан на 10 л вносят с помощью мерного цилиндра 100 мл 1М раствора триэтиламмония ацетата, добавляют 500,0 мл спирта этилового и 9,4 л воды для инъекций, перемешивают с помощью магнитной мешалки.

Приготовление подвижной фазы Б: в мерный стакан на 5 л вносят с помощью мерного цилиндра 50 мл 1М раствора триэтиламмония ацетата, добавляют 4,0 л спирта этилового и 950 мл воды для инъекций, перемешивают с помощью магнитной мешалки.

Приготовление 0,5 М раствора гидроксида натрия: в мерную колбу на 2 л вносят 10,0 г натрия гидроокиси, добавляют 100,0 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения, доводят до метки тем же растворителем, закрывают крышкой и перемешивают.

Приготовление раствора для диафильтрации: в мерную колбу на 2 л вносят 17,72 г натрия хлористого, 20,08 г натрия гидрофосфата 12-водного и 0,42 г натрия дигидрофосфата 2-водного, добавляют 200,0 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения, доводят до метки тем же растворителем, закрывают крышкой и перемешивают.

Полисиалирование ДНКазы I: в мерный стакан на 250 мл переносят 10 мл приготовленных, как описано выше ацетатного буферного раствора, 10 мл раствора цианоборгидрида натрия и 97,1 мл раствора полисиаловой кислоты. Полученную смесь перемешивают с помощью магнитной мешалки и выдерживают сначала при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем на водяной бане, находящейся при температуре 37°С, в течение 5 минут. После выдержки добавляют 3 мл раствора ДНКазы I в воде для инъекций в концентрации 1 г/мл, перемешивают и инкубируют реакционную массу при температуре 37°С в течение 180 минут.

По истечении выдержки стакан с реакционной массой помещают на ледяную баню и инкубируют при температуре (2-4)°С в течение 180 минут. Полученный раствор синтетического гликопротеина - конъюгата ДНКазы I и полисиаловой кислоты передают на стадию очистки «Обращеннофазовая хроматография».

Обращеннофазовая хроматография: Очистку синтетического гликопротеина формулы I проводят методом препаративной обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ осуществляют на хроматографической системе Varian PrepStar SD-2 (Varian, США) на препаративной колонке (500×50 мм), заполненной сорбентом SOURCE 30 RPC. Детектирование ведут при длине волны 214 нм.

Перед началом очистки хроматографическую колонку уравновешивают посредством пропускания элюента (подвижной фазы А) в течение 1,5-2 ч на скорости 20 мл/мин до постоянного значения оптической плотности элюата.

Линейный градиент: от 0 до 100% подвижной фазы Б от 0 до 100 мин.

К раствору синтетического гликопротеина на льду добавляют 13,2 мл спирта этилового и 2,6 мл 1М раствора триэтиламмоний ацетата, перемешивают и вводят при помощи инжектора в хроматограф при скорости потока 10 мл/мин. Все остальные хроматографические операции проводят при комнатной температуре.

Колонку промывают 500 мл подвижной фазы А, после чего начинают элюирование градиентной системой при скорости потока 20 мл/мин. Сбор элюата ведут следующим образом:

- начинают не ранее 20 минуты градиента и по достижению оптической плотности 0,05 ОЕ переключают клапан;

- далее клапан переключают по достижению максимума первого пика;

- по достижению оптической плотности 0,2 ОЕ;

- по достижению оптической плотности 0,05 ОЕ;

- сбор прекращают по достижению минимума оптической плотности между первым и вторым пиком.

Фракцию с содержанием синтетического гликопротеина более 93% передают на стадию «Концентрирование раствора синтетического гликопротеина».

Концентрирование раствора синтетического гликопротеина: концентрирование раствора синтетического гликопротеина ведут с помощью ультрафильтрации и диафильтрации. Для этого подготавливают ультрафильтрационную установку Cogent Micro Scale (Millipore, США), снабженную емкостью для рециркуляции и линией подачи раствора для диафильтрации. Монтируют кассету Пелликон 2 Биомакс с уровнем отсечения 5 кДа и площадью фильтрации 0,1 м².

