Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью



Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью
Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью

 


Владельцы патента RU 2559531:

Эмджен Рисерч (Мьюник)ГмбХ (DE)

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA). Предложена молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, который представляет собой одноцепочечное антитело, способное связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека, а также приматов Callithrix jacchus (игрунка), Saguinus Oedipus (эдипов тамарин) и Saimiri sciureus (беличья обезьяна), содержащим последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (QDGNE), и второй связывающий домен, способный связываться с PSMA. Также рассмотрены: последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, способ получения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела, фармацевтическая композиция, применение молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения, лечения или уменьшения симптомов рака, связанного с экспрессией PSMA, и способ предупреждения, лечения или уменьшения симптомов рака, связанного с экспрессией PSMA, у субъекта. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, связанных с PSMA. 8 н. и 12 з.п. ф-лы, 57 ил., 9 табл., 26 пр.

 

Настоящее изобретение относится к молекуле биспецифического одноцепочечного антитела, содержащей первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3-эпсилон-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп является частью аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8, и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). Согласно изобретению предложены также нуклеиновые кислоты, кодирующие указанную молекулу биспецифического одноцепочечного антитела, а также векторы и клетки-хозяева и способ их получения. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанную молекулу биспецифического одноцепочечного антитела, и к медицинским применениям указанной молекулы биспецифического одноцепочечного антитела.

Т-клеточное распознавание опосредовано клонотипически распределенными альфа-бета и гамма-дельта Т-клеточными рецепторами (TcR), которые взаимодействуют с пептид-нагруженными молекулами пептид-МНС (главный комплекс гистосовместимости) (рМНС) (Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). Антиген-специфические цепи TcR не содержат сигнальных доменов, а вместо этого связываются с консервативным мультисубъединичным аппаратом передачи сигнала CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979; Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46; Malissen Immunol. Rev. 191 (2003), 7-27). Механизм, посредством которого TcR-лигирование напрямую связано с аппаратом передачи сигнала, остается фундаментальным вопросом Т-клеточной биологии (Alarcon, см. выше; Davis, Cell 110 (2002), 285-287). Кажется очевидным, что в устойчивые Т-клеточные ответы вовлечены контактирование с корецептором, олигомеризация TcR и организация комплексов TcR-pMHC более высокого порядка в иммунологическом синапсе (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001), R289-R291; Davis, Nat. Immunol.4 (2003), 217-224). Однако самая ранняя передача сигнала посредством TcR происходит в отсутствие этих событий и может приводить к лиганд-индуцированному изменению в CD3-эпсилон (Alarcon, см. выше; Davis (2002), см. выше; Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179; Gil, Cell 109 (2002), 901-912). Эпсилон-, гамма-, дельта- и зета-субъединицы сигнального комплекса ассоциируются друг с другом с образованием CD3-эпсилон-гамма гетеродимера, CD3-эпсилон-дельта гетеродимера и CD3-зета-зета гомодимера (Call, см. выше). Различные исследования выявили, что молекулы CD3 важны для надлежащей экспрессии на клеточной поверхности альфа-бета TcR и нормального развития Т-клеток (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536; Wang, J. Exp. Med. 188 (1998), 1375-1380; Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995), 441-447). Исследование структуры фрагментов эктодоменов мышиного CD3-эпсилон-гамма гетеродимера показало, что эпсилон-гамма-субъединицы представляют собой C2-set lg-домены, которые взаимодействуют друг с другом с образованием необычной поперечной (side-to-side) димерной конфигурации (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Хотя богатый цистеиновыми остатками "стебель", по-видимому, играет важную роль в запуске димеризации CD3 (Su, см. выше, Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), взаимодействие посредством внеклеточных доменов CD3-эпсилон и CD3-гамма является достаточным для образования комплекса этих белков с TcR-бета (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92; Manolios & Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995), 532-536). Несмотря на продолжающуюся дискуссию по этому вопросу, преобладающая стехиометрия TcR вероятней всего содержит один альфа-бета TcR, один CD3-эпсилон-гамма гетеродимер, один CD3-эпсилон-дельта гетеродимер и один CD3-зета-зета гомодимер (Call, см. выше). С учетом центральной роли человеческого CD3-эпсилон-гамма гетеродимера в иммунном ответе не так давно была установлена кристаллическая структура этого комплекса, связанного с терапевтическим антителом OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

Многие терапевтические стратегии основаны на модулировании Т-клеточного иммунитета путем направленного воздействия на передачу сигнала посредством TcR, в частности на моноклональные антитела (mAb) против CD3 человека, которые широко используются в клинических схемах введения иммунодепрессантов. CD3-специфическое мышиное mAb OKT3 было первым mAb, разрешенным для применения у людей (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29), и оно находит широкое клиническое применение в качестве иммунодепрессанта при трансплантации (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430; Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003), 123-132; Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998), 1351-1352), при диабете типа 1 (Chatenoud (2003), см. выше) и при псориазе (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913). Более того, анти-CD3 mAb могут индуцировать частичную Т-клеточную передачу сигнала и клональную толерантность (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997), 1413-1422). OKT3 описано в литературе как мощный Т-клеточный митоген (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) и как мощный Т-клеточный киллер (Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). OKT3 проявляет эти виды активности время-зависимым образом, и после ранней активации Т-клеток, приводящей к высвобождению цитокинов, последующее введение OKT3 блокирует все известные Т-клеточные функции. Благодаря этому последующему блокированию Т-клеточной функции OKT3 нашло такое широкое применение в качестве иммунодепрессанта в курсах терапии с целью снижения или даже аннулирования отторжения тканевого аллотрансплантата.

OKT3 реверсирует отторжение тканевого аллотрансплантата вероятней всего путем блокирования функции всех Т-клеток, которые играют главную роль в остром отторжении. OKT3 взаимодействует с CD3-комплексом и блокирует функцию CD3-комплекса в мембране Т-клеток человека, который ассоциирован с антиген-распознающей структурой Т-клеток (TCR) и является важным для сигнальной трансдукции. Предметом множества исследований был вопрос о том, с какой субъединицей TCR/CD3 связывается OKT3. Некоторые факты все же свидетельствуют о специфичности OKT3 к эпсилон-субъединице комплекса TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Дополнительные данные свидетельствуют о том, что для связывания OKT3 с комплексом TCR/CD3 необходимо присутствие других субъединиц этого комплекса (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

Другие общеизвестные антитела, обладающие специфичностью к молекуле CD3, перечислены в Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Как указано выше, такие CD3-специфические антитела способны индуцировать различные Т-клеточные ответы, такие как продуцирование лимфокинов (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982), 337), пролиферация (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) и индукция Т-клеточных супрессоров (Kunicka, "Lymphocyte Typing II" 1 (1986), 223). То есть, в зависимости от условий эксперимента CD3-специфическое моноклональное антитело может либо ингибировать. либо индуцировать цитотоксичность (Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770; Phillips. J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

Хотя известно, что многие антитела против CD3, описанные в данной области, распознают CD3-эпсилон-субъединицу CD3-комплекса, большинство из них в действительности связываются с конформационными эпитопами и, следовательно, распознают CD3-эпсилон только в нативном окружении TCR. Конформационные эпитопы характеризуются наличием двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые обособлены в первичной последовательности, но объединяются на поверхности молекулы, когда полипептид сворачивается в нативный белок/антиген (Sela, (1969) Science 166, 1365; Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Конформационные эпитопы, связывающиеся с антителами против CD3-эпсилон, описанными в данной области, можно разделить на две группы. В основной группе указанные эпитопы представляют собой эпитопы, образованные двумя субъединицами CD3, например CD3-эпсилон-цепью и CD3-гамма- или CD3-дельта-цепью. Например, в результате проведения нескольких исследований было установлено, что наиболее широко используемые моноклональные антитела против CD3-эпсилон, а именно OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 и Leu-4, не связываются с клетками, однократно трансфицированными CD3-эпсилон-цепью. Однако эти антитела окрашивали клетки, двукратно трансфицированные комбинацией CD3-эпсилон плюс либо CD3-гамма, либо CD3-дельта (Tunnacliffe, см. выше; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52; Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). Во второй, меньшей группе конформационный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный в пределах самой CD3-эпсилон субъединицы. Членом этой группы является, например, mAb АРА 1/1, индуцированное против денатурированной CD3-эпсилон-цепи (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). В совокупности, большинство антител против CD3-эпсилон, описанных в данной области, распознают конформационные эпитопы, расположенные на двух или более субъединицах CD3. Отдельные аминокислотные остатки, образующие трехмерную структуру этих эпитопов, могут быть локализованы при этом либо на самой CD3-эпсилон субъединице, либо на CD3-эпсилон субъединице и других субъединицах CD3, таких как CD3-гамма или CD3-дельта.

Другая проблема, связанная с антителами против CD3, заключается в том, что многие антитела против CD3, как было установлено, являются видоспецифическими. Моноклональные антитела против CD3 функционируют путем высокоспецифического распознавания свих молекул-мишеней что справедливо, как правило, для любых других моноклональных антител. Они распознают только один сайт, или эпитоп, на их целевой молекуле CD3. Например, одним из наиболее широко используемых и лучше всего охарактеризованных моноклональных антител, специфичных к CD3-комплексу, является OKT-3. Это антитело взаимодействует с CD3 шимпанзе, но не с гомологом CD3 других приматов, таких как макаки, или с CD3 собаки (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). Аналогичным образом, в WO 2005/118635 или WO 2007/033230 описаны человеческие моноклональные антитела против CD3-эпсилон, которые взаимодействуют с CD3-эпсилон человека, но не с CD3-эпсилон мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося шимпанзе, такого как макак-резус, яванский макак или павиан. Анти-CD3 моноклональное антитело UCHT-1 также взаимодействует с CD3 шимпанзе, но не с CD3 макака (собственные данные). С другой стороны, есть также примеры моноклональных антител, которые распознают антигены макака, но не их человеческие копии. Одним из примеров этой группы является моноклональное антитело FN-18, направленное на CD3 макака (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). Интерес представляет тот факт, что обнаружено, что периферические лимфоциты от примерно 12% яванских макаков не взаимодействуют с моноклональным антителом против CD3 макака-резуса (FN-18) из-за полиморфизма антигена CD3 у макаков. Uda с соавторами описали замену двух аминокислот в последовательности CD3 яванских макаков, которые не взаимодействуют с антителами FN-18, по сравнению с CD3 животных, которые взаимодействуют с антителами FN-18 (Uda et al., J. Med. Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J. Med. Primatol. 33 (2004), 34-7).

Эта различающая способность, т.е. видовая специфичность, свойственная не только моноклональным антителам против CD3 (и их фрагментам), но и моноклональным антителам вообще, существенно затрудняет их разработку в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний человека. Для того чтобы получить разрешение на продажу, любое новое лекарство-кандидат должно пройти строгое тестирование. Это тестирование можно подразделить на доклиническую и клиническую фазы, причем клиническая фаза дополнительно подразделяется на общеизвестные клинические фазы I, II и III, которые проводят на пациентах-людях, а доклиническую фазу проводят на животных. Цель доклинического тестирования состоит в том, чтобы доказать, что лекарственное средство-кандидат обладает желаемой активностью и, что очень важно, является безопасным. Только после установления безопасности и возможной эффективности лекарственного средства-кандидата в доклинических испытаниях на животных это лекарственное средство-кандидат будет одобрено соответствующим регулирующим органом для клинических испытаний на людях. Лекарственные средства-кандидаты могут быть протестированы в отношении безопасности на животных следующими тремя путями: (1) на релевантном виде, т.е. на виде, в организме которого лекарственные средства-кандидаты могут распознавать ортологические антигены, (2) на трансгенном животном, содержащем человеческие антигены, и (3) путем использования имитатора лекарственного средства-кандидата, который может связываться с ортологическими антигенами, присутствующими в организме животного. Ограничения по трансгенным животным заключаются в том, что эта технология обычно ограничивается грызунами. Между грызунами и человеком имеются значительные различия в физиологии, и результаты по безопасности нельзя с легкостью экстраполировать на людей. Ограничениями по имитатору лекарственного средства-кандидата являются другой состав вещества по сравнению с реальным лекарственным средством-кандидатом, и часто используемыми животными являются грызуны с тем ограничением, которое обсуждается выше. Следовательно, доклинические данные, полученные на грызунах, имеют ограниченную прогностическую способность в отношении лекарственного средства-кандидата. Подход к решению проблемы выбора тестирования безопасности заключается в использовании релевантного вида, предпочтительно низшего примата. В настоящее время ограничение, касающееся моноклональных антител, подходящих для терапевтического вмешательства у человека и описанных в данной области, заключается в том, что релевантными видами являются высшие приматы, в частности шимпанзе. Шимпанзе считаются исчезающим видом, и в связи с их человекоподобной природой использование таких животных для тестирования безопасности лекарственного средства запрещено в Европейских странах и в значительной степени ограничено в других странах. CD3 был также успешно использован в качестве мишени для биспецифических одноцепочечных антител с той целью, чтобы перенаправлять цитотоксические Т-клетки к патологическим клеткам и, в результате, выводить больные клеток из соответствующего организма (WO 99/54440; WO 04/106380). Например, Bargou с соавторами (Science 321 (2008):974-7) недавно сообщили о клинической активности конструкции CD19xCD3 биспецифического антитела, названной блинатумомабом, которая обладает потенциалом контактировать со всеми цитотоксическими Т-клетками у пациентов-людей для лизиса раковых клеток. Низкие дозы, такие как 0,005 миллиграммов на квадратный метр в сутки, у пациентов с неходжкинской лимфомой приводили к истощению клеток-мишеней в крови. Частичные и полные регрессии опухолей впервые наблюдались при уровне дозы 0,015 миллиграммов, и у всех семи пациентов, которых лечили дозами 0,06 миллиграммов, наблюдалась регрессия опухоли. Блинатумомаб также приводил к клиренсу опухолевых клеток из костного мозга и печени. Несмотря на то, что это исследование дало клиническое доказательство концепции для терапевтической эффективности формата биспецифического одноцепочечного антитела в лечении рака клеток крови, все еще существует потребность в успешных концепциях для терапий других видов рака.

По оценкам, в Соединенных Штатах Америки в 2008 году у 186320 мужчин будет впервые диагностирован рак предстательной железы, и примерно 28660 мужчин умрут от этой болезни. Согласно большинству предыдущих отчетов по смертности от рака в 2004 году общий уровень смертности от рака предстательной железы среди американских мужчин составлял 25 на 100000. В конце 1980-х годов широкое применение теста на специфический антиген предстательной железы (PSA) сыграло большую роль в улучшении лечения рака предстательной железы. Этот тест позволяет измерять количество PSA-белка в крови, которое часто бывает повышенным у пациентов с раком предстательной железы. В 1986 году Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США (U.S. Food and Drug Administration) одобрило применение теста на PSA для мониторинга пациентов с раком предстательной железы и в 1994 году дополнительно одобрило его применение в качестве скрининг-теста в отношении этого заболевания. Благодаря всеобщему проведению тестирования на PSA в США, в настоящее время приблизительно 90 процентов всех случаев рака предстательной железы диагностируется на ранней стадии, и, следовательно, мужчины живут дольше после установления диагноза. Однако чтобы определить, действительно ли скрининг PSA спасает жизни, потребуются результаты двух проводящихся в настоящее время клинических испытаний, а именно спонсируемого Национальным институтом рака (NCI) Скринингового испытания в отношении предстательной железы, легкого, ободочной и прямой кишки и яичника (PLCO) и Европейского исследования со скринингом в отношении рака предстательной железы (ERSPC). В проводившихся в течение последних 25 лет клинических испытаниях исследовалась эффективность природных и синтетических соединений в предупреждении рака предстательной железы. Например, в Испытании в отношении предупреждения рака предстательной железы (РСРТ), в котором участвовало около 19000 здоровых мужчин, было обнаружено, что финастерид, лекарственное средство, разрешенное для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ВРН), которая представляет собой доброкачественное увеличение предстательной железы, снижает риск развития рака предстательной железы на 25 процентов. Еще одно испытание, Испытание по предупреждению рака с использованием селена и витамина Е (SELECT), в котором участвуют более 35000 мужчин, проводится с целью определения, могут ли ежедневные добавки селена и витамина Е снижать инцидентность рака предстательной железы у здоровых мужчин. В других испытаниях по предотвращению рака предстательной железы, которые проводятся в настоящее время, оценивается защитный потенциал поливитаминов, витаминов С и D, сои, зеленого чая и ликопена, который является природным соединением, обнаруженным в томатах. Одно исследование, о котором сообщалось в 2005 году, показало, что специфические гены были слитыми в 60-80 процентах проанализированных опухолей предстательной железы. Это исследование представляет собой первое наблюдение неслучайных генных перестроек при раке предстательной железы. Это генетическое изменение может быть использовано, в конечном счете, в качестве биомаркера для диагностики и, возможно, для лечения этого заболевания. Другие исследования показали, что генетические вариации в специфической области хромосомы 8 могут увеличивать риск развития рака предстательной железы у человека. Эти генетические вариации объясняют приблизительно 25 процентов случаев рака предстательной железы, которые имеют место у белых мужчин. Они являются первыми достоверными генетическими вариантами, которые увеличивают риск развития рака предстательной железы и могут помочь ученым лучше понять генетические причины этого заболевания. Проводится также исследование, направленное на выяснение, как белки, циркулирующие в крови пациента, могут быть использованы для улучшения диагностики рака предстательной железы и других видов рака. В 2005 году ученые идентифицировали группу специфических белков, продуцируемых иммунной системой пациента в ответ на опухоли предстательной железы. Эти белки, типа аутоантитела, способны обнаруживать присутствие клеток рака предстательной железы в образцах крови с точностью свыше 90 процентов. При использовании в комбинации с PSA эти белки и другие белки крови могут, в конечном счете, быть использованы для сокращения количества ложноположительных результатов, получаемых только тестированием на PSA, и, следовательно, для сокращения многочисленных ненужных биопсий предстательной железы, выполняемых каждый год из-за ложноположительных результатов теста на PSA.

Помимо PSA было идентифицировано несколько других маркеров рака предстательной железы, включая, например, шестидоменный трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы (STEAP) (Hubert et al., PNAS 96 (1999), 14523-14528), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA) (Reiter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95:1735-1740, 1998) и специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA; PSM) (Israeli et al., Cancer Res. 53 (1993), 227-230). PSMA первоначально был определен моноклональным антителом (MAb) 7E11, получаемым в результате иммунизации частично очищенным мембранным препаратом из клеточной линии метастазов аденокарциномы предстательной железы в лимфатических узлах (LNCaP) (Horoszewicz et al., Anticancer Res. 7 (1987); 927-35). Фрагмент кДНК из 2,65 п.н. (пар нуклеотидов), кодирующий белок PSMA, клонировали и затем картировали в хромосому 11p11.2 (Israeli et al., смотри выше; O'Keefe et al., Biochem. Biophys. Acta 1443 (1998), 113-127). Первоначальный анализ PSMA продемонстрировал повсеместную экспрессию в клетках секреторного эпителия предстательной железы. Иммуногистохимическое окрашивание продемонстрировало, что в гиперпластических и доброкачественных тканях PSMA отсутствует или умеренно экспрессируется, тогда как злокачественные ткани окрашиваются с наибольшей интенсивностью (Horoszewicz et al., смотри выше). Последующие исследования повторили эти результаты и продемонстрировали экспрессию PSMA как универсальный признак в практическим каждой ткани предстательной железы, исследованной на данный момент. Эти сведения также демонстрируют, что экспрессия PSMA стремительно увеличивается пропорционально агрессивности опухоли (Burger et al., Int. J. Cancer 100 (2002), 228-237; Chang et al., Cancer Res. 59 (1999), 3192-98; Chang et al., Urology 57 (2001), 1179-83), Kawakami and Nakayama, Cancer Res. 57 (1997), 2321-24; Liu et al., Cancer Res. 57 (1997), 3629-34; Lopes et al., Cancer Res. 50 (1990), 6423-29; Silver et al., Clin. Cancer Res. 9 (2003), 6357-62; Sweat et al., Urology 52 (1998), 637-40; Troyer et al., Int. J. Cancer 62 (1995), 552-558; Wright et al., Urology 48 (1996), 326-334). Увеличение уровней PSMA связано с андроген-независимым раком предстательной железы (РСа), что согласуется с корреляцией между экспрессией PSMA и стадией опухоли. Анализ образцов тканей, взятых у пациентов с раком предстательной железы, продемонстрировал повышенные уровни PSMA после физической кастрации или андроген-депривационной терапии. В отличие от экспрессии специфического антигена предстательной железы, которая подавляется после удаления андрогенов, экспрессия PSMA значительно увеличивается в образцах первичных и метастатических опухолей (Kawakami et al., Wright et al., смотри выше). Известно также, что согласующаяся с повышенной экспрессией в андроген-независимых опухолях транскрипция PSMA подвергается понижающей регуляции стероидами, и введение тестостерона опосредует резкое снижение уровней белка PSMA и mRNA (Israeli et al., Cancer Res. 54 (1994), 1807-11; Wright et al., смотри выше). Кроме того, PSMA в значительной степени экспрессируется во вторичных опухолях предстательной железы и при скрытом метастическом заболевании. Иммуногистохимический анализ выявил относительно интенсивную и равномерную экспрессию PSMA в метастатических поражениях, распространившихся в лимфатические узлы, кость, мягкую ткань и легкие, по сравнению с доброкачественными тканями предстательной железы (Chang et al. (2001), смотри выше; Murphy et al., Cancer 78 (1996), 809-818; Sweat et al., смотри выше). Некоторые данные также показали ограниченную экспрессию PSMA в экстрапростатических тканях, включая почечные проксимальные канальцы, некоторые клетки интестинальной мембраны щеточной каемки и редкие клетки в криптах ободочной и толстой кишки (Chang et al. (1999), Horoszewicz et al., Israeli et al. (1994), Lopes et al., Troyer et al., смотри выше). Однако уровни PSMA в этих тканях обычно на два-три порядка меньше, чем уровни, наблюдаемые в предстательной железе (Sokoloff et al., Prostate 43 (2000), 150-157). PSMA также экспрессируется в ассоциированных с опухолями новообразованных сосудах большинства исследованных солидных раковых опухолей, однако отсутствует в нормальном сосудистом эндотелии (Chang et al. (1999), Liu et al., Silver et al., смотри выше). Хотя значение экспрессии PSMA в сосудистой сети неизвестно, специфичность к опухоль-ассоциированному эндотелию делает PSMA потенциальной мишенью для лечения многих форм злокачественности.

Несмотря на то, что было приложено много усилий для идентификации новых мишеней для терапевтических подходов к лечению рака, рак все еще является одним из наиболее часто диагностируемых заболеваний. В этой связи, все еще существует потребность в эффективных способах лечения рака.

Согласно настоящему изобретению предложена молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп является частью аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8, и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA).

Хотя контактирующие с Т-клетками биспецифические одноцепочечные антитела, описанные в данной области, имеют большой терапевтический потенциал для лечения злокачественных заболеваний, большинство этих биспецифических молекул ограничены тем, что они являются видоспецифическими и распознают только антиген человека и, вследствие генетического сходства, по всей вероятности шимпанзе. Преимущество настоящего изобретения заключается в создании биспецифического одноцепочечного антитела, содержащего связывающий домен, проявляющий межвидовую специфичность к CD3-эпсилон-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе.

В настоящем изобретении неожиданно был идентифицирован N-концевой, содержащий аминокислотные остатки 1-27 полипептидный фрагмент внеклеточного домена CD3-эпсилон, который, в отличие от всех остальных известных эпитопов CD3-эпсилон, описанных в данной области, сохраняет свою трехмерную структурную целостность при удалении из его нативного окружения в CD3-комплексе (и возможно слиянии с гетерологичной аминокислотной последовательностью, такой как ЕрСАМ или Fc-область иммуноглобулина). Таким образом, согласно настоящему изобретению предложена молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом N-концевого, содержащего аминокислотные остатки 1-27 полипептидного фрагмента внеклеточного домена CD3-эпсилон-цепи (причем CD3-эпсилон-цепь, например, удалена из ее нативного окружения и/или содержится (презентирована на поверхности) в Т-клетке) человека и по меньшей мере одного примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп является частью аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8; и второй связывающий домен, способный связываться со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). Предпочтительные приматы, не являющиеся шимпанзе, упомянуты в данном описании в другом месте. По меньшей мере один (или их выборка или все) примат(ы), выбранный(е) из Callithrix jacchus (игрунка), Saguinus Oedipus (эдипов тамарин), Saimiri sciureus (беличья обезьяна) и Масаса fascicularis (яванский макак) (SEQ ID NO: либо 1047, либо 1048, либо обе), особенно предпочтительны. Масаса mulatta, также известный как макак-резус, также рассматривается как еще один предпочтительный примат. Поэтому предусматривается, что антитела по изобретению связываются с (способны связываться с) независимым от окружения эпитопом N-концевого, содержащего аминокислотные остатки 1-27 полипептидного фрагмента внеклеточного домена CD3-эпсилон человека и Callithrix jacchus, Saguinus oedipus, Saimiri sdureus и Macaca fascicularis (SEQ ID NO: либо 1047, либо 1048, либо обе), и возможно также Macaca mulatta. Молекула биспецифического одноцепочечного антитела, содержащая первый связывающий домен, как он определен в данном описании, может быть получена (доступна) или может быть изготовлена в соответствии с протоколом, изложенным в приведенных ниже примерах (в частности в Примере 2). Для этого предусматривается (а) иммунизация мышей N-концевым, содержащим аминокислотные остатки 1-27 полипептидным фрагментом внеклеточного домена CD3-эпсилон человека и/или Saimiri sciureus; (б) создание иммунной библиотеки scFv мышиных антител; (в) идентификация CD3-эпсилон-специфических связывающих фрагментов путем тестирования способности связываться с по меньшей мере SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8.

Независимость от окружения эпитопа CD3, предложенного в этом изобретении, соответствует первым 27 N-концевым аминокислотам CD3-эпсилон или функциональным фрагментам этого участка из 27 аминокислот. Фраза "независимый от окружения", используемая в данном описании в отношении эпитопа CD3, означает, что связывание описанных здесь связывающих молекул/молекул антител по изобретению не приводит к изменению или модификации конформации, последовательности или структуры, окружающей антигенную детерминанту или эпитоп. Напротив, эпитоп CD3, распознаваемый традиционной CD3-связывающей молекулой (например, молекулой, описанной в WO 99/54440 или WO 04/106380), локализован на CD3-эпсилон-цепи в С-концевой области по отношению к N-концевым аминокислотам 1-27 независимого от окружения эпитопа, причем он принимает надлежащую конформацию, только если он встроен в остальную часть эпсилон-цепи и удерживается в правильном стерическом положении за счет гетеродимеризации эпсилон-цепи либо с гамма-, либо с дельта-цепью CD3.

Анти-CD3-связывающие молекулы/домены как часть молекулы биспецифического одноцепочечного антитела, которая представлена в данном описании и создана (и направлена) против независимого от окружения эпитопа CD3, обеспечивают неожиданное клиническое улучшение в отношении перераспределения Т-клеток и, следовательно, более благоприятный профиль безопасности. Без какой-либо связи с теорией, поскольку эпитоп CD3 не зависит от окружения, образуя автономный самодостаточный субдомен без большого влияния на остальную часть CD3-комплекса, CD3-связывающие молекулы/домены, представленные в данном описании, индуцируют меньшие аллостерические изменения в конформации CD3, чем традиционные CD3-связывающие молекулы, которые распознают зависимые от окружения эпитопы CD3 (например, как описано в WO 99/54440 или WO 04/106380).

Независимость от окружения эпитопа CD3, который распознается CD3-связывающим доменом PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, связана с меньшим или с отсутствующим перераспределением Т-клеток (перераспределение Т-клеток отождествляется с начальным эпизодом уменьшения и последующим восстановлением абсолютного количества Т-клеток) в ходе начальной фазы лечения PSMAxCD3 биспецифическим одноцепочечным антителом по изобретению. В результате обеспечивается лучший профиль безопасности PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению по сравнению с традиционными CD3-связывающими молекулами, известными в данной области, которые распознают зависимые от окружения эпитопы CD3. В частности, поскольку перераспределение Т-клеток в ходе начальной фазы лечения CD3-связывающими молекулами является основным фактором риска неблагоприятных явлений, таких как неблагоприятные явления со стороны ЦНС (центральная нервная система), PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению имеет значительное преимущество с точки зрения безопасности по сравнению с CD3-связывающими молекулами, известными в данной области, за счет распознавания скорее независимого от окружения, чем зависимого от окружения эпитопа CD3. Пациенты с такими неблагоприятными явлениями со стороны ЦНС, связанными с перераспределением Т-клеток в ходе начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, обычно страдают от спутанности сознания и дезориентации и в некоторых случаях от недержания мочи. Спутанность сознания представляет собой изменение психического состояния, при котором пациент не способен думать с его или ее обычным уровнем ясности. Пациенту обычно трудно сконцентрироваться, и процесс мышления становится не только затуманенным и неясным, но часто в значительной степени замедленным. Пациенты с неблагоприятными явлениями со стороны ЦНС, связанными с перераспределением Т-клеток в ходе начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, могут также страдать потерей памяти. Часто спутанность сознания приводит к потере способности узнавать людей, места, определять время или даты. Чувство дезориентации является обычным явлением при спутанности сознания, и способность принимать решения нарушается. Неблагоприятные явления со стороны ЦНС, связанные с перераспределением Т-клеток в ходе начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, могут дополнительно включать неясную речь и/или трудности с подбором слов. Это расстройство может ухудшать как выразительность, так и восприятие речи, а также способность читать и писать. Помимо недержания мочи у некоторых пациентов неблагоприятные явления со стороны ЦНС, связанные с перераспределением Т-клеток в ходе начальной фазы лечения традиционными CD3-связывающими молекулами, могут также сопровождаться вертиго и головокружением.

Сохранение трехмерной структуры в пределах упомянутого 27-аминокислотного N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон может быть использовано для создания связывающих доменов, предпочтительно человеческих, которые способны связываться с N-концевым полипептидным фрагментом CD3-эпсилон in vitro и с нативным CD3-комплексом (CD3-эпсилон-субъединицей CD3-комплекса) на Т-клетках in vivo с одинаковой аффинностью связывания. Эти данные строго указывают на то, что N-концевой фрагмент, как он описан здесь, образует третичную конформацию, которая сходна с его структурой, в норме существующей in vivo. Был проведен очень чувствительный тест, демонстрирующий важность структурной целостности аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон. Индивидуальные аминокислоты из аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон были заменены на аланин (аланиновое сканирование), чтобы протестировать чувствительность аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон к минорным нарушениям. CD3-связывающие домены как часть биспецифических одноцепочечных антител по изобретению были использованы для тестирования на связывание с аланиновыми мутантами аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон (смотри приведенный ниже Пример 5). Индивидуальные замены первых пяти аминокислотных остатков в самом конце N-концевого фрагмента и двух аминокислот в положениях 23 и 25 аминокислот 1-27 N-концевого полипептидного фрагмента CD3-эпсилон были критическими для связывания молекул антител. Замена аминокислотных остатков в области положений 1-5, содержащей остатки Q (глутамин в положении 1), D (аспарагиновая кислота в положении 2), G (глицин в положении 3), N (аспарагин в положении 4) и Е (глутаминовая кислота в положении 5), на аланин аннулировала связывание PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, с указанным фрагментом. В то же время, по меньшей мере для некоторых биспецифических одноцепочечных антител по изобретению, предпочтительно человеческих, два аминокислотных остатка на С-конце упомянутого фрагмента Т (треонин в положении 23) и I (изолейцин в положении 25) снижали энергию связывания с биспецифическими одноцепочечными антителами по изобретению, предпочтительно человеческими.

Неожиданно было обнаружено, что выделенное таким образом биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, не только распознает N-концевой фрагмент CD3-эпсилон человека, но и соответствующие гомологичные фрагменты CD3-эпсилон различных приматов, включая цепкохвостых обезьян (игрунка, Callithrix jacchus; эдипов тамарин, Saguinus oedipus; беличья обезьяна, Saimiri sciureus) и низших узконосых обезьян (Масаса fascicularis, также известный как яванский макак или макак-крабоед; или Масаса mulatta, также известный как макак-резус). Таким образом, было обнаружено специфическое в отношении многих приматов PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению. Приведенные ниже анализы последовательностей подтвердили, что человек и приматы имеют общий участок с высокогомологичным участком последовательности на N-конце внеклеточного домена CD3-эпсилон-цепи.

Аминокислотная последовательность вышеупомянутых N-концевых фрагментов CD3-эпсилон представлена в SEQ ID NO:2 (человек), SEQ ID NO:4 (Callithnx jacchus); SEQ ID NO:6 (Saguinus oedipus); SEQ ID NO:8 (Saimiri sciureus); SEQ ID NO:1047 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTILTC или SEQ ID NO:1048 QDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILT (Масаса fascicularis, также известный как яванский макак) и SEQ ID NO:1049 QDGNEEMGSITQTPYHVSISGTTVILT (Macaca mulatta, также известный как макак-резус).

Второй связывающий домен PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению связывается со специфическим мембранным антигеном предстательной железы (PSMA). Предпочтительно, второй связывающий домен PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела связывается с PSMA человека или PSMA примата, не являющегося шимпанзе; более предпочтительно, он связывается с PSMA человека и PSMA примата, не являющегося шимпанзе, и, следовательно, обладает межвидовой специфичностью; еще более предпочтительно, он связывается с PSMA человека и PSMA макака (и, следовательно, также обладает межвидовой специфичностью). Особенно предпочтительно, PSMA макака представляет собой PSMA яванского макака и/или PSMA макака-резуса. Однако из объема настоящего изобретения не исключено, что второй связывающий домен может также связываться с гомологами PSMA других видов, такими как гомолог PSMA грызунов.

Рак предстательной железы является вторым по количеству случаев видом рака у мужчин. По оценкам, в 2008 году в США у 186320 мужчин будет впервые диагностирован рак предстательной железы и примерно 28660 мужчин умрут от этой болезни. Риск рака предстательной железы строго связан с возрастом: очень мало случаев зарегистрировано у мужчин в возрасте до 50 лет, и три четверти случаев имеют место у мужчин в возрасте свыше 65 лет. Самое большое число случаев диагностировано у мужчин в возрасте 70-74 года. В настоящее время темпы роста населения старшего возраста значительно выше, чем темпы роста общей численности населения. По прогнозам, к 2025-2030 годам население старше 60 лет будет увеличиваться в 3,5 раза быстрее, чем общая численность населения. По прогнозам, доля лиц старшего возраста увеличится более чем вдвое во всем мире за следующий полувековой период, и это означает, что следует ожидать дальнейшего увеличения случаев диагностированного рака предстательной железы. Сильно ограниченная экспрессия PSMA и его положительная регуляция на прогрессирующих и метастатических стадиях рака предстательной железы, а также его роль в качестве неоантигена на опухолевой сосудистой сети многих разных типов других солидных опухолей квалифицирует PSMA как антиген, представляющий собой привлекательную мишень для терапии рака с использованием антител. Как показано в приведенных ниже примерах, PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению предоставляет преимущественное средство для уничтожения PSMA-экспрессирующих человеческих раковых клеток, проиллюстрированного на примере клеточной линии LNCaP рака предстательной железы человека. Кроме того, цитотоксическая активность PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению выше, чем цитотоксическая активность антител, описанных в данной области. Поскольку предпочтительно и CD3-связывающий домен, и PSMA-связывающий домен PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению проявляют межвидовую специфичность, т.е. взаимодействуют с антигенами человека и приматов, не являющихся человеком, оно может быть использовано для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля этих связывающих доменов у приматов и, в идентичной форме, в качестве лекарственного средства у людей.

Предпочтительно, согласно настоящему изобретению предложено также PSMAxCD3 биспецифические одноцепочечные антитела, содержащие второй связывающий домен, который связывается как с PSMA человека, так и с гомологом PSMA макака, т.е. гомологом примата, не являющегося шимпанзе. В предпочтительном воплощении биспецифическое одноцепочечное антитело содержит второй связывающий домен, проявляющий межвидовую специфичность к PSMA человека и примата, не являющегося шимпанзе. В данном случае, идентичная молекула биспецифического одноцепочечного антитела может быть использована как для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля этих связывающих доменов у приматов, так и в качестве лекарственных средств у людей. Другими словами, одна и та же молекула может быть использована и в доклинических исследованиях на животных, и в клинических исследованиях на людях. За счет этого достигаются в высокой степени сравнимые результаты и намного более высокая прогностическая способность исследований на животных по сравнению с видоспецифическими молекулами-имитаторами. Поскольку и CD3-связывающий домен, и PSMA-связывающий домен PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению проявляют межвидовую специфичность, т.е. взаимодействуют с антигенами человека и приматов, не являющихся шимпанзе, оно может быть использовано как для доклинической оценки безопасности, активности и/или фармакокинетического профиля этих связывающих доменов у приматов и, в идентичной форме, в качестве лекарственных средств у людей. Понятно, что в предпочтительном воплощении межвидовая специфичность первого и второго связывающего домена антител по изобретению идентична.

