Штамм вируса ящура aphtae epizooticae типа а для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а и их контроля



Штамм вируса ящура aphtae epizooticae типа а для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а и их контроля
Штамм вируса ящура aphtae epizooticae типа а для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а и их контроля
Штамм вируса ящура aphtae epizooticae типа а для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа а и их контроля

 


Владельцы патента RU 2560268:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированный в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013. Предложенный штамм вируса может быть использован при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А и их контроля. Штамм способен репродуцироваться в первично-трипсинизированнной монослойной культуре клеток почки свиньи, перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18÷24 часов инкубирования титр инфекционной активности вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,0÷7,5 lg ТЦД50/см3. 1 ил., 6 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Ящур - это острое, контагиозное, вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30÷40.

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов.

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР и РФ в течение последних 50 лет.

К ним относятся следующие штаммы: А7 №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А7 №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае.

Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны.

Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими им в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ» [1, 2, 3].

Известен штамм №550 вируса ящура А22, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах постсоветсткого пространства [4].

В 1990-2000-х годах в Центральной Азии и на Ближнем Востоке доминировали две генетические линии вируса ящура типа А: линия А/Иран/96 (к этой генетической группе относится российский производственный штамм А/Армения/98) и А/Иран/2005. Генетическая линия А/Иран/99 не получила такого широкого распространения, как две упомянутые выше. Штаммы из группы А/Иран/99 и А/Иран/96 не входят в настоящее время в первоочередной перечень рекомендуемых Всемирной референтной лабораторией МЭБ/ФАО по ящуру вакцинных штаммов, тогда как штамм А/Иран/2005 (А/Турция/06)относится к высоко приоритетным [5].

Известен штамм вируса ящура Aphtae epizooticae A №1707 «Армения-98» для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [6].

Выделение в 1998 г. в хозяйстве Охчик Амассийского района Армении от КРС вируса ящура типа А и изучение его филогенетического родства показало, что при сравнительном исследовании первичной структуры гена VP1 штамма вируса ящура типа А №1707 «Армения-98» с производственными штаммами и полевыми изолятами установлено, что изоляты «Армения - 98» идентичны между собой и родственны штаммам типа А Турция/97, Турция/98 и Иран/96. Также установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа A22 (18% различий), куда относится и используемый для производства средств диагностики и специфической профилактики штамм А22 №550.

Производственный штамм А №1707 «Армения-98» применяли в составе противоящурных вакцин в буферной зоне Закавказья.

Известен относящийся этой же линии выделенный в 1999 г. от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия штамм А (Грузия) 1999/№1721 [7].

С 2003 года на территории Ирана был выделен изолят вируса ящура типа А, значительно отличающийся от ранее изученных штаммов этого типа. В течение 2005-2006 гг. ящур типа А получил широкое распространение в странах Западной Азии-Иране, Турции, Саудовской Аравии и Пакистане. В феврале 2006 года ящур типа А линии Иран/05 попал во Фракию - европейскую часть Турции, которая граничит с Болгарией и Грецией. Проведение 100% вакцинации всех жвачных с применением штамма А22 во Фракии в феврале-марте 2006 г. предотвратило распространение ящура в соседние Грецию и Болгарию, однако через 3-4 месяца появились свежие случаи заболевания [8].

Известен штамм вируса ящура А №2045/Киргизия/2007, выделенный в Киргизской Республике от больной ящуром телки в 2007 г., принадлежащий к генетической линии, получившей название А Иран/2005 [9].

Недостатки вышеуказанных штаммов, в том, что приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к настоящему изобретению является штамм А №2045/Киргизия/2007 (прототип).

Вспышка ящура на территории РФ была отмечена в июле 2013 г. во дворах у жителей села Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики в буферной зоне, где КРС и МРС с профилактической целью вакцинировали против ящура типа О, А, Азия-1. Из имевшихся у жителей села 2721 голов КРС разного возраста и 941 голов МРС заболело 23 головы КРС.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и иммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (авторское наименование) вируса ящура типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, был выделен в июле 2013 года от больных животных в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики (экспертиза №2171). Производственный штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А депонирован 28 января 2014 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером (ссылкой): штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 обладает более высокой инфекционной и антигенной активностью.

Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура типа А.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А.