Вносят в емкость для рециркуляции 1,0 л 0,5 М раствора гидроксида натрия, направляют линии возврата ретентата и сбора фильтрата в емкость для сбора отработанных растворов и включают установку. Подают раствор на кассету на скорости 100 мл/мин до опорожнения емкости для рециркуляции.

Подсоединяют линии возврата ретентата и сбора фильтрата к емкости для рециркуляции. Вносят в емкость для рециркуляции 1,0 л 0,5 М раствора гидроксида натрия и рециркулируют раствор на скорости 200 мл/мин в течение 30 минут.

Останавливают установку, направляют линии возврата ретентата и сбора фильтрата в емкость для сбора отработанных растворов и включают установку. Подают раствор на кассету на скорости 200 мл/мин до полного опорожнения емкости для рециркуляции.

Останавливают установку, помещают в емкость для рециркуляции 1,0 л воды для инъекций, подсоединяют к линии подачи диафильтрующего раствора емкость, содержащую 2 л воды для инъекций, и пропускают эту воду через кассету на скорости 100 мл/мин до опорожнения обоих емкостей. Останавливают установку, промывают фланец линии возврата ретентата водой для инъекций и подсоединяют его к емкости для рециркуляции.

Раствор синтетического гликопротеина помещают в емкость для рециркуляции (Сб-11₂). Запускают установку на скорости 100 мл/мин, визуально инспектируют отсутствие течи в соединительных линиях, после чего увеличивают скорость рециркуляции до 360 мл/мин. Проверяют давление на входе в кассету - давление должно находится в диапазоне 1,5-2,5 атм. При необходимости изменяют скорость рециркуляции. Ведут ультрафильтрацию до исчерпания раствора в питающей емкости и падения уровня раствора в емкости для рециркуляции до отметки 10 мл.

Останавливают установку, подключают к линии подачи диафильтрующего раствора емкость с раствором для диафильтрации. Включают установку, ведут диафильтрацию до достижения отметки 200 мл в питающей емкости. Останавливают установку, отсоединяют линию подачи диафильтрующего раствора, продолжают рециркуляцию на скорости 100 мл/мин до достижения отметки 10 мл в емкости для рециркуляции. Останавливают установку, перекрывают линию сбора фильтрата штатным зажимом и продолжают рециркуляцию на скорости 20 мл/мин в течение 5 минут. Останавливают установку, помещают линию возврата ретентата в мерный цилиндр, включают подачу жидкости в кассету на скорости 360 мл/мин и полностью собирают диафильтрованный раствор в мерный цилиндр.

Оставшийся раствор для диафильтрации помещают в емкость для рециркуляции и промывают им установку на скорости 20 мл/мин.

Из мерного цилиндра с диафильтрованным раствором берут аликвоту и измеряют концентрацию синтетического гликопротеина. По данным анализа разбавляют раствор водой для инъекций до концентрации синтетического гликопротеина 3,0 г/л.

Выход конъюгата на стадии ТП.5 составляет 66,8% в пересчете на загруженную ДНКазу I.

Полученный концентрированный раствор синтетического гликопротеина используется в производстве заявляемой ингаляционной лекарственной формы.

ПРИМЕР 2. Приготовление заявляемой ингаляционной лекарственной формы синтетического гликопротеина формулы I (вариант).

Приготовление раствора вспомогательных веществ: в мерную колбу на 50 мл загружают 1,153 г лактозы моногидрата, 0,191 г кальция хлористого шестиводного и 0,153 г магния хлористого шестиводного, добавляют 20 мл воды для инъекций, перемешивают до полного растворения, доводят тем же растворителем до метки, закрывают крышкой и перемешивают.

Приготовление раствора для лиофилизации: в смесительный модуль Mobius Single-use Mixing Systems (Millipore, США) объемом 10,0 л устанавливают разовую полиэтиленовую емкость. К азотному порту разовой полиэтиленовой емкости смесительного модуля присоединяют шланг подачи стерильного азота, остальные загрузочные и разгрузочные порты при этом перекрыты. Разовым кратковременным открытием вентиля на линии подачи азота расправляют полиэтиленовую емкость. После этого открывают порт подачи жидких реагентов и с помощью мерного цилиндра загружают 330,9 мл концентрированного раствора синтетического гликопротеина, полученного так, как это описано в Примере 1, 50 мл раствора вспомогательных веществ и 193,2 мл воды для инъекций. Перемешивают в течение 10 минут.