Было обнаружено в настоящем изобретении, что существует возможность создания PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела, предпочтительно человеческого, причем идентичная молекула может быть использована в доклиническом тестировании на животных, а также в клинических исследованиях и даже в терапии человека. Это возможно благодаря неожиданной идентификации PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела, предпочтительно человеческого, которое, в дополнение к связыванию с CD3-эпсилон и PSMA человека соответственно (и благодаря вероятному генетическому сходству с копией шимпанзе), также связывается с гомологами указанных антигенов приматов, не являющихся шимпанзе, включая цепкохвостых обезьян и низших узконосых обезьян. Как показано в приведенных ниже Примерах, указанное PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, может быть использовано в качестве терапевтического агента или лекарственного средства против различных заболеваний, включая, без ограничения, рак. PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело является особенно предпочтительным для терапии рака, предпочтительно солидных опухолей, более предпочтительно карцином и рака предстательной железы. С точки зрения вышеуказанного, отпадает необходимость конструировать имитирующее PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело для тестирования на филогенетически далеком (от людей) виде. В результате, идентичная молекула может быть использована в доклиническом тестировании на животных и, когда она предназначена для введения людям, в клиническом тестировании, а также для последующего получения разрешения на продажу и терапевтического применения в качестве лекарственного средства. Возможность использовать одну и ту же молекулу для доклинического тестирования на животных и позже для введения людям фактически исключает или, по меньшей мере, в значительной степени снижает опасность того, что данные, полученные в доклиническом тестировании на животных, будут иметь ограниченную применимость к людям. Коротко, получение доклинических данных по безопасности у животных с использованием одной и той же молекулы, которую в действительности будут вводить людям, дает большую гарантию применимости данных к сценарию, имеющему отношение к людям. Напротив, в традиционных подходах с использованием молекул-имитаторов необходимо молекулярно адаптировать указанные молекулы-имитаторы к животной тест-системе, используемой для доклинической оценки безопасности. Так, молекула, предназначенная для применения в терапии человека, фактически отличается от молекулы-имитатора, используемой в доклиническом тестировании, по последовательности, а также вероятно по структуре, по фармакокинетическим параметрам и/или биологической активности, и, следовательно, данные, полученные в доклиническом тестировании на животных, имеют ограниченную, применимость к человеку/переносимость на человека. Использование молекул-имитаторов требует конструирования, продуцирования, очистки и определения характеристик полностью новой конструкции. Это приводит к дополнительным затратам на разработку и необходимости затрачивать больше времени для получения этой молекулы. В итоге, помимо разработки фактического лекарственного средства, которое предназначено для применения в терапии человека, приходится отдельно разрабатывать имитаторы, то есть приходиться проводить две линии разработки для двух молекул. Таким образом, основное преимущество описанного здесь PSMAxCDS биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, проявляющего межвидовую специфичность, заключается в том, что идентичная молекула может быть использована для терапевтического лечения людей и в доклиническом тестировании на животных.

Предпочтительно, по меньшей мере один из указанного первого или второго связывающего домена биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению является CDR (участок, определяющий комплементарность)-трансплантированным, гуманизированным или человеческим, как подробно изложено ниже. Предпочтительно, и первый связывающий домен, и второй связывающий домен биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению являются CDR-трансплантированными, гуманизированными или человеческими. Для PSMAxCDS биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, формирование иммунной реакции против указанных связывающих молекул исключается в максимально возможной мере при введении молекулы пациентам-людям.

Еще одним основным преимуществом PSMAxCDS биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, является его пригодность для доклинического тестирования на различных приматах. Поведение лекарственного средства-кандидата у животных должно идеально соответствовать ожидаемому поведению этого лекарственного средства-кандидата при введении людям. Таким образом, необходимо, чтобы данные, полученные в результате такого доклинического тестирования, как правило, имели высокую прогнозирующую силу для людей. Однако трагический исход проведенной ранее Фазы 1 клинического испытания с использованием TGN1412 (моноклональное антитело против CD28), когда в доклиническом тестировании указанного антитела не наблюдались неблагоприятные эффекты или наблюдались только ограниченные неблагоприятные эффекты в исследованиях на животных, проводимых на яванских макаках, а после введения указанного антитела пациентам-людям у шести пациентов-людей развилась полиорганная недостаточность (Lancet 368 (2006), 2206-7), свидетельствует о том, что лекарственное средство-кандидат может действовать по-разному у приматов и у людей. Результаты этих драматических нежелательных негативных явлений свидетельствуют о том, что ограничение доклинического тестирования только одним видом (примат, не являющийся шимпанзе) может быть недостаточным. Тот факт, что PSMAxCDS биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению связывается у ряда цепкохвостых и низших узконосых обезьян, может помочь решить проблемы, возникающие в случае, упомянутом выше. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены средства и методы для сведения к минимуму видовых различий в эффектах при разработке и тестировании лекарственных средств для терапии человека.

Имея PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, проявляющее межвидовую специфичность, больше нет необходимости адаптировать тест-животное к лекарственному средству-кандидату, предназначенному для введения людям, например создавать трансгенных животных. PSMAxCDS биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, проявляющее межвидовую специфичность, согласно применениям и способам по изобретению может быть непосредственно использовано для доклинического тестирования на приматах, не являющихся шимпанзе, без какой-либо генетической обработки животных. Как известно специалистам в данной области, в подходах, при которых тест-животное адаптируют к лекарственному средству-кандидату, всегда имеется риск того, что результаты, полученные в доклиническом тестировании на безопасность, будут в меньшей степени репрезентативными и прогностическими для людей из-за модификации животного. Например, у трансгенных животных белки, кодируемые трансгенами, часто сверхэкспрессируются в высокой степени. Поэтому данные, полученные по биологической активности антитела против этого белка-антигена, могут иметь ограниченную прогностическую ценность для людей, у которых белок экспрессируется на намного более низких, в большей степени физиологических уровнях.

Дополнительное преимущество применения проявляющего межвидовую специфичность PSMAxCDS биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, заключается в том, что шимпанзе как исчезающий вид практически не используются для тестирования на животных. Шимпанзе являются ближайшими родственниками людей, и ранее на основе данных по секвенированию геномов они были сгруппированы в семейство гоминид (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Поэтому обычно считается, что данные, полученные с использованием шимпанзе, в высокой степени предсказуемы для людей. Однако из-за их статуса исчезающего вида число шимпанзе, которых можно использовать для медицинских экспериментов, чрезвычайно ограничено. Как указано выше, содержание и обслуживание шимпанзе для тестирования на животных является, следовательно, и дорогостоящим, и этически проблематичным. Применение PSMAxCDS биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, позволяет избежать и этических возражений, и финансовых затрат в ходе доклинического тестирования без нанесения ущерба качеству, т.е. пригодности полученных данных тестирования на животных. В этой связи, применение PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, обеспечивают разумную альтернативу исследованиям на шимпанзе.

Еще одним преимуществом PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, является возможность извлечения множества образцов крови при использовании их в качестве части доклинического тестирования на животных, например в ходе фармакокинетических исследований на животных. Многократное извлечение образцов крови легче достигается с использованием примата, не являющегося шимпанзе, чем с использованием низших животных, например мыши. Извлечение множества образцов крови дает возможность непрерывно тестировать параметры крови для определения биологических эффектов, индуцированных PSMAxCD3 биспецифическим одноцепочечным антителом по изобретению, предпочтительно человеческим. Кроме того, извлечение множества образцов крови дает возможность исследователю оценить фармакокинетический профиль PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, как оно определено здесь. Кроме того, потенциальные побочные эффекты, которые могут быть индуцированы указанным PSMAxCD3 биспецифическим одноцепочечным антителом по изобретению, предпочтительно человеческим, отраженные показателями крови, могут быть измерены в разных образцах крови, извлеченных в ходе проведения курса введения указанного антитела. Это обеспечивает возможность определения профиля потенциальной токсичности PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, как оно определено в данном описании.

Преимущества PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, как оно определено здесь, проявляющего межвидовую специфичность, кратко могут быть суммированы следующим образом:

Во-первых, PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, как оно определено в данном описании, которое используют в доклиническом тестировании, является тем же самым антителом, которое используют в терапии человека. Поэтому больше нет необходимости разрабатывать две независимые молекулы, которые могут отличаться по их фармакокинетическим свойствам и биологической активности. Большим преимуществом является то, что, например, фармакокинетические результаты в большей степени напрямую переносимы на и применимы для человека, чем, например, в традиционных подходах с использованием имитаторов.

Во-вторых, применение PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, предпочтительно человеческого, как оно определено в данном описании, для получения терапевтических средств для человека является менее дорогостоящим и трудоемким, чем в подходах с использованием имитаторов.

В-третьих, PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению, предпочтительно человеческое, как оно определено в данном описании, может быть использовано для доклинического тестирования не только на одном виде приматов, но и на ряде разных видов приматов, что снижает риск потенциальных видовых различий между приматами и человеком.

В-четвертых, шимпанзе как исчезающий вид для тестирования на животных может быть исключен, если желательно.

В-пятых, множественные образцы крови могут быть извлечены для всесторонних фармакокинетических исследований.

В-шестых, благодаря человеческому происхождению предпочтительно человеческих связывающих молекул согласно предпочтительному воплощению изобретения, формирование иммунной реакции против указанных связывающих молекул сводится к минимуму при введении пациентам-людям. Исключается индуцирование иммунного ответа с использованием антител, специфичных к лекарственному средству-кандидату, из вида, не являющегося человеком, такого как, например, мышь, приводящее к выработке человеческих антимышиных антител (НАМА) против терапевтических молекул мышиного происхождения.

И последнее, но не менее важное, терапевтическое применение PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению обеспечивает новый и изобретательский терапевтический подход для лечения рака, предпочтительно солидных опухолей, более предпочтительно карцином, и рака предстательной железы. Как показано в приведенных ниже примерах, PSMAxCD3 биспецифическое одноцепочечное антитело по изобретению предоставляет преимущественное средство для уничтожения PSMA-экспрессирующих клеток рака предстательной железы человека. Кроме того, цитотоксическая активность PSMAxCD3 биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению выше, чем активность антител, описанных в данной области.

Как отмечено в данном описании выше, согласно настоящему изобретению предложены полипептиды, т.е. биспецифические одноцепочечные антитела, содержащие первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, и второй связывающий домен, способный связываться с PSMA. Второй связывающий домен предпочтительно связывается с PSMA человека и с PSMA примата, не являющегося шимпанзе. Преимущество молекул биспецифических одноцепочечных антител в качестве лекарственных средств-кандидатов, отвечающих требованиям предпочтительного биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, заключается в использовании таких молекул в доклиническом тестировании на животных, а также в клинических исследованиях и даже для терапии человека. В предпочтительном воплощении биспецифических одноцепочечных антител по изобретению, проявляющих межвидовую специфичность, второй связывающий домен, связывающийся с PSMA, является человеческим. В биспецифической молекуле по изобретению, обладающей межвидовой специфичностью, связывающий домен, связывающийся с эпитопом CD3-эпсилон-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, расположен в порядке VH-VL или VL-VH на N-конце или на С-конце биспецифической молекулы. Примеры биспецифических молекул по изобретению, проявляющих межвидовую специфичность, с разными расположениями VH-цепи и VL-цепи в первом и втором связывающих доменах описаны в приведенных ниже примерах.

Используемый в данном описании термин "биспецифическое одноцепочечное антитело" означает одну полипептидную цепь, содержащую два связывающих домена. Каждый связывающий домен содержит одну вариабельную область из тяжелой цепи антитела ("VH-область"), где VH-область первого связывающего домена специфически связывается с молекулой CD3ε, и VH-область второго связывающего домена специфически связывается с PSMA. Эти два связывающих домена возможно связаны друг с другом коротким полипептидным спейсером. Неограничивающим примером полипептидного спейсера является Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) и его повторы. Каждый связывающий домен может дополнительно содержать одну вариабельную область из легкой цепи антитела ("VL-область"), причем VH-область и VL-область в каждом первом и втором связывающих доменах связаны друг с другом через полипептидный линкер, например типа, описанного и заявленного в ЕР 623679 В1, но в любом случае имеющий длину, достаточную для того, чтобы давать возможность VH-области и VL-области первого связывающего домена и VH-области и VL-области второго связывающего домена образовывать пару друг с другом, так чтобы вместе они были способны специфически связываться с соответствующими первым и вторым связывающими доменами.

Термин "белок" общеизвестен в данной области и описывает биологические соединения. Белки содержат одну или более аминокислотных цепей (полипептидов), в которых аминокислоты связаны друг с другом посредством пептидной связи. Термин "полипептид", используемый в данном описании, описывает группу молекул, которые состоят из более 30 аминокислот. В соответствии с изобретением эта группа полипептидов включает в себя "белки" при условии, что белки состоят из одной полипептидной цепи. Кроме того, в соответствии с определением термин "полипептид" описывает фрагменты белков при условии, что эти фрагменты состоят из более 30 аминокислот. Полипептиды также могут образовывать мультимеры, такие как димеры, тримеры и высшие олигомеры, т.е. состоящие из более чем одной полипептидной молекулы. Полипептидные молекулы, образующие такие димеры, тримеры и т.д., могут быть идентичными или неидентичными. Соответствующие структуры более высокого порядка таких мультимеров называются, следовательно, гомо- или гетеродимеры, гомо- или гетеротримеры и т.д. Примером гетеромультимера является молекула антитела, которая, в ее существующей в природе форме, состоит из двух идентичных легких полипептидных цепей и двух идентичных тяжелых полипептидных цепей. Термины "полипептид" и "белок" также относятся к природно модифицированным полипептидам/белкам, в которых модификация осуществляется, например, в результате посттрансляционных модификаций типа гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и тому подобного. Такие модификации общеизвестны в данной области.

Термин "связывающий домен" характеризует в соответствии с настоящим изобретением домен полипептида, который специфически связывается/взаимодействует с данной(ым) целевой(ым) структурой/антигеном/эпитопом. Таким образом, связывающий домен представляет собой "сайт взаимодействия с антигеном". Термин "сайт взаимодействия с антигеном" определяет, в соответствии с настоящим изобретением, мотив полипептида, который способен специфически взаимодействовать с конкретным антигеном или конкретной группой антигенов, например с идентичным антигеном у разных видов. Понятно также, что указанное связывание/взаимодействие определяет "специфическое распознавание". Термин "специфически распознающий" означает, в соответствии с данным изобретением, то, что молекула антитела способна специфически взаимодействовать и/или связываться с по меньшей мере двумя, предпочтительно по меньшей мере тремя, более предпочтительно по меньшей мере четырьмя аминокислотами антигена, например антигена CD3 человека, как определено в данном описании. Такое связывание может быть проиллюстрировано специфичностью по "принципу замка и ключа". Таким образом, специфические мотивы в аминокислотной последовательности связывающего домена и антиген связываются друг с другом благодаря их первичной, вторичной или третичной структуре, а также благодаря вторичным модификациям указанной структуры. Специфическое взаимодействие сайта взаимодействия с антигеном с его специфическим антигеном также может приводить к простому связыванию указанного сайта с антигеном. Более того, специфическое взаимодействие сайта взаимодействия с антигеном с его специфическим антигеном альтернативно может приводить к инициации сигнала, например, за счет индукции изменения конформации антигена, олигомеризации антигена и т.д. Предпочтительным примером связывающего домена в соответствии с настоящим изобретением является антитело. Связывающий домен может представлять собой моноклональное или поликлональное антитело или может происходить из моноклонального или поликлонального антитела.

Термин "антитело" охватывает его производные или функциональные фрагменты, которые все еще сохраняют специфичность связывания. Методики получения антител общеизвестны в данной области и описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, и в Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. Термин "антитело" также охватывает иммуноглобулины (Ig) разных классов (т.е. IgA, IgG, IgM, IgD и IgE) и подклассов (такие как IgG1, IgG2 и т.д.).

Определение термина "антитело" также включает такие воплощения, как химерные, одноцепочечные и гуманизированные антитела, а также фрагменты антител, такие как, среди прочего, Fab-фрагменты. Фрагменты или производные антител дополнительно включают фрагменты F(ab')2, Fv, scFv или однодоменные антитела, антитела, состоящие из единичного вариабельного домена, или иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий только один вариабельный домен, который может представлять собой VH или VL, которые специфически связываются с антигеном или эпитопом независимо от других V-областей или доменов (смотри, например, Harlow and Lane (1988) и (1999), процитированный выше). Такой иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен охватывает не только выделенный полипептид единичного вариабельного домена антитела, но и более крупные полипептиды, которые содержат один или более мономеров полипептидной последовательности единичного вариабельного домена антитела.

В данной области известны различные методики, которые можно использовать для получения таких антител и/или фрагментов. Так, производные (антител) могут быть также получены с использованием пептидомиметиков. Далее, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (смотри, среди прочих, патент США 4946778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфичных к выбранному(ым) полипептиду(ам). Кроме того, для экспрессии гуманизированных антител, специфичных к полипептидам и слитым белкам по данному изобретению, могут быть использованы трансгенные животные. Для получения моноклональных антител можно использовать любую методику, обеспечивающую получение антител, продуцируемых культурами стабильных клеточных линий. Примеры таких методик включают гибридомную методику (Kohler and Milstein, Nature, 256 (1975), 495-497), триомную методику, гибридомную методику с использованием В-клеток человека (Kozbor, Immunology Today, 4 (1983), 72) и EBV-гибридомную методику (EBV - вирус Эпштейна-Барр) для продуцирования человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Поверхностный плазменный резонанс, который использован в системе BIAcore, может быть использован для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом целевого полипептида, таким как CD3-эпсилон или PSMA (Schier, Human Antibodies Hybridomas, 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods, 183 (1995), 7-13). В контексте данного изобретения также предусматривается, что термин "антитело" охватывает конструкции антител, которые могут быть экспрессированы в хозяине, как описано в данном описании ниже, например конструкции антител, которые могут быть трансфицированы и/или трансдуцированы с использованием, среди прочего, вирусов или плазмидных векторов.

Термин "специфическое взаимодействие", используемый в соответствии с настоящим изобретением, означает, что связывающий домен не обладает перекрестной способностью взаимодействовать или не обладает значительной перекрестной способностью взаимодействовать с полипептидами, имеющими структуру, сходную со структурой полипептидов, с которыми связывается связывающий домен, и которые могли бы экспрессироваться теми же клетками, как и интересующий полипептид. Перекрестная способность взаимодействовать панели исследуемых связывающих доменов может быть протестирована, например, путем оценки связывания указанной панели связывающих доменов в стандартных условиях (смотри, например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, и Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Примеры специфического взаимодействия связывающего домена с конкретным антигеном включают специфичность лиганда к его рецептору. Указанное определение, в частности, охватывает взаимодействие лигандов, которые индуцируют сигнал после связывания с его специфическим рецептором. Примером указанного взаимодействия, которое, в частности, также охватывается указанным определением, является взаимодействие антигенной детерминанты (эпитопа) со связывающим доменом (антигенсвязывающим сайтом) антитела.

Используемый здесь термин "межвидовая специфичность", или "перекрестно-видовая специфичность", означает связывание связывающего домена, описанного в данном описании, с одной и той же молекулой-мишенью у людей и приматов, не являющихся шимпанзе. Таким образом, "межвидовую специфичность", или "перекрестно-видовую специфичность", следует понимать как межвидовую способность взаимодействовать с одинаковой молекулой "X", экспрессирующейся в разных видах, но не с молекулой, отличающейся от "X". Межвидовая специфичность моноклонального антитела, распознающего, например, CD3-эпсилон человека, по отношению к CD3-эпсилон примата, не являющегося шимпанзе, например CD3-эпсилон макака, может быть определена, например, FACS-анализом (анализ с использованием клеточного сортера с активацией флуоресценции (fluorescence-activated cell sorter)). FACS-анализ проводят способом, при котором соответствующее моноклональное антитело тестируют на связывание с клетками человека и примата, не являющегося шимпанзе, например с клетками макака, экспрессирующими указанные антигены CD3-эпсилон человека и примата, не являющегося шимпанзе, соответственно. Соответствующий анализ представлен в приведенных ниже примерах. Вышеупомянутое применимо, с необходимыми поправками, для антигена PSMA: межвидовая специфичность моноклонального антитела, распознающего, например, PSMA человека, по отношению к PSMA примата, не являющемуся шимпанзе, например PSMA макака, может быть определена, например, FACS-анализом. FACS-анализ проводят способом, при котором соответствующее моноклональное антитело тестируют на связывание с клетками человека и примата, не являющегося шимпанзе, например клетками макака, экспрессирующими указанные антигены PSMA человека и примата, не являющегося шимпанзе, соответственно.

Используемый в данном описании термин "CD3-эпсилон" означает молекулу, экспрессирующуюся как часть Т-клеточного рецептора, и имеет значение, обычно приписываемое ему в предшествующем уровне техники. Что касается человека, то этот термин охватывает индивидуальную или независимо комбинированную форму всех известных субъединиц CD3, например CD3-эпсилон, CD3-дельта, CD3-гамма, CD3-зета, CD3-альфа и CD3-бета. CD3-антигенами приматов, не являющихся шимпанзе, которые упомянуты в данном описании, являются, например, CD3 Масаса fasciculans и CD3 Масаса mulatta. Что касается Масаса fasciculans, то этот термин охватывает CD3-эпсилон FN-18-отрицательные и CD3-эпсилон FN-18-положительные. CD3-гамма и CD3-дельта. Что касается Масаса mulatta, то этот термин охватывает CD3-эпсилон, CD3-гамма и CD3-дельта. Предпочтительно, указанной CD3, как использовано в данном описании, является CD3-эпсилон.

CD3-эпсилон человека указана в GenBank под № доступа NM_000733 и содержит SEQ ID NO:1. CD3-гамма человека указана в GenBank под №доступа NM_000073. CD3-дельта человека указана в GenBank под №доступа NM_000732.

CD3-эпсилон "FN-18-отрицательная" Масаса fasciculans (т.е. CD3-эпсилон, не распознаваемая моноклональным антителом FN-18 вследствие полиморфизма, как изложено выше) указана в GenBank под № доступа АВ073994.

CD3-эпсилон "FN-18-положительная" Масаса fasciculans (т.е. CD3-эпсилон, распознаваемая моноклональным антителом FN-18) указана в GenBank под № доступа АВ073993. CD3-гамма Масаса fasciculans указана в GenBank под № доступа АВ073992. CD3-дельта Масаса fasciculans указана в GenBank под № доступа АВ073991.

Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности соответствующих CD3-эпсилон, гамма и дельта гомологов Масаса mulatta могут быть идентифицированы и выделены с использованием рекомбинантных методик, описанных в данной области (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001). Это применимо, с необходимыми поправками, к CD3-эпсилон, гамма и дельта гомологам других приматов, не являющихся шимпанзе, которые определены в данном описании. Идентификация аминокислотной последовательности игрунки (Callithrix jacchus), беличьей обезьяны (Saimiri sciureus) и эдипова тамарина (Saguinus oedipus) описана в приведенных ниже примерах. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена CD3-эпсилон Callithrix jacchus представлена в SEQ ID NO:3, аминокислотная последовательность внеклеточного домена CD3-эпсилон Saguinus oedipus представлена в SEQ ID NO:5, и аминокислотная последовательность внеклеточного домена CD3-эпсилон Saimiri sciureus представлена в SEQ ID NO:7.

PSMA человека указан в GenBank под № доступа 'AY101595'. Клонирование гомолога PSMA макака продемонстрировано в приведенных ниже примерах. Соответствующие кДНК и аминокислотная последовательности представлены в SEQ ID NO:385 и 386 соответственно.

В соответствии с вышеуказанным, термин "эпитоп" определяет антигенную детерминанту, которая специфически связывается с/идентифицируется связывающим доменом, как определено выше. Связывающий домен может специфически связываться/взаимодействовать с конформационными или непрерывными эпитопами, уникальными для структуры-мишени, например с CD3-эпсилон-цепью человека и примата, не являющегося шимпанзе, или PSMA человека и примата, не являющегося шимпанзе. Конформационный или непрерывный эпитоп характеризуется в отношении полипептидных антигенов наличием двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые обособлены в первичной последовательности, но объединяются на поверхности молекулы, когда полипептид сворачивается в нативный белок/антиген (Sela, (1969) Science, 166, 1365 и Laver, (1990) Cell, 61, 553-6). Два или более отдельных аминокислотных остатков, вносящих вклад в этот эпитоп, присутствуют на отдельно расположенных участках одной или более чем одной полипептидной цепи. Эти остатки объединяются на поверхности молекулы, когда полипептидная(ые) цепь(и) сворачивается(ются) в трехмерную структуру с образованием эпитопа. И наоборот, непрерывный или линейный эпитоп состоит из двух или более отдельных аминокислотных остатков, которые присутствуют в единственном линейном сегменте полипептидной цепи. В настоящем изобретении "зависимый от окружения" эпитоп CD3 относится к конформации указанного эпитопа. Такой зависимый от окружения эпитоп, расположенный на CD3-эпсилон-цепи, может складываться в правильную конформацию, только если он погружен в остаток эпсилон-цепи и удерживается в правильном положении за счет гетеродимеризации эпсилон-цепи либо с гамма-цепью, либо с дельта-цепью CD3. Наоборот, независимый от окружения эпитоп CD3, который предложен в данной заявке, относится к N-концевому, содержащему аминокислотные остатки 1-27 полипептиду или его функциональному фрагменту CD3-эпсилон-цепи. Этот N-концевой, содержащий аминокислотные остатки 1-27 полипептид или его функциональный фрагмент сохраняет свою трехмерную структурную целостность и правильную конформацию, когда его удаляют из нативного окружения в CD3-комплексе. Независимость от окружения N-концевого, содержащего аминокислотные остатки 1-27 полипептида или его функционального фрагмента, являющегося частью внеклеточного домена CD3-эпсилон, представляет собой, таким образом, эпитоп, который полностью отличается от эпитопов CD3-эпсилон, описанных в WO 2004/106380 в связи со способом получения человеческих связывающих молекул. В указанном способе использовали отдельно экспрессированную рекомбинантную CD3-эпсилон. Конформация этой отдельно экспрессированной рекомбинантной CD3-эпсилон отличалась от конформации, адаптированной к ее природной форме, т.е. к форме, в которой субъединица CD3-эпсилон TCR/CD3-комплекса существует как часть нековалентного комплекса либо с субъединицей CD3-дельта, либо с субъединицей CD3-гамма TCR/CD3-комплекса. Если в качестве антигена для селекции антител из библиотеки антител используют такой отдельно экспрессированный рекомбинантный белок CD3-эпсилон, то из данной библиотеки идентифицируют антитела, специфичные к этому антигену, несмотря на то, что такая библиотека не содержит антитела со специфичностью к собственным антигенам/аутоантигенам. Это вызвано тем, что отдельно экспрессированный рекомбинантный белок CD3-эпсилон не существует in vivo; он не является аутоантигеном. Следовательно, субпопуляции В-клеток, экспрессирующих антитела, специфичные к этому белку, не были истощены in vivo; библиотека антител, сконструированная из таких В-клеток, будет содержать генетический материал для антител, специфичных к этому отдельно экспрессированному рекомбинантному белку CD3-эпсилон.

Однако поскольку независимый от окружения N-концевой, содержащий аминокислотные остатки 1-27 полипептид или его функциональный фрагмент представляет собой эпитоп, который сворачивается в его нативную форму, связывающие домены по настоящему изобретению не могут быть идентифицированы способами, основанными на подходе, описанном в WO 04/106380. Поэтому можно было проверить тестами, что связывающие молекулы, описанные в WO 04/106380, не способны связываться с N-концевыми аминокислотными остатками 1-27 CD3-эпсилон-цепи. Следовательно, традиционные анти-CD3-связывающие молекулы или молекулы антител против CD3 (например, описанные в WO 99/54440) связываются с CD3-эпсилон-цепью в положении, которое находится ближе к С-концу, чем независимый от окружения N-концевой, содержащий аминокислотные остатки 1-27 полипептид или функциональный фрагмент, предусмотренный в данном описании. Молекулы антител OKT3 и UCHT-1 предшествующего уровня техники также обладают специфичностью к эпсилон-субъединице TCR/CD3-комплекса между аминокислотными остатками 35 и 85, и, соответственно, эпитоп этих антител также располагается ближе к С-концу. В дополнение к этому, UCHT-1 связывается с CD3-эпсилон-цепью в области между аминокислотными остатками 43 и 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol., 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS, 101 (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol., 147 (1991), 3047-52). Следовательно, анти-CD3-молекулы предшествующего уровня техники не связываются с определенным в данном описании независимым от окружения N-концевым, содержащим аминокислотные остатки 1-27 эпитопом (или его функциональным фрагментом) и не направлены против него. В частности, состояние уровня техники не обеспечивает анти-CD3-молекулы, которые специфически связываются с независимым от окружения N-концевым, содержащим аминокислотные остатки 1-27 эпитопом, и которые обладают межвидовой специфичностью, т.е. связываются с CD3-эпсилон человека и примата, не являющегося шимпанзе.

Для создания связывающего домена, предпочтительно человеческого, содержащегося в молекуле биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, могут быть использованы, например, моноклональные антитела, связывающиеся с CD3-эпсилон как человека, так и примата, не являющегося шимпанзе (например, с CD3-эпсилон макака), или моноклональные антитела, связывающиеся с PSMA человека и/или примата, не являющегося шимпанзе.

Используемые в данном описании термины "человеческий" и "человек" относятся к виду Homo sapiens. Поскольку речь идет о медицинских применениях конструкций, описанных в данном описании, то пациентов-людей следует лечить той же самой молекулой.

Предпочтительно, по меньшей мере один из указанного первого или второго связывающего домена биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению является CDR-трансплантированным, гуманизированным или человеческим. Предпочтительно, и первый, и второй связывающие домены биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению являются CDR-трансплантированными, гуманизированными или человеческими.

Используемый в данном описании термин "человеческое" антитело означает, что биспецифическое одноцепочечное антитело, как оно определено в данном описании, содержит аминокислотную(ые) последовательность(и), содержащуюся(иеся) в репертуаре антител зародышевой линии человека. В целях определения, указанное биспецифическое одноцепочечное антитело можно, следовательно, считать человеческим, если оно состоит из такой(их) аминокислотной(ых) последовательности(ей), т.е. если рассматриваемая(ые) аминокислотная(ые) последовательность(и) биспецифического одноцепочечного антитела является(ются) идентичной(ыми) экспрессированной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями) зародышевой линии человека. Биспецифическое одноцепочечное антитело, как оно определено в данном описании, может считаться человеческим, если оно состоит из последовательности(ей), которая(ые) отклоняется(ются) от ее (их) ближайшей(их) последовательности(ей) зародышевой линии человека не более чем можно было ожидать по отпечатку соматической гипермутации. Дополнительно, антитела многих млекопитающих, не являющихся людьми, например грызунов, таких как мыши и крысы, содержат аминокислотные последовательности VH CDR3, которые, как можно ожидать, также существуют в экспрессированном репертуаре антител человека. Любая(ые) такая(ие) последовательность(и) человеческого или не человеческого происхождения, которая(ые), как можно ожидать, существует(ют) в экспрессированном человеческом репертуаре, также могут считаться "человеческими" для целей настоящего изобретения.

Используемые в данном описании термины "гуманизированный", "гуманизация", "человекоподобный" или их грамматически родственные варианты используются взаимозаменяемо и относятся к биспецифическому одноцепочечному антителу, содержащему по меньшей мере в одном из его связывающих доменов по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность ("CDR") из антитела не человека или его фрагмента. Гуманизационные подходы описаны, например, в WO 91/09968 и US 6407213. В качестве неограничивающих примеров, этот термин охватывает случай, когда вариабельная область по меньшей мере одного связывающего домена содержит единственный CDR, например третий CDR в VH (CDRH3), из другого животного, не являющегося человеком, например грызуна, а также случай, когда вариабельная область/области содержат соответственные первый, второй и третий CDR из указанного животного, не являющегося человеком. В случае, когда все CDR связывающего домена биспецифического одноцепочечного антитела заменены на их соответствующие эквиваленты из, например, грызуна, обычно говорят о "CDR-трансплантации", и этот термин следует понимать как охватываемый термином "гуманизированный" или его грамматически родственными вариантами, используемыми в данном описании. Термин "гуманизированный" или его грамматически родственные варианты охватывают также случаи, когда, в дополнение к замене одного или более CDR в пределах VH и/или VL первого и/или второго связывающего домена, дополнительная(ые) мутация(ии) (например, замены) по меньшей мере одного единичного аминокислотного остатка (остатков) в каркасных участках ("FR") между CDR-участками осуществлена(ы) таким образом, что аминокислота(ы) в этом/этих положении(ях) соответствует(ют) аминокислоте(ам) в этом/этих положении(ях) у животного, из которого получают используемые для замены CDR-участки. Как известно в данной области, такие индивидуальные мутации часто делаются в каркасных участках после CDR-трансплантации, чтобы восстановить первоначальную аффинность связывания антитела не человека, использованного в качестве CDR-донора для его молекулы-мишени. Термин "гуманизированные" может также охватывать аминокислотную(ые) замену(ы) в CDR участках из животного, не являющегося человеком, на аминокислоту(ы) соответствующего CDR участка из человеческого антитела, в дополнение к аминокислотным заменам в каркасных участках, как описано выше.

Используемые в данном описании термины "гомолог" или "гомология" означают следующее: вывод о наличии гомологии между белками и ДНК часто делается на основе сходства последовательностей, особенно в биоинформатике. Например, обычно если два или более генов имеют в высокой степени сходные последовательности ДНК, то по всей вероятности они гомологичны. Но сходство последовательностей может возникать от разных предков: короткие последовательности могут быть сходными случайно, и последовательности могут быть сходными, поскольку обе выбраны для связывания с конкретным белком, таким как фактор транскрипции. Такие последовательности сходны, но не гомологичны. Области последовательностей, которые являются гомологичными, также называются консервативными. Это нельзя путать с консервативностью в аминокислотных последовательностях, в которых аминокислота в специфическом положении заменена, но физико-химические свойства аминокислоты остаются неизменными. Гомологичные последовательности бывают двух типов: ортологические и паралогические. Гомологичные последовательности являются ортологическими, если они отделены событием видообразования: когда вид расходится на два отдельных вида, расходящиеся копии единственного гена в получившемся в результате виде считаются ортологическими. Ортологи, или ортологические гены, представляют собой гены в разных видах, которые сходны друг с другом, поскольку они происходят от общего предка. Самым веским доказательством того, что два сходных гена являются ортологическими, является результат филогенетического анализа родословной генов. Гены, которые обнаружены в одном монофилетическом таксоне, являются ортологами, передавшимися по наследству от общего предка. Ортологи часто, но не всегда, имеют одинаковую функцию. Ортологические последовательности дают полезную информацию в исследованиях таксономической классификации организмов. Паттерн генетического расхождения может быть использован для установления связанности организмов. Два организма, которые находятся в очень тесном родстве, очевидно, продемонстрируют очень сходные последовательности ДНК между двумя ортологами. Напротив, организм, который эволюционно удален из другого организма, вероятно будет демонстрировать большее расхождение в последовательности исследуемых ортологов. Гомологичные последовательности являются паралогическими, если они отделены событием дупликации гена: если ген в организме дуплицирован, занимая два разных положения в одном и том же геноме, то две копии являются паралогическими. Набор последовательностей, которые являются паралогическими, называется паралогами друг друга. Паралоги обычно имеют одинаковую или сходную функцию, но иногда нет: из-за отсутствия первоначального селективного давления на копию дуплицированного гена эта копия свободно мутируется и приобретает новые функции. Пример можно найти у грызунов, таких как крысы и мыши. Грызуны имеют пару паралогических генов инсулина, хотя неясно, произошло ли какое-либо расхождение в функции. Паралогические гены часто принадлежат одному и тому же виду, но это необязательно: например, ген гемоглобина людей и ген миоглобина шимпанзе являются паралогами. Это обычная проблема в биоинформатике: когда последовательности геномов разных видов установлены и гомологичные гены найдены, специалист не может немедленно придти к заключению, что эти гены имеют одинаковую или сходную функцию, так как они могут быть паралогами, функция которых различается.