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 значительно отличается от производственных штаммов типа А. Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: А22 №550 - 22,65%, А22/Ирак/64 - 21,66%, А/Иран/96 - 21,43%, А/Армения/98 - 21,98%, А/Турция/06 - 8,23%, А/Иран/05 - 8,75%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 принадлежит к генетической линии Иран 2005 топотипа Азия.

Антигенное родство штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 антигенно отличается от производственных штаммов А22 №550, А22 Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/2006 и А/Киргизия/07. Штамм ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 не является для них близкородственным.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r1) составило для А22 №550 - 0,013, А22 Ирак/64 - 0,02, А/Иран/97 - 0,03, А/Турция/Об - 0,19 и А/Киргизия/2007 - 0,03. При значении r1≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [10, 11].

Биотехнологические характеристики

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 репродуцируется в монослойных культурах клеток: первично трипсинизированной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2. В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,0 до 7,5 lg ТЦД50/см3. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вирус вызывает ЦПД через 5 часов. Вирус сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7х106 Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см3.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в июле 2013 года от подозреваемого в заболевании ящуром КРС из села Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики (экспертиза №2171/2013). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 9 июля 2013 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [12].

Биологические и вирусологические методы включали выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией. Для постановки биопробы в первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5 см3 поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК.

Адаптация эпизоотического изолята А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для гипериммунизации морских свинок. Результаты адаптации вируса к клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакции: РСК с целью идентификации его типовой принадлежности (таблица 3). Проведена проверка штамма на отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2171/Кабардино-Балкарский/2013 выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:2 в РСК. Контаминации посторонними вирусами не обнаружено.

Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении рН 8,0-8,3.

Инактивированный антиген в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см3 внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [12].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5÷1,0 см3 и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 4.

Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций используют штамм вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике. Данные представлены в таблице 5.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Пример 4

Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной типа А штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вирус ящура репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2÷7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001÷0,05 ТЦЦ50 на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре (36°C)÷(37°C). Через 8-10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет (%) 15÷20, то культивирование продолжают еще 2÷3 часа. При достижении количества мертвых клеток (%) 90-95 культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов.

Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см3. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленной ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной (%) 0,025÷0,05. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при (36°C)÷(37°C) и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до (4°C)÷(8°C). В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005÷0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).

Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см3 Р<0,01 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см3. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.

Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные или полипропиленовые флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТ 28085-89.

Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см3, затем подкожно в дозе 10 см3. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 5 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Пример 5

Штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250÷300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000÷10000000 ИД50/1 см3 с антибиотиками, вводят по 0,2÷0,3 см3 в 20÷40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20÷30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в РСК на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.

Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 104,0 ИД50/0,1 см3. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°С÷40°С).

Пример 6

Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов КРС массой 200-250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:4 и третьей группе из 5 голов в разведении 1:16. Четвертая группа из 2 голов осталась без вакцинации.

Объем прививной дозы составил 2,0 см3. На 21 день после вакцинации у 15 вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 в дозе 104,0 ИД50/0,2 см3.

Данные по антигенной и протективной активности вакцины представлены в таблице 6.

Антигенную активность вакцины контролировали по уровню вируснейтрализующих антител в сыворотке крови в РН на монослое первично трипсинизированной культуры клеток СП и в реакции микронейтрализации (РМН) на культуре клеток IB-RS-2. На 21 день после вакцинации уровень вируснейтрализующих антител в РН у КРС, привитых цельной вакциной серий №1 и №2, составил 6,8±0,15 log2 и 6,5±0,41 log2, уровень вируснейтрализующих антител в РМН - 7,6±0,44 log2 и 5,7±0,28 log2.

Через 8 дней после заражения провели патологоанатомическое исследование КРС. Заболели все контрольные животные, 4 животных, привитых разведением вакцины 1:16 (серия №1), и 2 животных, привитых разведением вакцины 1:16 (серия №2).

ИмД50 вакцин серий №1 и №2 составила 0,19 и 0,11 см3. Прививная доза вакцин содержала 10,56 ПД50 и 18,38 ПД50 соответственно, что свидетельствует об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Источники информации

1. Ререр X. Ящур: пер. с нем. Г.А.Сурковой / под ред. и с предисл. канд. вет.наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.

2. Ящур /. А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

3. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев [и др.]. - М.: ВНИИТИБП, 1998. - С.532-548.

4. Промышленный регламент на производство вакцины против ящура типов А, О, С, Азия-1, Сат-1, Сат-2 и Сат-3 инактивированной сорбированной моно- и поливалентной (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21): утв. директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.09.2009.- Владимир, 2009. - 216 с.

