Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба



Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба
Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ камчатского краба

 


Владельцы патента RU 2560264:

Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "ТРИНИТА"(ООО НПП "ТРИНИТА") (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор, с последующей трансформацией в клетки E. coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E. coli культивируют в течение не более 20 час при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включения из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и 0,7 М NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в буфере 20 мМ MES-NaOH pH 6.0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6.0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией. Изобретение позволяет получить ингибитор сериновых протеиназ, обладающий улучшенными ингибиторными свойствами по отношению к коллагеназе, трипсину и субтилизину. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных и высокоактивных препаратов ингибиторов ферментов, которые могут быть использованы в медицине, косметологии, ветеринарии, а также для исследовательских целей.

Ингибиторы сериновых протеиназ (серпины, англ. serpins) представляют собой большую группу белков, которые играют важную роль во многих важных физиологических процессах, таких как свертывание крови, фибринолиз, перенос гормонов. Серпины входят в систему комплемента - комплекс белков, постоянно присутствующих в крови. Это каскадная система протеолитических ферментов, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов. В литературе имеются сведения о роли серпинов в предотвращении адгезии раковых клеток, инвазии в стенки кровеносных сосудов, препятствии метастазирования. Например, серпин камчатского краба способен ингибировать коллагеназу камчатского краба.

Коллагенолитические ферменты устойчивы к действию известных ингибиторов трипсина и химотрипсина. Коллагеназы вызывают деградацию коллагена, что связано с преждевременным старением кожи. Поэтому ингибитор коллагеназ можно ввести в различные косметические средства (кремы, лосьоны, гели, мази) для предотвращения образования морщин или лечения атрофии кожи.

Известен способ получения ингибитора коллагеназ из промысловых видов крабов, включающий гомогенизацию сырья, содержащего протеолитические ферменты, отделение экстракта центрифугированием, обработку полученного экстракта, очистку, концентрирование, обессоливание и лиофильную сушку препарата, в качестве вышеназванного сырья используют гепатопанкреас промысловых видов крабов, обработку экстракта ведут путем добавлением сульфата аммония 60-70% насыщения, отделяют полученный комплекс ферментов центрифугированием, растворяют последний в воде с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора, при этом очистку, концентрирование и обессоливание ферментов ведут на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа с промывкой полученного супернатанта водой и последующим его прогреванием при 80-85°С в течение 25-40 мин.

Для достижения 50% ингибирования по вышеуказанному способу необходимо к 1 мкг препарата коллагеназы «Морикраза» добавить 320 мкг ингибитора.

[Патент РФ 2292393, G21N 9/64, опубл. 03.03.2005].

Известен способ получения ингибитора коллагеназ с антикоагуляционным действием. Для решения поставленной задачи используют грубый препарат ингибитора коллагеназ из гепатопанкреаса камчатского краба. Для этого гомогенизированный препарат растворяют в 0,1 М ацетате аммония (pH=6,4), центрифугируют при 12000-15000 g. Супернатант высаливают добавлением сульфата аммония до 35-43% насыщения и отделяют осадок центрифугированием. Далее осадок растворяют в 0,01 М Трис-HCl буфере pH 7,0-8,0 и нагревают при температуре 80-85°С, в течение 40 мин. С последующим центрифугированием 15 мин при 12000 g. Сульфат пасту растворяют в буфере (0,05М Трис-HCl, 0,5 М NaCl; pH 8,0) и наносят на колонку Sephadex G100. Активные фракции объединяют и концентрируют ультрафильтрацией на мембране, пропускающей белки с молекулярной массой 30-50 кДа, промывают пятью объемами дистиллированной воды и высушивают лиофильно.

[Патент РФ №2403284, G12N 9/00, опубл. 25.11.2009].