Используемый в данном описании термин "примат, не являющийся шимпанзе" или "примат, не являющийся шимп." либо его грамматические варианты относятся к любому животному-примату (т.е. не человеку), иному чем шимпанзе, т.е. иному чем животное, принадлежащее роду Pan, включая виды Pan paniscus (карликовый шимпанзе, бонобо) и Pan troglodytes (обыкновенный шимпанзе), также известный как Anthropopithecus troglodytes (обыкновенный шимпанзе) или Simia satyrus (орангутанг). Следует иметь в виду, однако, что возможно, что антитела по изобретению могут также связываться с использованием их первого и/или второго связывающего домена с соответствующими эпитопами/фрагментами и т.д. указанных шимпанзе. Данное изобретение просто позволяет избежать проведения тестов на животных с использованием шимпанзе, если желательно. Поэтому предусматривается также, что в другом воплощении антитела по настоящему изобретению также связываются с использованием их первого и/или второго связывающего домена с соответствующими эпитопами шимпанзе. Термины "примат", "вид приматов", "приматы" или их грамматические варианты означают отряд плацентарных млекопитающих, разделенный на два подотряда полуобезьян и антропоидов и включающий человекообразных обезьян, обезьян и лемуров. Конкретно, термин "приматы", используемый в данном описании, включает подотряд Strepsirrhini (мокроносые обезьяны) (полуобезьяны, не являющиеся долгопятами), включая инфраотряд Lemuriformes (лемурообразные) (включающий надсемейства Cheirogaleoidea (карликовые лемуры) и Lemuroidea (лемуриды)), инфраотряд Chiromyiformes (руконожкообразные) (включающий семейство Daubentoniidae (руконожковые)) и инфраотряд Lorisifonnes (лориобразные) (включающий семейства Lorisidae (лориевые) и Galagidae (галаговые)). Термин "приматы", используемый в данном описании, также включает подотряд Haplorrhini (сухоносые обезьяны), включающий инфраотряд Tarsiiformes (долгопятообразные) (включающий семейство Tarsiidae (долгопятовые)), инфраотряд Simiifomies (обезьянообразные) (включающий Platyrrhini (широконосые обезьяны) или цепкохвостых обезьян, и Catarrhini (узконосые обезьяны), включая Cercopithecidea (мартышкообразные) или низших узконосых обезьян)).

В рамках изобретения вид приматов, не являющихся шимпанзе, можно понимать как представляющий собой лемура, долгопята, гиббона, игрунку (принадлежащую цепкохвостым обезьянам семейства Cebidae (капуцины)) или низшую узконосую обезьяну (принадлежащую надсемейству Cercopithecoidea (собакоподобные)).

Используемый в данном описании термин "низшая узконосая обезьяна" включает любую обезьяну надсемейства Cercopithecoidea, которое само делится на следующие семейства: Cercopithecinae (мартышковые обезьяны), которые встречаются главным образом в Африке, но включает другой род макаков, встречающихся в Азии и Северной Африке; и Colobinae (тонкотелые), которое включает большинство встречающихся в Азии родов, а также африканских представителей толстотелых обезьян.

Конкретно, в пределах подсемейства Cercopithecinae предпочтительный примат, не являющийся шимпанзе, может происходить из трибы мартышковых (Cercopithecini), в пределах рода Allenopithecus (болотная обезьяна Аллена, Allenopithecus nigroviridis); в пределах рода Miopithecus (мартышка карликовая талапойн, Miopithecus talapoin; габонский талапойн, Miopithecus ogouensis); в пределах рода Erythrocebus (мартышка обыкновенная гусар, Erythrocebus patas); в пределах рода Chlorocebus (мартышка зеленая, Chlorocebus sabaceus; мартышка зеленая гривет, Chlorocebus aethiops; мартышка горнобейлская вервет, Chlorocebus djamdjamensis; мартышка танталусская, Chlorocebus tantalus; верветка, Chlorocebus pygerythrus; малбрук, Chlorocebus cynosures); или в пределах рода Cercopithecus (мартышка дриас или мартышка салонгойская, Cercopithecus dryas; мартышка диана, Cercopithecus diana; мартышка роловейская, Cercopithecus roloway, большая белоносая мартышка, Cercopithecus nictitans; мартышка голубая, Cercopithecus mitis; мартышка серебряная, Cercopithecus doggetti; мартышка золотистая, Cercopithecus kandti; мартышка Сикса, Cercopithecus albogularis; мартышка мона, Cercopithecus mona; мартышка мона Кэмпбелла, Cercopithecus campbelli; мартышка мона Лоуи, Cercopithecus lower, мартышка мона хохлатая, Cercopithecus pogonias; мартышка мона Вольфа, Cercopithecus wolfi; мартышка мона Дента, Cercopithecus denti; мартышка малая белоносая, Cercopithecus petaurista; мартышка белогорлая, Cercopithecus erythrogaster, мартышка Склатера, Cercopithecus sclateri; мартышка красноухая, Cercopithecus erythrotis; мартышка голуболицая [усатая], Cercopithecus cephus; мартышка краснохвостая, Cercopithecus ascanius; мартышка Л'Хоеста, Cercopithecus lhoesti; мартышка Преусса, Cercopithecus preussi; мартышка солнцехвостая, Cercopithecus solatus; мартышка совинолицая, Cercopithecus hamlyni; мартышка де Брасса, Cercopithecus neglectus).

Альтернативно, предпочтительный примат, не являющийся шимпанзе, также в пределах подсемейства Cercopithecinae, но в пределах трибы павиановых (Papionini), может происходить из рода макаков (Масаса) (обезьяна варварийская, Масаса sylvanus; макак львинохвостый, Масаса silenus; южный свинохвостый макак или берук (Beruk), Масаса nemestrina; макак северный свинохвостый, Масаса leonina; макак пагайский или Bokkoi, Масаса pagensis; макак сиберу, Масаса siberu; макак Моора, Масаса maura; макак обутый, Масаса ochreata; макак тонкинский, Масаса tonkeana; макак Гека, Масаса hecki; макак горонталский, Масаса nigriscens; макак целебесский хохлатый или черная обезьяна, Масаса nigra; макак яванский или макак-крабоед, или макак длиннохвостый или кера (Kera), Масаса fascicularis; макак короткохвостый или макак медвежий, Масаса arctoides; макак резус, Масаса mulatta; макак формозский горный, Масаса cyclopis; макак японский, Масаса fuscata; макак цейлонский, Масаса sinica; макак индийский, Масаса radiata; макак бесхвостый, Масаса sylvanmus; макак ассамский, Масаса assamensis; макак тибетский или макак Милна-Эдвардса, Масаса thibetana; макак аруначалский или "обезьяна из глубины леса", Масаса munzala); в пределах рода Lophocebus (мангобей серощекий, Lophocebus albigena; Lophocebus albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; мангобей чернохохлый, Lophocebus aterrimus; мангобей Опденбоха, Lophocebus opdenboschi; мангобей высокогорный, Lophocebus kipunji); в пределах рода Papio (павиан гамадрил, Papio hamadryas; сфинкс, или гвинейский павиан, Papio papio; павиан анубис, Papio anubis; павиан бабуин, или желтый павиан, Papio cynocephalus; чакма, или павиан медвежий, Papio ursinus); в пределах рода Theropithecus (гелада, Theropithecus gelada); в пределах рода Cercocebus (мангобей дымчатый, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; мангобей красноголовый, Cercocebus torquatus; мангобей проворный, Cercocebus agilis; мангобей золотистобрюхий, Cercocebus chrysogaster, мангобей речной (танский), Cercocebus galeritus; мангобей Санье, Cercocebus sanjei); или в пределах рода Mandrillus (мандрил, Mandrillus sphinx; дрил, Mandrillus leucophaeus).

Наиболее предпочтительным является Масаса fascicularis (также известный как яванский макак или макак-крабоед, и поэтому обозначенный в Примерах как "яванский") и Масаса mulatta (макак-резус, обозначенный как "резус").

В пределах подсемейства Colobinae предпочтительный примат, не являющийся шимпанзе, может происходить из африканской группы, в пределах рода Colobus (колобус черный, Colobus satanas; колобус ангольский, Colobus angolensis; колобус королевский, Colobus polykomos; колобус медвежий, Colobus vellerosus; черно-белая гвереца, Colobus guereza); в пределах рода Piliocolobus (колобус красный западный, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; колобус Пеннанта, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieri; колобус красный Преусса, Piliocolobus preussi; колобус красный Фолона, Piliocolobus tholloni; колобус красный центрально-африканский, Piliocolobus foai; Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentieroruin; колобус красный угандийский, Piliocolobus tephrosceles; колобус красный узунгвайский, Piliocolobus gordonorum; колобус красный занзибарский, Piliocolobus kirkii; колобус красный речной (танский), Piliocolobus rufomitratus); или в пределах рода Procolobus (колобус оливковый, Procolobus verus).

В пределах подсемейства Colobinae предпочтительный примат, не являющийся шимпанзе, альтернативно может быть из группы лангуров (тонкотелов), в пределах рода Semnopithecus (лангур серый непальский, Semnopithecus schistaceus; лангур серый кашмирский, Semnopithecus ajax; лангур серый тарайский, Semnopithecus hector, лангур североравнинный серый, Semnopithecus entellus; лангур серый черностопый, Semnopithecus hypoleucos; лангур южноравнинный серый, Semnopithecus dussumien; лангур серый опушенный, Seinnopithecus priam); в пределах группы Т.vetulus рода Trachypithecus (лангур пурпуролицый, Trachypithecus vetulus; лангур Нилгири, Trachypithecus johnii); в пределах группы Т.cristatus рода Trachypithecus (лангур яванский, Trachypithecus auratus; тонкотел серебристый, или лангур серебристый, Trachypithecus cristatus; лангур индокитайский, Trachypithecus germaini; лангур тенассерский, Trachypithecus barbei); в пределах группы T.obscurus рода Trachypithecus (лангур дымчатый, или очковый, Trachypithecus obscurus; лангур Фейра, Trachypithecus phayrei); в пределах группы Т.pileatus вида Trachypithecus (лангур шапочниковый, Trachypithecus pileatus; лангур Шортриджа, Trachypithecus shortridgei; лангур золотой, или трахипитек Гее, Trachypithecus geei); в пределах группы Т. francoisi рода Trachypithecus (лангур Франсуа, Trachypithecus francoisi; лангур хатинхенский, Trachypithecus hatinhensis; лангур белоголовый, Trachypithecus poliocephalus; лангур лаотийский, Trachypithecus laotum; лангур Делакура, Trachypithecus delacouri; лангур черный индокитайский, Trachypithecus ebenus); или в пределах рода Presbytis (сюрили суматранский, Presbytis melalophos; тонкотел полосатый, Presbytis femoralis; тонкотел саравакский, Presbytis chrysomelas; тонкотел белобедрый, Presbytis siamensis; тонкотел белолобый, Presbytis frontata; тонкотел яванский, Presbytis comata; тонкотел Томаса, Presbytis thomasi; тонкотел Хоуза, Presbytis hosei; тонкотел каштановый, Presbytis rubicunda; лангур ментавайский или Joja, Presbytis potenziani; тонкотел натунский, Presbytis natunae).

В пределах подсемейства Colobinae предпочтительный примат, не являющийся шимпанзе, альтернативно может быть из группы курносых (odd-nosed) обезьян, в пределах рода Pygathrix (пигатрикс красноплюсный, Pygathrix nemaeus; пигатрикс черноплюсный, Pygathrix nigripes; пигатрикс сероплюсный, Pygathrix cinerea); в пределах рода Rhinopithecus (обезьяна курносая золотистая, Rhinopithecus roxellana; обезьяна курносая черная, Rhinopithecus bieti; обезьяна курносая серая, Rhinopithecus brelichi; лангур тонкинский курносый, Rhinopithecus avunculus); в пределах рода Nasalis (носач обыкновенный, Nasalis larvatus); или в пределах рода Simias (лангур свинохвостый, Simias concoloi).

Используемый в данном описании термин "игрунка" означает любых цепкохвостых обезьян рода Callithrix, относящихся, например, к атлантическим игрункам подрода Callithrix (так!) (игрунка обыкновенная, Callithrix (Callithrix) jacchus; игрунка черноухая, Callithrix (Callithrix) penicillata; игрунка Вайеда, Callithrix (Callithrix) kuhlii; игрунка белоголовая, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; игрунка желтоголовая, Callithrix (Callithrix) flaviceps; игрунка белоухая, Callithrix (Callithrix) aurita); относящихся к амазонским игрункам подрода Mico (шелковые игрунки) (игрунка Рио-Акари, Callithrix (Mico) acariensis; игрунка Manicore, Callithrix (Mico) manicorensis; игрунка серебристая, Callithrix (Mico) argentata; игрунка белая, Callithrix (Mico) leucippe; игрунка Эмилия (Emilia's marmoset), Callithrix (Mico) emiliae; игрунка чернокисточная, Callithrix (Mico) nigriceps; игрунка Марка (Marca's marmoset), Callithrix (Mico) marcai; игрунка чернохвостая, Callithrix (Mico) melanura; игрунка белоплечая, Callithrix (Mico) humeralifera; игрунка Maues, Callithrix (Mico) mauesi; игрунка золотистая (gold-and-white marmoset), Callithrix (Mico) chrysoleuca; игрунка Гершковица (Hershkovitz's marmoset), Callithrix (Mico) intermedia; игрунка Satere, Callithrix (Mico) saterei); игрунку Roosmalens' Dwarf, принадлежащую подроду Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); или карликовую игрунку, принадлежащую подроду Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

Другие роды цепкохвостых обезьян включают тамаринов рода Saguinus (включающего группу S.oedipus, группу S.midas, группу S.nigricollis, группу S.mystax, группу S.bicolor и группу S.inustus) и беличьих обезьян рода Saimiri (например, Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).

В предпочтительном воплощении молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению примат, не являющийся шимпанзе, представляет собой низшую узконосую обезьяну. В более предпочтительном воплощении данного полипептида низшая узконосая обезьяна представляет собой обезьяну рода макаков рода Papio. Наиболее предпочтительно, обезьяной рода макаков является макак ассамский (Масаса assamensis), макак варварийский (Масаса sylvanus), макак боннет (Масаса radiata), макак обутый или целебесский обутый (Масаса ochreata), макак целебесский хохлатый (Масаса nigra), макак формозский горный (Масаса cyclopsis), снежная обезьяна или японский макак (Масаса fuscata), яванский макак, или макак-крабоед, или длиннохвостый макак (Масаса fascicularis), львинохвостый макак (Масаса silenus), свинохвостый макак (Масаса nemestrina), макак-резус (Масаса mulatta), тибетский макак (Масаса thibetana), макак тонкинский (Масаса tonkeana), макак цейлонский (Масаса sinica), макак короткохвостый, или макак краснолиций, или макак медвежий (Масаса arctoides), или макак Моора (Масаса maurus). Наиболее предпочтительно, обезьяной рода павианов является Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus.

В альтернативном предпочтительном воплощении молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению примат, не являющийся шимпанзе, представляет собой цепкохвостую обезьяну. В более предпочтительном воплощении данного полипептида цепкохвостой обезьяной является обезьяна рода Callithrix (игрунковые), рода Saguinus (тамарины) или рода Saimiri (беличьи обезьяны). Наиболее предпочтительно, обезьяной рода Callithrix является Callithrix jacchus (игрунка обыкновенная), обезьяной рода Saguinus является Saguinus oedipus (эдипов тамарин), и обезьяной рода Saimiri является Saimiri sciureus (беличья обезьяна).

Используемый в данном описании термин "клеточный поверхностный антиген " означает молекулу, которая обнаруживается на поверхности клетки. В большинстве случаев эта молекула будет располагаться в или на плазматической мембране клетки, так что по меньшей мере часть этой молекулы остается доступной в ее третичной форме снаружи клетки. Неограничивающим примером клеточной поверхностной молекулы, которая локализована в плазматической мембране, является трансмембранный белок, содержащий, в его третичной конформации, области гидрофильности и гидрофобности. При этом по меньшей мере одна гидрофобная область делает возможным внедрение или вставку клеточной поверхностной молекулы в гидрофобную плазматическую мембрану клетки, а гидрофильные области простираются по обе стороны плазматической мембраны в цитоплазму и внеклеточное пространство соответственно. Неограничивающими примерами клеточных поверхностных молекул, расположенных на плазматической мембране, являются белки, которые модифицированы по остатку цистеина, чтобы нести пальмитоильную группу, белки, модифицированные по С-концевому остатку цистеина, чтобы нести фарнезильную группу, или белки, которые модифицированы по С-концу, чтобы нести гликозил-фосфатидилинозитольный ("GPI") якорь. Эти группы позволяют осуществлять ковалентное присоединение белков к наружной поверхности плазматической мембраны, где они остаются доступными для распознавания внеклеточными молекулами, такими как антитела. Примерами клеточных поверхностных антигенов являются CD3-эпсилон и PSMA. Как указано в данном описании выше, PSMA является клеточным поверхностным антигеном, который представляет собой мишень для терапии различных видов рака, включая, но ими не ограничивая, солидные опухоли, предпочтительно карциномы, и рак предстательной железы.

В свете этого, PSMA может быть также охарактеризован как опухолевый антиген. Используемый в данном описании термин "опухолевый антиген" может означать те антигены, которые презентированы на клетках опухоли. Эти антигены могут быть презентированы на клеточной поверхности посредством внеклеточного участка, который часто объединен с трансмембранной и цитоплазматической частью молекулы. Эти антигены иногда могут быть презентированы только опухолевыми клетками и никогда нормальными клетками. Опухолевые антигены могут экспрессироваться исключительно на опухолевых клетках или могут представлять собой опухоль-специфическую мутацию в отличие от нормальных клеток. В этом случае они называются опухоль-специфическими антигенами. Более общими являются антигены, которые презентированы опухолевыми клетками и нормальными клетками, и они называются опухоль-ассоциированными антигенами. Эти опухоль-ассоциированные антигены могут сверхэкспрессироваться в отличие от нормальных клеток, или они доступны для связывания антител в опухолевых клетках вследствие менее компактной структуры опухолевой ткани в отличие от нормальной ткани. Одним примером опухолевого антигена в соответствии с настоящим изобретением является PSMA.

Как указано в данном описании выше, молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению связывается первым связывающим доменом с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, где указанный эпитоп является частью аминокислотной последовательности, входящей в группу, состоящую из 27 аминокислотных остатков, как представлено в SEQ ID NO:2, 4, 6 или 8, или их функциональным фрагментом.

В соответствии с настоящим изобретением для молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению предпочтительным является то, что указанным эпитопом является часть аминокислотной последовательности, содержащая 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот.

Более предпочтительно, указанный эпитоп содержит по меньшей мере аминокислотную последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu (Q-D-G-N-E).

В пределах объема настоящего изобретения функциональный фрагмент N-концевых аминокислотных остатков 1-27 означает, что указанный функциональный фрагмент по-прежнему представляет собой независимый от окружения эпитоп, сохраняющий свою трехмерную структурную целостность при его удалении из его нативного окружения в CD3-комплексе (и слиянии с гетерологической аминокислотной последовательностью, такой как ЕрСАМ или Fc-область иммуноглобулина, например, как показано в Примере 3.1). Сохранение трехмерной структуры в пределах 27-аминокислотного N-концевого полипептида, или его функционального фрагмента, CD3-эпсилон может быть использована для создания связывающих доменов, которые связываются с N-концевым полипептидным фрагментом CD3-эпсилон in vitro и с нативным CD3-комплексом (CD3-эпсилон-субъединицей CD3-комплекса) на Т-клетках in vivo с одинаковой аффинностью связывания. В настоящем изобретении функциональный фрагмент N-концевых 1-27 аминокислотных остатков означает, что предложенные CD3-связывающие домены по-прежнему могут связываться с такими функциональными фрагментами, и это не зависит от окружения. Специалист в данной области техники осведомлен о методах картирования эпитопов с целью определения того, какие аминокислотные остатки эпитопа распознаются такими анти-CD3-связывающими доменами (например, аланиновое сканирование; смотри приведенные ниже примеры).

В одном воплощении изобретения молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению содержит (первый) связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, и второй связывающий домен, способный связываться с клеточным поверхностным антигеном PSMA.

В пределах объема настоящего изобретения предпочтительным также является, что второй связывающий домен связывается с антигеном клеточной поверхности PSMA человека и/или PSMA примата, не являющегося шимпанзе. Особенно предпочтительно, второй связывающий домен связывается с PSMA человека и PSMA примата, не являющегося шимпанзе, предпочтительно PSMA макака. Следует иметь в виду, что второй связывающий домен связывается с по меньшей мере одним PSMA примата, не являющегося шимпанзе, однако он может также связываться с двумя, тремя или более гомологами PSMA примата, не являющегося шимпанзе. Например, второй связывающий домен может связываться с PSMA яванского макака и с PSMA макака-резуса.

Настоящее изобретение, включающее все способы, наборы и т.д., описанные в данном описании, также относится ко второму связывающему домену как таковому (т.е. не в окружении биспецифического одноцепочечного антитела). Термин "как таковой" дополнительно охватывает форматы антител, отличающихся от биспецифических одноцепочечных антител, описанных в данном описании, например фрагменты антител (содержащие второй домен), гуманизированные антитела, слитые белки, содержащие второй домен, и т.д. Форматы антител, отличающихся от биспецифических одноцепочечных антител по настоящему изобретению, также описаны в данном описании выше.

Для создания второго связывающего домена молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, например биспецифических одноцепочечных антител, как они определены в данном описании, могут быть использованы моноклональные антитела, связывающиеся с соответствующим клеточным поверхностным антигеном человека и/или примата, не являющегося человеком, таким как PSMA. Подходящие связывающие домены для биспецифического полипептида, как он определен в данном описании, могут быть получены, например, из моноклональных антител с межвидовой специфичностью рекомбинантными методами, описанными в данной области. Моноклональное антитело, связывающееся с клеточным поверхностным антигеном человека и с гомологом указанного клеточного поверхностного антигена у примата, не являющегося шимпанзе, может быть протестировано FACS-анализами, как изложено выше. Для специалистов в данной области очевидно, что антитела с межвидовой специфичностью могут быть также созданы гибридомными методами, описанными в литературе (Milstein and Kohler, Nature 256 (1975), 495-7). Например, мыши могут быть альтернативно иммунизированы клеточным поверхностным антигеном человека и примата, не являющегося шимпанзе, таким как PSMA. Из этих мышей гибридомные клетки, продуцирующие антитело с межвидовой специфичностью выделяют по гибридомной технологии и анализируют методом FACS-анализа, как изложено выше. Создание и анализ биспецифических полипептидов, таких как биспецифические одноцепочечные антитела, проявляющие межвидовую специфичность, как описано в данном описании, проиллюстрировано в приведенных ниже примерах. Преимущества биспецифических одноцепочечных антител, проявляющих межвидовую специфичность, включают преимущества, указанные в данном описании.

Особенно предпочтительным в отношении молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению является то, что первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, содержит VL-область, содержащую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, выбранные из следующих:

(a) CDR-L1, как представлено в SEQ ID NO:27, CDR-L2, как представлено в SEQ ID NO:28, и CDR-L3, как представлено в SEQ ID NO:29;

(b) CDR-L1, как представлено в SEQ ID NO:117, CDR-L2, как представлено в SEQ ID NO:118, и CDR-L3, как представлено в SEQ ID NO:119; и

(c) CDR-L1, как представлено в SEQ ID NO:153, CDR-L2, как представлено в SEQ ID NO:154, и CDR-L3, как представлено в SEQ ID NO:155.

Вариабельные области, т.е. вариабельная легкая цепь ("L" или "VL") и вариабельная тяжелая цепь ("Н" или "VH"), понимаются в данной области как обеспечивающие связывающий домен антитела. Эти вариабельные области содержат участки, определяющие комплементарность.

Термин "участок, определяющий комплементарность" (CDR) общеизвестен в данной области для определения антигенной специфичности антитела. Термин "CDR-L" или "LCDR" относится к CDR в VL, в то время как термин "CDR-H" или "HCDR" относится к CDR в VH.

В альтернативном предпочтительном воплощении молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, содержит VH-область, содержащую CDR-Н1, CDR-H2 и CDR-Н3, выбранные из следующих:

(a) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:12, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:13, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:14;

(b) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:30, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:31, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:32;

(c) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:48, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:49, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:50;

(d) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:66, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:67, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:68;

(e) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:84, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:85, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:86;

(f) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:102, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:103, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:104;

(g) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:120, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:121, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:122;

(h) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:138, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:139, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:140;

(i) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:156, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:157, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:158; и

(j) CDR-H1, как представлено в SEQ ID NO:174, CDR-H2, как представлено в SEQ ID NO:175, и CDR-H3, как представлено в SEQ ID NO:176.

Предпочтительным также является то, что связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, содержит VL-область, выбранную из группы, состоящей из VL-области, как представлено в SEQ ID NO:35, 39, 125, 129, 161 или 165.

Альтернативно, предпочтительно, первый связывающий домен, способный связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, содержит VH-область, выбранную из группы, состоящей из VH-области, как представлено в SEQ ID NO:15,19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 или 181.

Более предпочтительно, молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению характеризуется первым связывающим доменом, способным связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, который содержит VL-область и VH-область, выбранные из группы, состоящей из следующих:

(a) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:17 или 21, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:15 или 19;

(b) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:35 или 39, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:33 или 37;

(c) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:53 или 57, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:51 или 55;

(d) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:71 или 75, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:69 или 73;

(e) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:89 или 93, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:87 или 91;

(f) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:107 или 111, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:105 или 109;

(g) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:125 или 129, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:123 или 127;

(h) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:143 или 147, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:141 или 145;

(i) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:161 или 165, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:159 или 163; и

(j) VL-область, как представлено в SEQ ID NO:179 или 183, и VH-область, как представлено в SEQ ID NO:177 или 181.

Согласно предпочтительному воплощению молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению пары VH-областей и VL-областей в первом связывающем домене, связывающемся с CD3-эпсилон, находятся в формате одноцепочечного антитела (scFv). VH и VL-области расположены в порядке VH-VL или VL-VH. Предпочтительно, VH-область расположена N-терминально по отношению к линкерной последовательности. VL-область расположена на С-конце линкерной последовательности. Другими словами, расположение доменов в CD3-связывающем домене молекулы биспецифического одноцелочечного антитела по изобретению представляет собой предпочтительно VH-VL, причем указанный CD3-связывающий домен расположен С-терминально по отношению ко второму (клеточный поверхностный антиген, такой как PSMA) связывающему домену. Предпочтительно, VH-VL содержит или представляет собой SEQ ID NO:185.

Предпочтительное воплощение описанной выше молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению характеризуется первым связывающим доменом, способным связываться с эпитопом CD3ε(эпсилон)-цепи человека и примата, не являющегося шимпанзе, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 или 187.

Данное изобретение также относится к описанному выше биспецифическому одноцепочечному антителу, где второй связывающий домен связывается с клеточным поверхностным антигеном PSMA.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения охарактеризованная выше молекула биспецифического одноцепочечного антитела содержит во втором связывающем домене группу следующих последовательностей CDR H1, CDR H2, CDR Н3, CDR L1, CDR L2 и CDR L3, выбранных из группы, состоящей из:

a) CDR H1-3 из SEQ ID NO:394-396 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:389-391;

b) CDR H1-3 из SEQ ID NO:408-410 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:403-405;

c) CDR H1-3 из SEQ ID NO:422-424 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:417-419;

d) CDR H1-3 из SEQ ID NO:436-438 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:431-433;

e) CDR H1-3 из SEQ ID NO:445-447 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:450-452;

f) CDR H1-3 из SEQ ID NO:464-466 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:459-461;

g) CDR H1-3 из SEQ ID NO:478-480 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:473-475;

h) CDR H1-3 из SEQ ID NO:492-494 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:487-489;

i) CDR H1-3 из SEQ ID NO:506-508 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:501-503;

j) CDR H1-3 из SEQ ID NO:520-522 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:515-517;

k) CDR H1-3 из SEQ ID NO:534-536 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:529-531;

l) CDR H1-3 из SEQ ID NO:548-550 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:543-545;

m) CDR H1-3 из SEQ ID NO:562-564 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:557-559;

n) CDR H1-3 из SEQ ID NO; 576-578 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:571-573;

о) CDR H1-3 из SEQ ID NO:590-592 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:585-587;

p) CDR H1-3 из SEQ ID NO:604-606 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:599-601;

q) CDR H1-3 из SEQ ID NO:618-620 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:613-615;

r) CDR H1-3 из SEQ ID NO:632-634 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:627-629;

s) CDR H1-3 из SEQ ID NO:646-648 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:641-643;

t) CDR H1-3 из SEQ ID NO:660-662 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:655-657;

u) CDR H1-3 из SEQ ID NO:674-676 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:669-671;

v) CDR H1-3 из SEQ ID NO:688-690 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:683-685;

w) CDR H1-3 из SEQ ID NO:702-704 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:697-699;

x) CDR H1-3 из SEQ ID NO:716-718 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:711-713; и

y) CDR H1-3 из SEQ ID NO:729-731 и CDR L1-3 из SEQ ID NO:724-726.

Последовательности соответствующих VL- и VH-областей второго связывающего домена молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, а также соответствующих scFv представлены в Перечне последовательностей.

В молекуле биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению связывающие домены расположены в порядке VL-VH-VH-VL, VL-VH-VL-VH, VH-VL-VH-VL или VH-VL-VL-VH, как проиллюстрировано в приведенных ниже примерах. Предпочтительно, связывающие домены расположены в порядке VH PSMA-VL PSMA-VH CD3-VL CD3 или VL PSMA-VH PSMA-VH CD3-VL CD3.

Особенно предпочтительное воплощение по изобретению относится к охарактеризованному выше полипептиду, где молекула биспецифического одноцепочечного антитела содержит последовательность, выбранную из следующих:

(a) аминокислотная последовательность, как представлено в любой из SEQ ID ID NO:399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 или 989;

(b) аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты, как представлено в любой из SEQ ID ID NO:400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 или 976;

(c) аминокислотная последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичная, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 96% идентичная аминокислотной последовательности (а) или (b).

Данное изобретение относится к молекуле биспецифического одноцепочечного антитела, содержащего аминокислотную последовательность, как представлено в любой из SEQ ID ID NO:399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693, 707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 или 989, а также к аминокислотным последовательностям, по меньшей мере на 85% идентичным, предпочтительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичным, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным аминокислотной последовательности SEQ ID NO:399, 413, 427, 441, 455, 469, 483, 497, 511, 525, 539, 553, 567, 581, 595, 609, 623, 637, 651, 665, 679, 693,707, 721, 734, 799, 817, 863, 849, 835, 785, 899, 935, 1017, 1031, 917, 1003, 953, 971 или 989. Изобретение также относится к соответствующим последовательностям нуклеиновой кислоты, как представлено в любой из SEQ ID ID NO:400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 или 976, а также к последовательностям нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 85% идентичным, предпочтительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичным, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным последовательностям нуклеиновой кислоты, представленным в SEQ ID NO:400, 414, 428, 442, 456, 470, 484, 498, 512, 526, 540, 554, 568, 582, 596, 610, 624, 638, 652, 666, 680, 694, 708, 736, 735, 800, 818, 864, 850, 836, 786, 882, 900, 936, 1018, 1032, 918, 1004, 954, 972, 990, 804, 822, 868, 886, 904, 940, 922, 958 или 976. Следует иметь в виду, что идентичность последовательностей определяется по всей нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Для выравнивания последовательностей могут быть использованы, например, программы Gap или BestFit (Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48 (1970), 443-453; Smith and Waterman, Adv. Appl. Math 2 (1981), 482-489), которые входят в программный пакет GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991). Это рутинный для специалистов в данной области метод определения и идентификации нуклеотидной или аминокислотной последовательности, имеющей, например, 85%-ную (90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную) идентичность последовательности с нуклеотидными или аминокислотными последовательностями биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению. Например, согласно гипотезе "качелей" Ф.Крика 5'-основание на антикодоне не является пространственно ограниченным в такой же степени, как другие два основания, и поэтому может иметь нестандартное спаривание оснований. Другими словами: третье положение в триплете кодона может варьировать таким образом, что два триплета, которые различаются этим третьем положением, могут кодировать один и тот же аминокислотный остаток. Указанная гипотеза известна специалисту в данной области (смотри, например, http://en.wikipedia.org/wiki/Wobble_Hypothesis; Crick, J Mol Biol 19 (1966):548-55).

Предпочтительные расположения доменов в конструкциях PSMAxCDS биспецифических одноцепочечных антител по изобретению продемонстрированы в приведенных ниже примерах.

В предпочтительном воплощении изобретения биспецифические одноцепочечные антитела обладают межвидовой специфичностью в отношении CD3-эпсилон и в отношении клеточного поверхностного антигена PSMA человека и примата, не являющегося шимпанзе, распознаваемого их вторым связывающим доменом.

В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложена последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая описанную выше молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Многие подходящие векторы известны специалистам в молекулярной биологии, и их выбор будет зависеть от желаемой функции, и они включают плазмиды, космиды, вирусы, бактериофаги и другие векторы, традиционно используемые в генной инженерии. Для конструирования различных плазмид и векторов могут быть использованы методы, хорошо известные специалистам в данной области техники, например, методы, описанные в Sambrook et al. (смотри выше) и в Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Альтернативно, полинуклеотиды и векторы по изобретению могут быть включены в липосомы для доставки в клетки-мишени. Как указано более подробно ниже, для выделения индивидуальных последовательностей ДНК использовали клонирующий вектор. Если необходима экспрессия конкретного полипептида, то релевантные последовательности могут быть перенесены в экспрессирующие векторы. Типичные клонирующие векторы включают pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 и pGBT9. Типичные экспрессирующие векторы включают pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, рОР13САТ.

Предпочтительно, указанный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой регуляторную последовательность, функционально связанную с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая определена в данном описании изобретения.

Термин "регуляторная последовательность" относится к последовательностям ДНК, которые необходимы для осуществления экспрессии кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. У прокариот регуляторные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосом и терминаторы. У эукариот регуляторные последовательности обычно включают промоторы, терминаторы и, в некоторых случаях, энхансеры, трансактиваторы или транскрипционные факторы. Термин "регуляторная последовательность" включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии, и также может включать дополнительные предпочтительные компоненты.

Термин "функционально связанный" относится к смежному положению, где описанные таким образом компоненты находятся в таком взаимном расположении, которое позволяет им функционировать надлежащим образом. Регуляторная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с регуляторными последовательностями. В том случае, когда регуляторной последовательностью является промотор, специалисту очевидно, что предпочтительней использовать двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

Таким образом, упомянутым вектором предпочтительно является экспрессирующий вектор. "Экспрессирующий вектор" представляет собой конструкцию, которая может быть использована для трансформации выбранного хозяина и обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности в выбранном хозяине. Экспрессирующие векторы могут представлять собой, например, клонирующие векторы, бинарные векторы или интегрирующие векторы. Экспрессия включает транскрипцию молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно в транслируемую (область) иРНК (информационная РНК). Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотах и/или эукариотических клетках, известны специалистам в данной области техники. В случае эукариотических клеток они содержат в норме промоторы, обеспечивающие инициацию транскрипции, и возможно поли-А-сигналы, обеспечивающие терминацию транскрипции и стабилизацию этого транскрипта. Возможные регуляторные элементы, позволяющие осуществлять экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промотор PL, lac, trp или tac в Е.coli, а примерами регуляторных элементов, позволяющих осуществлять экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются промотор АОХ1 или GAL1 в дрожжах или промоторы на основе CMV, SV40 (обезьяний вирус 40), RSV (вирус саркомы Рауса), CMV-энхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон в клетках млекопитающих и других животных.

Помимо элементов, ответственных за инициацию транскрипции, подобные регуляторные элементы также могут содержать сигналы терминации транскрипции, такие как сайт SV40-поли-А или сайт tk-поли-А, расположенный ниже данного полинуклеотида. Кроме того, в зависимости от используемой экспрессирующей системы, к кодирующей последовательности описанной последовательности нуклеиновой кислоты могут быть добавлены лидерные последовательности, способные направлять данный полипептид в клеточный компартмент или секретировать его в среду, и они общеизвестны в данной области техники (смотри также приведенные ниже Примеры). Лидерная(ые) последовательность(и) собирае(ю)тся в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции, и предпочтительно, чтобы лидерная последовательность была способна направлять секрецию транслированного белка или его участка в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Возможно, гетерологичная последовательность может кодировать слитый белок, включающий N-концевой идентифицирующий пептид, обеспечивающий желаемые характеристики, например, стабилизацию или упрощенную очистку экспрессированного рекомбинантного продукта (смотри выше). В этом контексте в данной области техники известны подходящие экспрессирующие векторы, такие как Okayama-Berg кДНК-экспрессирующий вектор pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA или pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025, и Raum et al. Cancer Immunol. Immunother. (2001) 50(3), 141-150) или pSPORT1 (GIBCO BRL).

Предпочтительно, экспрессирующие регуляторные последовательности будут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных трансформировать трансфицируемые эукариотические клетки-хозяева, но регуляторные последовательности прокариотических хозяев также могут быть использованы. После того, как вектор будет включен в соответствующего хозяина, этот хозяин поддерживается в условиях, подходящих для обеспечения высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и, если желательно, дальше могут следовать сбор и очистка полипептида по изобретению (смотри, например, приведенные ниже Примеры).

Альтернативной экспрессирующей системой, которая может быть использована для экспрессии белка, активного в отношении клеточного цикла, является система насекомых. В одной из таких систем в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в личинках Trichoplusia используется вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Кодирующая последовательность описываемой молекулы нуклеиновой кислоты может быть клонирована в несущественную область вируса, такую как полиэдриновый ген, и помещена под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка указанной кодирующей последовательности будет инактивировать полиэдриновый ген и приводить к получению рекомбинантного вируса, в котором отсутствует белок оболочки. Эти рекомбинантные вирусы затем используют для инфицирования клеток S. frugiperda или личинок Trichoplusia, в которых экспрессируется белок по изобретению (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91 (1994), 3224-3227).

Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры. Предпочтительно, описанные выше векторы по изобретению содержат селектируемый и/или поддающийся оценке маркер.

Селектируемые маркерные гены, полезные для селекции трансформированных клеток и, например, растительной ткани и растений, хорошо известны специалистам в данной области техники и придают, например, устойчивость к антиметаболитам в качестве основы селекции для dhfr, который обеспечивает устойчивость к метотрексату (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, который обеспечивает устойчивость к аминогликозидам неомицину, канамицину и паромицину (Herrera-Estrella, EMBO J., 2 (1983), 987-995); и hygro, который обеспечивает устойчивость к гигромицину (Marsh, Gene, 32 (1984), 481-485). Описаны дополнительные селектируемые гены, а именно trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана; hisD, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 8047); манноза-6-фосфатизомераза, которая позволяет клеткам утилизировать маннозу (WO 94/20627); и ODC (орнитиндекарбоксилаза), которая обеспечивает устойчивость к ингибитору орнитиндекарбоксилазы 2-(дифторметил)-DL-орнитину (DFMO) (McConlogue, 1987, в: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); или дезаминаза из Aspergillus terreus, которая обеспечивает устойчивость к бластицидину S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem., 59 (1995), 2336-2338).

Полезные поддающиеся оценке маркеры также известны специалистам в данной области техники и имеются в продаже. Предпочтительно, указанным маркером является ген, кодирующий люциферазу (Giacomin, PI. Sci., 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact., 178 (1996), 121), зеленый флуоресцентный белок. (Gerdes, FEBS Lett., 389 (1996), 44-47) или β-глюкуронидазу (Jefferson, EMBO J., 6 (1987), 3901-3907). Это воплощение, в частности, полезно для простого и быстрого скрининга клеток, тканей и организмов, содержащих упомянутый вектор.

Как описано выше, упомянутая молекула нуклеиновой кислоты может быть использована сама по себе или как часть вектора для экспрессии полипептида по изобретению в клетках, например, для его очистки, а также для генотерапевтических задач. Молекулы нуклеиновых кислот или векторы, содержащие последовательность(и) ДНК, кодирующую(ие) любой описанный выше полипептид по изобретению, вводят в клетки, которые в свою очередь продуцируют интересующий полипептид. Генная терапия, основанная на введении терапевтических генов в клетки с использованием методик ex vivo или in vivo, представляет собой одно из наиболее важных применений генного переноса. Подходящие векторы, способы или системы доставки генов для генной терапии in vitro или in vivo описаны в литературе и известны специалисту в данной области техники (смотри, например, Giordano, Nature Medicine, 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res., 79 (1996), 911-919; Anderson, Science, 256 (1992), 808-813; Verma, Nature, 389 (1994), 239; Isner, Lancet, 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res., 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood, 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther., 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci., 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther., 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine, 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5580859; US 5589466; или Schaper, Current Opinion in Biotechnology, 7 (1996), 635-640). Упомянутые. молекулы нуклеиновых кислот и векторы могут быть сконструированы для непосредственного введения или для введения посредством липосом или вирусных векторов (например, аденовирусного, ретровирусного) в клетку. Предпочтительно, указанная клетка представляет собой клетку зародышевой линии, эмбриональную клетку или яйцеклетку или происходит из них; наиболее предпочтительно, указанная клетка представляет собой стволовую клетку. Примером эмбриональной стволовой клетки может быть, среди прочего, стволовая клетка, которая описана в Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 8424-8428.

Согласно изобретению предложен также хозяин, подвергнутый трансформации или трансфекции вектором по изобретению. Указанный хозяин может быть получен путем введения описанного выше вектора по изобретению или описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению в хозяина. Присутствие по меньшей мере одного вектора или по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты в хозяине может опосредовать экспрессию гена, кодирующего описанные выше конструкции одноцепочечных антител.

Описанные молекула нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению, которые вводят в хозяина, либо могут быть встроены в геном хозяина, либо могут поддерживаться внехромосомно.

Хозяином может быть любая прокариотическая или эукариотическая клетка.

Термин "прокариот" означает все бактерии, которые могут быть трансформированы или трансфицированы молекулами ДНК или РНК с целью экспрессии белка по изобретению. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, Е.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин "эукариотический" охватывает клетки дрожжей, высших растений, насекомых и предпочтительно млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного получения, белок, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению, может быть гликозилированным или может быть негликозилированным. Особенно предпочтительным является использование плазмиды или вируса, содержащей(его) кодирующую последовательность полипептида по изобретению, генетически слитую с N-концевой FLAG-меткой и/или C-концевой His-меткой. Предпочтительно, длина указанной FLAG-метки составляет примерно 4-8 аминокислот, наиболее предпочтительно 8 аминокислот. Описанный выше полинуклеотид может быть использован для трансформации или трансфекции хозяина с использованием любой из методик, общепризнанных специалистами в данной области техники. Кроме того, методы получения слитых, функциональным образом связанных генов и их экспрессии, например в клетках млекопитающих и бактериях, общеизвестны в данной области техники (Sambrook, смотри выше).

Предпочтительно, указанным хозяином является бактерия или клетка насекомых, грибов, растений или животных.

В частности, предусматривается, что указанный хозяин может представлять собой клетку млекопитающего. В частности, предпочтительные клетки-хозяева включают клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка), клетки COS (фибробласты африканской зеленой мартышки), линии миеломных клеток типа SP2/0 или NS/0. Как проиллюстрировано в приведенных ниже примерах, в качестве хозяев особенно предпочтительны клетки СНО.

Более предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет собой человеческую клетку или человеческую клеточную линию, например per.с6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).

В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, включающему культивирование хозяина по изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию данной молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, и выделение полученного полипептида из культуры.

Трансформированные хозяева могут быть выращены в ферментерах и культивированы в соответствии с методиками, известными в данной области техники для достижения оптимального клеточного роста. Затем молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению может быть выделена из ростовой среды, клеточных лизатов или клеточных мембранных фракций. Выделение и очистка, например, экспрессируемых микробами молекул биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению могут быть осуществлены любыми общепринятыми методами, такими как, например, препаративные хроматографические методы разделения и иммунологические методы разделения, например методы разделения с использованием моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против метки молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, или как описано в приведенных ниже примерах.

В данной области техники известно, что условия культивирования хозяина, обеспечивающие экспрессию, зависят от системы хозяина и экспрессирующей системы/экспрессирующего вектора, используемых в таком способе. Параметры, модифицируемые для достижения условий, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида, известны в данной области техники. Следовательно, подходящие условия могут быть определены специалистом в данной области техники без дополнительного изобретательского вклада.

Сразу после экспрессии молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению может быть очищена в соответствии со стандартными в данной области техники методиками, включая осаждение сульфатом аммония, методику с использованием аффинных колонок, колоночную хроматографию, электрофорез в геле и тому подобное (смотри Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Для фармацевтических применений предпочтительны по существу чистые полипептиды с гомогенностью по меньшей мере примерно 90-95% и наиболее предпочтительны с гомогенностью 98-99% или более. После очистки, частично или до гомогенности, при желании, молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению затем может быть использована в терапевтических целях (в том числе экстракорпорально) или для разработки и проведения методов анализа. Кроме того, в приведенных ниже примерах подробно описаны способы выделения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению из культуры. Выделение может быть также осуществлено способом выделения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, способной связываться с эпитопом CD3-эпсилон (CD3ε) человека и примата, не являющегося шимпанзе, включающим следующие стадии:

(a) приведение полипептида(ов) в контакт с N-концевым фрагментом внеклеточного домена CD3ε, состоящим максимально из 27 аминокислот, содержащим аминокислотную последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO:341) или Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO:342), фиксированным через его С-конец на твердой фазе;

(b) элюирование связанного(ых) полипептида(ов) из указанного фрагмента; и

(c) выделение полипептида(ов) из элюата, полученного на стадии (b).

Предпочтительно, полипептид(ы), выделенный(ые) вышеуказанным способом по изобретению, является(ются) полипептидом(ами) человека.

Этот способ выделения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению представляет собой способ выделения одного или более разных полипептидов с одинаковой специфичностью к фрагменту внеклеточного домена CD3ε, содержащего на своем N-конце аминокислотную последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO:341) или Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-lle-Gly (SEQ ID NO:342), из множества полипептидов-кандидатов, а также способ очистки полипептида из раствора. Неограничивающим примером последнего способа очистки молекулы биспецифического одноцепочечного антитела из раствора является, например, очистка рекомбинантно экспрессирующейся молекулы биспецифического одноцепочечного антитела из культурального супернатанта или препарата такой культуры.

Как указано выше, фрагмент, используемый в этом способе, представляет собой N-концевой фрагмент внеклеточного домена молекулы CD3ε примата. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена молекулы CD3ε разных видов представлена в SEQ ID NO:1, 3, 5 и 7. Две формы N-концевого октамера представлены в SEQ ID NO:341 и 342. Предпочтительно, этот N-конец свободно доступен для связывания полипептидов, которые должны быть идентифицированы способом по изобретению. Термин "свободно доступный" в контексте изобретения означает не имеющий дополнительных мотивов, таких как His-метка. Интерференция такой His-метки со связывающей молекулой, идентифицируемой способом по изобретению, описана в приведенных ниже примерах 6 и 20.

Согласно этому способу указанный фрагмент фиксируют через его С-конец на твердой фазе. Специалист в данной области техники без труда и без какой-либо изобретательской деятельности выберет подходящую твердофазную подложку в зависимости от используемого воплощения способа по изобретению. Примеры твердой подложки включают, но не ограничиваются ими, матрицы типа гранул (например, агарозные гранулы, сефарозные гранулы, полистирольные гранулы, декстрановые гранулы), планшеты (культуральные планшеты или многолуночные планшеты), а также чипы, например Biacore®. Выбор средств и методов фиксации/иммобилизации фрагмента на указанной твердой подложке зависит от выбора твердой подложки. Обычно используемым методом фиксации/иммобилизации является связывание через N-гидроксисукцинимидный (NHS) сложный эфир. Лежащая в основе этого связывания химия, а также альтернативные методы фиксации/иммобилизации известны специалисту в данной области, например из Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, Inc. (1996). Для фиксации/иммобилизации на хроматографических подложках обычно используют следующие средства: NHS-активированную сефарозу (например, HiTrap-NHS от GE Life Science-Amersham), CnBr-активированную сефарозу (например, GE Life Science-Amersham), NHS-активированные декстрановые гранулы (Sigma) или активированный полиметакрилат. Эти реагенты могут быть также использованы в периодическом подходе. Кроме того, в периодическом подходе могут быть использованы декстрановые гранулы, содержащие оксид железа (доступные, например, от Miltenyi). Эти гранулы могут быть использованы в комбинации с магнитом для отделения гранул от раствора. Полипептиды могут быть иммобилизованы на чипе Biacore (например, на чипах СМ5) за счет использования NHS-активированного карбоксиметилдекстрана. Дополнительными примерами подходящей твердой подложки являются многолуночные планшеты с реакционноспособными аминогруппами (например, планшеты Nunc Immobilizer™).

Согласно этому способу указанный фрагмент внеклеточного домена CD3-эпсилон может быть связан с твердой подложкой напрямую или через участок аминокислот, который может представлять собой линкерную или другую белковую/полипептидную группировку. Альтернативно, внеклеточный домен CD3-эпсилон может быть связан через одну или более чем одну адапторную молекулу.

Средства и методы элюирования пептида или полипептида, связанного с иммобилизованным эпитопом, общеизвестны в данной области. То же самое справедливо для выделения идентифицированного(ых) полипептида(ов) из элюата.

Способ выделения одной или более молекул биспецифического одноцепочечного антитела с одинаковой специфичностью к фрагменту внеклеточного домена CD3ε, содержащего на своем N-конце аминокислотную последовательность Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly (где Х представляет собой Met или Ile), из множества полипептидов-кандидатов может включать одну или более стадий следующих способов селекции антиген-специфических структур:

CD3ε-специфические связывающие домены могут быть отобраны из репертуаров антитела. Библиотека фагового дисплея может быть сконструирована по стандартным методикам, которые описаны, например, в "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Форматом фрагментов антител в библиотеке антител может быть scFv, но обычно также может быть Fab-фрагмент или даже фрагмент однодоменного антитела. Для выделения фрагментов антител могут быть использованы не подвергнутые какому-либо воздействию библиотеки фрагментов антител. Для отбора связывающих структур с потенциально низкой иммуногенностью при их последующем терапевтическом применении предпочтительными для прямой селекции фрагментов человеческих антител могут быть библиотеки фрагментов человеческих антител. В некоторых случаях они могут составлять основу для синтетических библиотек антител (Knappik et al. J. Mol. Biol., 2000, 296:57 ff). Соответствующим форматом может быть Fab, scFv (как описано ниже) или доменные антитела (dAb, обзор по которым приведен в Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21:484 ff).

Известно также в данной области, что во многих случаях пригодного источника человеческих иммунных антител против антигена-мишени нет. Поэтому животных подвергают иммунизации антигеном-мишенью, и из ткани животных, например селезенки или РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), выделяют соответствующие библиотеки антител. N-концевой фрагмент может быть биотинилирован или ковалентно связан с белками типа KLH (гемоцианин лимфы улитки) или бычьего сывороточного альбумина (BSA). Согласно общим подходам для иммунизации используют грызунов. Некоторые репертуары иммунных антител не человеческого происхождения могут быть особенно полезны по иным причинам, например по причине присутствия однодоменных антител (VHH), происходящих из видов одногорбых верблюдов (camelid species) (как описано в Muyldermans, J. Biotechnol., 74:277; De Genst et al., Dev. Como. Immunol., 2006, 30:187 ff). Таким образом, соответствующим форматом библиотеки антител могут быть Fab, scFv (как описано ниже) или однодоменные антитела (VHH).

В одном из возможных подходов 10-недельные мыши F1 от скрещиваний balb/c x C57black могут быть иммунизированы целыми клетками, например экспрессирующими трансмембранную ЕрСАМ, демонстрирующую на N-конце в качестве трансляционного слияния N-концевые аминокислоты 1-27 зрелой CD3ε-цепи. Альтернативно, мыши могут быть иммунизированы слитым белком 1-27 CD3-эпсилон-Fc (соответствующий подход описан в приведенном ниже Примере 2). После бустерной(ых) иммунизации(ий) могут быть взяты образцы крови, и сывороточный титр антител против CD3-положительных Т-клеток может быть протестирован, например, в FACS-анализе. Обычно сывороточные титры значительно выше у иммунизированных, чем у неиммунизированных животных.

Иммунизированные животные могут стать основой для создания иммунных библиотек антител. Примеры таких библиотек включают библиотеки фагового дисплея. Такие библиотеки, как правило, могут быть сконструированы по стандартным методикам, которые описаны, например, в "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

Антитела не человека также могут быть гуманизированы посредством фагового дисплея в результате создания библиотек более вариабельных антител, которые впоследствии могут быть обогащены в отношении связывающих фрагментов в процессе селекции.

В подходе с применением фагового дисплея любой из пулов фагов, который экспонирует библиотеки антител, образует основу для селекции связывающих структур с использованием соответствующего антигена в качестве молекулы-мишени. Центральный этап, на котором выделяют антиген-специфические, антиген-связанные фаги, называется пэннингом. Благодаря экспонированию фрагментов антител на поверхности фагов, этот общий способ называется фаговым дисплеем. Один из предпочтительных способов селекции заключается в использовании небольших белков, таких как домен N2 нитевидного фага, трансляционно слитый с N-концом scFv, экспонируемых данным фагом. Другим дисплейным методом, известным в данной области техники, который может быть использован для выделения связывающих структур, является метод рибосомного дисплея (смотри обзор в Groves & Osboum, Expert. Opin. Biol. Ther., 2005, 5:125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J. Immunol. Methods, 2004, 290:52 ff). Чтобы продемонстрировать связывание scFv-содержащих фаговых частиц со слитым белком 1-27 CD3ε-Fc, фаговая библиотека, несущая клонированный scFv-репертуар, может быть собрана из соответствующего культурального супернатанта с использованием PEG (полиэтиленгликоль). scFv-содержащие фаговые частицы могут - быть подвергнуты инкубации с иммобилизованным слитым белком CD3ε-FC. Иммобилизованный слитый белок CD3ε-Fc может быть нанесен на твердую фазу. Связывающие структуры могут быть элюированы, и элюат может быть использован для инфицирования свежей порции неинфицированных бактериальных хозяев. Бактериальные хозяева, подвергнутые успешной трансдукции фагмидной копией, кодирующей человеческий scFv-фрагмент, снова могут быть подвергнуты селекции на устойчивость к карбенициллину и после этого могут быть инфицированы, например хелперным фагом VCMS 13, для запуска второго раунда экспонирования антител и селекции in vitro. В норме проводят в сумме от 4 до 5 циклов селекции. Связывание выделенных связывающих структур может быть протестировано на CD3эпсилон-положительных клетках Jurkat, клетках HPBall, PBMC или трансфицированных эукариотических клетках, которые несут N-концевую CD3ε-последовательность, слитую с экспонируемой на поверхности ЕрСАМ, в проточно-цитометрическом анализе (смотри приведенный ниже Пример 4).

Предпочтительно, описанный выше способ может представлять собой способ, при котором фрагмент внеклеточного домена CD3ε состоит из одного или более фрагментов полипептида, имеющего аминокислотную последовательность из любой одной, представленной в SEQ ID NO:2, 4, 6 или 8. Более предпочтительно, указанный фрагмент представляет собой 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 аминокислотных остатков в длину.

Этот способ идентификации молекулы биспецифического одноцепочечного антитела может представлять собой способ скрининга множества молекул биспецифических одноцепочечных антител, содержащих связывающий домен, связывающийся с эпитопом CD3ε человека и примата, не являющегося шимпанзе, с межвидовой специфичностью. Альтернативно, способ идентификации представляет собой способ очистки/выделения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела, содержащей связывающий домен, связывающийся с эпитопом CD3ε человека и примата, не являющегося шимпанзе, с межвидовой специфичностью.

Кроме того, согласно данному изобретению предложена композиция, содержащая молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению или биспецифическое одноцепочечное антитело, полученное способом, описанным выше. Предпочтительно, указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

Согласно данному изобретению предложена также молекула биспецифического одноцепочечного антитела, как она определена в данном описании, или полученная способом, как он определен в данном описании, где указанная молекула биспецифического одноцепочечного антитела предназначена для применения в предупреждении, лечении или уменьшении симптомов рака. Предпочтительно, указанный рак представляет собой солидную опухоль, более предпочтительно карциному, или рак предстательной железы. Предпочтительно, биспецифическая одна цепь дополнительно содержит подходящие носители, стабилизаторы и/или эксципиенты. Кроме того, предпочтительно, указанная молекула биспецифического одноцепочечного антитела является подходящей для введения в комбинации с дополнительным лекарственным средством. Указанное лекарственное средство может представлять собой небелковое соединение или белковое соединение, и его можно вводить одновременно или неодновременно с молекулой биспецифического одноцепочечного антитела, как оно определено в данном описании.

В соответствии с изобретением термин "фармацевтическая композиция" относится к композиции для введения пациенту, предпочтительно пациенту-человеку. Конкретная предпочтительная фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит биспецифические одноцепочечные антитела, направленные против и созданные против независимых от окружения эпитопов CD3. Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит подходящие носители, стабилизаторы и/или эксципиенты. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция представляет собой композицию для парентерального, трансдермального, внутрипросветного, внутриартериального, интратекального и/или интраназального введения или введения посредством прямой инъекции в ткань. В частности предусматривается, что указанную композицию вводят пациенту посредством инфузии или инъекции. Введение подходящих композиций может быть осуществлено разными способами, например внутривенным, интраперитонеальным, подкожным, внутримышечным, местным или интрадермальным введением. В частности, согласно настоящему изобретению предусматривается непрерывное введение подходящей композиции. В качестве неограничивающего примера, непрерывное, т.е. постоянное введение, может быть реализовано посредством небольшой насосной системы, приводимой в действие пациентом, для дозирования поступления терапевтического агента в организм пациента. Фармацевтическую композицию, содержащую биспецифические одноцепочечные антитела по данному изобретению, направленные против и созданные против независимых от окружения эпитопов CD3, можно вводить с использованием указанных насосных систем. Такие насосные системы общеизвестны в данной области техники и обычно рассчитаны на периодическую замену картриджей, содержащих вводимый инфузией терапевтический агент. При замене картриджа в такой насосной системе может быть обеспечено временное прерывание во всех иных обстоятельствах непрерывного потока терапевтического агента в организм пациента. И в этом случае фаза введения перед заменой картриджа и фаза введения после замены картриджа все же считаются в рамках понимания фармацевтических средств и способов по изобретению вместе составляющими одно "непрерывное введение" такого терапевтического агента.

Постоянное или непрерывное введение этих биспецифических одноцепочечных антител по данному изобретению, направленных против и созданных против независимых от окружения эпитопов CD3, может быть внутривенным или подкожным с использованием устройства для доставки жидкости или небольшой насосной системы, включающей подающий механизм для подачи жидкости из резервуара и запускающий механизм для приведения в действие подающего механизма. Насосные системы для подкожного введения могут включать в себя иглу или канюлю для протыкания кожи пациента и доставки подходящей композиции в организм пациента. Указанные насосные системы могут быть непосредственно зафиксированы на коже или прикреплены к коже пациента автономно от вены, артерии или кровеносного сосуда, тем самым обеспечивая прямой контакт между насосной системой и кожей пациента. Насосная система может быть прикреплена к коже пациента в течение периода времени от 24 часов вплоть до нескольких суток. Насосная система может представлять собой систему небольшого размера с резервуаром для небольших объемов. В качестве неограничивающего примера, объем резервуара для подходящей фармацевтической композиции, предназначенной для введения, может составлять от 0,1 до 50 мл.

Непрерывное введение может быть трансдермальным с использованием пластыря, накладываемого на кожу и заменяемого через определенные промежутки времени. Специалист в данной области техники осведомлен о системах использования пластыря для доставки лекарственного средства, подходящих для этой задачи. Следует отметить, что трансдермальное введение особенно подходит в качестве непрерываемого введения, поскольку замена первого использованного пластыря предпочтительно может быть осуществлена одновременно с заменой на новый, второй пластырь, например. на поверхности кожи, находящейся в непосредственной близости от первого использованного пластыря и непосредственно перед удалением первого использованного пластыря. Проблем с прерыванием потока или сильным повреждением клеток не возникает.

Композиция по настоящему изобретению, содержащая, в частности, биспецифические одноцепочечные антитела, направленные против и созданные против независимых от окружения эпитопов CD3, могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры подходящих фармацевтических носителей хорошо известны в данной области техники и включают растворы, например забуференные фосфатами физиологические растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильные растворы, липосомы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, могут быть изготовлены общеизвестными традиционными способами. Композиции могут содержать углеводы, буферные растворы, аминокислоты и/или поверхностно-активные вещества. Углеводы могут представлять собой невосстанавливающие сахара, предпочтительно трегалозу, сахарозу, октасульфат, сорбит или ксилит. Такие композиции могут быть использованы для непрерывных введений, которые могут быть внутривенными или подкожными, с использованием и/или без использования насосных систем. Аминокислоты могут представлять собой заряженные аминокислоты, предпочтительно лизин, ацетат лизина, аргинин, глутамат и/или гистидин. Поверхностно-активные вещества могут представлять собой детергенты, предпочтительно с молекулярной массой более 1,2 кДа, и/или простой полиэфир, предпочтительно с молекулярной массой более 3 кДа. Неограничивающими примерами предпочтительных детергентов являются Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 или Tween 85. Неограничивающими примерами предпочтительного простого полиэфира являются PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 или PEG 5000. Буферные системы, используемые в настоящем изобретении, могут иметь предпочтительное значение рН 5-9, и они могут содержать цитрат, сукцинат, фосфат, гистидин и ацетат. Композиции по настоящему изобретению можно вводить субъекту в подходящей дозе, которая может быть определена, например, в результате исследований с применением возрастающих доз путем введения увеличивающихся доз описанной здесь молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, проявляющего межвидовую специфичность в отношении приматов, не являющихся шимпанзе, например макаков. Как указано выше, описанная здесь молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, проявляющая межвидовую специфичность, может быть предпочтительно использована в идентичной форме в доклиническом тестировании на приматах, не являющихся шимпанзе, и в виде лекарственного средства у людей. Эти композиции можно также вводить в комбинации с другими белковыми и небелковыми лекарственными средствами. Эти лекарственные средства можно вводить одновременно с композицией, содержащей описанную здесь молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, проявляющую межвидовую специфичность, или отдельно до или после введения указанного полипептида в соответствии с определенными временными интервалами и дозами. Режим дозирования будет определять лечащий врач по клиническим показателям. Как известно в медицине, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер тела пациента, площадь поверхности тела пациента, возраст пациента, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол пациента, время и путь введения, общее состояние здоровья пациента и другие лекарственные средства, вводимые совместно. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные разбавители включают раствор хлорида натрия, декстрозу в растворе Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактозой или нелетучие масла. Внутривенные разбавители включают жидкие и питательные наполнители, электролиты-наполнители (например, на основе декстрозы в растворе Рингера) и тому подобное. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное. К тому же, композиция по настоящему изобретению может содержать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, предпочтительно человеческого происхождения. Предусматривается, что композиция по изобретению может содержать, в дополнение к описанной здесь молекуле биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, дополнительные биологически активные агенты в зависимости от предполагаемого применения композиции. Такими агентами могут быть лекарственные средства, действующие на желудочно-кишечную систему, лекарственные средства, действующие в качестве цитостатических средств, лекарственные средства, предупреждающие гиперурикемию, лекарственные средства, подавляющие иммунные реакции (например, кортикостероиды), лекарственные средства, модулирующие воспалительный ответ, лекарственные средства, действующие на систему кровообращения, и/или, такие агенты, как цитокины, известные в данной области.

Биологическая активность фармацевтической композиции, определенной в данном описании, может быть определена, например, анализами цитотоксичности, как описано в приведенных ниже примерах, в WO 99/54440, или в Schlereth et al. Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12. Используемые в данном описании термины "эффективность" или "эффективность in vivo" относятся к ответной реакции на терапию фармацевтической композицией по изобретению, определяемой с использованием, например, стандартизированных критериев оценки ответной реакции NCI (Национальный институт рака США). Успех или эффективность терапии in vivo с использованием фармацевтической композиции по изобретению относится к эффективности композиции в отношении ее назначения, т.е. к способности композиции вызывать ее желаемый эффект, т.е. истощение патологических клеток, например опухолевых клеток. Эффективность in vivo может быть проконтролирована утвержденными стандартными методами определения соответствующих нозологических форм, включая, без ограничения, определение количества лейкоцитов, дифференциальный анализ крови, метод сортировки флуоресцентно-активированных клеток, аспирацию костного мозга. В дополнение к этому могут быть использованы методы определения клинических химических параметров, специфичных для различных заболеваний, и другие утвержденные стандартные методы. Кроме того, могут быть использованы компьютерная томография, рентгеновское исследование, ядерная магнитно-резонансная томография (например, для оценки ответной реакции на основе критериев Национального института рака США [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister ТА, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group.J. Clin. Oncol., 1999 Apr; 17(4):1244]), позитронно-эмиссионное томографическое сканирование, определение количества лейкоцитов, дифференциальный анализ крови, сортировка флуоресцентно-активированных клеток, аспирация костного мозга, биопсии/гистологии лимфатических узлов и определение различных лимфома-специфических клинических химических параметров (например, лактатдегидрогеназы) и другие утвержденные стандартные методы.

Другой большой проблемой в разработке таких лекарственных средств, как фармацевтическая композиция по изобретению, является прогнозируемое модулирование фармакокинетических свойств. С этой целью определяют фармакокинетический профиль лекарственного средства-кандидата, т.е. профиль фармакокинетических параметров, которые влияют на способность конкретного лекарственного средства лечить данное состояние. Фармакокинетические параметры лекарственного средства, оказывающего влияние на способность лекарственного средства лечить конкретное болезненное состояние, включают, но не ограничиваются ими, период полувыведения, объем распределения, метаболизм "первого прохождения" через печень и степень связывания с сывороткой крови. На эффективность данного лекарственного агента может оказывать влияние каждый из упомянутых выше параметров.

"Период полувыведения" означает время, за которое 50% введенного лекарственного средства выводится в результате биологических процессов, например метаболизма, экскреции и т.д.

Под "метаболизмом первого прохождения через печень" подразумевается способность лекарственного средства метаболизироваться после первого контакта с печенью, т.е. в процессе его первого прохождения через печень.

"Объем распределения" означает степень удерживания лекарственного средства во всех различных компартментах организма, таких как, например, внутриклеточные и внеклеточные пространства, ткани и органы и т.д., и распределение лекарственного средства в этих компартментах.

"Степень связывания с сывороткой крови" означает склонность лекарственного средства взаимодействовать или связываться с белками сыворотки крови, такими как альбумин, приводящая к снижению или потере биологической активности лекарственного средства.

Фармакокинетические параметры также включают биодоступность, латентный период (Tlag), Tmax, скорости всасывания, время начала и/или Cmax для заданного количества вводимого лекарственного средства.

"Биодоступность" означает количество лекарственного средства в компартменте крови.

"Латентный период" означает время задержки между введением лекарственного средства и его детектированием и возможностью измерения в крови или плазме.

"Tmax" представляет собой время, после которого достигается максимальная концентрация лекарственного средства в крови, а "Cmax" представляет собой максимальную концентрацию в крови, получаемую при использовании данного лекарственного средства. На промежуток времени для достижения концентрации лекарственного средства в крови или тканях, которая требуется для биологического эффекта этого лекарственного средства, оказывают влияние все параметры. Фармакокинетические параметры биспецифических одноцепочечных антител, проявляющих межвидовую специфичность, которые могут быть определены в доклиническом тестировании на животных, на приматах, не являющихся шимпанзе, перечисленных выше, также приведены, например в публикации Schlereth et al. Cancer Immunol. Immunother., 20 (2005), 1-12.

Используемый в данном описании термин "токсичность" относится к токсическим эффектам лекарственного средства, выражающимся в неблагоприятных явлениях или тяжелых неблагоприятных явлениях. Эти побочные явления могут относиться к полной непереносимости лекарственного средства и/или к отсутствию локальной переносимости после введения. Токсичность может также включать тератогенные или карциногенные эффекты, вызываемые этим лекарственным средством.

Используемые в данном описании термины "безопасность", "безопасность in vivo" или "переносимость" определяют введение лекарственного средства без индуцирования тяжелых неблагоприятных явлений сразу после введения (локальная переносимость) и в течение более продолжительного применения лекарственного средства. "Безопасность", "безопасность in vivo" или "переносимость" можно оценивать, например, через регулярные интервалы в ходе лечения и последующего периода наблюдения. Измерения включают клиническую оценку, например проявлений о стороны органов, и скрининг лабораторных аномалий. В соответствии со стандартами NCI-CTC и/или MedDRA можно проводить клиническую оценку и регистрировать/кодировать отклонение относительно нормальных показателей. Проявления со стороны органов могут включать такие критерии, как аллергия/иммунология, кровь/костный мозг, сердечная аритмия, коагуляцию и тому подобное, которые изложены, например, в Общих терминологических критериях для неблагоприятных явлений (Common Terminology Criteria for adverse events) v3.0 (CTCAE). Лабораторные параметры, которые могут быть протестированы, включают, например, гематологический, клинический химический, коагуляционный профиль и анализ мочи, а также исследование других жидкостей организма, таких как сыворотка, плазма, лимфоидная или спинномозговая жидкость, ликвор и т.п. Таким образом, безопасность может быть оценена, например, путем врачебного осмотра, использования методов визуализации (т.е. ультразвуковое исследование, рентгеновское исследование, СТ-сканирование (компьютерная томография), магнитно-резонансная визуализация (MRI)), других измерений с использованием технических средств (т.е. электрокардиограмма), основных жизненных показателей состояния организма, путем измерения лабораторных показателей и регистрации неблагоприятных явлений. Например, неблагоприятные явления у приматов, не являющихся шимпанзе, в применениях и способах по изобретению могут быть исследованы гистопатологическими и/или гистохимическими методами.

Используемый в данном описании термин "эффективная и нетоксичная доза" относится к переносимой дозе биспецифического одноцепочечного антитела, как оно определено в данном описании, которая достаточно высока для того, чтобы вызвать истощение патологических клеток, элиминацию опухоли, сокращение размеров опухоли или стабилизацию заболевания без или по существу без больших токсических эффектов. Такие эффективные и нетоксичные дозы могут быть определены, например, в результате описанных в данной области исследований с возрастающими дозами, и она должна быть ниже дозы, вызывающей тяжелые неблагоприятные побочные явления (дозолимитирующая токсичность (DLT)).

На вышеупомянутые термины также имеются ссылки, например, в Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals (Доклиническая оценка безопасности производимых биотехнологическими методами фармацевтических средств) S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по данному изобретению или полученную способом по изобретению, для предупреждения, лечения или уменьшения симптомов рака. Предпочтительно, указанный рак представляет собой солидную опухоль, предпочтительно карциному, или рак предстательной железы. Предпочтительно, указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит подходящие носители, стабилизаторы и/или эксципиенты.

В еще одном аспекте изобретение относится к применению молекулы биспецифического одноцепочечного антитела/полипептида, как она определена в данном описании выше, или полученной способом, как он определен в данном описании выше, для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения, лечения или уменьшения симптомов заболевания. Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой рак. Более предпочтительно, указанный рак представляет собой солидную опухоль, предпочтительно карциному, или рак предстательной железы.

В другом предпочтительном воплощении применения молекулы биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению указанная фармацевтическая композиция пригодна для введения в комбинации с дополнительным лекарственным средством, т.е. как часть комбинированной терапии. В указанной комбинированной терапии активный агент возможно может входить в состав той же фармацевтической композиции, в состав которой входит молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, или может входить в состав отдельной фармацевтической композиции. В этом последнем случае, указанная отдельная фармацевтическая композиция пригодна для введения до, одновременно или после введения указанной фармацевтической композиции, содержащей молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению. Дополнительное лекарственное средство или фармацевтическая композиция может представлять собой небелковое соединение или белковое соединение. В случае, когда дополнительное лекарственное средство представляет собой белковое соединение, тогда предпочтительно это белковое соединение способно обеспечивать сигнал активации для иммунных эффекторных клеток.

Предпочтительно, указанные белковое соединение или небелковое соединение можно вводить одновременно или неодновременно с молекулой биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, молекулой нуклеиновой кислоты, как она определена в данном описании выше, вектором, как он определен в данном описании выше, или хозяином, как он определен в данном описании выше.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу предупреждения, лечения или уменьшения симптомов заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий стадию введения эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. Предпочтительно, указанное заболевание представляет собой рак. Предпочтительно, указанный рак представляет собой солидную опухоль, предпочтительно карциному, или рак предстательной железы.

В другом предпочтительном воплощении способа по изобретению указанная фармацевтическая композиция пригодна для введения в комбинации с дополнительным лекарственным средством, т.е. как часть комбинированной терапии. В указанной комбинированной терапии активный агент возможно может входить в состав той же фармацевтической композиции, в которую входит молекула биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, или может входить в состав отдельной фармацевтической композиции. В этом последнем случае, указанная отдельная фармацевтическая композиция пригодна для введения до, одновременно или после введения указанной фармацевтической композиции, содержащей молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению. Дополнительное лекарственное средство или фармацевтическая композиция может представлять собой небелковое соединение или белковое соединение. В случае, когда дополнительное лекарственное средство представляет собой белковое соединение, тогда предпочтительно это белковое соединение способно обеспечивать сигнал активации для иммунных эффекторных клеток.

Предпочтительно, указанные белковое соединение или небелковое соединение можно вводить одновременно или неодновременно с молекулой биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, молекулой нуклеиновой кислоты, как она определена в данном описании выше, вектором, как он определен в данном описании выше, или хозяином, как он определен в данном описании выше.

Предпочтительно, в описанном выше способе указанный субъект представляет собой человека.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к набору, содержащему молекулу биспецифического одноцепочечного антитела по изобретению, молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, вектор по изобретению или хозяина по изобретению.

Эти и другие воплощения описаны и охвачены описанием и Примерами настоящего изобретения. Рекомбинантные методики и иммунологические методы описаны, например, в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. Дополнительную литературу, касающуюся любого из антител, способов, применений и соединений, используемых в соответствии с настоящим изобретением, можно найти в общедоступных библиотеках и базах данных с использованием, например, электронных устройств. Например, можно использовать общепризнанную базу данных "Medline", доступную через Интернет, например по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Дополнительные базы данных и адреса, такие как http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ или перечисленные на домашней странице сервиса EMBL (European Molecular Biology Laboratory) под адресом http://www.embl.de/services/index.html, известны специалисту в данной области техники и также могут быть доступны с использованием, например, http://www.google.com.