Стерильная фильтрация: по окончании перемешивания (на предыдущей стадии) при помощи силиконового шланга соединяют разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров диаметром пор 045/0,22 мкм, которая соединена с разовой приемной емкостью стерильной смеси при помощи шланга с обжимным концом. Питающий конец силиконового шланга находится в зоне класса чистоты С. Шланг через уплотнительную муфту входит в изолятор, стерилизующая система, обжимной шланг и приемная емкость находятся в изоляторе. Открывают разгрузочный порт смесительного модуля и вентиль на подачи стерильного азота. Передавливают перемешанный раствор через собранную стерилизующую систему в приемную полипропиленовую емкость объемом 5 литров, во время фильтрации смеси контролируют давление на линии подачи стерильного азота по показаниям манометра, корректируя с помощью редуктора значение давления от 0,07 до 0,15 МПа (от 0,7 до 1,5 бар). Прекращают подачу азота в смесительный модуль и перекрывают обжимной шланг к приемной 5-литровой полипропиленовой емкости стерильной смеси.

При помощи силиконовых шлангов соединяют приемную емкость стерилизованной смеси с депирогенизирующим фильтром 0,22 мкм и разовой приемной емкостью депирогенизированного раствора, установленной на магнитной мешалке. Включают магнитную мешалку. К емкости стерилизованной смеси присоединяют линию подачи стерильного азота и открытием вентиля подачи азота передавливают смесь через депирогенизирующий фильтр в стерильную разовую 5-литровую полипропиленовую финишную приемную емкость.

Силиконовый шланг, соединяющий депирогенизирующий фильтр с финишной приемной емкостью, перекрывают зажимом с образованием блокирующего полукольца. Аналогичным полукольцом блокируют силиконовый шланг, соединяющий разгрузочный порт смесительного модуля с системой стерилизующих фильтров. Отсоединяют силиконовые шланги с входного фитинга стерилизующего фильтра и выходного фитинга депирогенизирующего фильтра. Снимают соединения азотной линии с 5-литровой полипропиленовой приемной емкости стерильного раствора, содержащего активное вещество и вспомогательные вещества готовой лекарственной формы. Полученный стерильный раствор перемешивают в течение 15 мин. По окончании перемешивания отбирают пробу для определения концентрации активного вещества - синтетического гликопротеина. Полученные данные используются для уточнения объема дозирования при наполнении флаконов для следующей стадии («Лиофильной сушки»).

Лиофильная сушка: стерильные флаконы стеклянные для инъекционных препаратов объемом 10 мл в количестве 276 шт. заносят в передаточный шлюз изолятора, снимают первичную упаковку, закрывают крышку шлюза и обрабатывают флаконы УФ-излучением в течение 15 минут. Тем временем из лиофильной сушилки Epsilon 2-10D (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия), находящейся в изоляторе, достают поддоны и устанавливают на стол изолятора. По окончании обработки флаконов УФ-излучением открывают внутреннюю крышку шлюза, ведущую в изолятор, вскрывают первичную упаковку и устанавливают флаконы в поддоны лиофильной сушилки Epsilon 2-10D, использованную упаковку сбрасывают в контейнер для отходов, предусмотренный в изоляторе. Таким же образом заносятся стерильные крышки и колпачки флаконов в изолятор.

Стерилизованный и депирогенизированный раствор, содержащий активное вещество и вспомогательные вещества, полученный на стадии «Стерильная фильтрация», из приемной емкости при помощи диспенсера eLINE Pro (Biohit, Финляндия) дозируется во флаконы примерно по 2 мл с учетом концентрации активного вещества в растворе таким образом, чтобы концентрация активного вещества в конечном лиофилизате составляла 3,7 мг в одном флаконе. По окончании дозирования смеси на каждый флакон легким нажатием устанавливается крышка таким образом, чтобы оставалось отверстие для испарения жидкости. Не плотно укупоренные флаконы на поддонах устанавливаются в лиофильную сушилку Epsilon 2-10D.