Наиболее близким является способ получения ингибитора коллагеназ с противоопухолевым действием, который заключается в следующем. В качестве источника противоопухолевого препарата используют препарат ингибитора коллагеназы из гепатопанкреаса камчатского краба, полученный по способу Патент РФ 2292393 С2, 03.03.2005, Способ получения ингибитора коллагеназы с противоопухолевым действием из гепатопанкреаса камчатского краба характеризуется проведением гомогенизации сырья в 0,1 М ацетате аммония, содержащем 0,1-1 мМ ацетата кальция при pH 6,4-7,0, гомогенат центрифугируют, к супернатанту добавляют сульфат аммония до 60-70%-ного насыщения, полученный комплекс ферментов отделяют центрифугированием, растворяют последний в дистиллированной воде с добавлением 0,1-1 мМ ацетата кальция до получения истинного раствора с последующей очисткой, концентрированием и обессоливанием ферментов на поливолоконной мембране с размером пор 100 кДа и промывкой концентрата, содержащего ингибитор коллагеназы, дистиллированной водой с последующим прогреванием до 60-100°С, отделением осадка центрифугированием, полученный при этом суммарный препарат ингибитора коллагеназы растворяют в 0,05М Трис-HCl буфере, pH 7,0-8,0 и хроматографируют на колонке с аффинным сорбентом - аргинин-силохромом, с последующей элюцией активных ферментов Трис-HCl буфером с добавлением 1 М NaCl и 20% изопропилового спирта, фракцию, содержащую ингибитор, упаривают на роторном испарителе при 60-80°С и концентрируют ультрафильтрацией на мембране с размером пор 30-50 кДа, концентрат, содержащий целевой продукт, промывают раствором хлористого натрия и лиофильно высушивают.

[Патент РФ №2412995, G12N 9/00, опубл. 25.11.2009].

Для достижения 50% ингибирования «Морикразы» необходим 96-кратный избыток препарата ингибитора. Минимальное количество препарата, которое вызывает замедление роста клеток рабдомиосаркомы человека, составляет 0,25 мг/мл. Ингибитор в таких количествах не может применяться в медицинских целях. Достижение более низких доз при использовании данного способа принципиально невозможно по ряду причин.

Особенностью серпинов, к которым относится эндогенный ингибитор камчатского краба, является конформационная подвижность их молекулы. Серпины активны только тогда, когда их реакционный центр экспонирован на поверхности белковой глобулы. Существуют латентная и метастабильная неактивные формы, когда реактивная петля втянута вглубь молекулы.

Основным механизмом, который может быть применен ко всем реакциям серпинов с сериновыми протеиназами, а также к некоторым реакциям серпинов с цистеиновыми протеиназами, является суицидный механизм ингибирования, показанный на фиг.1.

Механизм заключается в следующем: протеиназамишень признает реактивную петлю ингибитора как потенциальный субстрат. Таким образом, первым шагом является образование нековалентного комплекса Михаэлиса, дальнейшая атака активным центром сериновой протеиназы пептидной связи серпина приводит к образованию тетраэдрического переходного состояния, судьба которого двояка. Он может либо высвободить свободный фермент и расщепленный серпин (субстратный путь, первый продукт), либо, расщепив активную связь реактивной петли, «втянуть» фермент, образовав тем самым кинетически запертый комплекс (ингибирование, второй продукт), который может со временем переходить в первый продукт. Каждая реакция характеризуется своей константой, переходом кинетически запертого комплекса в первый продукт можно пренебречь, поскольку константа этого перехода обычно намного меньше константы образования первого продукта.

Таким образом, при совместном выделении препарата протеиназ и ингибитора большая часть ингибитора связывается в прочный комплекс с протеиназами, а также подвергается расщеплению протеолитическими ферментами, что отрицательно сказывается на выходе активного ингибитора. Кроме того, очистка ингибитора по способу не позволяет отделить от активного белка неактивные формы, которые отличаются только конформацией молекулы. Поэтому для полного ингибирования приходится брать, как минимум, десятикратный избыток ингибитора.

Техническая задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в получении рекомбинантного ингибитора PC камчатского краба повышенной чистоты и активности.