Графические материалы иллюстрируют:

Фиг.1

Слитая конструкция N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон приматов с гетерологичным растворимым белком.

Фиг.2

На Фиг.2 представлены средние значения поглощения для образцов в четырех повторах, измеренные в анализе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), определяющем присутствие конструкции, состоящей из N-концевых аминокислот 1-27 зрелой CD3-эпсилон-цепи человека, слитой с шарнирным и Fc-гамма-участком человеческого IgG1 и C-концевой 6-гистидиновой меткой, в супернатанте (SN) временно трансфицированных клеток 293. В первом столбце, отмеченном как "27 аа huCD3E", показано среднее значение поглощения для конструкции, во втором столбце, отмеченном как "нерелев. SN", показано среднее значение для супернатанта клеток 293, трансфицированных нерелевантной конструкцией, в качестве отрицательного контроля. Сравнение значений, полученных для данной конструкции, со значениями, полученными для отрицательного контроля, четко демонстрирует присутствие рекомбинантной конструкции.

Фиг.3

На Фиг.3 показаны средние значения поглощения для образцов в четырех повторах, измеренные в ELISA-анализе, определяющем связывание анти-CD3-связывающих молекул с межвидовой специфичностью в форме неочищенных препаратов одноцепочечных антител, экспрессируемых в периплазматическое пространство, с конструкцией, содержащей N-концевые аминокислоты 1-27 зрелой CD3-эпсилон-цепи человека, слитой с шарнирным и Fc-гамма-участком человеческого IgG1 и С-концевой His6-меткой. В столбцах показаны, слева направо, средние значения абсорбции для специфичностей, обозначенных как A2J HLP, I2C HLP, E2M HLP, F70 HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1L HLP, F12Q HLP, F6A HLP и Н1Е HLP. В самом правом столбце, помеченном как "отр. контр." показано среднее значение поглощения для препарата одноцепочечного мышиного антитела против CD3 человека в качестве отрицательного контроля. Сравнение значений, полученных для анти-CD3-специфичностей, со значениями, полученными для отрицательного контроля (отр. контр.), четко демонстрирует сильное связывание анти-CD3-специфичностей с N-концевыми аминокислотами 1-27 зрелой CD3-эпсилон-цепи человека.

Фиг.4

Слитая конструкция N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон приматов с гетерологичным мембраносвязанным белком.

Фиг.5

Совмещенные гистограммы разных трансфектантов, протестированных в FACS-анализе, определяющем присутствие рекомбинантных трансмембранных слитых белков, состоящих из ЕрСАМ яванского макака и N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки, тамарина, беличьей обезьяны и домашней свиньи, соответственно. На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих конструкции, содержащие 27-мер человека, 27-мер игрунки, 27-мер тамарина, 27-мер беличьей обезьяны и 27-мер свиньи соответственно. На каждой отдельной совмещенной гистограмме тонкая линия означает образец, инкубированный с PBS (забуференный фосфатами физиологический раствор), содержащим 2% FCS (фетальная сыворотка теленка) вместо анти-Flag М2-антитела, в качестве отрицательного контроля, а толстая линия означает образец, инкубированный с анти-Flag М2-антителом. Совмещенная гистограмма для каждой конструкции показывает связывание анти-Flag М2-антитела с трансфектантами, что четко демонстрирует экспрессию рекомбинантных конструкций в трансфектантах.

Фиг.6

Совмещенные гистограммы разных трансфектантов, протестированных в FACS-анализе, определяющем связывание анти-CD3-связывающих молекул с межвидовой специфичностью в форме неочищенных препаратов одноцепочечных антител, экспрессируемых в периплазматическое пространство, с N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки, тамарина и беличьей обезьяны соответственно, слитой с ЕрСАМ яванского макака.

Фиг.6А:

На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих 1-27 CD3-ЕрСАМ, содержащий 27-мер человека, протестированных с использованием CD3-специфических связывающих молекул, обозначенных Н2С HLP, F12Q HLP, Е2М HLP и G4H HLP соответственно.

Фиг.6В:

На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих 1-27 CD3-ЕрСАМ, содержащий 27-мер игрунки, протестированных с использованием CD3-специфических связывающих молекул, обозначенных Н2С HLP, F12Q HLP, Е2М HLP и G4H HLP соответственно.

Фиг.6С:

На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих 1-27 CD3-ЕрСАМ, содержащий 27-мер тамарина, протестированных с использованием CD3-специфических связывающих молекул, обозначенных Н2С HLP, F12Q HLP, Е2М HLP и G4H HLP соответственно.

Фиг.6D:

На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих 1-27 CD3-ЕрСАМ, содержащий 27-мер беличьей обезьяны, протестированных с использованием CD3-специфических связывающих молекул, обозначенных Н2С HLP, F12Q HLP, Е2М HLP и G4H HLP соответственно.

Фиг.6Е:

На совмещенных гистограммах, слева направо и сверху вниз, представлены результаты для трансфектантов, экспрессирующих 1-27 CD3-ЕрСАМ, содержащий 27-мер свиньи, протестированных с использованием CD3-специфических связывающих молекул, обозначенных Н2С HLP, F12Q HLP, Е2М HLP и G4H HLP соответственно.

На отдельных совмещенных гистограммах тонкая линия означает образец, инкубированный с препаратом одноцепочечного мышиного антитела против CD3 человека в качестве отрицательного контроля, а толстая линия означает образец, инкубированный с соответствующими указанными анти-CD3-связывающими молекулами. Принимая во внимание отсутствие связывания с трансфектантами 27-мера свиньи и уровни экспрессии конструкций, представленных на Фиг.5, совмещенные гистограммы демонстрируют специфическое и сильное связывание тестируемых анти-CD3-специфичностей человеческих биспецифических одноцепочечных антител с полной межвидовой специфичностью с клетками, экспрессирующими рекомбинантные трансмембранные слитые белки, содержащие N-концевые аминокислоты 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки, тамарина и беличьей обезьяны, соответственно, слитые с ЕрСАМ яванского макака, и, следовательно, демонстрируют межвидовую специфичность анти-CD3-связывающих молекул в отношении многих приматов.

Фиг.7

FACS-анализ для определения CD3-эпсилон человека на трансфицированных мышиных EL4 Т-клетках. Графический анализ показывает совмещение гистограмм. Толстая линия означает трансфицированные клетки, инкубированные с антителом UCHT-1 против CD3 человека. Тонкая линия означает клетки, инкубированные с мышиным контролем IgG1 изотипа. Связывание антитела UCHT1 против CD3 четко демонстрирует экспрессию CD3-зпсилон-цепи человека на клеточной поверхности трансфицированных мышиных EL4 Т-клеток.

Фиг.8

Связывание обладающих межвидовой специфичностью анти-CD3 антител с аланиновыми мутантами в эксперименте по аланиновому сканированию. Столбцы на отдельных Фигурах, слева направо и сверху вниз, представляют значения связывания, рассчитанные в условных единицах по логарифмической шкале для трансфектанта дикого типа (WT) и для всех аланиновых мутантов для положения 1-27. Значения связывания рассчитывают, используя следующую формулу:

v a l u e _ S a m p l e ( x , y ) = S a m p l e ( x , y ) n e g _ C o n t r . ( x ) ( U C H T 1 ( x ) n e g _ C o n t r . ( x ) ) * W T ( y ) n e g _ C o n t r . ( w t ) U C H T 1 ( w t ) n e g _ C o n t r . ( w t )

В этом уравнении value_Sample означает значение связывания в условных единицах, отображающее степень связывания специфического анти-CD3-антитела со специфическим аланиновым мутантом, как показано на этой Фигуре; Sample означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для специфического анти-CD3-антитела, проанализированного на специфическом аланин-сканирующем трансфектанте; neg_Contr. означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для отрицательного контроля, проанализированного на специфическом аланиновом мутанте; UCHT-1 означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для антитела UCHT-1, проанализированного на специфическом аланиновом мутанте; WT означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для специфического анти-CD3-антитела, проанализированного на трансфектанте дикого типа; x указывает соответствующий трансфектант; y указывает соответствующее анти-CD3-антитело; и wt указывает на то, что соответствующий трансфектант относится к дикому типу. Индивидуальные положения аланиновых мутантов помечены однобуквенным кодом аминокислоты дикого типа и номером положения.

Фиг.8А:

На Фиг.8А представлены результаты для анти-CD3-антитела A2J HLP с межвидовой специфичностью, экспрессируемого в виде химерной IgG молекулы. Сниженная активность связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 4 (аспарагин), в положении 23 (треонин) и в положении 25 (изолейцин). Полная потеря связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 1 (глутамин), в положении 2 (аспартат), в положении 3 (глицин) и в положении 5 (глутамат).

Фиг.8В:

На Фиг.8В представлены результаты для анти-CD3-антитела Е2М HLP с межвидовой специфичностью, экспрессируемого в виде химерной IgG молекулы. Сниженная активность связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 4 (аспарагин), в положении 23 (треонин) и в положении 25 (изолейцин). Полная потеря связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 1 (глутамин), в положении 2 (аспартат), в положении 3 (глицин) и в положении 5 (глутамат).

Фиг.8С:

На Фиг.8С представлены результаты для анти-CD3-антитела Н2С HLP с межвидовой специфичностью, экспрессируемого в виде химерной IgG молекулы. Сниженная активность связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 4 (аспарагин). Полная потеря связывания наблюдается для мутаций на аланин глутамин в положении 1 (глутамин), в положении 2 (аспартат), в положении 3 (глицин) и в положении 5 (глутамат).

Фиг.8D:

На Фиг.8D представлены результаты для анти-CD3-антитела F12Q HLP с межвидовой специфичностью, протестированного в виде периплазматически экспрессируемого одноцепочечного антитела. Полная потеря связывания наблюдается для мутаций с заменой на аланин в положении 1 (глутамин), в положении 2 (аспартат), в положении 3 (глицин) и в положении 5 (глутамат).

Фиг.9

FACS-анализ, определяющий связывание анти-CD3-связывающей, молекулы Н2С HLP, проявляющей межвидовую специфичность, с CD3 человека, содержащим и не содержащим N-концевую His6-метку.

Совмещенные гистограммы выполнены на клеточной линии EL4, трансфицированной CD3-эпсилон-цепью дикого типа человека (левая гистограмма) или CD3-эпсилон-цепью человека, содержащей N-концевую His6-метку (правая гистограмма), протестированной в FACS-анализе, определяющем связывание связывающей молекулы Н2С HLP с межвидовой специфичностью. Образцы инкубируют с контролем соответствующего изотипа в качестве отрицательного контроля (тонкая линия), антителом UCHT-1 против CD3 человека в качестве положительного контроля (пунктирная линия) и анти-CD3-антителом Н2С HLP с межвидовой специфичностью в форме химерной IgG молекулы (толстая линия).

Совмещенные гистограммы демонстрируют сравнимое связывание антитела UCHT-1 с обоими трансфектантами по сравнению с изотипическим контролем, демонстрирующим экспрессию обеих рекомбинантных конструкций. Совмещенные гистограммы также демонстрируют связывание анти-CD3-связывающей молекулы Н2С HLP только с CD3 эпсилон-цепью дикого типа человека, но не с His6-CD3-эпсилон-цепью человека. Эти результаты демонстрируют, что наличие свободного N-конца существенно для связывания анти-CD3-связывающей молекулы Н2С HLP с межвидовой специфичностью.

Фиг.10

FACS-анализ связывания указанных биспецифических одноцепочечных конструкций с межвидовой специфичностью с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 яванского макака, и T-клеточной линией 4119LnPx макака. FACS-окрашивание осуществляют, как описано в Примере 10. Толстая линия означает клетки, инкубированные с очищенным белком в концентрации 2 мкг/мл, которые после этого инкубируют с анти-his-антителом и РЕ-меченым детектирующим антителом. Тонкая линия на гистограммах отражает отрицательный контроль: клетки, инкубированные только с анти-his-антителом и детектирующим антителом.

Фиг.11

FACS-анализ связывания указанных биспецифических одноцепочечных конструкций с межвидовой специфичностью с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 яванского макака, и Т-клеточной линией 4119LnPx макака. FACS-окрашивание осуществляют, как описано в Примере 10. Толстая линия означает клетки, инкубированные с очищенным белком в концентрации 2 мкг/мл, которые после этого инкубируют с анти-his-антителом и РЕ-меченым детектирующим антителом. Тонкая линия на гистограммах отражает отрицательный контроль: клетки, инкубированные только с анти-his-антителом и детектирующим антителом.

Фиг.12

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 яванского макака, и Т-клеточной линией 4119LnPx макака. FACS-окрашивание осуществляют, как описано в Примере 10. Толстая линия означает клетки, инкубированные с очищенным белком в концентрации 2 мкг/мл, которые после этого инкубируют с анти-his-антителом и РЕ-меченым детектирующим антителом. Тонкая линия на гистограммах отражает отрицательный контроль: клетки, инкубированные только с анти-his-антителом и детектирующим антителом.

Фиг.13

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А): стимулированные CD4-/CD56- РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 человека, использованы в качестве клеток-мишеней. В): Т-клеточная линия 4119LnPx макака использована в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 яванского макака, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 11.

Фиг.14

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А) и В) Т-клеточная линия 4119LnPx макака использована в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 яванского макака, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 11.

Фиг.15

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А) и В): стимулированные CD4-/CD56- РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 человека, использованы в качестве Т-клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 11.

Фиг.16

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А): стимулированные CD4-/CD56- РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 человека, использованы в качестве клеток-мишеней. В): Т-клеточная линия 4119LnPx макака использована в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 яванского макака, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 11.

Фиг.17

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А): стимулированные CD4-/CD56- РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 человека, использованы в качестве клеток-мишеней. В): Т-клеточная линия 4119LnPx макака использована в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 яванского макака, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 11.

Фиг.18

Стабильность в плазме MCSP и CD3 биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, протестированных путем измерения цитотоксической активности, индуцированной образцами указанных одноцепочечных конструкций, инкубированных с 50% человеческой плазмы при 37°С и 4°С в течение 24 часов, соответственно, или с добавлением 50% человеческой плазмы непосредственно перед тестированием цитотоксичности, или без добавления плазмы. Клетки СНО, трансфицированные MCSP человека, использованы в качестве клеток-мишеней, и стимулированные CD4/CD56-РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток. Анализ выполнен, как описано в Примере 12.

Фиг.19

Начальное уменьшение и восстановление (т.е. перераспределение) абсолютного количества Т-клеток (незакрашенные квадраты) в периферической крови пациентов с B-NHL (В-клеточная неходжкинская лимфома) (номера пациентов 1, 7, 23, 30, 31 и 33 в Таблице 4), по существу не имевших циркулирующих CD19-положительных целевых В-клеток (закрашенные треугольники), во время начальной фазы внутривенной инфузии CD3-связывающей молекулы CD19xCD3, распознающей традиционный зависимый от окружения эпитоп CD3. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. Доза CD19xCD3 приведена в круглых скобках рядом с номером пациента.

Фиг.20

(А) Повторное перераспределение Т-клеток (незакрашенные квадраты) у пациента с B-NHL №19 (Таблица 4), не имевшего циркулирующих CD19-положительных целевых В-клеток (закрашенные треугольники) и у которого развились ЦНС-симптомы при непрерывной внутривенной инфузии CD19xCD3 в начальной дозе 5 мкг/м2/24 ч в течение одних суток с последующим резким увеличением дозы до 15 мкг/м2/24 ч. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. После восстановления количества циркулирующих Т-клеток в результате первого эпизода перераспределения, инициированного лечением, начатым с 5 мкг/м2/24 ч, пошаговое увеличение дозы от 5 до 15 мкг/м2/24 ч инициировало второй эпизод перераспределения Т-клеток, ассоциированный с развитием ЦНС-симптомов, среди которых преобладали спутанность сознания и дезориентация.

(В) Повторное перераспределение Т-клеток у пациента с B-NHL, у которого развились ЦНС-симптомы после повторной внутривенной болюсной инфузии CD19xCD3 при 1,5 мкг/м2. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Продолжительность инфузии для каждого болюсного введения составляла от 2 до 4 часов. Вертикальные стрелки указывают на начало болюсных инфузии. Точки на графике в начальный момент каждого болюсного введения показывают количество Т-клеток непосредственно перед началом болюсной инфузии. Каждая болюсная инфузия инициировала эпизод перераспределения Т-клеток, за которым следовало восстановление количества Т-клеток до следующей болюсной инфузии. Наконец, третий эпизод перераспределения Т-клеток был ассоциирован с развитием ЦНС-симптомов у этого пациента.

Фиг.21

Комплексная картина перераспределения Т-клеток (незакрашенные квадраты) у пациента с B-NHL №20 (Таблица 4) без циркулирующих CD19-положительных В-клеток-мишеней (закрашенные треугольники) в течение линейно возрастающей (ramp) инициации инфузии CD19xCD3, т.е. плавного постепенного увеличения скорости потока от почти нуля до 15 мкг/м2/24 ч в течение первых 24 часов лечения. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. Доза CD19xCD3 приведена в скобках рядом с номером пациента. Т-клетки, вновь появляющиеся в циркулирующей крови после начального перераспределения, инициированного первым воздействием CD19xCD3, снова исчезают из циркулирующей крови, что частично индуцируется все еще возрастающими уровнями CD19xCD3 во время ramp-фазы.

Фиг.22

Количества Т- и В-клеток во время лечения с использованием CD19xCD3 пациента с B-NHL №13 (Таблица 4), у которого имелось значительное количество циркулирующих CD19-положительных В-клеток-мишеней (лимфомы) (закрашенные треугольники). Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. Доза CD19xCD3 приведена в скобках рядом с номером пациента. Т-клетки (незакрашенные квадраты) полностью исчезают из кровотока после начала инфузии CD19xCD3 и не появляются вновь до тех пор, пока циркулирующие CD19-положительные В-клетки (лимфомы) (закрашенные треугольники) не будут истощены в периферической крови.

Фиг.23

Повторное перераспределение Т-клеток (незакрашенные квадраты) у пациента с B-NHL №24 (Таблица 4), у которого по существу не было циркулирующих CD19-положительных В-клеток-мишеней (закрашенные треугольники) и развились ЦНС-симптомы в результате инициации инфузии CD19xCD3 без добавления HSA (сывороточный альбумин человека), необходимого для стабилизации лекарственного средства (верхняя панель). После первого восстановления циркулирующих Т-клеток в конце начального перераспределения, неравномерный поток лекарственного средства, обусловленный отсутствием стабилизирующего HSA, инициировал второй эпизод перераспределения Т-клеток, ассоциированный с развитием ЦНС-симптомов, среди которых доминировали спутанность сознания и дезориентация. Когда этому же пациенту снова начинали вводить раствор CD19xCD3, содержащий добавку HSA для стабилизации лекарственного средства, то у пациента не наблюдалось никакого повторного перераспределения Т-клеток (нижняя панель), а также развития каких-либо ЦНС-симптомов. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. Доза CD19xCD3 приведена в скобках рядом с номером пациента.

Фиг.24

Модель адгезии Т-клеток к эндотелиальным клеткам, индуцированной моновалентным связыванием с зависимыми от окружения эпитопами CD3. Моновалентное взаимодействие традиционной CD3-связывающей молекулы с ее зависимым от окружения эпитопом на CD3-эпсилон может приводить к аллостерическому изменению конформации CD3 с последующим рекрутментом Nck2 к цитоплазматическому домену CD3-эпсилон (Gil et al. (2002) Cell 109:901). Поскольку Nck2 непосредственно связан с интегринами через PINCH и ILK (Legate et al. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:20), рекрутмент Nck2 к цитоплазматическому домену CD3-эпсилон после аллостерического изменения конформации CD3 в результате связывания традиционной CD3-связывающей молекулы (такой как CD19xCD3 из Примера 13) с ее зависимым от окружения эпитопом на CD3-эпсилон, может увеличивать адгезивность Т-клеток к эндотелиальным клеткам за счет временного перехода интегринов на поверхности Т-клеток в их более адгезивную изоформу через передачу сигнала изнутри наружу.

Фиг.25

Цитотоксическая активность тестируемого вещества, CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, использованного в исследовании in vivo на яванских макаках, описанном в Примере 14. Специфический лизис CD33-положительных клеток-мишеней определяли в стандартном анализе высвобождения "хрома при возрастающих концентрациях CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL. Время анализа составляло 18 часов. Т-клеточную линию 4119LnPx макака использовали в качестве источника эффекторных клеток. Клетки СНО, трансфицированные CD33 яванского макака, служили в качестве клеток-мишеней. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Е:Т-соотношение) составляло 10:1. Концентрацию CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, необходимую для полумаксимального лизиса клеток-мишеней (EC50), вычисляли из кривой доза-ответ, и она составляла 2,7 нг/мл.

Фиг.26

(А) Дозо- и время-зависимое истощение CD33-положительных моноцитов в периферической крови яванских макаков в результате непрерывной внутривенной инфузии CD33-AF5 VH-VL х I2C VH-VL, как описано в Примере 14. Процентное содержание относительно исходного (т.е. 100%) абсолютного количества циркулирующих CD33-положительных моноцитов после продолжительности лечения, указанной над столбцами, показано для каждого из двух яванских макаков для каждого уровня дозы. Уровень дозы (т.е. скорость потока при инфузии) указан под столбцами. Никакого истощения циркулирующих CD33-положительных моноцитов не наблюдалось у животных 1 и 2, которых лечили в течение 7 суток дозой 30 мкг/м2/24 ч. У животных 3 и 4, которых лечили в течение 7 суток дозой 60 мкг/м2/24 ч, количество циркулирующих CD33-положительных моноцитов уменьшилось до 68% и 40% от исходного соответственно. При 240 мкг/м2/24 ч циркулирующие CD33-положительные моноциты были почти полностью истощены в периферической крови через 3 суток лечения (животные 5 и 6). При 1000 мкг/м2/24 ч истощение циркулирующих CD33-положительных моноцитов в периферической крови завершалось уже через 1 сутки лечения (животные 7 и 8).

(В) Ход изменения количества Т-клеток и CD33-моноцитов в периферической крови двух яванских макаков во время непрерывной инфузии CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL в течение 14 суток при 120 мкг/м2/24 ч. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. После начальной мобилизации CD33-моноцитов в течение первых 12 часов после начала инфузии CD33-моноциты в периферической крови (закрашенные треугольники) истощаются на две трети (животное 10) и на 50% (животное 9) относительно соответствующих исходных количеств во время дальнейшей инфузии. Количество циркулирующих Т-клеток (незакрашенные квадраты) демонстрирует ограниченное начальное уменьшение, за которым следует восстановление количества уже в присутствии циркулирующих CD33-положительных моноцитарных клеток-мишеней.

Фиг.27

Цитотоксическая активность тестируемого вещества, MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, использованного в исследовании in vivo на яванских макаках, описанном в Примере 15. Специфический лизис MCSP-положительных клеток-мишеней определяли в стандартном анализе высвобождения 51хрома при возрастающих концентрациях MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL. Время анализа составляло 18 часов. Т-клеточную линию 4119LnPx макака использовали в качестве источника эффекторных клеток. Клетки СНО, трансфицированные MCSP яванского макака, служили в качестве клеток-мишеней. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Е:Т-соотношение) составляло 10:1. Концентрацию MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, необходимую для полумаксимального лизиса клеток-мишеней (ЕС50), вычисляли из кривой доза-ответ, и она составляла 1,9 нг/мл.

Фиг.28

Отсутствие начальных эпизодов уменьшения и последующего восстановления абсолютного количества Т-клеток (т.е. перераспределения) в периферической крови яванских макаков во время начальной фазы внутривенной инфузии CD3-связывающей молекулы MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, распознающей по существу независимый от окружения эпитоп CD3. Абсолютные количества клеток приведены в 1000 клеток на микролитр крови. Первая точка на графике показывает исходные количества непосредственно перед началом инфузии. Доза MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL приведена в круглых скобках рядом с номером животного. При известном отсутствии MCSP-положительных клеток-мишеней в циркулирующей крови яванских макаков не наблюдается индукции перераспределения Т-клеток (т.е. начального эпизода уменьшения и последующего восстановления абсолютного количества Т-клеток) вследствие опосредованного клетками-мишенями перекрестного связывания CD3. Кроме того, индукции перераспределения Т-клеток (т.е. начального эпизода уменьшения и последующего восстановления абсолютного количества Т-клеток), вызванной сигналом, который Т-клетки могут получать посредством исключительного взаимодействия только с CD3-связывающим сайтом, можно избежать, используя такие CD3-связывающие молекулы, как MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, распознающие по существу независимый от окружения эпитоп CD3.

Фиг.29

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, трансфицированными CD33 человека, с CD3+ Т-клеточной линией НРВ-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными CD33 макака, и с РВМС макака соответственно. FACS-окрашивание выполнено, как описано в Примере 16.4. Толстые линии означают клетки, инкубированные с очищенной биспецифической одноцепочечной конструкцией в концентрации 5 мкг/мл или с супернатантом клеточной культуры трансфицированных клеток, экспрессирующих конструкции биспецифического антитела с межвидовой специфичностью. Закрашенные гистограммы отображают отрицательные контроли. В качестве отрицательного контроля использовали супернатант нетрансфицированных клеток СНО. Для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции с межвидовой специфичностью совмещенная гистограмма демонстрирует специфическое связывание данной конструкции с CD33 человека и макака и CD3 человека и макака.

Фиг.30

На диаграммах показаны результаты анализов высвобождения хрома, обеспечивающих измерение цитотоксической активности, индуцированной указанными CD33-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. Также указаны использованные эффекторные клетки. Анализы выполнены, как описано в Примере 16.5. Диаграммы четко демонстрируют для каждой показанной конструкции сильное возрастание цитотоксической активности эффекторных клеток человека и макака против клеток СНО, трансфицированных CD33 человека и макака соответственно.

Фиг.31

Мониторинг очистки биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью, обозначенной E292F3 HL x I2C HL, с использованием SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и вестерн-блоттинга. Образцы из элюата, клеточного культурального супернатанта (SN) и проточной фракции колонки (FT) анализировали, как указано. Белковый маркер (М) применяли в качестве эталона масс. Интенсивная белковая зона с молекулярной массой от 50 до 60 кДа в SDS-PAGE демонстрирует эффективную очистку биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью до очень высокой степени чистоты с использованием одностадийного метода очистки, описанного в Примере 17.2. Вестерн-блоттинг с определением гистидин6-метки подтверждает идентичность белковой зоны в элюате как биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью. Слабый сигнал для образца проточной фракции в этом чувствительном методе детекции дополнительно указывает на практически полный захват биспецифических одноцепочечных молекул в результате осуществления этого метода очистки.

Фиг.32

Мониторинг очистки биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью, обозначенной V207C12 HL x H2C HL, с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Образцы из элюата, клеточного культурального супернатанта (SN) и проточной фракции колонки (FT) анализировали, как указано. Белковый маркер (М) применяли в качестве эталона масс. Интенсивная белковая зона с молекулярной массой от 50 до 60 кДа в SDS-PAGE демонстрирует эффективную очистку биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью до очень высокой степени чистоты с использованием одностадийного метода очистки, описанного в Примере 17.2. Вестерн-блоттинг с определением гистидин6-метки подтверждает идентичность белковой зоны в элюате как биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью. Слабый сигнал для образца проточной фракции в этом чувствительном методе детекции дополнительно указывает на практически полный захват биспецифических одноцепочечных молекул в результате осуществления данного метода очистки.

Фиг.33

Мониторинг очистки биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью, обозначенной, AF5HLxF12QHL, с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Образцы из элюата, клеточного культурального супернатанта (SN) и проточной фракции колонки (FT) анализировали, как указано. Белковый маркер (М) применяли в качестве эталона масс. Интенсивная белковая зона с молекулярной массой от 50 до 60 кДа в SDS-PAGE демонстрирует эффективную очистку биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью до очень высокой степени чистоты с использованием одностадийного метода очистки, описанного в Примере 17.2. Вестерн-блоттинг с определением гистидин6-метки подтверждает идентичность белковой зоны в элюате как биспецифической одноцепочечной молекулы с межвидовой специфичностью. Сигнал в образце проточной фракции в этом чувствительном методе детекции объясняется насыщением аффинной колонки вследствие высокой концентрации биспецифических одноцепочечных молекул в супернатанте.

Фиг.34

Стандартная кривая для AF5HLxI2CHL в 50%-ной сыворотке макака. На верхней диаграмме представлена стандартная кривая, полученная в анализе, описанном в Примере 18.2.

На нижней диаграмме представлены результаты для контрольных образцов (QC-образцов) AF5HLxI2CHL в 50%-ной сыворотке макака. Степень обнаружения составляет выше 90% для QC-образца с высокой и средней концентрацией и выше 80% для QC-образца с низкой концентрацией.

Таким образом, данный анализ позволяет определять AF5HLxI2CHL в образцах с сывороткой в диапазоне от 10 нг/мл до 200 нг/мл (перед разведением).

Фиг.35

Стандартная кривая для MCSP-G4 HL x I2C HL в 50%-ной сыворотке макака. На верхней диаграмме представлена стандартная кривая, полученная в анализе, описанном в Примере 18.2.

На нижней диаграмме представлены результаты для QC-образцов MCSP-G4 HL x I2C HL в 50%-ной сыворотке макака. Степень обнаружения составляет выше 98% для QC-образца с высокой и средней концентрацией и выше 85% для QC-образца с низкой концентрацией.

Таким образом, анализ позволяет определять MCSP-G4 HL x I2C HL в образцах с сывороткой в диапазоне от 10 нг/мл до 200 нг/мл (перед разведением).

Фиг.36

FACS-анализ связывания анти-Flag-антитела с клетками СНО, трансфицированными N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон указанных видов, слитыми с ЕрСАМ яванского макака. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 19.1. Толстые линии означают клетки, инкубированные с анти-Flag-антителом. Закрашенные гистограммы отображают отрицательные контроли. В качестве отрицательного контроля использовали PBS с 2% FCS. Гистограммы демонстрируют сильное и сравнимое связывание анти-Flag-антитела со всеми трансфектантами, что указывает на сильную и равную экспрессию трансфицированных конструкций.

Фиг.37

FACS-анализ связывания конструкции I2C IgG1 с клетками СНО, экспрессирующими N-концевые аминокислоты 1-27 CD3-эпсилон указанных видов, слитые с ЕрСАМ яванского макака. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 19.3. Толстые линии означают клетки, инкубированные с 50 мкл клеточного культурального супернатанта клеток, экспрессирующих конструкцию I2C IgG1. Закрашенные гистограммы отображают отрицательный контроль. Клетки, экспрессирующие N-концевые аминокислоты 1-27 CD3-эпсилон свиньи, слитые с ЕрСАМ яванского макака, использовали в качестве отрицательного контроля. В сравнении с отрицательным контролем гистограммы четко демонстрируют связывание конструкции I2C IgG1 с N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон человека, игрунки, тамарина и беличьей обезьяны.

Фиг.38

FACS-анализ связывания конструкции I2C IgG1, как описано в Примере 19.2, с человеческим CD3 с и без N-концевой His6-метки, как описано в Примерах 6.1 и 5.1 соответственно. Толстые линии означают клетки, инкубированные с антителом UCHT-1 против CD3 человека, Penta-His-антителом (Qiagen) и супернатантом культуры клеток, экспрессирующих конструкцию I2C IgG1, соответственно, как указано. Закрашенные гистограммы отображают клетки, инкубированные с нерелевантным мышиным антителом IgG1 в качестве отрицательного контроля.

Две верхние совмещенные гистограммы показывают сравнимое связывание антитела UCHT-1 с обоими трансфектантами по сравнению с изотипическим контролем, демонстрирующим экспрессию обеих рекомбинантных конструкций. Центральные совмещенные гистограммы демонстрируют связывание Penta-His-антитела с клетками, экспрессирующими His-CD3-эпсилон-цепь человека (His6-CD3), но не с клетками, экспрессирующими CD3-эпсилон-цепь дикого типа (WT-CD3). Нижние совмещенные гистограммы демонстрируют связывание конструкции I2C IgG1 с человеческой CD3-эпсилон-цепью дикого типа, но не с His6-CD3-эпсилон-цепью человека. Эти результаты демонстрируют, что присутствие свободного N-конца существенно для связывания анти-CD3-связывающей молекулы I2C с межвидовой специфичностью с CD3-эпсилон-цепью.

Фиг.39

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3 макака, и с Т-клеточной линией 4119LnPx макака соответственно. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 10. Толстые линии означают клетки, инкубированные с очищенной биспецифической одноцепочечной конструкцией в концентрации 2 мкг/мл или клеточным супернатантом, содержащим данную биспецифическую одноцепочечную конструкцию, соответственно. Закрашенные гистограммы отображают отрицательные контроли. Супернатант нетрансфицированных клеток СНО использовали в качестве отрицательного контроля для связывания с Т-клеточными линиями. Одноцепочечную конструкцию с нерелевантной целевой специфичностью использовали в качестве отрицательного контроля для связывания с клетками СНО, трансфицированными MCSP D3. Совмещенная гистограмма для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции с межвидовой специфичностью демонстрирует специфическое связывание данной конструкции с MCSP D3 человека и макака и CD3 человека и макака.

Фиг.40

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными MCSP D3-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. Также использовали эффекторные клетки и отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням, как указано. Анализ выполняли, как описано в Примере 11. Диаграммы четко демонстрируют сильный рекрутмент цитотоксической активности с межвидовой специфичностью под действием каждой конструкции.

Фиг.41

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, трансфицированными CD33 человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными CD33 макака, и с РВМС макака соответственно. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 21.2. Толстые линии означают клетки, инкубированные с клеточным культуральным супернатантом трансфицированных клеток, экспрессирующих конструкции биспецифических антител с межвидовой специфичностью. Закрашенные гистограммы отображают отрицательные контроли. В качестве отрицательного контроля использовали супернатант нетрансфицированных клеток СНО. Совмещенная гистограмма для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции с межвидовой специфичностью демонстрирует специфическое связывание данной конструкции с CD33 человека и макака и CD3 человека и макака.

Фиг.42

На диаграммах представлены результаты анализов высвобождения хрома, обеспечивающих измерение цитотоксической активности, индуцированной указанными CD33-специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. Также указаны использованные эффекторные клетки. Анализы выполняли, как описано в Примере 21.3. Диаграммы четко демонстрируют для каждой конструкции сильный рекрутмент цитотоксической активности эффекторных клеток человека и макака против клеток СНО, трансфицированных CD33 человека и макака соответственно.

Фиг.43

Перераспределение Т-клеток у шимпанзе при еженедельной внутривенной болюсной инфузии PBS/5% HSA и PBS/5% HSA плюс конструкция одноцепочечного EpCAM/CD3 биспецифического антитела в дозах 1,6, 2,0, 3,0 и 4,5 мкг/кг. Продолжительность инфузии для каждого болюсного введения составляла 2 часа. Вертикальные стрелки указывают на начало болюсных инфузии. Точки на графике в момент начала каждого болюсного введения показывают количества Т-клеток непосредственно перед началом болюсной инфузии. Каждая болюсная инфузия конструкции одноцепочечного EpCAM/CD3 биспецифического антитела, которая распознает традиционный зависимый от окружения CD3-эпитоп, инициирует эпизод перераспределения Т-клеток с последующим восстановлением Т-клеток до исходных значений перед следующей болюсной инфузией.

Фиг.44

CD3-специфический ELISA-анализ периплазматических препаратов, содержащих Flag-меченые белковые scFv-фрагменты из отобранных клонов. Периплазматические препараты растворимых белковых scFv-фрагментов добавляли в лунки планшета для ELISA, которые были покрыты растворимым слитым белком человеческая CD3-эпсилон (аа 1-27)-Fc (aa означает аминокислота) и были дополнительно блокированы PBS с 3% BSA. Определение осуществляли, используя моноклональное анти-Flag-биотин-меченое антитело, затем конъюгированный с пероксидазой стрептавидин. ELISA проявляли раствором субстрата ABTS (2,2'-азинобис(3-этилбензотиозолин-6-сульфонат). Значения OD (оптическая плотность) (ось y) измеряли при 405 нм, используя ELISA-ридер. Названия клонов представлены на оси x.

Фиг.45

ELISA-анализ периплазматических препаратов, содержащих Flag-меченые белковые scFv-фрагменты из отобранных клонов. Те же периплазматические препараты растворимых белковых scFv-фрагментов, что и на Фиг.44, добавляли в лунки планшета для ELISA, которые не были покрыты растворимым слитым белком человеческая CD3-эпсилон (аа 1-27)-Fc, но были покрыты IgG1 человека (Sigma) и блокированы 3%-ным BSA в PBS.

Определение осуществляли, используя моноклональное анти-Flag-биотин-меченое антитело, затем конъюгированный с пероксидазой стрептавидин. ELISA проявляли раствором субстрата ABTS. Значения OD (ось y) измеряли при 405 нм, используя ELISA-ридер. Названия клонов представлены на оси x.

