Варианты гемагглютининов вируса свиного гриппа

Авторы патента:

ДЗИН, Хонг (US)

C12N7/04 - инактивация или истощение; получение субъединиц вирусов

C12N7/01 - вирусы, например бактериофаги, модифицированные введением чужеродного генетического материала (векторы C12N 15/00)

C12N15/44 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа

C07K14/11 - Orthomyxoviridae, например гриппа

A61K39/145 - Orthomyxoviridae, например вирус гриппа

Владельцы патента RU 2560420:

МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи (US)

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Предложен новый рекомбинантный полипептид вируса гриппа, представляющий собой гемагглютинин. Описанный полипептид может быть использован для получения новых рекомбинантных реассортантных штаммов вируса гриппа. Также описаны рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид, способ получения реассортантных вирусов гриппа, реассортантный вирус гриппа и композиции, содержащие такой вирус. Изобретение может быть использовано в медицине. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 табл.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке в соответствии с § 119(e) Капитула 35 Свода законов США испрашивается приоритет временных заявок США №№: 61/220 426, поданной 25 июня 2009 г.; 61/227 986, поданной 23 июля 2009 г.; 61/234 021, поданной 14 августа 2009 г.; и 61/258 890, поданной 6 ноября 2009 г. Содержание каждой из этих заявок специально целиком включено в данное описание в качестве ссылок.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глобальное распространение вирусов гриппа A (H1N1), происходящих от вируса свиней, среди человеческой популяции в апреле 2009 г. ознаменовало первую пандемию гриппа за последний 41 год. Более 35000 людей были инфицированы этим новым вирусом H1N1 по состоянию на 15 июня 2009 г. В прошлом веке вирус гриппа также был причиной опустошительной пандемии 1918-1919 гг. Кроме того, вирус H1N1, происходящий от вируса свиней, был причиной прерванной пандемии в 1976 г. Вирус гриппа 1918 г. вызвал легкую вспышку заболевания весной 1918 г. и волну смертельных случаев в глобальном масштабе осенью того же года, став причиной смерти 50 млн человек во всем мире. Хотя вирус гриппа H1N1 2009 г., происходящий от вируса свиней, рассматривали в начале 2009 г. как ослабленный, существует вероятность того, что этот вирус может мутировать и стать более вирулентным к осени 2009 г. По этой причине имеется неотложная потребность в разработке эффективной вакцины для профилактики тяжелой пандемии, вызванной вирусами H1N1 2009 г.

Были выделены реассортантные вирусы гриппа с формулой генома 6:2 (имеющие сегменты HA и NA из генома вирусов гриппа A (H1N1), происходящих от вируса свиней, и "скелетные" сегменты ослабленных штаммов вирусов гриппа), полезные для разработки вакцин, живые и инактивированные вакцины, тем не менее, большинство выделенных до сих пор штаммов демонстрируют низкий титр при приготовлении на основе яиц. Те же самые изоляты слабо инфицируют клетки MDCK и формируют маленькие бляшки со слабым цитопатогенным действием. Кроме того, существенная потеря вирусной активности наблюдается после фильтрации вируса. Следовательно, первоначально изолированные штаммы реассортантного вируса гриппа H1N1 являются слабыми кандидатами для разработки вакцинного штамма.