Технический результат полученный при реализации предлагаемого технического решения состоит в улучшении ингибиторных свойств полученного рекомбинантного ингибитора по отношению к ряду протеолитических ферментов.

Поставленная задача достигается способом получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающимся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученные ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC с аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор, с последующей трансформацией в клетки Е.coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E.coli культивируют в течение не более 20 час при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включений из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включений растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в 20 мМ MES-NaOH буфере pH 6,0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6,0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией.

Преимущественно к ДНК ингибитора PC амплифицируют последовательно 18 и 25 циклами ПЦР соответственно в режимах - 95° в течение 10 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 3 мин и при 95°C в течение 7 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 1 мин.

Обычно культивирование трансформированных клеток E.coli ведут в автоиндукционной среде ZYM 5052 или с использованием Lysogeny broth (LB) с дополнительной индукцией 0,4 mM IPTG, а осадок клеток биомассы ресуспендируют в буфере лизиса, содержащего 1 mM PMSF и 5 М 2-меркаптоэтанол,

Целесообразно ренатурацию растворенного ингибитора вести в 20 мМ MES-NaOH буфере pH 6,0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6,0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000.

Предварительную очистку ведут на анионообменном сорбенте DEAE-Toyopearl или на катионообменном сорбенте Mono S 5/50 GL.

Указанный технический результат достигается за счет получения следующим образом рекомбинантного ингибитора PC камчатского краба.

В качестве источника получения ингибитора вместо гепатопанкреаса камчатского краба используется штамм E.coli, трансформированный плазмидой, несущей ген ингибитора камчатского краба, для чего кДНК ингибитора PC получают на основе мРНК, выделенной из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus любым из известных методов молекулярной биологии. Далее кДНК ингибитора PC амплифицируют методом ПЦР, встраивают в экспрессионный вектор, например вектор рЕТ28а, и трансформируют этой конструкцией соответствующий штамм. Следующим этапом является культивирование трансформированных клеток E.coli, индукция и экспрессия в течение 5-20 часов. Для выделения ингибитора PC из телец включения полученную биомассу разрушают, центрифугируют, отмывают примесные белки и растворяют в буфере с мочевиной.

Проводят предварительную очистку препарата в денатурированном виде методом хроматографии на различных колонках. После чего проводят процедуру регенерации растворенного ингибитора, т.н. рефолдинг, в различных растворах. После рефолдинга возможна очистка полученного препарата с использованием хроматографии, например ионообменной на SP-Sepharose.

Полученный препарат характеризуется аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг.2.

Ингибиторные активности тестировали по трипсину с помощью хромогенного субстрата Bz-Arg-pNA, растворенного в DMF (5 мг/мл). Для этого 10 мкл трипсина (1 мг/мл в буфера А: 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0) с 200 мкл раствора ингибитора инкубировали 40 минут, затем добавляли 585 мкл буфера А и 5 мкл субстрата (5 мг/мл) и выдерживали в термостате при 37°C до появления желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 50% уксусной кислоты, центрифугировали 5 мин при 12000 g и измеряли поглощение A410.

Активность рассчитывалась по формуле:

где

А410 - оптическое поглощение раствора при длине волны 410 нм,

1000 - коэффициент пересчета объемов к 1 мл V - общий объем смеси (мкл),

ε410 - молярный коэффициент поглощения n-нитроанилина при длине волны 410 нм (8900 М-1*см-1),

Δt - время с момента внесения фермента до остановки реакции (мин). Остаточную активность трипсина вычисляли по разности между активностью трипсина без ингибитора (100%) и таковой в присутствии ингибитора,

υ - аликвота исследуемого раствора белка.

Пример 1

Синтезируют первую цепь кДНК из суммарной РНК из гепатопанкреаса краба обратной транскрипцией с SMART Oligo II и CDS праймерами (список использованных праймеров представлен на фиг.3), амплифицируют 18 циклами ПЦР в режиме 95°C - 10 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 3 мин.