Фиг.46

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, трансфицированными PSMA человека, с CD3+ Т-клеточной линией НРВ-ALL человека, с клетками СНО, трансфицированными PSMA макака, и с Т-клеточной линией 4119LnPx макака соответственно. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 24.4. Толстая линия означает клетки, инкубированные с клеточным культуральным супернатантом, которые затем инкубировали с анти-His-антителом и РЕ-меченым детектирующим антителом. Гистограмма, изображенная тонкими линиями, отображает отрицательный контроль: только клетки, инкубированные с анти-His-антителом и детектирующим антителом.

Фиг.47

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными биспецифическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А) и В) Стимулированные CD4/CD56- РВМС человека использованы в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные PSMA человека, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 24.5.

Фиг.48

Цитотоксическая активность, индуцированная указанными биспецифическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. А) и В) Т-клеточная линия 4119LnPx макака использована в качестве эффекторных клеток, и клетки СНО, трансфицированные PSMA макака, использованы в качестве клеток-мишеней. Анализ выполнен, как описано в Примере 24.5.

Фиг.49

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с PSMA-положительной клеточной линией LNCaP рака предстательной железы человека, с CD3+ Т-клеточной линией HPB-ALL человека и с Т-клеточной линией 4119LnPx макака соответственно. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 24.7. Толстые линии означают клетки, инкубированные с клеточным культуральным супернатантом трансфицированных клеток, экспрессирующих конструкции биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью. Закрашенные гистограммы отображают отрицательные контроли. Клеточную культуральную среду использовали в качестве отрицательного контроля. Совмещенные гистограммы для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции с межвидовой специфичностью демонстрируют связывание данной конструкции с PSMA человека и с CD3 человека и макака.

Фиг.50

На диаграммах показаны результаты анализов высвобождения хрома, обеспечивающих измерение цитотоксической активности, индуцированной указанными специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанные клеточные линии-мишени. Также указаны использованные эффекторные клетки. Анализы осуществляли, как описано в Примере 24.8. Диаграммы четко демонстрируют для каждой конструкции сильный рекрутмент цитотоксической активности эффекторных Т-клеток человека и макака против PSMA-положительных клеток рака образцом клеточной линии LNCaP рака предстательной железы человека или клеточной линией 4119LnPx макака.

Фиг.51

FACS-анализ связывания указанных обладающих межвидовой специфичностью биспецифических одноцепочечных конструкций с PSMA-положительными клетками. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 24.7. Совмещенные гистограммы для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции с межвидовой специфичностью демонстрируют связывание данной конструкции с PSMA человека и с CD3 человека и макака.

Фиг.52

На диаграммах показаны результаты анализов высвобождения хрома, обеспечивающих измерение цитотоксической активности, индуцированной указанными специфическими одноцепочечными конструкциями с межвидовой специфичностью, перенаправленными на указанную клеточную линию-мишень. Также указаны использованные эффекторные клетки. Анализы осуществляли, как описано в Примере 24.8. Диаграммы четко демонстрируют для каждой конструкции сильный рекрутмент цитотоксической активности эффекторных Т-клеток человека и макака против PSMA-положительных клеток.

Фиг.53

FACS-анализ связывания указанных биспецифических одноцепочечных конструкций с клетками СНО, экспрессирующими указанные человеческие/крысиные PSMA химеры, как описано в Примере 25.1. FACS-окрашивание выполняли, как описано в Примере 25.2. Жирные линии означают клетки, инкубированные с клеточным культуральным супернатантом трансфицированных клеток, экспрессирующих конструкции биспецифических антител. Закрашенные гистограммы показывают отрицательные контроли. Супернатант нетрансфицированных клеток СНО использовали в качестве отрицательного контроля. Совмещенные гистограммы для каждой биспецифической одноцепочечной конструкции демонстрируют специфическое связывание данной конструкции с химерными конструкциями huPSMArat140-169, huPSMArat191-258, huPSMArat281-284, huPSMArat683-690 и huPSMArat716-750. По сравнению с сигналами, полученными для другой биспецифической одноцепочечной конструкции, имеет место четкое отсутствие связывания конструкций биспецифических одноцепочечных антител PM84-D7 x I2C, PM29-G1 x I2C и РМ49-В9 x I2C с химерной конструкцией huPSMArat300-344. Кроме того, по сравнению с сигналами, полученными для других биспецифических одноцепочечных конструкций, имеет место четкое отсутствие связывания конструкции биспецифического одноцепочечного антитела РМ34-С7 x I2C с конструкцией huPSMArat598-617.

Фиг.54

Связывание scFv MP9076-A9, PSMA-связывающего фрагмента-мишени PSMA BiTE антитела РМ 76-А9 x I2C, с 15-мерными пептидами, перекрывающими внеклеточный домен PSMA человека и перекрывающимися с их соседними пептидами по 14 аминокислотам. Номера пептидов отображены по оси X. ELISA-сигналы с использованием His-детекции отображены по оси Y.

Фиг.55

Связывание scFv MP9076-B10, PSMA-связывающего фрагмента-мишени PSMA BiTE антитела РМ 76-В10 x I2C, с 15-мерными пептидами, перекрывающими внеклеточный домен PSMA человека и перекрывающимися с их соседними пептидами по 14 аминокислотам. Номера пептидов отображены по оси X. ELISA-сигналы с использованием His-детекции отображены по оси Y.

Фиг.56

Связывание scFv F1-A10, PSMA-связывающего фрагмента-мишени PSMA BiTE антитела РМ F1-A10 x I2C, с 15-мерными пептидами, перекрывающими внеклеточный домен PSMA человека и перекрывающимися с их соседними пептидами по 14 аминокислотам. Номера пептидов отображены по оси X. ELISA-сигналы с использованием His-детекции отображены по оси Y.

Фиг.57

Потенциальные доминантные эпитопы scFv МР 9076-А9, МР 9076-В10 и F1-A10. Потенциальные коровые связывающие аминокислоты в трехмерной структуре PSMA человека обведены кружком пунктирной линией. Цветные коды изображают scFv и соответствующие эпитопы. Кристаллическая структура PSMA человека описана в Davis et al., 2005 (PNAS, 102:5981-6).

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется приведенными ниже неограничивающими примерами, которые дают лучшее понимание настоящего изобретения и многих его преимуществ.

ПРИМЕРЫ

1. Идентификация последовательностей CD3-эпсилон из образцов крови приматов, не являющихся человеком

Для идентификации CD3-эпсилон использовали образцы крови следующих приматов, не являющихся человеком: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus и Saimiris ciureus. Для выделения общей клеточной РНК готовили образцы свежей, обработанной гепарином цельной крови в соответствии с протоколом производителя (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). Осуществляли транскрипцию экстрагированной иРНК в кДНК в соответствии с опубликованными протоколами. Кратко, 10 мкл осажденной РНК инкубировали с 1,2 мкл 10-кратной гексануклеотидной смеси (Roche) при 70°С в течение 10 минут и хранили на льду. Добавляли реакционную смесь, содержащую 4 мкл 5-кратного буфера Superscript II, 0,2 мкл 0,1 М дитиотрейтола, 0,8 мкл Superscript II (Invitrogen), 1,2 мкл дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (25 мкМ), 0,8 мкл ингибитора РНКазы (Roche) и 1,8 мкл воды, не содержащей ДНКазу и РНКазу (Roth). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут с последующей инкубацией при 42°С в течение 50 минут и при 90°С в течение 5 минут. Реакционную смесь охлаждали на льду, затем добавляли 0,8 мкл РНКазы Н (1 ед./мкл, Roche) и инкубировали в течение 20 минут при 37°С.

кДНК первой цепи из каждого образца подвергали 35 отдельным циклам полимеразной цепной реакции, используя ДНК-полимеразу Taq (Sigma) и следующую комбинацию праймеров, сконструированную на основании изучения базы данных: прямой праймер 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3' (SEQ ID NO:253); обратный праймер 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3' (SEQ ID NO:254). Амплифицированные зоны 550 пар оснований (п.о.) выделяли из геля (Gel Extraction Kit, Qiagen) и секвенировали (Sequiserve, Vaterstetten/Germany, смотри перечень последовательностей).

CD3-эпсилон Callithrix jacchus

Нуклеотиды

Аминокислоты (SEQ ID NO:3)

CD3-эпсилон Saguinus oedipus

Нуклеотиды

Аминокислоты (SEQ ID NO:5)

CD3-эпсилон Saimiris ciureus

Нуклеотиды

Аминокислоты (SEQ ID NO:7)

2. Создание фрагментов (scFv) одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, связывающихся с N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон человека и разных приматов, не являющихся шимпанзе

2.1. Иммунизация мышей с использованием N-конца CD3-эпсилон, выделенного из его нативного CD3-окружения посредством слияния с гетерологичным растворимым белком

Мышей F1 от скрещиваний balb/c x C57black в возрасте десяти недель иммунизировали слитым белком CD3-эпсилон-Fc, несущим большую часть N-концевых аминокислот 1-27 зрелой CD3-эпсилон-цепи (1-27 CD3-Fc) человека и/или беличьей обезьяны. Для этого 40 мкг слитого белка 1-27 CD3-Fc вместе с 10 нмоль тиоат-модифицированного CpG-олигонуклеотида (5'-tccatgacgttcctgatgct-3') (SEQ ID NO:343) в 300 мкл PBS на одну мышь инъецировали интраперитонеально. Мыши получали бустерные иммунизации через 21, 42 и возможно 63 суток тем же способом. Через десять суток после первой бустерной иммунизации брали образцы крови, и титр антител в сыворотке против слитого белка 1-27 CD3-Fc тестировали методом ELISA. Дополнительно тестировали титр против CD3-положительной Т-клеточной линии HPBaII человека методом проточной цитометрии согласно стандартным протоколам. Сывороточные титры у иммунизированных животных были значительно выше, чем у неиммунизированных животных.

2.2. Создание иммунной библиотеки scFv мышиных антител: конструирование комбинаторной библиотеки антител и фаговый дисплей

Через трое суток после последней инъекции клетки селезенки мышей собирали для получения общей РНК согласно стандартным протоколам.

Посредством ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) на РНК селезенки мышей с использованием VK- и VH-специфических праймеров конструировали библиотеку ДНК-фрагментов вариабельной области легкой цепи (каппа) (VK) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) иммуноглобулинов (Ig) мыши. кДНК синтезировали согласно стандартным протоколам.

Праймеры конструировали таким образом, чтобы создать сайт распознавания для 5'-Xhol и 3'-BstEII для амплифицированных V-фрагментов тяжелой цепи и сайт распознавания для 5'-Sacl и 3'-Spel для амплифицированных VK-фрагментов ДНК.

Для ПЦР-амплификации ДНК-фрагментов VH каждый из восьми разных праймеров, специфичных к 5'-VH-семейству (MVH1(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT (SEQ ID NO:344); MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT (SEQ ID NO:345); MVH3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT (SEQ ID NO:346); MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA (SEQ ID NO:347); MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA (SEQ ID NO:348); MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT (SEQ ID NO:349); MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA (SEQ ID NO:350); MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT (SEQ ID NO:351)), объединяли с одним 3'-VH-праймером (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g (SEQ ID NO:352)); для ПЦР-амплификации фрагментов VK-цепи каждый из семи разных праймеров, специфичных к 5'-VK-семейству (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG ААТ СТ (SEQ ID NO:353); MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC (SEQ ID NO:354); MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA (SEQ ID NO:355); MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA (SEQ ID NO:356); MUVK5 CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA (SEQ ID NO:357); MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA (SEQ ID NO:358); MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA (SEQ ID NO:359)), объединяли с одним 3'-VK-праймером (3'MuVkHindIII/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc (SEQ ID NO:360)).

Для амплификации использовали следующую ПЦР-программу: денатурация при 94°С в течение 20 с; отжиг праймеров при 52°С в течение 50 с и удлинение праймеров при 72°С в течение 60 с; и 40 циклов, затем окончательное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

450 нг фрагментов легкой цепи каппа (расщепленных Sacl-Spel) лигировали с использованием 1400 нг фагмиды pComb3H5Bnis (расщепленной Sacl-Spel; большой фрагмент). Полученную комбинаторную библиотеку антител затем подвергали трансформации в 300 мкл электрокомпетентных клеток Escherichia coli XL1 Blue посредством электропорации (2,5 кВ; кювета со щелью 0,2 см; 25 мкФ; 200 Ом, Biorad gene-pulser) с получением в результате библиотеки размером более 107 независимых клонов. Через один час фенотипической экспрессии отбирали положительные трансформанты по устойчивости к карбенициллину, кодируемой вектором pComb3H5BHis, в 100 мл жидкой супербульонной (SB) культуры в течение ночи. Затем клетки собирали центрифугированием и плазмиду получали, используя имеющийся в продаже набор для получения плазмид (Qiagen).

2800 нг этой плазмидной ДНК, содержащей VK-библиотеку (расщепленную Xhol-BstEII; большой фрагмент), лигировали с 900 нг V-фрагментов тяжелой цепи (расщепленных Xhol-BstEII) и снова подвергали трансформации в две аликвоты по 300 мкл электрокомпетентных клеток Е.coli XL1 Blue посредством электропорации (2,5 кВ; кювета со щелью 0,2 см; 25 мкФ, 200 Ом) с получением библиотеки VH-VK scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент) общим размером более 107 независимых клонов.

После фенотипической экспрессии и медленной адаптации к карбенициллину клетки Е.coli, содержащие библиотеку антител, переносили в SB-карбенициллин(50 мкг/мл)-селективную среду. Клетки Е.coli, содержащие библиотеку антител, затем инфицировали инфекционной дозой 1012 частиц хелперного фага VCSM13, приводящей к продуцированию и секреции нитевидного фага М13, где фаговая частица содержит одноцепочечную pComb3H5BHis-ДНК, кодирующую мышиный scFv-фрагмент, и экспонировала соответствующий scFv-белок в виде трансляционного слияния с оболочечным белком III фага. Этот пул фагов, экспонирующих библиотеку антител, затем использовали для селекции антигенсвязывающих структур.

2.3. Селекция CD3-специфических связывающих фрагментов на основе фагового дисплея

Фаговую библиотеку, несущую клонированный scFv-репертуар, собирали из соответствующего культурального супернатанта посредством осаждения с помощью PEG8000/NaCl и центрифугирования. Приблизительно от 1011 до 1012 scFv-фаговых частиц ресуспендировали в 0,4 мл PBS/0,1% BSA и инкубировали с 105-107 клеток Jurkat (CD3-положительная линия Т-клеток человека) в течение 1 часа на льду при медленном перемешивании. Эти клетки Jurkat выращивали заранее в среде RPMI, обогащенной фетальной телячьей сывороткой (FCS) (10%), глутамином и пенициллином/стрептомицином, собирали центрифугированием, промывали в PBS и ресуспендировали в PBS/1% FCS (содержащей азид натрия). scFv-несущие фаги, которые не связывались специфически с клетками Jurkat, удаляли путем проведения до пяти стадий промывки PBS/1% FCS (содержащей азид натрия). После промывки связавшиеся структуры элюировали с клеток путем ресуспендирования клеток в HCl-глициновом буфере, рН 2,2 (10-минутная инкубация с последующим интенсивным перемешиванием), и после нейтрализации 2 М раствором Tris рН 12 элюат использовали для инфицирования свежей неинфицированной культуры Е.coli XL1 Blue (OD600 больше 0,5). Культуру Е.coli, содержащую клетки Е.coli, подвергнутые успешной трансдукции фагмидной копией, кодирующей человеческий scFv-фрагмент, снова подвергали селекции на устойчивость к карбенициллину и затем инфицировали хелперным фагом VCMS 13, чтобы начать второй раунд экспонирования антител и селекции in vitro. Обычно осуществляли суммарно от 4 до 5 циклов селекции.

2.4. Скрининг CD3-специфических связывающих фрагментов

Плазмидную ДНК, соответствующую 4-5 раундам пэннинга, выделяли из культур Е.coli после селекции. Для получения растворимого scFv-белка, фрагменты VH-VL-ДНК вырезали из плазмид (Xhol-Spel). Эти фрагменты клонировали через те же сайты рестрикции в плазмиду pComb3H5BFlag/His, отличающуюся от исходной pComb3H5BHis тем, что экспрессионная конструкция (например, scFv) включает в себя Flag-метку (TGD YKDDDDK) между scFv и His6-меткой, и дополнительные фаговые белки удалены. После лигирования каждый пул (разные раунды пэннинга) плазмидной ДНК подвергали трансформации в 100 мкл компетентных к температурному шоку Е.coli TG1 или XLI blue и высевали на карбенициллин-LB-агар. Одиночные колонии отбирали и переносили в 100 мкл LB-карб (50 мкг/мл).

Е.coli, трансформированные pComb3H5BHis, содержащей VL- и VH-сегмент, продуцируют растворимый scFv в значительных количествах после вырезания фрагмента гена III и индукции с использованием 1 мМ IPTG (изопропилтиогалактопиранозид). Благодаря подходящей сигнальной последовательности scFv-цепь экспортируется в периплазму, где она сворачивается в функциональную конформацию.

Одиночные бактериальные колонии Е.coli TG1 отбирали с чашек для трансформации для получения небольших количеств периплазмы и выращивали на SB-среде (например, 10 мл), дополненной 20 мМ MgCl2 и карбенициллином (50 мкг/мл), и ресуспендировали в PBS (например, 1 мл) после сбора. В результате четырех циклов замораживания при -70°С и оттаивания при 37°С наружная мембрана бактерий разрушалась под действием температурного шока, и растворимые периплазматические белки, включая scFv, высвобождались в супернатант. После удаления центрифугированием интактных клеток и клеточного дебриса собирали супернатант, содержащий scFv человека против CD3 человека, и использовали для дальнейшего исследования.

2.5. Идентификация CD3-специфических связывающих фрагментов

Связывание выделенных scFv тестировали методом проточной цитометрии на эукариотических клетках, экспрессирующих на своей поверхности гетерологичный белок, экспонирующий на своем N-конце первые 27 N-концевых аминокислот CD3-эпсилон.

Как описано в Примере 4, первые аминокислоты 1-27 N-концевой последовательности зрелой CD3-эпсилон-цепи Т-клеточного рецепторного комплекса человека (аминокислотная последовательность: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT SEQ ID NO:2) подвергали слиянию с N-концом трансмембранного белка ЕрСАМ таким образом, чтобы N-конец был расположен на наружной поверхности клетки. Кроме этого, между N-концевой 1-27 последовательностью CD3-эпсилон и последовательностью ЕрСАМ встраивали FLAG-эпитоп. Этот продукт слияния экспрессировали в клетках почки человеческого эмбриона (HEK) и клетках яичника китайского хомячка (СНО).

Эукариотические клетки, экспонирующие ббльшую часть 27 N-концевых аминокислот зрелой CD3-эпсилон других видов приматов, получали таким же образом для Saimiri sciureus (N-концевая аминокислотная последовательность CD3-эпсилон: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO:8), для Callithrix jacchus (CD3-эпсилон N-концевая аминокислотная последовательность: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO:4) и для Saguinus oedipus (CD3-эпсилон N-концевая аминокислотная последовательность: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT SEQ ID NO:6).

Для анализа методом проточной цитометрии 2,5×105 клеток инкубировали с 50 мкл супернатанта или с 5 мкг/мл очищенных конструкций в 50 мкл PBS с 2% FCS. Связывание конструкций определяли с использованием анти-His-антитела (Penta-His-антитело, не содержащее BSA, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) в концентрации 2 мкг/мл в 50 мкл PBS с 2% FCS. В качестве реагента для второй стадии использовали конъюгированный с R-фикоэритрином, аффинно очищенный F(ab')2-фрагмент антитела козы против IgG мыши (специфичный к Fc-гамма-фрагменту), разведенный в соотношении 1:100 в 50 мкл PBS с 2% FCS (Dianova, Hamburg, FRG). Образцы измеряли на FACSscan (BD biosciences, Heidelberg, FRG).

Связывание неизменно подтверждали методом проточной цитометрии, как описано в предыдущем абзаце, на первичных Т-клетках человека и разных приматов (например, Saimiri sciureus, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus).

2.6. Создание человеческих/гуманизированных эквивалентов CD3-эпсилон-специфических scFv не человека

VH-область мышиного анти-CD3 scFv выравнивали относительно аминокислотных последовательностей антитела зародышевой линии человека. Выбирали VH-последовательность антитела зародышевой линии человека, которая имела наибольшую гомологию с VH не человека, и выполняли прямое выравнивание данных двух аминокислотных последовательностей. Имелся ряд каркасных остатков для VH не человека, которые отличались от каркасных областей VH человека ("разные положения в каркасе"). Некоторые из этих остатков могут участвовать в связывании антитела с его мишенью и активности антитела в отношении его мишени.

Для конструирования библиотеки, которая содержит мышиные CDR и в каждом положении каркаса отличается от обоих вариантов выбранной человеческой VH-последовательности ("человеческий" и материнский "мышиный" аминокислотный остаток), синтезировали вырожденные олигонуклеотиды. В состав этих олигонуклеотидов входит в разных положениях "человеческий" остаток с вероятностью 75% и "мышиный остаток" с вероятностью 25%. Для одной человеческой VH, например, необходимо было синтезировать шесть таких олигонуклеотидов, которые перекрываются в концевом участке из приблизительно 20 нуклеотидов. Для этого каждый второй праймер представлял собой антисмысловой праймер. Сайты рестрикции, необходимые для последующего тонирования в пределах олигонуклеотидов, удаляли.

Эти праймеры могут иметь длину от 60 до 90 нуклеотидов в зависимости от количества праймеров, которые необходимы для перекрывания по всей V-последовательности.

Эти праймеры, например шесть праймеров, смешивали в равных количествах (например, 1 мкл каждого праймера (исходный раствор праймера: 20-100 мкМ) с 20 мкл реакционной смеси ПЦР) и добавляли к ПЦР-смеси, состоящей из ПЦР-буфера, нуклеотидов и Taq-полимеразы. Эту смесь инкубировали при 94°С в течение 3 минут, при 65°С в течение 1 минуты, при 62°С в течение 1 минуты, при 59°С в течение 1 минуты, при 56°С в течение 1 минуты, при 52°С в течение 1 минуты, при 50°С в течение 1 минуты и при 72°С в течение 10 минут в ПЦР-циклере. После этого продукт подвергали электрофорезу в агарозном геле и продукт размером от 200 до 400 выделяли из геля согласно стандартным методам.

Этот продукт ПЦР затем использовали в качестве матрицы для стандартной ПЦР-реакции с использованием праймеров, которые вводят подходящие для клонирования N-концевые и С-концевые сайты рестрикции. Фрагмент ДНК правильного размера (для VH приблизительно 350 нуклеотидов) выделяли электрофорезом в агарозном геле согласно стандартным методам. Таким способом был амплифицирован достаточный ДНК-фрагмент VH. Этот VH-фрагмент теперь представлял собой пул VH-фрагментов, каждый из которых имел разное количество "человеческих" и "мышиных" остатков в соответствующих отличающихся положениях в каркасе (пул гуманизированных VH). Аналогичную процедуру осуществляли для VL-области мышиного анти-CD3 scFv (пул гуманизированных VL).

Пул гуманизированных VH затем объединяли с пулом гуманизированных VL в векторе для фагового дисплея pComb3H5Bhis для формирования библиотеки функциональных scFv, из которой после дисплея с использованием нитевидного фага отбирали анти-CD3-связывающие фрагменты, производили скрининг, идентифицировали и подтверждали, как описано выше для родительских не человеческих (мышиных) анти-CD3 scFv. Одиночные клоны затем анализировали на наличие подходящих свойств и аминокислотной последовательности. Те scFv, аминокислотная последовательность которых имеет наибольшую гомологию с V-сегментами зародышевой линии человека, являются предпочтительными, в частности те из них, в которых по меньшей мере один CDR среди CDR I и II VH и CDR I и II VL-каппа или CDR I и II VL-лямбда демонстрируют более чем 80%-ную идентичность аминокислотной последовательности с наиболее близким соответствующим CDR из всех V-сегментов зародышевой линии человека. Анти-CD3 scFv превращали в рекомбинантные биспецифические одноцепочечные антитела, как описано в приведенных ниже примерах 9,16 и 24.

3. Создание рекомбинантного слитого белка, состоящего из N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, слитой с Fc-областью IgG1 (1-27 CD3-Fc)

3.1. Клонирование и экспрессия 1-27 CD3-Fc

Кодирующую последовательность N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, слитой с шарнирной областью и Fc-гамма-участком человеческого иммуноглобулина IgG1, а также с состоящей из 6 гистидиновых остатков меткой, получали генным синтезом согласно стандартным протоколам (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность рекомбинантного слитого белка представлены в SEQ ID NO:230 и 229). Фрагмент генного синтеза конструировали таким образом, чтобы он содержал сначала сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции, затем иммуноглобулиновый лидерный пептид из 19 аминокислот, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность первых 27 аминокислот внеклеточного участка зрелой CD3-эпсилон-цепи человека, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность шарнирной области и Fc-гамма-участка человеческого IgG1, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность состоящей из 6 гистидиновых остатков метки и стоп-кодон (Фиг.1). Фрагмент генного синтеза конструировали также таким образом, чтобы ввести сайты рестрикции в начало и в конец кДНК, кодирующей данный слитый белок. Введенные сайты рестрикции, EcoRI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. Фрагмент генного синтеза клонировали через EcoRI и Sall в плазмиду, обозначенную pEF-DHFR (pEF-DHFR описана в Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025, и в Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150), следуя стандартным протоколам. Плазмиду с подтвержденной последовательностью использовали для трансфекции в экспрессирующей системе FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Через 3 суток собирали супернатанты клеточных культур трансфектантов и тестировали их методом ELISA на присутствие рекомбинантной конструкции. Специфичное к Fc-гамма-фрагменту IgG человека антитело козы (полученное от Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK) разводили в PBS до концентрации 5 мкг/мл и наносили по 100 мкл/лунку на 96-луночный планшет MaxiSorp для ELISA (Nunc GmbH & Со. KG, Wiesbaden, Germany) в течение ночи при 4°С. Лунки промывали PBS с 0,05% Tween 20 (PBS/Tween) и блокировали 3%-ным BSA в PBS (бычий альбумин, фракция V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) в течение 60 минут при комнатной температуре (КТ). После этого лунки снова промывали PBS/Tween и затем инкубировали с клеточными культуральными супернатантами в течение 60 минут при КТ. После промывки лунок проводили инкубацию с анти-His-антителом, конъюгированным с пероксидазой (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Germany), разведенным в соотношении 1:500 в PBS с 1% BSA, в течение 60 минут при КТ. Затем лунки промывали 200 мкл PBS/Tween и добавляли 100 мкл раствора субстрата SIGMAFAST OPD (SIGMAFAST OPD [дигидрохлорид о-фенилендиамина]) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М H2SO4. Цветную реакцию измеряли на спектрофотометре для микропланшетов PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) при 490 нм с вычитанием фонового поглощения при 620 нм. Как показано на Фиг.2, присутствие конструкции по сравнению с нерелевантным супернатантом мнимо транфицированных клеток НЕК 293, использованных в качестве отрицательного контроля, четко определялось.

3.2. Анализ связывания одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью с 1-27 CD3-Fc

Связывание неочищенных препаратов экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, специфичных к CD3-эпсилон, с 1-27 CD3-Fc тестировали в ELISA-анализе. Козье антитело против IgG человека, специфичное к Fc-гамма-фрагменту (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK), разводили в PBS до концентрации 5 мкг/мл и наносили по 100 мкл/лунку на 96-луночный планшет для ELISA MaxiSorp (Nunc GmbH & Со. KG, Wiesbaden, Germany) в течение ночи при 4°С. Лунки промывали PBS с 0,05% Tween 20 (PBS/Tween) и блокировали PBS с 3% BSA (бычий альбумин, фракция V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) в течение 60 минут при КТ. После этого лунки промывали PBS/Tween и проводили инкубацию с супернатантами клеток, экспрессирующих конструкцию 1-27 CD3-Fc, в течение 60 минут при КТ. Лунки промывали PBS/Tween и проводили инкубацию с неочищенными препаратами экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, как описано выше, в течение 60 минут при комнатной температуре. После промывки PBS/Tween лунки инкубировали с анти-Flag М2-антителом, конъюгированным с пероксидазой (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany), разведенным в соотношении 1:10000 в PBS с 1% BSA, в течение 60 минут при КТ. Лунки промывали PBS/Tween и инкубировали со 100 мкл раствора субстрата SIGMAFAST OPD (OPD [дигидрохлорид о-фенилендиамина]) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Цветную реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 М H2SO4 и выполняли измерения на спектрофотометре для микропланшетов PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) при 490 нм с вычитанием фонового поглощения при 620 нм. Наблюдалось сильное связывание человеческих одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, специфичных к CD3-эпсилон, с конструкцией 1-27 CD3-Fc no сравнению с мышиным анти-CD3 одноцепочечным антителом (Фиг.3).

4. Создание рекомбинантных трансмембранных слитых белков, состоящих из N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон разных приматов, не являющихся шимпанзе, слитых с ЕрСАМ яванского макака (1-27 CD3-EpCAM)

4.1. Клонирование и экспрессия 1-27 CD3-EpCAM

CD3-эпсилон выделяли из разных приматов, не являющихся шимпанзе (игрунки, тамарина, беличьей обезьяны), и свиньи. Кодирующие последовательности N-концевых аминокислот 1-27 зрелой CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки (Callithrix jacchus), эдипова тамарина (Saguinus oedipus), беличьей обезьяны (Saimiri sciureus) и домашней свиньи (Sus scrofa; используемой в качестве отрицательного контроля), слитые с N-концом Flag-меченой ЕрСАМ яванского макака, получали генным синтезом согласно стандартным протоколам (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность рекомбинантных слитых белков представлены в SEQ ID NO:231-240). Фрагменты генного синтеза конструировали таким образом, чтобы они содержали сначала сайт BsrGI для обеспечения слияния в правильной рамке считывания с кодирующей последовательностью иммуноглобулинового лидерного пептида из 19 аминокислот, уже присутствующего в целевом экспрессирующем векторе, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность N-концевых аминокислот 1-27 внеклеточного участка зрелых CD3-эпсилон-цепей, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность Flag-метки и затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность зрелого трансмембранного белка ЕрСАМ яванского макака (Фиг.4). Фрагменты генного синтеза конструировали также таким образом, чтобы ввести сайт рестрикции в конец кДНК, кодирующей данный слитый белок. Введенные сайты рестрикции, BsrGI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. Фрагменты генного синтеза затем клонировали через BsrGI и Sall, следуя стандартным протоколам, в производное плазмиды, обозначенной pEF DHFR (pEF-DHFR описана в Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), которая уже содержала кодирующую последовательность иммуноглобулинового лидерного пептида из 19 аминокислот. Плазмиды с подтвержденной последовательностью использовали для временной трансфекции клеток 293-HEK с использованием реагента MATra-A (IBA GmbH, Gottingen, Germany) и 12 мкг плазмидной ДНК для прикрепленных клеток 293-HEK во флаконах для клеточных культур емкостью 175 мл в соответствии с протоколом производителя. Через 3 суток культивирования клеток трансфектанты тестировали в отношении экспрессии на клеточной поверхности рекомбинантного трансмембранного белка FACS-анализом согласно стандартным протоколам. С этой целью 2,5×105 клеток инкубировали с анти-Flag М2-антителом (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) в концентрации 5 мкг/мл в PBS с 2% FCS. Связавшееся антитело детектировали с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши, специфичного к Fc-гамма-фрагменту, разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACScaIibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). Экспрессия Flag-меченых рекомбинантных трансмембранных слитых белков, состоящих из ЕрСАМ яванского макака и N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки, тамарина, беличьей обезьяны и свиньи соответственно четко определялась на трансфицированных клетках (Фиг.5).

4.2. Связывание одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью с 1-27 CD3-EpCAM

Связывание неочищенных препаратов экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью с N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон-цепей человека, игрунки, тамарина и беличьей обезьяны соответственно, слитых с ЕрСАМ яванского макака, тестировали в FACS-анализе согласно стандартным протоколам. С этой целью 2,5×105 клеток инкубировали с неочищенными препаратами экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью (получение осуществляли как описано выше и согласно стандартным протоколам) и одноцепочечным мышиным антителом против CD3 человека в качестве отрицательного контроля. В качестве вторичного антитела использовали Penta-His-антитело (Qiagen GmbH, Hildesheim, Germany) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкл PBS с 2% FCS. Связывание антитела определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши, специфичного к Fc-гамма-фрагменту, разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACScalibur (BD biosciences. Heidelberg, Germany). Как показано на Фиг.6 (А-Е), наблюдалось связывание одноцепочечных антител с трансфектантами, экспрессирующими рекомбинантные трансмембранные слитые белки, состоящие из N-концевых аминокислот 1-27 CD3-эпсилон-цепи человека, игрунки, тамарина или беличьей обезьяны, слитой с ЕрСАМ яванского макака. Никакого связывания одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью со слитым белком, состоящим из 1-27 N-концевых аминокислот CD3-эпсилон-цепи свиньи, слитой с ЕрСАМ яванского макака, который использовали в качестве отрицательного контроля, не наблюдалось. Была продемонстрирована межвидовая специфичность одноцепочечных анти-CD3-антител в отношении многих приматов. Сигналы, полученные с использованием анти-Flag М2-антитела и одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, были соизмеримыми, что указывает на высокую активность связывания одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью с N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон.

5. Анализ связывания одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью путем аланинового сканирования мышиных клеток, трансфицированных CD3-эпсилон-цепью человека и ее аланиновыми мутантами

5.1. Клонирование и экспрессия CD3-эпсилон человека, дикого типа

Кодирующую последовательность CD3-эпсилон-цепи человека получали генным синтезом согласно стандартным протоколам (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность CD3-эпсилон-цепи человека представлены в SEQ ID NO:242 и 241). Фрагмент генного синтеза конструировали таким образом, чтобы он содержал сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции и сайты рестрикции в начале и в конце кДНК, кодирующей CD3-эпсилон человека. Введенные сайты рестрикции, EcoRI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. Фрагмент генного синтеза затем клонировали через EcoRI и Sall в плазмиду, обозначенную pEF NEO, следуя стандартным протоколам. pEF NEO была получена из pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) в результате замены кДНК DHFR на кДНК (гена) устойчивости к неомицину путем традиционного молекулярного клонирования. Плазмиду с подтвержденной последовательностью использовали для трансфекции мышиной Т-клеточной линии EL4 (АТСС № TIB-39), культивированной в среде RPMI со стабилизирующей добавкой L-глутамина, дополненной 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота), 1% пирувата, 1% заменимых аминокислот (все Biochrom AG Berlin, Germany), при 37°С, влажности 95% и 7% CO2. Трансфекцию осуществляли с использованием реагента для трансфекции SuperFect (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) и 2 мкг плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. Через 24 часа клетки промывали PBS и снова культивировали в вышеупомянутой среде для культивирования клеток с 600 мкг/мл G418 для селекции (РАА Laboratories GmbH, Pasching, Austria). Через 16-20 суток после трансфекции наблюдался рост устойчивых клеток. Еще через 7-14 суток клетки тестировали в отношении экспрессии CD3-эпсилон человека FACS-анализом согласно стандартным протоколам. 2,5×105 клеток инкубировали с антителом UCHT-1 против CD3 человека (BD biosciences, Heidelberg, Germany) в концентрации 5 мкг/мл в PBS с 2% FCS. Связывание антитела определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши (специфичного к Fc-гамма-фрагменту), разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). Экспрессия человеческой CD3-эпсилон-цепи дикого типа в трансфицированных клетках EL4 показана на Фиг.7.

5.2. Клонирование и экспрессия одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью в виде IgG1-антител

С целью создания улучшенных средств определения связывания одноцепочечных анти-CD3-антител с межвидовой специфичностью Н2С HLP. A2J HLP и Е2М HLP превращали в IgG1-антитела с мышиными IgG1 и человеческими константными областями лямбда. Последовательности кДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи соответствующих IgG-антител, получали генным синтезом согласно стандартным протоколам. Фрагменты генного синтеза для каждой специфичности конструировали таким образом, чтобы они содержали сначала сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции, затем иммуноглобулиновый лидерный пептид из 19 аминокислот (SEQ ID NO:244 и 243), затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность соответствующей вариабельной области тяжелой цепи или соответствующей вариабельной области легкой цепи, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность константной области тяжелой цепи мышиного IgG1 (SEQ ID NO:246 и 245) или кодирующую последовательность константной области легкой цепи лямбда человека (SEQ ID NO:248 и 247) соответственно. Сайты рестрикции вводили в начало и в конец кДНК, кодирующей данный слитый белок. Сайты рестрикции, EcoRI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали для последующих процедур клонирования. Фрагменты генного синтеза клонировали через EcoRI и Sall в плазмиду, обозначенную pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) для конструкций тяжелой цепи, и pEF ADA (pEF ADA описана в Raum et al., Cancer Immunol. Immunother., 50(3), (2001), 141-50) для конструкций легкой цепи согласно стандартным протоколам. Плазмиды с подтвержденными последовательностями использовали для котрансфекции соответствующих конструкций легкой и тяжелой цепей в экспрессирующей системе FreeStyle 293 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Через 3 суток клеточные культуральные супернатанты трансфектантов собирали и использовали для эксперимента по аланиновому сканированию.