5. WRLFMD Quarterly Report July-September 2013 - URL http://www.wrlfmd.org/ref_labs/rei_lab_reports/OIE-FAO

6. Пат. РФ №2140452, C12N 7/00, A61K 39/135, G01N 33/569, А61К39/42, С07К16/08,27.10.1999 г.

7. Пат. РФ №2242513, C12N 7/00, A61K 39/135, 20.12.2004 г.

8. Foot-and-mouth Disease. Situation worldwide and major epidemiological events in 2005-2006 / K. Sumption, J. Lubroth, T. Murrai, S. De La Rocqe // EMPRESS/ Focus on…, 2007, №1, IIP.

9. Пат. РФ №2451745, C12N 7/00, A61K 39/135, 27.05.2012 г.

10. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. -, Paris, 2012 - Vol.1, Chapter 2.1.5. - P.166-169.

11. Selection of foot and mouth disease vaccine strains - a review / D.J. Paton, J.-F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol.24(3). - P.981-993.

12. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

Таблица 1
Антигенное соответствие (r1) в РМН штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А с производственными штаммами вируса ящура типа А
Штамм Показатель r1
А22 №550 0,013
А22/Ирак/64 0,02
А/Иран/97 0,03
А/Турция/06 0,19
А №2045/Киргизия/2007 0,03
Таблица 2
Биологические свойства вируса эпизоотического штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура типа А
Система репродукции вируса Время проявления биологической активности (часы) Количество адаптационных пассажей Характеристика адаптированного материала
Активность в РСК Титр инфекционной активности (lg ТЦД50/см3)
ПСГК-30 20 5 1:4 6,45
IB-RS-2 24 5 1:2 6,0
ВНК-21 20 5 1:2 7,5
Таблица 3
Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала в РСК (экспертиза №2171 /Кабардино-Балкарский/2013)
Экспертиза №2171 Контроль
Гипериммунные сыворотки в рабочем разведении цельный 1:2 1:4 1:8 к/а А/Турция/06 А22/Ирак/64 OPanAsia2 Азия-1 Шамир 3/89 б/а
А/Турция/06 4 - - - 4 4 - - -
А22/Ирак/64 4 4 - - 4 - - -
O PanAsia2 - - - - - - 4 - -
Азия-1 Шамир 3/89 - - - - - - 4 -
б/с - - - - - - - - -
б/к 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Примечание: 4 - 100% задержка гемолиза;
«-« полный гемолиз;
б/с - без сыворотки;
б/а - без антигена;
б/к - без комплемента
Таблица 4
Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура
Наименование препарата Серия Объем (см3) Активность в РСК
с гомологичным антигеном с гетерологичными антигенами
А/Турция/Об O PanAsia2 Азия-1 Шамир3/89
Гипериммунная сыворотка 1 200 1:30 <1:20 <1:20 <1:20
Таблица 5
Характеристика диагностических антигенов из штамма А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 вируса ящура, выращенного в различных культурах клеток
Наименование препарата Серия Объем (см3) Активность в РСК
с гомологичным диагностикумом А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 с гетерологичным диагностикумом А
Культуральный антиген ПСГК-30 1 40 1:8 <1:2
Культуральный антиген IB-RS-2 1 60 1:12 1:2
Таблица 6
Результаты испытания сорбированной инактивированной моновалентной вакцины из штамма ВЯ А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 на КРС
Вакцина серии №1 Вакцина серии №2
Разведе-
ние
Генерал.
п/зараж.
Титр ВНА (log2) ИМД50 Разведе-
ние
Генерал.
п/зараж.
Титр ВНА (log2) ИМД50
РН РМН РН РМН
Ц - 7,0 7,5 0,19 Ц - 6,5 6,5 0,11
- 6,25 7,5 - 8,0 6,0
- 6,75 7,5 - 6,5 5,0
- 7,0 6,5 - 5,75 5,5
- 7,0 9,0 - 5,75 5,5
М±m 6,8±0,15 7,6±0,44 M±m 6,5±0,41 5,7±0,28
1:4 - 6,25 6,5 1:4 - 7,25 6,0
- 5,0 5,5 - 5,0 6,0
- 4,25 7,0 - 4,25 5,5
- 4,5 5,5 - 4,0 5,5
- 3,5 5,0 - 6,0 6,0
М±m 4,75±0,46 5,9±0,41 M±m 5,3±0,6 5,8±0,13
1:16 + 3,0 4,0 1:16 - 3,5 4,0
- 5,0 6,0 - 3,0 4,0
+ 1,5 4,0 + 1,75 4,0
+ 2,0 4,5 - 2,25 4,0
+ 1,75 4,0 + 2,5 5,0
М±m 2,65±0,64 4,5±0,43 M±m 2,6±0,3 4,2±0,22

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа А, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером А №2171 /Кабардино-Балкарский/2013 (производственный) для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А и их контроля.