На фиг.4 представлен агарозный гель-электрофорез образца амплифицированной кДНК. М - маркер молекулярного веса ДНК, cDNA - образец кДНК.

Амплифицированную кДНК разбавляют в 40 раз и используют в качестве матрицы для ПЦР с праймерами Serp_Nde I (DIR-N) / SerpJHind III (KEV-М).(фиг.3). Проводят 25 циклов ПЦР в следующем режиме амплификации: 95°C - 7 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 1 мин. Результат - агарозный гель-электрофорез продуктов ПЦР представлен на фиг.5.

Полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, клонируют в вектор рЕТ28а (на фиг. 6 показана карта полученной конструкции) по сайтам Nde I и Hind III с последующей трансформацией в клетки E.coli BL21(DE3). Для получения биомассы клеток с рекомбинантным ингибитором PC единичную колонию трансформированных клеток E.coli BL21(DE3) pET28a/Serp-N культивируют в 1 л среды ZYM 5052 при 37°C в течение 20 часов. Далее биомассу осаждают центрифугированием. Клетки промывают и снова центрифугируют. Затем осадок клеток ресуспендируют в буфере лизиса, содержащего 1 mM PMSF и 5 тМ 2-меркаптоэтанол, и лизируют ультразвуком на ледяной бане. Супернатант удаляют, а к лизату добавляют 40 мл буфера 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 мМ NaCl, 25% сахароза, 2 мМ EDTA, 1.5% Triton X-100, 1.5% дозоксихолат-Na и тщательно ресуспендируют. Лизат центрифугируют, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и подвергают предварительной очистке на анионообменном сорбенте DEAE-Toyopearl с градиентной элюцией тем же буфером, содержащим 0,7 М NaCl. Ренатурацию проводят методом снижения концентрации денатуранта в 20 мМ MES-NaOH буфер pH 6,0. Фракции денатурированного белка, прошедшие хроматографию на DEAE-Toyopearl, разбавляют по каплям в 20 раз в 20 мМ MES-NaOH буфере pH 6,0. Полученный раствор инкубируют в течение ночи при 4°С и наносят на колонку с SP-Sepharose. Сорбированный белок элюируют 500 mM NaCl в 20 мМ MES-NaOH pH 6,0 буфере.

На фиг.7 представлен SDS-PAGE электрофорез ренатурированного белка после хроматографии на SP-Sepharose, а на фиг.8 - спектр поглощения фракции ренатурированного белка.

Как видно из представленного материала, - ренатурированный ингибитор PC, прошедший хроматографическую очистку на SP-Sepharose, характеризуется высокой чистотой и типичным для белков спектром поглощения с максимумом при 280 нм. Выход ренатурированного продукта составляет 0,5 мг/литр культуры клеток.

Пример 2

Клонирование, вставку в вектор и трансформацию проводят как и в примере 1.

Для получения биомассы клеток с рекомбинантным ингибитором PC единичную колонию трансформированных клеток E.coli BL21(DE3) pET28a/Serp-N культивируют в 1 л среды LB при 37°С в течение 2 часов, проводят индукцию 0,4 mM IPTG и далее продолжают культивировать в течение 5 часов. Далее биомассу осаждают центрифугированием. Клетки промывают и снова центрифугируют. Затем осадок клеток ресуспендируют в буфере лизиса, содержащего 1 mM PMSF и 5 mM 2-меркаптоэтанол, и лизируют ультразвуком на ледяной бане. Супернатант удаляют, а к лизату добавляют 40 мл буфера 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 мМ NaCl, 25% сахароза, 2 мМ EDTA, 1.5% Triton X-100, 1,5% дозоксихолат-Na и тщательно ресуспендируют. Лизат центрифугируют, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и подвергают очистке на катионообменном сорбенте Mono S 5/50 GL с градиентной элюцией тем же буфером, содержащим 0,7 М NaCl. Ренатурацию проводят методом снижения концентрации денатуранта в 20 мМ MES-NaOH буфер pH 6,0. Фракции денатурированного белка, прошедшие хроматографию на Mono S 5/50 GL, разбавляют по каплям в 20 раз в 20 мМ MES-NaOH буфере pH 6,0, 2М NaCl 0,05% PEG 6000. Выход продукта составляет 0,8 мг/литр культуры клеток E.coli.