Настоящее изобретение направлено на создание новых и/или вновь выделенных вариантов гемагглютинина H1 вируса свиного гриппа, которые пригодны для применения с целью получения вакцин различного типа, а также в исследованиях, диагностике и т.п. Настоящее изобретение направлено также на создание способов улучшения эффективности репликации вирусов гриппа H1. Другие многочисленные полезные свойства будут понятны при рассмотрении приведенных далее разделов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано в данном описании, штаммы реассортантного вируса гриппа с формулой генома 6:2, пригодные для применения в разработке вакцин H1N1, получали с применением методов обратной генетики. Первоначально выделенные реассортантные вирусы, содержащие сегменты генома HA и NA дикого типа, которые плохо развивались в яйцах, были модифицированы таким образом, что их развитие в яйцах существенно улучшилось. Анализ последовательностей у модифицированных реассортантных вирусов показал, что аминокислотные замены в положениях 119, 153, 154 и 186 свиного гемагглютинина H1 были ответственны за улучшение развития в яйцах и в клетках MDCK. Было обнаружено, что аминокислотные замены остатка 155 в составе HA, для которых ранее было показано, что они усиливают репликацию вируса свиного гриппа 1976 г., также повышают репликацию реассортантного вируса A/CA/7/09 в яйцах. Вирусы, несущие аминокислотные замены оснований 119 и 186 в составе HA, имели повышенный уровень развития в яйцах без существенного изменения антигенности вируса. Варианты гемагглютинина H1, описанные в данном описании, придают фенотип с повышенным уровнем роста реассортантным вирусам с формулой генома 6:2, содержащим 6 внутренних сегментов генома из штаммов вирусов PR8 или A/Ann Arbor/6/60. Более того, вариантные вирусы, содержащие скелетные сегменты ca A/Ann Arbor/6/60 и вариант гемагглютинина H1, имеющий аминокислотную замену остатка 119 или 186 в составе HA, были ослабленными и обладали очень высокой иммуногенностью у хорьков. Эти данные показывают, что варианты реассортантного вируса гриппа, включающие аминокислотную замену остатка 119 и/или 186 в составе HA, пригодны для разработки вакцины на основе свиного вируса гриппа H1N1 для применения у человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает полипептидные и полинуклеотидные последовательности гемагглютинина вируса гриппа, а также векторы, вирусы, вакцины, композиции и тому подобное, содержащие такие последовательности, и способы их применения. Дополнительные особенности изобретения более подробно описаны в данном описании.

Одной из особенностей является то, что настоящее изобретение направлено на создание выделенных или рекомбинантных полипептидов гемагглютинина. В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению является полипептидом гемагглютинина H1. В другом варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может быть полипептидом гемагглютинина свиного вируса гриппа.

В одном из вариантов осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аминокислоту неприродного происхождения в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1 или в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аминокислоту неприродного происхождения в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1 и в положении, соответствующем положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению включает по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D.

В конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, включающую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. В другом конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать глутаминовую кислоту (E) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1, и аспарагиновую кислоту (D) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1. В дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может содержать аспарагин (N) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 119 в SEQ ID NO:1, и аспарагиновую кислоту (D) в качестве аминокислотного остатка, соответствующего положению аминокислотного остатка 186 в SEQ ID NO:1.

В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может дополнительно включать замену H273Y.

В дополнительном варианте осуществления изобретения выделенный или рекомбинантный полипептид HA по изобретению может дополнительно включать замену D222G и/или Q223R.

В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения полипептид HA по изобретению содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Изобретение также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по изобретению, и реассортантные или рекомбинантные вирусы гриппа, содержащие такие полипептиды и/или нуклеиновые кислоты по изобретению.

В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:7. В дополнительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, содержащую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 нуклеотидных замен, делеций или инсерций.

В конкретном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 в составе SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно нуклеотидной последовательности остатков 84-1064 в составе SEQ ID NO:7. В дополнительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота по изобретению содержит нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 нуклеотидных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном примере осуществления первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном примере осуществления второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, который кодирует полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 из состава SEQ ID NO:6 или 8, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения первый сегмент генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном примере осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В еще одном варианте осуществления реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В дополнительном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В другом варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34, первый сегмент генома, содержащий нуклеотидную последовательность остатков 84-1064 из состава SEQ ID NO:7, и второй сегмент генома, который кодирует полипептид нейраминидазы. В конкретном варианте осуществления изобретения второй сегмент генома содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В конкретном варианте осуществления изобретения полипептид нейраминидазы содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