На терминале лиофильной сушилки Epsilon 2-10D задается температура полок -(45±2)°С и время замораживания 3-4 часа. После достижения материалом указанной температуры производится выдержка в течение 3-4 часов. Конденсатор сушилки охлаждается до -(80±5)°С и включается вакуумный насос. Остаточное давление в сушилке задают 0,01 mbar (1 Па), время выхода на режим сублимации составляет 55-65 мин. Производится сушка препарата в течение 3 часов при указанных параметрах. По истечении указанного времени начинается постепенный нагрев полок и материала со скоростью (5-6)°С в час, задается остаточное давление 0,005 mbar. При достижении температуры (8-10)°С нагрев прекращается и выдерживается материал в этих условиях в течение 2 часов. Об окончании процесса высушивания свидетельствует постоянная температура материала, равная температуре полок, постоянный уровень вакуума (0,005 mbar), срабатывает датчик понижения давления паров. По окончании сушки отключается вакуумный насос, камера сушилки заполняется сухим стерильным азотом и в автоматическом режиме происходит заключительное укупоривание флаконов.

Выход на стадии приготовления ингаляционной лекарственной формы составляет 93,6-95,6%, считая на активное вещество - синтетический гликопротеин.

Получают 268-276 флаконов варианта заявляемой ингаляционной лекарственной формы, каждый флакон содержит 8,0±0,8 мг лиофилизата следующего состава:

Синтетический гликопротеин формулы I	3,7 мг
Магния хлорид	0,28 мг
Кальция хлорид	0,33 мг
Лактоза	3,7 мг

ПРИМЕР 3. Оценка стабильности синтетического гликопротеина формулы I при различном содержании ионов кальция и магния в лекарственной форме.

Сравнительную стабильность синтетического гликопротеина формулы I при различном содержании ионов кальция и магния в лекарственной форме в отношении накопления дезамидированных форм ДНКазы и агрегатов при хранении как лиофилизированой, так и растворенной в 0,9% растворе натрия хлорида определяли так, как это описано [Bei Chen; Constantino, H.R., Influence of calcium ions on the stmcture and stability of recombinant human deoxyribonuclease I in the aqueous and lyophilized states, J.Pharm. Sci., 1999, v.88 (4), pp.477-82].

Для этого ингаляционные лекарственные формы синтетического гликопротеина формулы I готовили так, как это описано в Примере 2, за исключением того, что в раствор вспомогательных веществ вносили различные количества солей кальция и магния. Содержание дезамидированных форм ДНКазы и агрегатов при их определении сразу после изготовления ингаляционной лекарственной формы (лиофилизации) или, соответственно, сразу при приготовлении раствора для ингаляции (из лиофилизата) принимали за единицу. Результаты экспериментов иллюстрируются Таблицей 1, Таблицей 2.

Таблица 1.
Изменение содержания агрегатов в ингаляционной лекарственной форме (лиофилизате) синтетического гликопротеина во времени при хранении при температуре +20°С при различном содержании солей магния.
Содержание кальция хлорида (мас.%)	00,00-0,99 мас.%	1,00-2,99 мас.%	3,00-3,99 мас.%	4,00-4,99 мас.%
При изготовлении	1	1	1	1
Через 1 месяц	2	1,5	1	2
Через 3 месяца	3	2	1	2
Через 6 месяцев	5	3	1,2	3

Таблица 2.
Изменение содержания агрегатов в растворе ингаляционной лекарственной формы (8 мг лиофилизата на 1 мл) синтетического гликопротеина во времени при хранении при температуре +37°С при различном содержании солей магния.
Содержание магния хлорида (масс.%) в лиофилизате	00,00-0,99 мас.%	1,00-2,99 мас.%	3,00-3,99 мас.%	4,00-4,99 мас.%
При изготовлении	1	1	1	1
Через 1 час	2	1,3	1	2
Через 3 часа	4	2,2	1	3
Через 6 часов	6	2,8	1,1	4

Из представленной таблицы следует, что агрегация в наименьшей степени имеет место при содержании ионов двухвалентных металлов (кальция или магния) в лиофилизате ингаляционной лекарственной формы синтетического гликопротеина в пределах 3,00-3,99 мас.%.