Сравнительное ингибирование трех сериновых протеиназ нативным и рекомбинантным ингибиторами PC показало, что, например, для ингибирования одного и того же количества коллагеназы PC необходимо в 4,8 раза меньшее количество рекомбинантного ингибитора, чем нативного, а для трипсина быка в 14 раз меньшие количества. Количество ингибитора (мг), необходимое для 50% ингибирования активности 1 мг сериновых протеиназ, представлено в таблице 1.

Таблица 1
Протеиназа Коллагеназа Трипсин Субтилизин
Предлагаемый способ 2 0,4 4
Прототип 96 3 19

Таким образом, поставленная задача повышения активности препарата ингибитора была достигнута. Это дает возможность применять рекомбинантный ингибитор в значительно меньших количествах по сравнению с нативным.

1. Способ получения рекомбинантного ингибитора сериновых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, заключающийся в том, что из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtchaticus выделяют РНК и осуществляют синтез кДНК ингибитора PC из суммарной РНК методом обратной транскрипции, которую амплифицируют методом полимеразной цепной реакции с праймерами, полученный ПЦР-продукт, содержащий ген ингибитора PC, кодирующий ингибитор PC c аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 2, клонируют в экспрессионный вектор с последующей трансформацией в клетки E. coli, полученные при этом рекомбинантные штаммы E. coli культивируют в течение не более 20 час. при 37°C, а полученную биомассу подвергают центрифугированию, отмывают от остатков среды, ресуспендируют в буфере лизиса и лизируют, выделяют тельца включения из полученной биомассы разрушением ультразвуком, лизат ресуспендируют в буфере промывки и снова осаждают тельца включения, полученные тельца включения растворяют в 8 М мочевине и повергают предварительной очистке на сорбенте с градиентной элюцией буфером, содержащем 8 М мочевину и 0,7 М NaCl, после чего проводят ренатурацию растворенного ингибитора, методом снижения концентрации денатуранта в буфере 20 мМ MES-NaOH pH 6.0 или 20 мМ MES-NaOH pH 6.0, 2 М NaCl, 0,05% PEG 6000 и последующую очистку препарата ионообменной хроматографией.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что кДНК ингибитора PC амплифицируют последовательно 18 и 25 циклами ПЦР соответственно в режимах - 95°C в течение 10 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 3 мин и при 95°C в течение 7 сек; 65°C - 20 сек; 72°C - 1 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование трансформированных клеток E. coli ведут в автоиндукционной среде ZYM 5052 или с использованием Lysogeny broth (LB) с дополнительной индукцией 0,4 мМ IPTG.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осадок клеток биомассы ресуспендируют в буфере лизиса, содержащего 1 мМ PMSF и 5 М 2-меркаптоэтанол.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительную очистку ведут на анионообменном сорбенте DEAE-Toyopearl.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительную очистку ведут на катионообменном сорбенте Mono S 5/50 GL.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстрагирования говяжьего пепсина.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к лечению гемофилии. Конъюгаты фактора IX модифицированы для включения биосовместимого полимерного фрагмента.
Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов, главным образом из сырья животного происхождения, и может быть использовано на предприятиях по переработке животного сырья, например для приготовления применяемых в сыроделии молокосвертывающих ферментных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa), и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к производству сычужного фермента из сычугов телят, ягнят и козлят-молочников и может быть использовано в молочной промышленности при производстве молокосвертывающих ферментных препаратов, а также в ветеринарии, микробиологической промышленности и медицине.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных высокоактивных препаратов ингибиторов, которые могут быть использованы в биохимии, медицине, фармакологии, патофизиологии, для терапии тромбоэмболических заболеваний, а также для исследовательских целей.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению сериновых протеаз, содержащих GLA-остаток, и может быть использовано в медицине. .