5.3. Клонирование и экспрессия аланиновых мутантов CD3-эпсилон человека для аланинового сканирования

27 фрагментов кДНК, кодирующих CD3-эпсилон-цепь человека, с заменой одного кодона в последовательности дикого типа CD3-эпсилон человека на кодон, кодирующий аланин (GCC), для каждой аминокислоты из аминокислот 1-27 внеклеточного домена зрелой CD3-эпсилон-цепи человека соответственно, получали генным синтезом. За исключением замененного кодона фрагменты кДНК были идентичны вышеупомянутому фрагменту кДНК человеческого CD3 дикого типа. Только один кодон был заменен в каждой конструкции по сравнению с описанным выше фрагментом кДНК человеческого CD3 дикого типа. Сайты рестрикции EcoRI и Sall были введены во фрагменты кДНК в положения, идентичные конструкции дикого типа. Все сканируемые по аланину конструкции клонировали в pEF NEO, и плазмиды с подтвержденной последовательностью трансфицировали в клетки EL4. Трансфекцию и селекцию трансфектантов осуществляли, как описано выше. В результате получили панель экспрессируемых конструкций, в которых первая аминокислота CD3-эпсилон-цепи человека, глутамин (Q, Gln) в положении 1, была заменена на аланин. Последней аминокислотой, замененной на аланин, был треонин (Т, Thr) в положении 27 зрелой CD3-эпсилон-цепи дикого типа человека. Для каждой аминокислоты между глутамином 1 и треонином 27 соответственно были получены трансфектанты с заменой аминокислоты дикого типа на аланин.

5.4. Эксперимент по аланиновому сканированию

Химерные IgG-антитела, описанные в пункте 5.2, и одноцепочечные антитела с межвидовой специфичностью, специфичные к CD3-эпсилон, тестировали в эксперименте по аланиновому сканированию. Связывание антител с клеточными линиями EL4, трансфицированными мутантными по аланину конструкциями CD3-эпсилон человека, описанными в пункте 5.3, тестировали FACS-анализом согласно стандартным протоколам. 2,5×105 клеток соответствующих трансфектантов инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта, содержащего химерные IgG-антитела, или с 50 мкл неочищенных препаратов экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных антител. Для образцов, инкубированных с неочищенными препаратами экспрессирующихся в периплазму одноцепочечных антител, анти-Flag М2-антитело (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) использовали в качестве вторичного антитела в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкл PBS с 2% FCS. Для образцов, инкубированных с химерными IgG-антителами, необходимости во вторичном антителе не было. Для всех образцов связывание молекул антител определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши (специфичного к Fc-гамма-фрагменту), разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). Определяли дифференциальное связывание химерных IgG-молекул или одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью с клеточными линиями EL4, трансфицированными аланиновыми мутантами CD3-эпсилон человека. В качестве отрицательного контроля использовали либо изотипический контроль, либо неочищенный препарат экспрессирующегося в периплазму одноцепочечного антитела нерелевантной специфичности соответственно. Антитело UCHT-1 использовали в качестве положительного контроля уровня экспрессии аланиновых мутантов CD3-эпсилон человека. Клеточные линии EL4, трансфицированные аланиновыми мутантами аминокислот тирозина в положении 15, валина в положении 17, изолейцина в положении 19, валина в положении 24 или лейцина в положении 26 зрелой CD3-эпсилон-цепи, не оценивали из-за очень низких уровней экспрессии (данные не показаны). Связывание одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью и одноцепочечных антител в формате химерных IgG с клеточными линиями EL4, трансфицированными аланиновыми мутантами CD3-эпсилон человека, показано на Фиг.8 (A-D) в виде относительного связывания в условных единицах со средними геометрическими значениями флуоресценции соответствующих отрицательных контролей, вычтенными из всех соответствующих средних геометрических величин флуоресценции для образцов. Для компенсации различных уровней экспрессии все значения для образцов для конкретного трансфектанта затем делили на среднее геометрическое значение флуоресценции антитела UCHT-1 для соответствующего трансфектанта. Для сравнения со значением специфичности для образца дикого типа все значения соответствующих специфичностей для образцов окончательно делили на значение для образца дикого типа, при этом значение для образца дикого типа было принято за 1 условную единицу связывания.

Использованные вычисления конкретно показаны в следующей формуле:

v a l u e _ S a m p l e ( x , y ) = S a m p l e ( x , y ) n e g _ C o n t r . ( x ) ( U C H T 1 ( x ) n e g _ C o n t r . ( x ) ) * W T ( y ) n e g _ C o n t r . ( w t ) U C H T 1 ( w t ) n e g _ C o n t r . ( w t )

В этом уравнении value_Sample означает значение связывания в условных единицах, представляющее собой степень связывания специфического анти-CD3-антитела со специфическим аланиновым мутантом, как показано на Фиг.8 (A-D); Sample означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для специфического анти-CD3-антитела, проанализированного на специфическом аланин-сканирующем трансфектанте; neg_Contr. означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для отрицательного контроля, проанализированного на специфическом аланиновом мутанте; UCHT-1 означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для антитела UCHT-1, проанализированного на специфическом аланиновом мутанте; WT означает среднее геометрическое значение флуоресценции, полученное для специфического анти-CD3-антитела, проанализированного на трансфектанте дикого типа; x задает соответствующий трансфектант; y задает соответствующее анти-CD3-антитело, и wt указывает на то, что соответствующий трансфектант относится к дикому типу.

Как можно видеть из Фиг.8 (A-D), IgG-антитело A2J HLP продемонстрировало ярко выраженную потерю связывания для следующих аминокислот: аспарагин в положении 4, треонин в положении 23 и изолейцин в положении 25 зрелой CD3-эпсилон-цепи. Полная потеря связывания IgG-антитела A2J HLP наблюдалась для следующих аминокислот: глутамин в положении 1, аспартат в положении 2, глицин в положении 3 и глутамат в положении 5 зрелой CD3-эпсилон-цепи. IgG-антитело Е2М HLP продемонстрировало ярко выраженную потерю связывания для следующих аминокислот: аспарагин в положении 4, треонин в положении 23 и изолейцин в положении 25 зрелой CD3-эпсилон-цепи. IgG-антитело Е2М HLP продемонстрировало полную потерю связывания следующих аминокислот: глутамин в положении 1, аспартат в положении 2, глицин в положении 3 и глутамат в положении 5 зрелой CD3-эпсилон-цепи. IgG-антитело Н2С HLP продемонстрировало промежуточную потерю связывания для аминокислоты аспарагин в положении 4 зрелой CD3-эпсилон-цепи, и оно продемонстрировало полную потерю связывания для следующих аминокислот: глутамин в положении 1, аспартат в положении 2, глицин в положении 3 и глутамат в положении 5 зрелой CD3-эпсилон-цепи. Одноцепочечное антитело F12Q HLP продемонстрировало по существу полную потерю связывания для следующих аминокислот: глутамин в положении 1, аспартат в положении 2, глицин в положении 3 зрелой CD3-эпсилон-цепи и глутамат в положении 5 зрелой CD3-эпсилон-цепи.

6. Анализ связывания анти-CD3-связывающей молекулы Н2С HLP с межвидовой специфичностью с CD3-эпсилон-цепью человека с N-концевой His6-меткой и без нее, которую трансфицировали в мышиную Т-клеточную линию EL4

6.1. Клонирование и экспрессия CD3-эпсилон-цепи человека с N-концевой гексагистидиновой меткой (His6-меткой)

Фрагмент кДНК, кодирующий CD3-эпсилон-цепь человека с N-концевой His6-меткой. получали генным синтезом. Фрагмент генного синтеза конструировали таким образом, чтобы он содержал сначала сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции, затем, в рамке считывания, иммуноглобулиновый лидерный пептид из 19 аминокислот, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность His6-метки, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность зрелой CD3-эпсилон-цепи человека (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность данной конструкции представлены в SEQ ID NO:256 и 255). Фрагмент генного синтеза конструировали также таким образом, чтобы он содержал сайты рестрикции в начале и в конце кДНК. Введенные сайты рестрикции, EcoRI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. Фрагмент генного синтеза затем клонировали через EcoRI и Sail в плазмиду, обозначенную pEF-NEO (как описано выше), следуя стандартным протоколам. Плазмиду с подтвержденной последовательностью использовали для трансфекции мышиной Т-клеточной линии EL4. Трансфекцию и селекцию трансфектантов осуществляли, как описано выше. Через 34 суток культивирования клеток трансфектанты использовали в описанном ниже анализе.

6.2. Связывание анти-CD3-связывающей молекулы Н2С HLP с межвидовой специфичностью с CD3-эпсилон-цепью человека с N-концевой His6-меткой и без нее

Химерное IgG-антитело Н2С HLP со специфичностью связывания к CD3-эпсилон, тестировали в отношении связывания с CD3-эпсилон человека с N-концевой His-меткой и без нее. Связывание этого антитела с клеточными линиями EL4, трансфицированными His6-CD3-эпсилон человека и человеческим CD3-эпсилон дикого типа соответственно, тестировали FACS-анализом согласно стандартным протоколам. 2,5×105 клеток трансфектантов инкубировали с 50 мкл клеточного культурального супернатанта, содержащего химерное IgG-антитело или 50 мкл соответствующих контрольных антител в концентрации 5 мкг/мл в PBS с 2% FCS. В качестве отрицательного контроля использовали соответствующий изотипический контроль, а в качестве положительного контроля экспрессии конструкций использовали CD3-специфическое антитело UCHT-1 соответственно. Связывание антител определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши (специфичного к Fc-гамма-фрагменту), разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACSCalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany). По сравнению с El-4-клеточной линией, трансфицированной человеческой CD3-эпсилон дикого типа, была определена очевидная потеря связывания химерного IgG антитела Н2С HLP со специфичностью связывания с CD3-эпсилон человека с N-концевой His-меткой. Эти результаты показали, что свободный N-конец CD3-эпсилон является существенным для связывания специфической анти-CD3-связывающей молекулы Н2С HLP с межвидовой специфичностью с эпсилон-цепью CD3 человека (Фиг.9).

7. Клонирование и экспрессия C-концевых, трансмембранных и укороченных внеклеточных доменов MCSP человека

Кодирующую последовательность С-концевого, трансмембранного и укороченного внеклеточного домена MCSP человека (аминокислоты 1538-2322) получали генным синтезом согласно стандартным протоколам (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность рекомбинантной конструкции для экспрессии C-концевого, трансмембранного и укороченного внеклеточного домена MCSP человека (обозначенного D3 человека) представлены в SEQ ID NO:250 и 249). Фрагмент генного синтеза конструировали таким образом, чтобы он содержал сначала сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции, затем кодирующую последовательность иммуноглобулинового лидерного пептида из 19 аминокислот, затем, в рамке считывания, FLAG-метку, затем, в рамке считывания, последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для целей клонирования и кодирующую искусственный линкер из 9 аминокислот (SRTRSGSQL), затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность С-концевого, трансмембранного и укороченного внеклеточного домена MCSP человека и стоп-кодон. Сайты рестрикции вводили в начало и в конец данного фрагмента ДНК. Сайты рестрикции, EcoRI на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. Фрагмент расщепляли EcoRI и Sall и клонировали в pEF-DHFR (pEF-DHFR описана в Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), следуя стандартным протоколам. Плазмиду с подтвержденной последовательностью использовали для трансфекции клеток CHO/dhfr- (ATCC № CRL 9096). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой глутамина, дополненной 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина (все приобретено у Biochrom AG Berlin, Germany) и нуклеозидами из исходного раствора реагентов со степенью чистоты "для клеточных культур" (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) до конечной концентрации аденозина 10 мкг/мл, дезоксиаденозина 10 мкг/мл и тимидина 10 мкг/мл в инкубаторе при 37°С, влажности 95% и 7% CO2. Трансфекцию осуществляли с использованием реагента для трансфекции PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) и 5 мкг плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. После культивирования в течение 24 часов клетки промывали один раз PBS и снова культивировали в RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Таким образом, клеточная культуральная среда не содержала нуклеозидов, поэтому селекцию осуществляли на трансфицированных клетках. Приблизительно через 14 суток после осуществления трансфекции наблюдался рост устойчивых клеток. Еще через 7-14 суток трансфектанты тестировали FACS-анализом в отношении экспрессии конструкции. 2,5×105 клеток инкубировали с 50 мкл анти-Flsg-М2-антитела (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany), разведенного до концентрации 5 мкг/мл в PBS с 2% FCS. Связывание антитела определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши (специфичного к Fc-гамма-фрагменту), разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany).

8. Клонирование и экспрессия С-концевых, трансмембранных и укороченных внеклеточных доменов MCSP макака

Последовательность кДНК С-концевых, трансмембранных и укороченных внеклеточных доменов MCSP макака (обозначенных D3 макака) получали путем проведения серии из трех ПЦР на кДНК из кожи макака (№ по каталогу С1534218-Су-ВС; BioCat GmbH, Heidelberg, Germany) в следующих реакционных условиях: 1 цикл при 94°С в течение 3 мин, 40 циклов при 94°С в течение 0,5 мин, при 52°С в течение 0,5 мин и при 72°С в течение 1,75 мин, затем заключительный цикл при 72°С в течение 3 мин. Использовали следующие праймеры: прямой праймер: 5'-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3' (SEQ ID NO:361) обратный праймер: 5'-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3' (SEQ ID NO:362) прямой праймер: 5'- TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3' (SEQ ID NO:363) обратный праймер: 5'- CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3' (SEQ ID NO:364) прямой праймер: 5'- GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3' (SEQ ID NO:365) обратный праймер: 5'- GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3' (SEQ ID NO:366).

В результате проведения этих ПЦР получили три перекрывающихся фрагмента (А: 1-1329, В: 1229-2428, С: 1782-2547), которые выделяли и секвенировали согласно стандартным протоколам, используя ПЦР-праймеры, и таким образом получили участок последовательности кДНК MCSP макака размером 2547 п.о. (последовательность кДНК и аминокислотная последовательность этого участка MCSP макака представлены в SEQ ID NO:252 и 251) от 74 п.о. выше последовательности, кодирующей С-концевой домен, до 121 п.о. ниже стоп-кодона. Другую ПЦР, которую проводили в следующих реакционных условиях: 1 цикл при 94°С в течение 3 мин, 10 циклов при 94°С в течение 1 мин, при 52°С в течение 1 мин и при 72°С в течение 2,5 мин, заключительный цикл при 72°С в течение 3 мин, использовали для слияния ПЦР-продуктов вышеупомянутых реакций А и В. Использовали следующие праймеры: прямой праймер: 5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg-3' (SEQ ID NO:367) обратный праймер: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3' (SEQ ID NO:368).

Праймеры для этой ПЦР конструировали таким образом, чтобы ввести сайты рестрикции в начало и в конец фрагмента кДНК, кодирующего С-концевые, трансмембранные и укороченные внеклеточные домены MCSP макака. Введенные сайты рестрикции, Mfel на 5'-конце и Sall на 3'-конце, использовали в последующих процедурах клонирования. ПЦР-фрагмент затем клонировали через Mfel и Sall в плазмиду Bluescript, содержащую фрагмент EcoRI/Mfel вышеупомянутой плазмиды pEF-DHFR (pEF-DHFR описана в Raum et al. Cancer Immunol. Immunother. 50 (2001) 141-150), путем замены С-концевых, трансмембранных и укороченных внеклеточных доменов MCSP человека. Фрагмент генного синтеза содержал кодирующие последовательности иммуноглобулинового лидерного пептида и Flag-метки, а также искусственного линкера (SRTRSGSQL), в рамке считывания, с 5'-концом фрагмента кДНК, кодирующего С-концевые, трансмембранные и укороченные внеклеточные домены MCSP макака. Этот вектор использовали для трансфекции клеток CHO/dhfr- (ATCC № CRL 9096). Клетки культивировали в RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой глутамина, дополненной 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина (все от Biochrom AG Berlin, Germany) и нуклеозидами из исходного раствора реагентов со степенью чистоты "для клеточных культур" (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) до конечной концентрации аденозина 10 мкг/мл, дезоксиаденозина 10 мкг/мл и тимидина 10 мкг/мл, в инкубаторе при 37°С, влажности 95% и 7% CO2. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента для трансфекции PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) и 5 мкг плазмидной ДНК в соответствии с протоколом производителя. После культивирования в течение 24 часов клетки промывали один раз PBS и снова культивировали в RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Таким образом, клеточная культуральная среда не содержала нуклеозидов, и поэтому селекцию осуществляли на трансфицированных клетках. Приблизительно через 14 суток после осуществления трансфекции наблюдался рост устойчивых клеток. Еще через 7-14 суток трансфектанты тестировали FACS-анализом в отношении экспрессии рекомбинантной конструкции. 2,5×105 клеток инкубировали с 50 мкл анти-Flag-М2-антитела (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany), разведенного до концентрации 5 мкг/мл в PBS с 2% FCS. Связывание антитела определяли с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином, аффинно очищенного F(ab')2-фрагмента антитела козы против IgG мыши (специфичного к Fc-гамма-фрагменту), разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS (ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, UK). Образцы измеряли на FACScalibur (BD biosciences, Heidelberg, Germany).

9. Создание и определение характеристик MCSP и CD3 биспецифических одноцепочечных молекул с межвидовой специфичностью

Молекулы биспецифических одноцепочечных антител, каждая из которых содержит связывающий домен с межвидовой специфичностью к CD3-эпсилон человека и примата, не являющегося шимпанзе, а также связывающий домен с межвидовой специфичностью к MCSP человека и примата, не являющегося шимпанзе, конструировали, как указано в приведенной ниже Таблице 1.

Таблица 1
Форматы MCSP и CD3 биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью
SEQID (нукл./бел.) Форматы белковых конструкций (N→C)
190/189 MCSP-G4 HL x H2C HL
192/191 MCSP-G4 HL x F12Q HL
194/193 MCSP-G4 HL x I2 CHL
196/195 MCSP-G4 HLP x F6A HLP
198/197 MCSP-G4 HLP x H2C HLP
202/201 MCSP-G4 HLP x G4H HLP
206/205 MCSP-G4 HLP x E1L HLP
208/207 MCSP-G4 HLP x E2M HLP
212/211 MCSP-G4 HLP x F12Q HL
214/213 MCSP-G4 HLP x I2C HL
216/215 MCSP-D2 HL x H2C HL
218/217 MCSP-D2 HL x F12Q HL
220/219 MCSP-D2 HL x I2C HL
222/221 MCSP-D2 HLP x H2C HLP
224/223 MCSP-F9 HL x H2C HL
226/225 MCSP-F9 HLP x H2C HLP
228/227 MCSP-F9 HLP x G4H HLP
318/317 MCSP-A9 HL x H2C HL
320/319 MCSP-A9 HL x F12Q HL
322/321 MCSP-A9 HL x I2C HL
324/323 MCSP-C8 HL x I2C HL
328/327 MCSP-B7 HL x I2C HL
326/325 MCSP-B8 HL x I2C HL
330/329 MCSP-G8 HL x I2C HL
332/331 MCSP-D5 HL x I2C HL
334/333 MCSP-F7 HL x I2C HL
336/335 MCSP-G5 HL x I2C HL
338/337 MCSP-F8 HL x I2C HL
340/339 MCSP-G10 HL x I2C HL

Вышеупомянутые конструкции, содержащие вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и вариабельные домены легкой цепи (VL) с межвидовой специфичностью к MCSP D3 человека и макака, и VH- и VL-домены с межвидовой специфичностью к CD3 человека и макака, получали генным синтезом. Фрагменты генного синтеза конструировали таким образом, чтобы они содержали сначала сайт Козака для эукариотической экспрессии данной конструкции, затем иммуноглобулиновый лидерный пептид из 19 аминокислот, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность соответствующей молекулы биспецифического одноцепочечного антитела, затем, в рамке считывания, кодирующую последовательность гистидин6-метки и стоп-кодон. Фрагмент генного синтеза конструировали также таким образом, чтобы ввести подходящие N- и С-концевые сайты рестрикции. Фрагмент генного синтеза клонировали через эти сайты рестрикции в плазмиду, обозначенную pEF-DHFR (pEF-DHFR описана в Raum et al. Cancer Immunol. Immunother. 50 (2001) 141-150), согласно стандартным протоколам (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Данные конструкции трансфицировали стабильно или временно в дефектные по DHFR клетки СНО (АТСС № CRL 9096) посредством электропорации или, альтернативно, временно трансфицировали в НЕК 293 (клетки почки эмбриона человека, АТСС номер: CRL-1573) согласно стандартным протоколам.

Эукариотическую экспрессию белка в дефектных по DHFR клетках СНО осуществляли, как описано в Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Генную амплификацию конструкций индуцировали путем добавления увеличивающихся концентраций метотрексата (МТХ) до конечной концентрации МТХ 20 нМ включительно. После двух пассажей стационарной культуры клетки выращивали в роллерных флаконах в жидкой соевой среде HyQ PF СНО без нуклеозидов (с 4,0 мМ L-глутамина, с 0,1% Pluronic F-68; HyClone) в течение 7 суток, затем собирали. Клетки выделяли центрифугированием, и супернатант, содержащий экспрессированный белок, хранили при -20°С.

Для хроматографии использовали систему Akta® Explorer (GE Health Systems) и программное обеспечение Unicorn®. Аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом ("IMAC") осуществляли с использованием Fractogel EMD chelate® (Merck), который нагружали ZnCl2 в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Колонку уравновешивали буфером А (20 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7,2; 0,1 М NaCl), и клеточный культуральный супернатант (500 мл) наносили на колонку (10 мл) при скорости потока 3 мл/мин. Колонку промывали буфером А для удаления несвязавшегося образца. Связавшийся белок элюировали с использованием двухстадийного градиента буфера В (20 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7,2; 0,1 М NaCl; 0,5 М имидазол) следующим образом:

стадия 1: 20% буфера B в 6 колоночных объемах;

стадия 2: 100% буфера B в 6 колоночных объемах.

Элюированные белковые фракции со стадии 2 объединяли для дальнейшей очистки. Все химические реактивы имели исследовательскую степень чистоты и были приобретены у Sigma (Deisenhofen) или Merck (Darmstadt).

Гель-фильтрацию осуществляли на препаративной колонке HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham), уравновешенной Equi-буфером (25 мМ цитрат; 200 мМ лизин; 5% глицерин; рН 7,2). Элюированные белковые образцы (скорость потока 1 мл/мин) подвергали стандартным SDS-PAGE и вестерн-блоттингу для детекции. Перед очисткой колонку калибровали для определения молекулярной массы (набор маркеров молекулярной массы, Sigma MW GF-200). Концентрацию белка определяли при OD 280 нм.

Очищенный белок, биспецифическое одноцепочечное антитело, анализировали методом SDS-PAGE в восстановительных условиях с использованием предварительно залитых 4-12%-ных гелей в бис-Tris-буфере (Invitrogen). Приготовление и нанесение образцов осуществляли согласно протоколу производителя. Молекулярную массу определяли, используя белковый стандарт MultiMark (Invitrogen). Гель окрашивали коллоидным Coomassie (протокол Invitrogen). Определенная методом SDS-PAGE чистота выделенного белка составляет более 95%.

Биспецифическое одноцепочечное антитело имеет молекулярную массу примерно 52 кДа в нативных условиях, как определено гель-фильтрацией в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Все конструкции очищали согласно данному методу.

Вестерн-блоттинг осуществляли с использованием мембраны Optitran® BA-S83 в аппарате для блоттинга Invitrogen в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Для детекции белка биспецифического одноцепочечного антитела использовали антитело против His-метки (Penta-His, Qiagen). Антитело козы против Ig мыши, меченое щелочной фосфатазой (АР) (Sigma), использовали в качестве вторичного антитела, a BCIP/NBT (Sigma) в качестве субстрата. Детектировали единственную полосу при 52 кДа, соответствующую очищенному биспецифическому одноцепочечному антителу.

Альтернативно, конструкции временно экспрессировали в дефектных по DHFR клетках СНО. Кратко, 4×105 клеток на одну конструкцию культивировали в 3 мл полной среды RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой глутамина, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и нуклеозидами из исходного раствора реагентов со степенью чистоты "для клеточных культур" (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany) до конечной концентрации аденозина 10 мкг/мл, дезоксиаденозина 10 мкг/мл и тимидина 10 мкг/мл, в инкубаторе при 37°С, 95% влажности и 7% CO2 за одни сутки до проведения трансфекции. Трансфекцию осуществляли с использованием реагента для трансфекции Fugene 6 (Roche, №11815091001) в соответствии с протоколом производителя. 94 мкл среды OptiMEM (Invitrogen) и 6 мкл Fugene 6 смешивали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. После этого добавляли 1,5 мкг ДНК на одну конструкцию, перемешивали и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. В то же время дефектные по DHFR клетки СНО промывали 1х PBS и ресуспендировали в 1,5 мл полной среды RPMI 1640. Смесь для трансфекции разбавляли 600 мкл полной среды RPMI 1640, добавляли к клеткам и инкубировали в течение ночи при 37°С, влажности 95% и 7% СО2. Через сутки после проведения трансфекции инкубируемый объем для каждого подхода увеличивали до 5 мл путем добавления полной среды RPMI 1640. Супернатант собирали после 3 суток инкубации.

10. Проточно-цитометрический анализ связывания MCSP и CD3 биспецифических антител с межвидовой специфичностью

С целью тестирования функциональности конструкций биспецифических антител с межвидовой специфичностью в отношении способности связываться с MCSP D3 и CD3 человека и макака соответственно осуществляли FACS-анализ. Для этого клетки СНО, трансфицированные MCSP D3 человека (как описано в Примере 7) и CD3-положительную линию клеток HPB-ALL Т-клеточного лейкоза человека (DSMZ, Braunschweig, ACC483) использовали для тестирования связывания с антигенами человека. Способность связываться с антигенами макака тестировали с использованием созданного трансфектанта MCSP D3 макака (описанного в Примере 8) и Т-клеточной линии 4119LnPx макака (любезно предоставленной профессором Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg; опубликованной в Knappe A, et al., и Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200000 клеток соответствующих клеточных линий инкубировали в течение 30 мин на льду с 50 мкл очищенного белка конструкций биспецифических антител с межвидовой специфичностью (2 мкг/мл) или с супернатантом клеточной культуры трансфицированных клеток, экспрессирующих эти конструкции биспецифических антител с межвидовой специфичностью. Клетки дважды промывали в PBS с 2% FCS, и связывание данной конструкции определяли с использованием мышиного анти-His-антитела (Penta-His-антитело; Qiagen; разведенное в соотношении 1:20 в 50 мкл PBS с 2% FCS). После промывки связавшиеся анти-His-антитела определяли с использованием Fc-гамма-специфического антитела (Dianova), конъюгированного с фикоэритрином, разведенного в соотношении 1:100 в PBS с 2% FCS. В качестве отрицательного контроля для связывания с Т-клеточными линиями использовали супернатант нетрансфицированных клеток СНО. Одноцепочечную конструкцию с нерелевантной целевой специфичностью использовали в качестве отрицательного контроля связывания с MCSP-D3-трансфицированными клетками СНО.

Проточную цитометрию выполняли на аппарате FACS-Calibur, и для получения и анализа данных использовали программное обеспечение CellQuest (Becton Dickinson biosciences, Heidelberg). FACS-окрашивание и измерение интенсивности флуоресценции осуществляли, как описано в Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002).

Биспецифическое связывание одноцепочечных молекул, перечисленных выше, которые демонстрируют межвидовую специфичность к MCSP D3 и межвидовую специфичность к CD3 человека и макака, четко определялось, как показано на Фиг.10, 11, 12 и 39. В FACS-анализе все конструкции продемонстрировали связывание с CD3 и MCSP D3 по сравнению с соответствующими отрицательными контролями. Была продемонстрирована межвидовая специфичность биспецифических антител к антигенам CD3 и MCSP D3 человека и макака.

11. Биологическая активность MCSP и CD3 биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью

Биологическую активность созданных биспецифических одноцепочечных антител анализировали путем определения высвобождения хрома 51 (51Cr) в анализах цитотоксичности in vitro с использованием MCSP D3-положительных клеточных линий, описанных в Примерах 7 и 8. В качестве эффекторных клеток использовали стимулированные CD4/CD56-истощенные PBMC человека, стимулированные PBMC человека или Т-клеточную линию 4119LnPx макака, как показано в соответствующих графических материалах.

Получение стимулированных CD4/CD56-истощенных PBMC осуществляли следующим образом: На чашку Петри (диаметр 145 мм; Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) наносили имеющееся в продаже анти-CD3-специфическое антитело (например, OKT3, Othoclone) в конечной концентрации 1 мкг/мл в течение 1 часа при 37°С. Несвязавшийся белок удаляли за одну стадию промывки, используя PBS. Свежие РВМС выделяли из периферической крови (30-50 мл крови человека) центрифугированием в градиенте фиколла согласно стандартным протоколам. 3-5×107 РВМС добавляли в предварительно покрытую чашку Петри в 120 мл RPMI 1640 со стабилизирующей добавкой смеси глутамин/10% FCS/IL-2 20 ед./мл (пролейкин, Chiron) и стимулировали в течение 2 суток. На третьи сутки клетки собирали и промывали один раз RPMI 1640. Добавляли IL-2 до конечной концентрации 20 ед./мл, и клетки снова культивировали в течение одних суток в той же среде для культивирования клеток, как указано выше. Посредством истощения CD4+ Т-клеток и CD56+ NK-клеток согласно стандартным протоколам осуществляли обогащение CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL).

Клетки-мишени дважды промывали PBS и метили 11,1 МБк 51Cr в конечном объеме 100 мкл RPMI с 50% FCS в течение 45 минут при 37°С. После этого меченые клетки-мишени промывали 3 раза 5 мл RPMI и затем использовали в анализе цитотоксичности. Анализ выполняли в 96-луночном планшете в общем объеме 250 мкл дополненной среды RPMI (как и выше) с соотношением Е:Т 10:1. Наносили 1 мкг/мл молекул биспецифического одноцепочечного антитела с межвидовой специфичностью и 20 их трехкратных разведении. Если использовали супернатант, содержащий молекулы биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью, то наносили 21 его двукратное разведение и 20 его трехкратных разведении в анализе цитотоксичности для макака и человека соответственно. Время анализа составляло 18 часов, и цитотоксичность измеряли в относительных значениях высвобожденного хрома в супернатанте, соответствующих разнице между максимальным лизисом (добавление Triton-X) и спонтанным лизисом (без эффекторных клеток). Все измерения выполняли в четырех повторах. Измерение радиоактивности хрома в супернатантах выполняли с использованием гамма-счетчика Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany). Анализ экспериментальных данных выполняли с использованием Prism 4 для Windows (версия 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). Сигмоидальные кривые доза-ответ обычно имеют значения R2 выше 0,90, как определено с использованием этого программного обеспечения. Значения ЕС50, рассчитанные с использованием данной программы анализа, использовали для сравнения биологической активности.

Как показано на Фиг.13-17 и 40, все созданные конструкции биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью демонстрируют цитотоксическую активность против клеток-мишеней, положительных в отношении MCSP D3 человека, индуцированную стимулированными CD4/CD56-истощенными РВМС человека или стимулированными РВМС человека, и против клеток-мишеней, положительных в отношении MCSP D3 макака, индуцированную Т-клеточной линией 4119LnPx макака.

12. Стабильность в плазме MCSP и CD3 биспецифических одноцепочечных антител с межвидовой специфичностью

Стабильность созданных биспецифических одноцепочечных антител в плазме человека анализировали путем инкубации биспецифических одноцепочечных антител в 50%-ной плазме человека при 37°С и 4°С в течение 24 часов и последующего тестирования биологической активности. Биологическую активность исследовали в анализе цитотоксичности in vitro путем определения высвобождения хрома 51 (51Cr) с использованием MCSP-положительной линии клеток СНО (экспрессирующих MCSP, клонировали в соответствии с Примером 14 или 15) в качестве мишени и стимулированных CD3-положительных Т-клеток человека в качестве эффекторных клеток.

Значения EC50, рассчитанные с использованием программы анализа, которая описана выше, использовали для сравнения биологической активности биспецифических одноцепочечных антител, инкубированных с 50%-ной плазмой человека в течение 24 часов при 37°С и 4°С соответственно с биспецифическими одноцепочечными антителами без добавления плазмы или смешанными с таким же количеством плазмы непосредственно перед анализом.

Как показано на Фиг.18 и в Таблице 2, биологическая активность G4 H-L x I2C H-L, G4 H-L x H2C H-L и G4 H-L x F12Q H-L биспецифических антител не была значительно снижена по сравнению с контролями без добавления плазмы или с добавлением плазмы непосредственно перед тестированием биологической активности.

Таблица 2
Биологическая активность биспецифических антител без добавления плазмы и с добавлением плазмы
Конструкция Без плазмы С плазмой Плазма 37°С Плазма 4°С
G4 H-L x I2C H-L 300 796 902 867
G4 H-L x H2C H-L 496 575 2363 1449
G4 H-L x F12Q H-L 493 358 1521 1040

13. Перераспределение циркулирующих Т-клеток в отсутствие циркулирующих клеток-мишеней, инициированное первым воздействием CD3-связывающих молекул, направленных на традиционные, то есть зависимые от окружения, эпитопы CD3, является основным фактором риска неблагоприятных явлений, связанных с началом лечения

Перераспределение Т-клеток у пациентов с В-клеточной неходжкинской лимфомой (B-NHL) после начала лечения традиционными CD3-связывающими молекулами

Традиционная CD19xCD3-связывающая молекула представляет собой CD3-связывающую молекулу формата биспецифических тандемных scFv (Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6) или WO 99/54440). Она состоит из двух разных связывающих участков, направленных на (1) CD19 на поверхности нормальных и злокачественных В-клеток человека и (2) CD3 на Т-клетках человека. В результате перекрестного связывания CD3 на Т-клетках с CD19 на В-клетках эта конструкция инициирует перенаправленный лизис нормальных и злокачественных В-клеток посредством цитотоксической активности Т-клеток. эпитоп CD3, распознаваемый такой традиционной CD3-связывающей молекулой, локализован на CD3-эпсилон-цепи, где он принимает надлежащую конформацию только при погружении в остальную часть эпсилон-цепи и удерживании в правильном положении посредством гетеродимеризации эпсилон-цепи либо с гамма-, либо с дельта-цепью CD3. Взаимодействие этого в высокой степени зависимого от окружения эпитопа с традиционной CD3-связывающей молекулой (смотри, например, Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6) или WO 99/54440), даже когда оно осуществляется исключительно моновалентным образом и без какого-либо перекрестного связывания, может индуцировать аллостерическое изменение конформации CD3, приводящее к экспонированию скрытого в других случаях, обогащенного пролином участка в цитоплазматическом домене CD3-эпсилон-цепи. Будучи экспонированным, обогащенный пролином участок может стимулировать молекулу сигнальной трансдукции Nck2, которая способна запускать дальнейшие внутримолекулярные сигналы. Хотя этого недостаточно для полной Т-клеточной активации, которая непременно требует перекрестного связывания нескольких молекул CD3 на поверхности Т-клетки, например посредством перекрестного связывания нескольких анти-CD3 молекул, связанных с несколькими молекулами CD3 на Т-клетке с несколькими молекулами CD19 на поверхности В-клетки, исключительно моновалентное взаимодействие традиционных CD3-связывающих молекул с зависимым от окружения эпитопом на CD3-эпсилон все же не остается инертным в отношении Т-клеток в смысле передачи сигнала. Без какой-либо связи с теорией, традиционные моновалентные CD3-связывающие молекулы (известные в данной области) могут индуцировать некоторые Т-клеточные реакции при инфузии их людям даже в тех случаях, когда циркулирующие клетки-мишени недоступны для перекрестного связывания с CD3. Важной Т-клеточной реакцией на внутривенную инфузию традиционной моновалентной CD19xCD3-связывающей молекулы пациентам с B-NHL, по существу не имеющим циркулирующих CD19-положительных В-клеток, является перераспределение Т-клеток после начала лечения. Было обнаружено, что в фазе I клинического испытания эта Т-клеточная реакция имеет место во время начальной фазы внутривенной инфузии CD19xCD3-связывающих молекул у всех индивидуумов без циркулирующих CD19-положительных целевых В-клеток, по существу независимо от дозы CD19xCD3-связывающих молекул (Фиг.19). Однако было обнаружено, что резкое увеличение воздействия CD19xCD3-связывающих молекул инициирует фактически такую же реакцию перераспределения Т-клеток у этих пациентов, что и первоначальное воздействие на Т-клетки CD19xCD3-связывающих молекул в начале лечения (Фиг.20А), и даже постепенное увеличение воздействия CD19xCD3-связывающих молекул по-прежнему может оказывать влияние на перераспределение циркулирующих Т-клеток (Фиг.21). Обнаружено также, что эта, по существу не зависящая от дозы, Т-клеточная реакция перераспределения в отсутствие циркулирующих клеток-мишеней, инициированная традиционными CD3-связывающими молекулами, подобными CD19xCD3-связывающей молекуле (описанной, например, в WO 99/54440), у 100% подвергнутых лечению индивидуумов является основным фактором риска неблагоприятных явлений, связанных с началом лечения.