 

Похожие патенты:

Представленное изобретение относится к области биотехнологии и касается способа обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота. Охарактеризованный способ включает выявление фрагмента LTR (Long Terminal Repeat) - последовательности провируса лейкоза.

Изобретения касаются штаммов вируса гриппа A/PR/8/59/M2 (H1N1), A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Вакцинные штаммы A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) - реассортанты, полученные путем скрещивания эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом A/PR/8/59/M2 (H1N1).
Изобретение относится к области биотехнологии и касается специфических олигонуклеотидных праймеров. Представленные праймеры включают сайты эндонуклеазного расщепления, фланкирующие участки генома, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, а также нуклеопротеин N, для получения библиотеки генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N вируса лихорадки долины Рифт.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном.

Представлены композиция и способ ее получения. Охарактеризованная композиция содержит: эффективное количество вирусного антигена, который представляет собой живой аттенуированный ротавирус, предварительно обработанный 0,1% сывороточным альбумином человека, и фармацевтически приемлемый буфер.

Изобретения касаются инфекционной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей инфекционный вирус Torque teNO свиней (PTTV), которая содержит по меньшей мере одну копию геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, соответствующих генотипам или подтипам PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA и PTTV2c-VA, а также биологически функциональной плазмиды или вирусного вектора, содержащего такую инфекционную нуклеотидную геномную последовательность, и клетки-хозяина, содержащей такую плазмиду или вектор.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picomaviridae, рода Aphtovirus.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Объектом изобретения является новый штамм вируса Сендай Sen293nsk1, адаптированный к эффективному размножению в культуре клеток человека НЕК293.
Данное изобретение имеет отношение к таким композициям и фармацевтическим композициям, которые включают поксвирусы, и более конкретно, которые включают внеклеточные оболочечные вирусы.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа их использования. Предложенный способ выявления и дифференциации генома вакцинного штамма В-82 от полевых изолятов вируса миксомы кроликов включает: выделение ДНК из биологического материала, постановку мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, комплементарных участкам генов M130R и M151R вируса миксомы кролика и имеющих следующий нуклеотидный состав: амплификацию ДНК вируса и оценку проведения реакции.

Настоящее изобретение раскрывает стабильную вакцинную композицию, включающую по меньшей мере один иммуноген, выбранный из инактивированного цирковируса свиней типа 2 (PCV-2), вируса ящура (FMDV) и бактерий; сапонин, гидроксид алюминия, неионные поверхностно-активные вещества с конечным ГЛБ эмульсии от около 9 до около 12.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа А сем. Picomaviridae, рода Aphtovirus.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биофармацевтике, и может быть использована для сохранения иммуногенной композиции в пригодном состоянии для введения животному.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против ящура типа А. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae, сем.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против ящура. Способ изготовления вакцины против ящура включает культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, при этом очистку вирусной суспензии от балластных примесей проводят добавлением производных полигуанидинов в конечной концентрации 0,005-0,01% или смеси хлороформа и производных полигуанидинов, взятых в весовых соотношениях (40-160):1, соответственно, в конечной концентрации 0,4-0,8.
Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии. Предложено применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины, где этоний используют в виде 10%-ного водного раствора, который вносят в состав противоящурных вакцин в количестве 750 мкг на 1 см3 препарата.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полиэпитопному вакцинному белку, предназначенному для иммунизации против вируса ящура, нуклеиновой кислоте, кодирующей данный белок, рекомбинантной плазмиде pA7248-AMV-H-PE для продукции в растениях данного белка и к вакцинному препарату для профилактики и защиты от инфекции, вызываемой вирусом ящура.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса ящура А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, полученный в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура, адъюванты гидроокись алюминия с сапонином и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока. 10 з.п. ф-лы, 7 пр., 8 табл., 1 ил.
Наверх