Другой особенностью изобретения является то, что оно включает стерильную композицию с одним или несколькими полипептидами, перечисленными выше, или их фрагментами. Изобретение также включает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких полипептидов, описанных выше, а также способы стимуляции иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие введение пациенту иммунологически эффективного количества одного или нескольких полипептидов, описанных выше. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является моновалентной иммуногенной композицией, содержащей один реассортантный вирус гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей три реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тривалентной иммуногенной композицией, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей четыре реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению является тетравалентной иммуногенной композицией, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Виктория и реассортантный вирус гриппа B линии Ямагата. В конкретном примере осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа, который включает сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Дополнительно, изобретение включает реассортантный вирус гриппа, который содержит сегмент генома, кодирующий один или несколько полипептидов, описанных выше. Более того, изобретение включает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество такого реассортантного вируса гриппа. Способы стимуляции иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие введение иммунологически эффективного количества такого реассортантного вируса гриппа в физиологически приемлемом носителе, также являются частью настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный вирус гриппа по изобретению является реассортантным вирусом с формулой генома 6:2, содержащим 6 внутренних сегментов генома от одного или нескольких донорных вирусов (например, A/AA/6/60 или A/Puerto Rico/8/34, более известного как PR8) и дополнительно включающим 2 сегмента генома (обычно и предпочтительно кодирующих HA и NA или их фрагменты). Иммуногенные композиции, содержащие такой реассортантный (рекомбинантный) вирус, также являются особенностью настоящего изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретения, реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну замену, делецию или инсерцию. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену H273Y. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену D222G и/или Q223R. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены D222G, K119E и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R, H273Y и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60 и сегмент HA генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В одном из вариантов осуществления изобретения, реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну замену, делецию или инсерцию. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену D222G и/или Q223R. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. Полипептид HA может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замену H273Y. В конкретном примере осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены D222G, K119E и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, несущую замены Q223R, H273Y и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа по изобретению содержит 6 внутренних сегментов генома из A/Puerto Rico/8/34 (PR8) и сегмент HA генома, кодирующий полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В конкретном варианте осуществления изобретения сегмент HA генома может кодировать полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Также в объем изобретения включены реассортантные вирусы гриппа, содержащие полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения такие реассортантные вирусы являются реассортантными вирусами с формулой генома 6:2, содержащими 6 внутренних сегментов генома от одного или нескольких донорных вирусов (например, A/AA/6/60 или A/Puerto Rico/8/34), первый сегмент генома, кодирующий полипептид гемагглютинина по изобретению, и второй сегмент генома, кодирующий полипептид нейраминидазы. Иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективные количества такого реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа, также находятся в компетенции настоящего изобретения.

Реассортантные или рекомбинантные вирусы по изобретению демонстрируют высокую скорость репликации в тканевых культурах или в яйцах с развивающимся эмбрионом. В одном из вариантов осуществления изобретения реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в яйцах с развивающимся эмбрионом. В другом варианте осуществления реассортантный или рекомбинантный вирус гриппа развивается до титра по меньшей мере примерно 7,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 8,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 9,5 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10 lg БОЕ/мл, по меньшей мере примерно 10,5 lg БОЕ/мл или по меньшей мере примерно 11 lg БОЕ/мл в тканевых культурах.

Также рассматриваются способы получения реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа с применением культивирования клетки-хозяина, несущей полинуклеотид по изобретению.

В других вариантах осуществления изобретение включает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких из описанных выше реассортантных вирусов гриппа по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуногенная композиция по изобретению содержит жизнеспособный вирус по изобретению. Другие варианты осуществления изобретения включают способы стимуляции иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие введение пациенту иммунологически эффективного количества одного или нескольких из описанных выше реассортантных вирусов гриппа (необязательно в физиологически эффективном носителе).

Изобретение также включает вакцины, содержащие рекомбинантный или реассортантный вирус гриппа по изобретению. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является расщепленной или инактивированной вакциной. В другом варианте осуществления изобретения вакцина по изобретению является живой вакциной с ослабленным вирусом гриппа. В дополнительном варианте осуществления изобретения вакцина по изобретению может быть моновалентной, бивалентной, тривалентной или тетравалентной вакциной.