Подобные данные были также получены авторами настоящего изобретения в отношении сохранения энзиматической актвиности синтетического гликопротина формулы I в растворе предлагаемой готовой лекарственной формы, в том числе в сравнении с коммерческим препаратом «обычной» (неполисиалированной) ДНКазы I человека (дорназы альфа) (Pulmozyme, Хофманн ля Рош, Швейцария). Энзиматическую активность определяли так, как это описано в Примере 4. При этом уменьшение энзиматической активности коммерческого препарата при хранении происходило в 1,5-2 раза быстрее, чем раствора предложенной ингаляционной лекарственной формы.

ПРИМЕР 4. Влияние содержания лактозы в лекарственной форме на изменение энзиматической активности при лиофилизации (после растворения) и вязкость.

Влияние содержания лактозы в лекарственной форме на изменение энзиматической активности при лиофилизации определяли по изменению энзиматической активность в растворе до лиофилизации препарата (которая бралась за 100%) и после доведения лиофилизированного препарата в воде для инъекций до того же объема раствора, который помещался во флакон перед его лиофилизацией.

Для этого ингаляционные лекарственные формы синтетического гликопротеина формулы I готовили так, как это описано в Примере 2, за исключением того, что в раствор вспомогательных веществ вносили различные количества лактозы. Энзиматическую активность определяли, как это описано [Lichtinghagen R, Determination of Pulmpzime (domase alpha) stability using kinetic colormetric DNase I activity assay, Eur. J. 2006, v.63, pp.365-8]. В качестве стандарта при определении энзиматической активности использовался коммерческий препарат дорназы альфа (Pulmozyme, 1000000 Ед/л, Хофманн ля Рош, Швейцария). Ферментативная активность синтетического гликопротеина перед лиофилизацией раствора была принята за 100% (как исходная). Вязкость растворов определяли на вискозиметре AMVn (Anton Paar, Австрия). Результаты экспериментов иллюстрируются Таблицей 3.

Таблица 3.
Влияние содержания лактозы в ингаляционной лекарственной форме синтетического гликопротеина на уменьшение энзиматической активности, вызванной лиофилизацией, и вязкость.
Содержание лактозы (мас.%) в лиофилизате	20	30	40	50	60
Энзиматическая активность, % от исходной	85%	88%	95%	96%	98%
Вязкость, мПас	1.02	1.17	1.23	1.50	1.81

Из представленных данных видно, что с увеличением концентрации лактозы увеличивается процент сохраненной энзиматической активности гликопротеина в ингаляционной лекарственной форме, однако, критически увеличивается вязкость раствора (более 1.4 мПас), что резко уменьшает эффективность ингаляции при использовании ингаляторов. Таким образом, на основании представленных данных и данных других подобных экспериментов авторами было выбрано оптимальное содержание лактозы в заявляемой ингаляционной лекарственной форме.

1. Лиофилизированная лекарственная форма гликопротеина дезоксирибонуклеазы I человека для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что указанный гликопротеин, представляющий собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека, получаемую в микроорганизме Е. coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи, следующей формулы:


используется в качестве активного вещества, а в качестве вспомогательных веществ используются магния хлорид, кальция хлорид и лактоза при следующем соотношении компонентов, мас.%:

гликопротеин формулы I	45,0±5,0
магния хлорид	3,5±0,5
кальция хлорид	4,0±0,5
лактоза	45,0±5,0

2. Способ получения лекарственной формы по п. 1, отличающийся тем, что к водному раствору синтетического гликопротеина формулы I добавляют водный раствор, содержащий магния хлорид, кальция хлорид, лактозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: гликопротеин формулы I (45,0±5,0), магния хлорид (3,5±0,5), кальция хлорид (4,0±0,5), лактоза (45,0±5,0); перемешивают, затем стерильно разливают во флаконы боросиликатного стекла, лиофилизируют, заполняют флаконы стерильным азотом, стерильно укупоривают флаконы пробками и обжимают колпачками.