В соответствии с протоколом исследования для фазы 1 открытого многоцентрового испытания на пациентах (interpatient) с увеличением дозы были отобраны пациенты с рецидивирующей гистологически подтвержденной медленно растущей В-клеточной неходжкинской лимфомой (B-NHL), включая лимфому из клеток мантийной зоны. Протокол исследований был утвержден независимыми комиссиями по этике всех участвующих центров и послан для уведомления компетентным контролирующим органам.

Для включения в данное исследование необходимо было иметь поддающееся измерению заболевание (по меньшей мере одно патологическое изменение не менее 1,5 см), которое документально подтверждено КТ-сканированием (компьютерная томография). Пациенты получали традиционную CD19xCD3-связывающую молекулу непрерывной внутривенной инфузией с использованием портативной насосной мини-системы в течение четырех недель при постоянной скорости потока (т.е. при постоянной уровне дозы). Пациентов госпитализировали на первые две недели лечения, после чего их выписывали из госпиталя, и они продолжали лечение дома. Пациентам без видимого прогрессирования заболевания после четырех недель предлагали продолжить лечение в течение следующих четырех недель. До этого момента тестировали шесть разных уровней доз без достижения максимально переносимой дозы (MTD): 0,5, 1,5, 5, 15, 30 и 60 мкг/м2/24 ч. Каждая группа состояла из трех пациентов, если не наблюдалось никаких неблагоприятных явлений, определяемых согласно протоколу исследований как DLT (дозолимитирующая токсичность). Если отмечали один случай DLT среди первых трех пациентов, то группу расширяли до шести пациентов, которым, при отсутствии второго случая DLT, разрешали дальше увеличивать дозу. Соответственно, уровни доз без DLT в группах из 3 пациентов или с одним случаем DLT в группах из 6 пациентов рассматривались как безопасные. Используемое в исследовании лечение прекращали у всех пациентов, у которых развилась DLT. Для доз 15 и 30 мкг/м2/24 ч в течение первых 24 ч исследовали различные режимы начала лечения в нескольких дополнительных группах: (1) пошаговое увеличение после 5 мкг/м2/24 ч в течение первых 24 ч до поддерживающей дозы 15 мкг/м2/24 ч (группа пациентов 15-step), (2) равномерное непрерывное линейное увеличение скорости потока (ramp) фактически от нуля до 15 или 30 мкг/м2/24 ч (группы пациентов 15-ramp и 30-ramp) и (3) начало (лечения) поддерживающей дозой с самого начала (группы пациентов 15-flat, 30-flat и 60-flat). Все группы пациентов с уровнем доз 0,5, 1,5 и 5 мкг/м2/24 ч начинали лечение поддерживающей дозой с самого начала (т.е. flat-инициация (инициация постоянной дозой)).

Изменение во времени абсолютного количества В- и Т-клеток в периферической крови определяли методом четырехцветного FACS-анализа следующим образом:

Сбор образцов крови и стандартный анализ

У пациентов групп 15-ramp, 15-flat, 30-ramp, 30-flat и 60-flat брали образцы крови (6 мл) до начала инфузии и через 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48 часов после начала инфузии CD19xCD3-связывающих молекул (как описано в WO 99/54440), а также на 8-е, 15-е, 17-е, 22-е, 24-е, 29-е, 36-е, 43-и, 50-е, 57-е сутки лечения и через 4 недели после окончания инфузии традиционных CD19xCD3-связывающих молекул, используя содержащие EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) пробирки Vacutainer™ (Becton Dickinson), которые доставлялись для анализа при 4°С. У пациентов группы 15-step брали образцы крови (6 мл) до начала инфузии и через 6, 24, 30, 48 часов после начала инфузии CD19xCD3-связывающих молекул, а также на 8-е, 15-е, 22-е, 29-е, 36-е, 43-и, 50-е, 57-е сутки лечения и через 4 недели после окончания инфузии традиционных CD19xCD3-связывающих молекул. Для уровней доз 0,5, 1,5 и 5 мкг/м2/24 ч брали образцы крови (6 мл) до начала инфузии и через 6, 24, 48 часов после начала инфузии CD19xCD3-связывающих молекул, а также на 8-е, 15-е, 22-е, 29-е, 36-е, 43-и, 50-е, 57-е сутки лечения и через 4 недели после окончания инфузии традиционных CD19xCD3-связывающих молекул. В некоторых случаях по практическим причинам имели место небольшие вариации этих временных точек. FACS-анализ субпопуляций лимфоцитов выполняли в пределах периода времени 24-48 ч после сбора образцов крови. Абсолютное количество субпопуляций лейкоцитов в образцах крови определяли дифференциальным анализом крови на CoulterCounter™ (Coulter).

Выделение РВМС из образцов крови

Выделение РВМС (мононуклеарных клеток периферической крови) осуществляли в соответствии с адаптированным протоколом выделения в градиенте Ficoll™. Кровь переносили при комнатной температуре в пробирки Leucosep™ (Greiner) емкостью 10 мл, предварительно заполненные 3 мл раствора Biocoll™ (Biochrom). Центрифугирование проводили в колебательном роторе в течение 15 мин при 1700 x g и 22°С без уменьшения числа оборотов. РВМС над слоем Biocoll™ отделяли, промывали один раз буфером для FACS (PBS/2% FBS [сыворотка плода коровы; Biochrom]), центрифугировали и ресуспендировали в буфере для FACS. Центрифугирование во время всех стадий промывки проводили в колебательном роторе в течение 4 мин при 800 x g и 4°С. При необходимости, лизис эритроцитов осуществляли путем инкубирования выделенных РВМС в 3 мл буфера для лизиса эритроцитов (8,29 г NH4Cl; 1,00 г KHCO3; 0,037 г EDTA; до 1,0 л H2Obidest (дважды дистиллированная), рН 7,5) в течение 5 мин при комнатной температуре с последующей стадией промывки в буфере для FACS.

Окрашивание РВМС антителами с флуоресцентной меткой против молекул клеточной поверхности

Моноклональные антитела были получены от Invitrogen (1№ по каталогу MHCD1301, 2№ по каталогу MHCD1401), Dako (5№ по каталогу С7224) или Becton Dickinson (3№ по каталогу 555516, 4№ по каталогу 345766), и их использовали в соответствии с рекомендациями производителей. От 5×105 до 1×106 клеток окрашивали, используя следующую комбинацию антител: анти-CD131/анти-CD142 (FITC (флуоресцеинизотиоцианат)) x анти-CD563 (РЕ (фикоэритрин)) x анти-CD34 (PerCP (перидининхлорофилл)) x анти-CD195 (АРС (аллофикоцианин)). Клетки осаждали в 96-луночных мультититрационных планшетах с V-образными лунками (Greiner), и супернатант удаляли. Клеточные осадки ресуспендировали в общем объеме 100 мкл, содержащем специфические антитела, разведенные в буфере для FACS. Инкубацию проводили в темноте в течение 30 мин при 4°С. После этого образцы дважды промывали буфером для FACS, и клеточные осадки ресуспендировали в буфере для FACS для анализа методом проточной цитометрии.

Проточно-цитометрическое определение окрашенных лимфоцитов FACS-анализом

Сбор данных осуществляли с помощью 4-цветного FACSCalibur™ BD (Becton Dickinson). Для каждого измерения брали 1×104 клеток определенных субпопуляций лимфоцитов. Чтобы получить процентное содержание субпопуляций лимфоцитов и провести классификацию интенсивностей экспрессии молекул клеточной поверхности, выполняли статистический анализ с использованием программы CellQuest Pro™ (Becton Dickinson). Затем процентные содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов относительно общих лимфоцитов (т.е. В-клетки плюс Т-клетки плюс NK-клетки, за исключением миелоидных клеток, посредством CD13/14-окрашивания), определенных FACS-анализом, коррелировали с количеством лимфоцитов, полученным в результате дифференциального анализа крови, для вычисления абсолютных количеств Т-клеток (CD3+, CD56-, CD13/14-) и В-клеток (CD19+, CD13/14-).

Перераспределение Т-клеток во время начальной фазы лечения традиционной CD19xCD3-связывающей молекулой (например, описанной в WO 99/54440) у всех пациентов, которые по существу не имели никаких циркулирующих CD19-положительных В-клеток в начале лечения, представлено на Фиг.19. Для сравнения, на Фиг.22 представлен репрезентативный пример перераспределения Т-клеток во время начальной фазы лечения CD19xCD3-связывающей молекулой у пациента со значительным количеством циркулирующих CD19-положительных В-клеток.

В обоих случаях (т.е. когда по существу нет или когда имеется много циркулирующих В-клеток) количество циркулирующих Т-клеток быстро уменьшается после начала лечения. Однако в отсутствие циркулирующих В-клеток Т-клетки имеют тенденцию очень рано возвращаться в циркулирующую кровь, в то время как возвращение Т-клеток в циркулирующую кровь тех пациентов, у которых содержалось значительное количество циркулирующих В-клеток в начале лечения, обычно задерживается до тех пор, пока эти циркулирующие В-клетки не будут истощены. Таким образом, картины перераспределения Т-клеток в основном различаются по кинетике возвращения Т-клеток в циркулирующую кровь.

Оценку эффективности на основе КТ-сканирования проводили по результатам центральной сравнительной радиологии (central reference radiology) через 4 недели лечения, а для пациентов, дополнительно получающих лечение в течение 4 недель, также через 8 недель лечения плюс, во всех случаях, через четыре недели после окончания лечения. Исчезновение и/или нормализацию размера всех известных патологических изменений (включая увеличенную селезенку), а также очищение костного мозга от лимфомных клеток в случаях инфильтрации костного мозга принимали за полную ответную реакцию (CR). Уменьшение по меньшей мере на 50% от исходного уровня суммы произведений двух наибольших диаметров (SPD) каждого предопределенного целевого патологического изменения принимали за частичную ответную реакцию (PR); уменьшение по меньшей мере на 25% рассматривали как минимальную ответную реакцию (MR). Прогрессирующее заболевание (PD) определяли как не менее чем 50%-ное увеличение SPD от исходного уровня. Отклонения SPD от исходного уровня в диапазоне от +50% до -25% рассматривали как стабильное заболевание (SD).

Демографические данные пациентов, полученные дозы и клинические результаты для 34 пациентов суммированы в Таблице 3. Клиническая противоопухолевая активность CD19xCD3-связывающей молекулы явно демонстрировала дозозависимый характер: стойкое истощение циркулирующих CD19-положительных В(лимфомных)-клеток в периферической крови наблюдалось начиная с дозы 5 мкг/м2/24 ч. При дозах 15 мкг/м2/24 ч и 30 мкг/м2/24 ч были зарегистрированы первые объективные клинические ответные реакции (PR и CR), а также случаи частичной и полной элиминации В-клеток лимфомы из инфильтрованного костного мозга. И наконец, при дозе 60 мкг/м2/24 ч уровень ответной реакции повышался до 100% (PR и CR), и очистка костного мозга от В-клеток лимфомы была полной во всех оцениваемых случаях.

CD19xCD3-связывающая молекула хорошо переносилась большинством пациентов. Наиболее часто встречающиеся неблагоприятные явления со степенями тяжести 1-4 у 34 пациентов, независимо от причины, суммированы в Таблице 4. Неблагоприятные явления, связанные с CD19xCD3-связывающей молекулой, обычно были временными и полностью обратимыми. В частности, были 2 пациента (пациенты №19 и №24 в Таблице 3) по существу без циркулирующих CD19-положительных В-клеток, лечение которых было прекращено раньше из-за неблагоприятных в отношении ЦНС явлений (основные симптомы: спутанность сознания и дезориентация), связанных с повторным перераспределением Т-клеток во время начальной фазы инфузии CD19xCD3-связывающей молекулы.

Один из этих пациентов (№19) находился в группе 15-step. Он получал CD19xCD3-связывающую молекулу в дозе 5 мкг/м2/24 ч в течение первых 24 ч с последующим резким увеличением до поддерживающей дозы 15 мкг/м2/24 ч. Соответствующая картина перераспределения Т-клеток показывает, что количество циркулирующих Т-клеток быстро уменьшалось на момент начала инфузии в дозе 5 мкг/м2/24 ч с последующим ранним повторным появлением Т-клеток в циркулирующей крови по существу без циркулирующих CD19-положительных В-клеток. Как следствие, количество периферических Т-клеток полностью восстанавливалось, когда дозу CD19xCD3-связывающей молекулы увеличивали через 24 ч с 5 до 15 мкг/м2/24 ч. Следовательно дозовый шаг мог инициировать второй эпизод перераспределения Т-клеток, как показано на Фиг.20А. Это повторное перераспределение Т-клеток было связано с побочными эффектами в отношении ЦНС (основные симптомы: спутанность сознания и дезориентация) у этого пациента, что явилось причиной прекращения инфузии. Взаимосвязь между повторным перераспределением Т-клеток и такими неблагоприятными в отношении ЦНС явлениями также наблюдалась в предварительной фазе I клинических испытаний у пациентов с B-NHL, получавших CD19xCD3-связывающую молекулу (например, описанную в WO 99/54440) в виде повторной болюсной инфузии в течение 2-4 часов каждая, после чего обычно следовал 2-х суточный период времени без лечения (Фиг.20В). Каждая единичная болюсная инфузия инициировала один эпизод перераспределения Т-клеток, заключающийся в быстром уменьшении количества циркулирующих Т-клеток и в восстановлении количества Т-клеток перед следующей болюсной инфузией. В целом, неблагоприятные в отношении ЦНС явления, связанные с повторным перераспределением Т-клеток, наблюдались у 5 из 21 пациента. На Фиг.20В представлен репрезентативный пример одного пациента, участвовавшего в клинических испытаниях с применением болюсной инфузии, у которого развились ЦНС-симптомы после третьего эпизода перераспределения Т-клеток. Обычно у пациентов с неблагоприятными в отношении ЦНС явлениями в клинических испытаниях с применением болюсной инфузии также наблюдаются низкие количества циркулирующих В-клеток.

Второй пациент (№24) из клинического испытания с применением непрерывной инфузии, лечение которого было прекращено раньше из-за неблагоприятных в отношении ЦНС явлений (основные симптомы: спутанность сознания и дезориентация), связанных с повторным перераспределением Т-клеток во время начальной фазы инфузии CD19xCD3-связывающей молекулы, находился в группе 15-flat. По ошибке этот пациент получал инфузию CD19xCD3-связывающей молекулы без добавления HSA, который необходим для стабилизации лекарственного средства. Результирующий неравномерный поток лекарственного средства инициировал повторяющиеся эпизоды перераспределения Т-клеток вместо только одного (Фиг.23А), после чего было принято решение о необходимости прекращения инфузии из-за развития ЦНС-симптомов. Однако когда этому же пациенту снова начали правильно вводить раствор CD19xCD3-связывающей молекулы, содержащий дополнительно HSA для стабилизации лекарственного средства (например, как описано в WO 99/54440), то никакого повторного перераспределения Т-клеток не наблюдалось, и у пациента никакие ЦНС-симптомы не развивались (Фиг.23В). Поскольку этот пациент также не имел по существу никаких циркулирующих В-клеток, то циркулирующие Т-клетки могли реагировать с быстрой кинетикой перераспределения даже при едва различимых изменениях в воздействии лекарственного средства, что и наблюдалось. Неблагоприятные в отношении ЦНС явления, связанные с перераспределением Т-клеток у пациентов, не имеющих по существу никаких циркулирующих клеток-мишеней, могут быть объяснены временным увеличением адгезивности Т-клеток к эндотелиальным клеткам с последующей сильной одновременной адгезией циркулирующих Т-клеток к стенкам кровеносного сосуда с последующим уменьшением количества Т-клеток в циркулирующей крови, которое наблюдалось. Массовое одновременное прикрепление Т-клеток к стенкам кровеносных сосудов может вызывать увеличение проницаемости эндотелия и активацию эндотелиальных клеток. Следствием увеличенной проницаемости эндотелия является перенос жидкости из внутрисосудистого компартмента в интерстициальные тканевые компартменты, включая интерстиций ЦНС. Активация эндотелиальных клеток путем прикрепления Т-клеток может оказывать прокоагуляционные эффекты (Monaco et al. J. Leukoc. Biol. 71 (2002) 659-668) с возможными нарушениями в кровотоке (включая церебральный кровоток), в частности в отношении капиллярной микроциркуляции. Таким образом, неблагоприятные в отношении ЦНС явления, связанные с перераспределением Т-клеток у пациентов, по существу не имеющих циркулирующих клеток-мишеней, могут быть следствием капиллярной утечки и/или нарушений капиллярной микроциркуляции вследствие адгезии Т-клеток к эндотелиальным клеткам. Эндотелиальный стресс, вызванный одним эпизодом перераспределения Т-клеток, переносится большинством пациентов, тогда как усиленный эндотелиальный стресс, вызванный повторяющимся перераспределением Т-клеток, часто является причиной неблагоприятных в отношении ЦНС явлений. Более чем один эпизод перераспределения Т-клеток может создавать меньший риск только у пациентов с низкими исходными количествами циркулирующих Т-клеток. Однако ограниченный эндотелиальный стресс, вызванный одним эпизодом перераспределения Т-клеток, также может вызывать неблагоприятные в отношении ЦНС явления в редких случаях повышенной чувствительности к таким явлениям, которые наблюдались у 1 из 21 пациента в клинических испытаниях с болюсной инфузией CD19xCD3-связывающей молекулы.

Без какой-либо связи с теорией, временное увеличение Т-клеточной адгезивности к эндотелиальным клеткам у пациентов, по существу не имеющих циркулирующих клеток-мишеней, можно объяснить как Т-клеточную реакцию на моновалентное взаимодействие традиционной CD3-связывающей молекулы, такой как CD19xCD3-связывающая молекула (смотри, например, WO 99/54440), с ее зависимым от окружения эпитопом на CD3-эпсилон, приводящее к аллостерическому изменению конформации CD3 с последующим рекрутментом Nck2 к цитоплазматическому домену CD3-эпсилон, как описано выше. Поскольку Nck2 непосредственно связан с интегринами через PINCH и ILK (Фиг.28), рекрутмент Nck2 к цитоплазматическому домену CD3-эпсилон после аллостерического изменения конформации CD3 в результате связывания традиционной CD3-связывающей молекулы, такой как CD19xCD3-связывающая молекула, с ее зависимым от окружения эпитопом на CD3-эпсилон, может увеличивать адгезивность Т-клеток к эндотелиальным клеткам за счет временного перехода интегринов на поверхности Т-клеток в их более адгезивную изоформу в результате сигнализации изнутри наружу.

Таблица 3
Демографические данные пациентов и клинические результаты
Группа Пациент Возраст/ пол Заболевание (классификация Ann Arbor) Уровень дозы [мг/м2/сутки] Очищение костного мозга Наилучшая ответная реакция* (продолжительность CR в месяцах или неделях)
1 1 71/м IC (иммуноцитома), по Binet С 0,0005 нет SD
2 67/ж MCL (лимфома из клеток мантийной зоны), Стадия IV/A/E 0,0005 n.d. PD
3 67/м CLL (хронический лимфолейкоз), Стадия IV/B/E 0,0005 n.d. MR
2 4 69/м MCL, Стадия IV/B 0,0015 n.i. SD
5 49/м MCL, Стадия IV/A/S 0,0015 n.d. SD
6 71/м MCL, Стадия IV/B/E 0,0015 n.i. PD
7 77/м MCL, Стадия IV/B/E/S 0,0015 n.i. SD
8 65/м CLL, Стадия IV/B/E/S 0,0015 n.d. PD
9 75/м FL (фолликулярная лимфома), Стадия II/В 0,0015 n.i. SD
3 10 58/м MCL, Стадия III/B/S 0,005 n.i. PD
11 68/ж FL, Стадия IV/B 0,005 n.d. SD
12 65/м MCL, Стадия III/A/E 0,005 n.i. SD
4a 13 60/м SLL, Стадия IV/B/S 0,015 Полная PR
14 73/м MCL, Стадия II/A/E 0,015 n.i. SD
15 44/м FL, Стадия IV/B/E/S 0,015 Частичная PR
16 61/м PL, Стадия IV/A/S 0,015 Полная CR (7 мес.)
17 67/м MZL (лимфома маргинальной зоны), Стадия IV/B/S 0,015 n.i. n.e.
18 64/м FL, Стадия IV/A/E 0,015 n.i. PD
19 75/м MCL, Стадия III/A 0,015 n.i. n.e.
20 65/ж FL; Стадия III/A 0,015 n.i. SD
21 60/м MCL, Стадия IV/A/E 0,015 нет SD
22 67/ж FL, Стадия IV/B 0,015 Полная MR
23 67/м DLBCL (диффузная В-крупноклеточная лимфома), Стадия III/В 0,015 n.i. n.e.
24 65/ж FL, Стадия III/A 0,015 n.d. SD
25 74/ж WD (болезнь Уиппла), Стадия IV/B 0,015 Частичная SD
5 26 67/м MCL, Стадия IV/A 0,03 Полная SD
27 48/м FL, Стадия III/A 0,03 n.i. PD
28 58/м MCL, Стадия III/A 0,03 n.i. CR (10 мес.+)
29 45/ж MCL, Стадия IV/B 0,03 Частичная PD
30 59/м MZL, Стадия III/A 0,03 n.i. n.е.
31 43/м FL, Стадия III/A 0,03 n.i. MR
6 32 72/м MCL, Стадия IV/A 0,06 Полная PR
33 55/м MCL, Стадия IV/B 0,06 Полная CR (4 мес.+)
34 52/м FL, Стадия IV/A 0,06 n.i. CR b (1 нед.+)
*Централизованно подтвержденные полные (CR) и частичные (PR) ответные реакции согласно критериям Cheson выделены жирным шрифтом; MR - минимальная ответная реакция (от ≥25 до <50%); SD - стабильное заболевание; PD - прогрессирующее заболевание; в круглых скобках дан период времени от первого документального подтверждения ответной реакции; + означает существующую на данный момент ответную реакцию.
aГруппа 4 была увеличена с целью исследования трех разных режимов начала лечения.
bPR через 8 недель лечения, которая перешла в CR после дополнительного 4-недельного цикла лечения такой же дозой после 7 недель без лечения.
n.e.: не оценивали, поскольку период лечения был менее 7 сут.
n.d.: не определяли (с инфильтрацией, но второй биопсии по окончании лечения не делали).
n.i.: без инфильтрации в начале лечения.
Таблица 4
Частота неблагоприятных явлений, наблюдаемая во время лечения
Независимые от режима неблагоприятные явления, имеющие место у не менее чем 3 пациентов (N=34) Степень 1-4 N (%) Степень 3-4 N (%)
Гипертермия 22 (64,7) 2 (5,9)
Лейкопения 21 (61,8) 11(32,4)
Лимфопения 21 (61,8) 21 (61,8)
Коагулопатия (увеличение количества D- 16(47,1) 6(17,6)
димеров)
Ферментная аномалия (АР, LDH, CRP) 16 (47,1) 10 (29,4)
Нарушение функции печени (ALT, AST, GGT) 16 (47,1) 1 (2,9)
Анемия 13 (38,2) 5 (14,7)
Озноб 13 (38,2) 0 (0,0)
Головная боль 12 (35,3) 1 (2,9)
Гипокалиемия 12 (35,3) 2 (5,9)
Тромбоцитопения 12 (35,3) 6 (17,6)
Увеличение массы 12 (35,3) 0 (0,0)
Гипергликемия 11 (32,4) 2 (5,9)
Нейтропения 11 (32,4) 8 (23,5)
Гематурия 10 (29,4) 0 (0,0)
Периферический отек 10 (29,4) 2 (5,9)
Анорексия 9 (26,5) 1 (2,9)
Диарея 9 (26,5) 0 (0,0)
Уменьшение массы 9 (26,5) 0 (0,0)
Утомляемость 8 (23,5) 1 (2,9)
Протеинурия 8 (23,5) 0 (0,0)
Гипокальциемия 7 (20,6) 2 (5,9)
Нарушение функции панкреатических ферментов 7 (20,6) 0 (0,0)
Кашель 6 (17,6) 0 (0,0)
Диспноэ 6 (17,6) 0 (0,0)
Боль в спине 5 (14,7) 0 (0,0)
Боль в месте введения катетера 5 (14,7) 0 (0,0)
Гипербилирубинемия 5 (14,7) 2 (5,9)
Гипоальбуминемия 5 (14,7) 0 (0,0)
Гипогаммаглобулинемия 5 (14,7) 1 (2,9)
Гипопротеинемия 5 (14,7) 0 (0,0)
Плевральный выпот 5 (14,7) 1 (2,9)
Рвота 5 (14,7) 0 (0,0)
Астения 4 (11,8) 1 (2,9)
Состояние спутанного сознания 4 (11,8) 0 (0,0)
Запор 4 (11,8) 0 (0,0)
Головокружение 4 (11,8) 0 (0,0)
Гипертензия 4 (11,8) 0 (0,0)
Гипонатриемия 4 (11,8) 2 (5,9)
Сухость слизистых оболочек 4 (11,8) 0 (0,0)
Мышечные спазмы 4 (11,8) 0 (0,0)
Тошнота 4 (11,8) 0 (0,0)
Ночная потливость 4 (11,8) 0 (0,0)
Абдоминальная боль 3 (8,8) 1 (2,9)
Асциты 3 (8,8) 0 (0,0)
Гиперкоагуляция 3 (8,8) 0 (0,0)
Гипергидроз 3 (8,8) 0 (0,0)
Гипоглобулинемия 3 (8,8) 0 (0,0)
Бессонница 3 (8.8) 0 (0,0)
Расстройство печени 3 (8,8) 1 (2,9)
Ринофарингит 3 (8,8) 0 (0,0)
Зуд 3 (8,8) 0 (0,0)
Использованные сокращения: АЕ - неблагоприятное явление; АР - щелочная фосфатаза; LDH - лактатдегидрогеназа; CRP - C-реактивный белок; ALT - аланинтрансаминаза; AST - аспартаттрансаминаза; GGT - гамма-глутамилтрансфераза; данные по АЕ с дополнительным циклом лечения пациента 34 пока еще на включены.

Как объяснено выше, традиционные CD3-связывающие молекулы (описанные, например, в WO 99/54440), способные связываться с зависимым от окружения эпитопом, даже функциональные, приводят к нежелательному эффекту перераспределения Т-клеток у пациентов, вызывающему неблагоприятные в отношении ЦНС явления. В противоположность этому, связывающие молекулы по настоящему изобретению, связываясь с независимыми от окружения N-концевыми аминокислотами 1-27 CD3-эпсилон-цепи, не вызывают таких эффектов перераспределения Т-клеток. Следовательно, CD3-связывающие молекулы по изобретению ассоциируются с лучшим профилем безопасности по сравнению с традиционными CD3-связывающими молекулами.

14. Биспецифические CD3-связывающие молекулы по изобретению, индуцирующие опосредованный Т-клетками лизис клеток-мишеней путем распознавания поверхностного антигена-мишени, истощают антиген-положительные клетки-мишени in vivo

Биспецифическая CD3-связывающая молекула по изобретению, распознающая CD33 в качестве антигена-мишени, истощает CD33-положительные циркулирующие моноциты в периферической крови яванских макаков

Конструкцию CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL (аминокислотная последовательность: SEQ ID NO:267) продуцировали путем экспрессии в клетках СНО, используя кодирующую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:268. Кодирующие последовательности (1) N-концевого лидерного пептида тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащего стартовый кодон, встроенный в консенсусную последовательность Козака, и (2) С-концевой His6-метки, за которой следует стоп-кодон, обе присоединяли, в рамке считывания, к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:268, затем результирующий фрагмент ДНК, полученный генным синтезом, вставляли в сайт множественного клонирования экспрессирующего вектора pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol. Immunother. 50 (2001) 141-150). Стабильную трансфекцию дефектных по DHFR клеток СНО, селекцию DHFR-положительных трансфектантов, секретирующих CD3-связывающую молекулу CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, в культуральный супернатант и амплификацию генов с использованием метотрексата для повышения уровней экспрессии осуществляли, как описано в Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025. Аналитический SEC-профиль CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL для использования у яванских макаков показал, что тестируемое вещество почти полностью состояло из мономера. Эффективность тестируемого вещества измеряли в анализе цитотоксичности, как описано в Примере 16.5, используя клетки СНО, трансфицированные CD33 яванского макака, в качестве клеток-мишеней и Т-клеточную линию 4119LnPx макака в качестве источника эффекторных клеток (Фиг.25). Было определено, что концентрация CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, необходимая для полумаксимального лизиса клеток-мишеней (ЕС50) эффекторными Т-клетками, составила 2,7 нг/мл.

Молодым (в возрасте приблизительно 3 года) взрослых яванских макаков (Масаса fascicularis) вводили посредством непрерывной внутривенной инфузии CD3-свяэывающую молекулу CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL при разных скоростях потока (т.е. при разных уровнях доз) для исследования истощения циркулирующих CD33-положительных моноцитов в периферической крови. Эта ситуация эквивалентна лечению традиционной CD3-связывающей молекулой CD19xCD3 (специфичной к CD19 на В-клетках и CD3 на Т-клетках) тех пациентов с B-NHL, у которых имеются циркулирующие CD19-положительные целевые В-клетки (смотри, например, WO 99/54440). Истощение циркулирующих CD19-положительных целевых В-клеток в периферической крови оказалось адекватным эквивалентом общей клинической эффективности традиционной CD3-связывающей молекулы (CD19xCD3, предложенной в WO 99/54440) у пациентов с CD19-положительными В-клеточными малигномами, подобными B-NHL. Аналогично, истощение циркулирующих CD33-положительных моноцитов в периферической крови рассматривается как адекватный эквивалент общей клинической эффективности CD33-направленных биспецифических CD3-связывающих молекул по изобретению, таких как CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL, у пациентов с CD33-положительными миелоидными малигномами, такими как AML (острый миелоидный лейкоз).

Непрерывную инфузию проводили способом с использованием поворотного механизма следующим образом: Обезьянам через бедренную вену в полую хвостовую вену вводят венозный катетер. Катетер продвигают подкожно до задней плечевой области и выводят на поверхность тела около задней лопатки. Затем трубку пропускают через корсет и защитную пружину. Корсет закрепляют вокруг животного, а катетер посредством трубки присоединяют к инфузионному насосу.

Раствор для введения (1,25 М лизин, 0,1% Tween 80, рН 7) без тестируемого вещества вводили инфузией непрерывно при скорости 48 мл/24 ч в течение 7 суток до начала лечения, чтобы животные привыкли к условиям инфузии. Лечение начинали путем добавления тестируемого вещества CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL в раствор для введения в количестве, необходимом для каждого индивидуального тестируемого уровня дозы (т.е. скорости потока CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL). Инфузионный резервуар меняли каждые сутки в течение всей фазы привыкания и лечения. Планируемая продолжительность лечения составляла 7 суток, за исключением уровня дозы 120 мкг/м2/24 ч, при котором животные получали лечение в течение 14 суток.

Ход изменения во времени абсолютных количеств циркулирующих Т-клеток и CD33-положительных моноцитов определяли 4- или 3-цветным FACS-анализом соответственно.

Сбор образцов крови и стандартный анализ

Образцы крови (1 мл) получали до начала непрерывной инфузии и через 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 часа после начала непрерывной инфузии MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL, а также через 7 и 14 суток (и через 9 суток при уровне дозы 120 мкг/м2/24 ч) лечения, используя EDTA-содержащие пробирки Vacutainer™ (Becton Dickinson), которые доставлялись для анализа при 4°С. В некоторых случаях по практическим причинам имели место небольшие вариации этих временных точек. FACS-анализ субпопуляций лимфоцитов осуществляли в пределах периода времени 24-48 ч после сбора образцов крови. Абсолютное количество субпопуляций лейкоцитов в образцах крови определяли дифференциальным анализом крови в обычной ветеринарной лаборатории.

Выделение РВМС из образцов крови

РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли в соответствии с протоколом, описанным выше в Примере 13, с корректировками используемых объемов.

Окрашивание РВМС антителами с флуоресцентной меткой против молекул клеточной поверхности

Моноклональные антитела, способные реагировать с антигенами яванского макака, получали от Becton Dickinson (1№ по каталогу 345784, 2№ по каталогу 556647, 3№ по каталогу 552851, 6№ по каталогу 557710), Beckman Coulter (4№ по каталогу IM2470) и Miltenyi (5№ по каталогу 130-091-732) и использовали в соответствии с рекомендациями производителей. От 5×105 до 1×106 клеток окрашивали, используя следующую комбинацию антител: анти-CD141 (FITC) x анти-CD562 (РЕ) x анти-CD33 (PerCP) x анти-CD194 (АРС) и анти-CD141 (FITC) x анти-CD335 (РЕ) x анти-CD166 (Alexa Fluor 647™). Дополнительные стадии выполняли, как описано в Примере 13 выше.

Проточно-цитометрическое определение окрашенных лимфоцитов FACS-анализом

Сбор данных осуществляли с использованием 4-цветного BD FACSCalibur™ (Becton Dickinson). Для каждого измерения брали 1×104 клеток определенных субпопуляций лимфоцитов. Чтобы получить процентное содержание субпопуляций лимфоцитов и провести классификацию интенсивностей экспрессии молекул клеточной поверхности, осуществляли статистический анализ с использованием программы CellQuest Pro™ (Becton Dickinson). Затем процентные содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов относительно общих лимфоцитов (т.е. В-клетки плюс Т-клетки плюс NK-клетки, за исключением миелоидных клеток, с CD13/14-окрашиванием) по данным FACS коррелировали с количеством лимфоцитов, полученным в результате проведения дифференциального анализа крови, для подсчета абсолютных количеств Т-клеток (CD3+, CD56-, CD13/14-). Абсолютные количества CD33-положительных моноцитов рассчитывали путем умножения количества моноцитов, полученного в результате проведения дифференциального анализа крови, на соответствующие отношения CD33-положительных моноцитов (CD33+, CD14+) ко всем моноцитам (CD14+) по данным FACS.

Процентное содержание по сравнению с исходным уровнем (т.е. 100%) абсолютных количеств циркулирующих CD33-положительных моноцитов в конце лечения с применением CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL в 4 группах из 2 яванских макаков с увеличением дозы внутри группы от 30 до 60 и от 240 до 1000 мкг/м2/24 ч представлены на Фиг.26А.

Как показано на Фиг.26 А, непрерывная внутривенная инфузия CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL индуцирует истощение циркулирующих CD33-положительных моноцитов дозозависимым образом. Несмотря на то, что при 30 мкг/м2/24 ч все еще не наблюдалось никакого заметного истощения циркулирующих CD33-положительных моноцитов, первое изменение в сторону уменьшения числа CD33-положительных моноцитов стало заметным при 60 мкг/м2/24 ч через 7 суток лечения. При 240 мкг/м2/24 ч циркулирующие CD33-положительные моноциты были почти полностью истощены в периферической крови через 3 суток лечения. Это достигалось еще быстрее при 1000 мкг/м2/24 ч, когда истощение циркулирующих CD33-положительных моноцитов в периферической крови завершалось уже через 1 сутки лечения.

Эти данные были подтверждены результатами, представленными на Фиг.26В, которые демонстрируют истощение циркулирующих CD33-положительных моноцитов на две трети и на 50% по сравнению с соответствующим исходным уровнем у двух яванских макаков, которых лечили путем непрерывной инфузии CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL при дозе 120 мкг/м2/24 ч в течение 14 суток.

Этот результат явно указывает на клиническую эффективность CD3-связывающих молекул по изобретению в целом и биспецифических CD33-направленных CD3-связывающих молекул по изобретению для лечения CD33-положительных малигном, таких как AML, в частности. Кроме того, перераспределение Т-клеток во время начальной фазы лечения с применением CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL в присутствии циркулирующих клеток-мишеней (т.е. CD33-положительных моноцитов) оказалось менее ярко выраженным, чем перераспределение Т-клеток во время начальной фазы лечения с применением традиционных CD19xCD3-конструкций, как описано в WO 99/54440 для пациентов с B-NHL со значительным количеством циркулирующих клеток-мишеней (т.е. CD19-положительных В-клеток), как представлено на Фиг.22. Несмотря на то, что Т-клетки полностью исчезают из кровотока после начала инфузии CD19xCD3 и не появляются вновь до тех пор, пока циркулирующие CD19-положительные целевые В-клетки не будут истощены в периферической крови (Фиг.22), начальное исчезновение циркулирующих Т-клеток не будет полным после начала инфузии CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL. и количество Т-клеток все еще будет восстанавливаться, пока присутствуют циркулирующие CD33-положительные клетки-мишени (Фиг.26В). Это является подтверждением того, что CD3-связывающие молекулы по изобретению (направленные против и созданные против эпитопа CD3ε(эпсилон)-цеп