Способы получения вакцины против вируса гриппа также включены в настоящее изобретение. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению может быть моновалентной, бивалентной, тривалентной или тетравалентной вакциной.

Настоящее изобретение также относится к способам и композициям для усиления репликационной активности вирусов гриппа, например, в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом и/или культуре клеток. Изобретение основано, в частности, на идентификации конкретных аминокислот белка H1, ассоциированных с повышенной репликационной активностью. Путем применения гена гемагглютинина H1, кодирующего белок гемагглютинина H1, содержащий одну или несколько из этих конкретных аминокислот, можно достичь улучшения выхода при получении частиц вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается способ повышения репликативной активности реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа, включающий изменение аминокислотного остатка полипептида гемагглютинина в положении, соответствующем аминокислотному остатку в положении 119 или 186 в составе SEQ ID NO:1, что приводит к повышению репликативной активности реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа. Также предложен рекомбинантный вирус гриппа, получаемый с применением этого способа.

Настоящее изобретение также относится к способам и композициям для усиления репликационной активности реассортантных вирусов гриппа H1N1, например, в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом и/или культуре клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается способ повышения репликативной активности реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа H1N1, включающий изменение аминокислотного остатка полипептида гемагглютинина в положении, соответствующем аминокислотному остатку в положении 119 или 186 в составе SEQ ID NO:1, что приводит в повышению репликативной активности реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа. Также предложен рекомбинантный вирус гриппа, получаемый с применением этого способа.

В одном из вариантов осуществления изобретения репликационная активность реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа по изобретению, который содержит полипептид гемагглютинина по изобретению, включающий аминокислоту неприродного происхождения, увеличена по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз относительно того же самого реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа, не включающего аминокислоту неприродного происхождения в том же самом положении. В другом варианте осуществления изобретения репликационная активность реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа по изобретению, который содержит полипептид гемагглютинина по изобретению, включающий аминокислоту неприродного происхождения, увеличена от 2 раз до 10 раз, от 2 раз до 20 раз, от 2 раз до 40 раз, от 2 раз до 100 раз, от 5 раз до 10 раз, от 5 раз до 20 раз, от 5 раз до 40 раз, от 5 раз до 100 раз относительно того же самого реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа, не включающего аминокислоту неприродного происхождения в том же самом положении.

В одном из вариантов осуществления изобретения максимальное значение титра в яйцах с развивающимся эмбрионом для реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа по изобретению, который содержит полипептид гемагглютинина по изобретению, включающий аминокислоту неприродного происхождения, увеличено по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз относительно того же самого реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа, не включающего аминокислоту неприродного происхождения в том же самом положении. В другом варианте осуществления изобретения максимальное значение титра в яйцах с развивающимся эмбрионом для реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа по изобретению, который содержит полипептид гемагглютинина по изобретению, включающий аминокислоту неприродного происхождения, увеличено от 2 раз до 10 раз, от 2 раз до 20 раз, от 2 раз до 40 раз, от 2 раз до 100 раз, от 5 раз до 10 раз, от 5 раз до 20 раз, от 5 раз до 40 раз, от 5 раз до 100 раз относительно того же самого реассортантного или рекомбинантного вируса гриппа, не включающего аминокислоту неприродного происхождения в том же самом положении.