Настоящее изобретение относится к способу предоставления вариантов протеазы или амилазы со значением эффективности, по меньшей мере, в одном интересующем тесте, превышающим показатель эффективности для указанного фермента дикого типа.

Изобретение относится к производному комплекса металл-сален. Комплекс представлен как А-В-С, где А: комплекс металл-сален; В: зона связи, включающая по меньшей мере одну дисульфидную связь; и С: функциональная молекула, состоящая из по меньшей мере одного из ферментов, антител, антигенов, пептидов, аминокислот, олигонуклеотидов, белков, нуклеиновых кислот и молекул лекарственного средства.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и представляет собой способ пивоварения, включающий добавление к суслу термостабильной протеазы после фильтрации сусла, но перед варкой сусла, причем термостабильность протеазы означает, что активность этой протеазы составляет по меньшей мере 70% ее активности, измеренной согласно следующему методу: протеазу разводят до концентрации 1 мг/мл в аналитическом буфере, содержащем 100 ммоль сукциновой кислоты, 100 ммоль HEPES, 100 ммоль CHES, 100 ммоль CABS, 1 ммоль СаСl2, 150 ммоль КСl, 0,01% Тритон Х-100, и с рН, доведенным до 5,5 с помощью NaOH; после чего протеазу преинкубируют i) во льду и ii) 10 мин при 70°С; субстрат, к которому протеаза проявляет активность, суспендируют в 0,01% Тритоне Х-100: для начала реакции в пробирку добавляют 20 мкл протеазы и инкубируют в термомиксере Эппендорфа при 70°С, 1400 об/мин в течение 15 минут; реакцию останавливают помещением пробирок в лед; образцы центрифугируют холодными при 14000 g в течение 3 минут и измеряют оптическую плотность OD590 супернатанта; полученное значение OD590 образцов без протеазы вычитают из полученного значения OD590 образцов, обработанных протеазой; определяют термостабильность протеазы посредством расчета процентной активности протеазы в образцах, преинкубированных при 70°С, относительно активности протеазы в образцах, инкубированных во льду, как 100%-ной активности.

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии эукариотической клетки. Предложен способ получения ядерных протеиназ из негистоновых и гистоновых белков растений, в котором первоначально в определенные интервалы времени от начала замачивания 0 ч, 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 15 ч, 18 ч, 21 ч проводят отделение зародышей от эндосперма с последующей консервацией зародышей в забуференном 80-90% глицерине при минус 25°С, выделяют клеточные ядра, проводят экстракцию ядерных фракций возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия и 6 М гуанидин гидрохлорида с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций гистоновые и негистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13%, 40% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8, пропускают полученные белки с помощью метода аффинной хроматографии через колонку с сефарозой 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина с последующей оценкой протеолитической активности.

Группа изобретений относится к хлебопекарной промышленности. Способ улучшения легкости разжевывания хлебобулочных изделий включает добавление по меньшей мере одной средне-термостойкой или термостойкой сериновой протеазы или металлопротеазы в указанное хлебобулочное изделие, где измеряют параметры текстуры, представляющие собой силу (г) и полную работу (г·сек), необходимые для разрушения идентичного образца хлебобулочного изделия.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который обеспечивает повышение качества (гомогенности) и выхода целевого продукта в условиях, когда гибридный белок обнаруживает дополнительные (скрытые) сайты расщепления энтеропептидазой.
Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. .

Изобретение относится к прикладной биохимии, медицине, ветеринарии и клинической лабораторной диагностике и касается способа определения активности тканевых, бактериальных, вирусных и грибковых протеиназ, расщепляющих иммуноглобулины различных классов.
Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом. Изобретение касается также способа продуцирования энтерокиназы с использованием такой клетки. Изобретение позволяет эффективно получать энтерокиназу. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.
Наверх