В конкретном примере осуществления изобретения предложен рекомбинантный вирус гриппа, который содержит полипептид гемагглютинина вируса H1N1, и этот полипептид включает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K119E, K119N и A186D. В конкретном варианте осуществления изобретения предложен рекомбинантный вирус гриппа, который содержит полипептид гемагглютинина вируса H1N1, и этот полипептид включает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из K119X и A186X, причем X - это любая аминокислота, не встречающаяся в природе в данном вирусе H1N1. В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению являются реассортантными вирусами с формулой генома 6:2, содержащими по меньшей мере 5 или 6 сегментов, принадлежащих ослабленному вирусу (или происходящих от него). В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению являются реассортантными вирусами с формулой генома 6:2, содержащими по меньшей мере 5 или 6 сегментов, принадлежащих ослабленному вирусу (или происходящих от него), выбранному из группы, состоящей из: Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, A/Leningrad/134/17/57 и A/Leningrad/17. В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включает полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению являются реассортантными вирусами с формулой генома 6:2 или 7:1, содержащими полипептид гемагглютинина по изобретению. В конкретном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению являются реассортантными вирусами с формулой генома 6:2 или 7:1, содержащими полипептид гемагглютинина по изобретению и по меньшей мере 5 или 6 сегментов, принадлежащих ослабленному вирусу (или происходящих от него), выбранному из группы, состоящей из: A/Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, A/Leningrad/134/17/57 и A/Leningrad/17. В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению содержат полипептид гемагглютинина, принадлежащий A/CA/04/09 или A/CA/07/09 (или происходящий от них), несущий 1, 2 или 3 замены (например, в положениях 119, 186). В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению содержат полипептид гемагглютинина, принадлежащий A/CA/04/09 или A/CA/07/09 (или происходящий от них), несущий глутаминовую кислоту или аспарагин в положении аминокислоты 119 и аспарагиновую кислоту в положении 186. В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению содержат полипептид гемагглютинина, принадлежащий A/CA/04/09 или A/CA/07/09 (или происходящий от них), несущий аминокислотную замену в положении аминокислоты 119 и в положении 186. В одном из вариантов осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению содержат полипептид гемагглютинина, принадлежащий вирусу свиного гриппа H1N1 (или происходящий от них), несущий аминокислотную замену в положении аминокислоты 119 и в положении 186. В конкретном примере осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций. В конкретном примере осуществления рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид HA, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,2%, по меньшей мере 99,4%, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,8% или по меньшей мере 99,9% идентичность последовательности относительно аминокислотной последовательности остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8. В дополнительном варианте осуществления изобретения рекомбинантные вирусы гриппа по изобретению включают полипептид гемагглютинина, содержащий аминокислотную последовательность остатков 1-327 в составе SEQ ID NO:6 или 8, включающую менее чем 3, менее чем 5, менее чем 10, менее чем 15, менее чем 20, менее чем 25, менее чем 30 аминокислотных замен, делеций или инсерций.

Специалисту в данной области будет понятно, что конкретное положение аминокислоты может варьироваться в зависимости от конкретного штамма вируса гриппа, используемого в векторе, способе и вирусах по изобретению. Например, белок гемагглютинина конкретного штамма вируса гриппа может содержать вставку или делецию в составе гена гемагглютинина, кодирующего белок гемагглютинина, такую, что положение, соответствующее положению 119 в составе SEQ ID NO:1 располагается, например, в остатке 93 или 97 в составе белка гемагглютинина конкретного штамма вируса гриппа. В частности, как продемонстрировано в таблице 3, положение 119 и 186 принадлежащего A/CA/07/09 полипептида гемагглютинина (SEQ ID NO:1) соответствует положению 118 и 185, соответственно, в составе принадлежащего A/South Dakota/6/07 полипептида гемагглютинина H1. Специалист в данной области легко определит, соответствует ли конкретное положение аминокислоты положению, которое, при внесении изменения, ассоциировано с повышенной репликационной активностью, применяя стандартные для данной области методики. Одной из таких стандартных методик является выравнивание аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 и полипептида гемагглютинина конкретного штамма вируса гриппа с применением алгоритмов, доступных в данной области.

Эти и другие объекты и особенности настоящего изобретения станут более понятными после ознакомления со следующим подробным описанием, а также сопутствующими фигурами и формулой изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Морфология бляшек вариантов, отобранных из клеток MDCK, и указанных вариантов, содержащих внесенные аминокислотные замены (A). Анализ бляшек проводили на клетках MDCK, инкубированных при 33°C в течение 4 дней и иммуноокрашенных с использованием поликлональной антисыворотки против вируса гриппа A. Сравнение морфологии бляшек двойного мутанта V5-119E/186D с мутантами с единичными заменами 119E и 186D представлено на панели B.

Фигура 2. Сравнение последовательностей белка HA1 для A/California/7/09, A/Swine/Iowa/1/1976 (код доступа нуклеотидной последовательности CY022069), A/Swine/1931 (код доступа нуклеотидной последовательности CY009628) и A/South Dakota/6/07. Аминокислоты в положениях 119, 153, 154, 155, 186 и 278 выделены.

Фигура 3. Белковый состав препаратов вирусов, очищенных из яиц с развивающимся эмбрионом.

Фигура 4. Белковый состав препаратов вирусов, очищенных из яиц с развивающимся эмбрионом.

Фигура 5. Белковый состав препаратов вирусов, полученных в яйцах с развивающимся эмбрионом при инкубации в течение (A) 48 ч и (B) 60 ч.

Фигура 6. Количественное сравнение белка HA1, выработанного двумя реассортантными вирусами H1N1 в яйцах с развивающимся эмбрионом.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в данном описании, имеют те же значения, что являются общепринятыми в области, к которой относится настоящее изобретение. Следующие определения дополняют таковые, используемые в данной области, и относятся к настоящему изобретению и необязательно относятся к любому родственному или не родственному случаю, например, к любому стандартным образом находящемуся в собственности патенту или заявке. Хотя при практическом осуществлении для тестирования настоящего изобретения возможно применение любых способов и материалов, схожих или эквивалентных описываемым в данном описании, предпочтительные материалы и способы описаны в данном описании. Следовательно, использованная в данном описании терминология предназначена только для целей описания частных вариантов осуществления изобретения и не является ограничивающей. Дополнительные термины определены и описаны ниже.

Выражение "по существу идентичные" в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов (например, ДНК, кодирующих молекулу HA или NA, или аминокислотную последовательность молекулы HA или NA) означает две или несколько последовательностей или подпоследовательностей, которые обладают по меньшей мере примерно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или более идентичностью нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании до достижения максимального соответствия, согласно оценке с применением алгоритма сравнения последовательностей или при визуальной проверке.

Термин "вариант" в отношении полипептида означает аминокислотную последовательность, которая изменена на одну или несколько аминокислот относительно референсной последовательности. Вариант может нести "консервативные" изменения, причем замененная аминокислота имеет схожие структурные или химические свойства, например, замена лейцина на изолейцин. Альтернативно, вариант может нести "не консервативные" изменения, например, замена глицина на триптофан. Аналогичные незначительные изменения также могут включать делецию или инсерцию аминокислоты, или оба эти типа изменений. Указания по определению того, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, вставлены или делетированы без нарушения биологической или иммунологической активности, можно найти с применением компьютерных программ, хорошо известных специалистам в данной области, например, программного обеспечения DNASTAR. Примеры консервативных замен также описаны в данном описании.

Полипептиды "нейраминидазы" по изобретению демонстрируют иммунологическую перекрестную реактивность с одной или несколькими известными молекулами нейраминидазы из вируса гриппа. Литературные источники изобилуют примерами таких известных нейраминидаз (например, в GenBank, в публикациях Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и т.д.). Схожим образом, полипептиды "гемагглютинина" по изобретению могут демонстрировать иммунологическую перекрестную реактивность с одной или несколькими известными молекулами гемагглютинина из вируса гриппа. Кроме того, литературные источники изобилуют примерами таких известных молекул гемагглютининов.

Гены также содержат неэкспрессируемые сегменты нуклеиновой кислоты, которые, например, образуют последовательности распознавания другими белками. Неэкспрессируемые регуляторные последовательности включают "промоторы" и "энхансеры", с которыми связываются регуляторные белки, такие как транскрипционные факторы, что приводит к транскрипции смежных или близко расположенных последовательностей. "Тканеспецифичный" промотор или энхансер - это промотор или энхансер, который регулирует транскрипцию в специфичном типе или типах тканей или клеток.

"Экспрессия гена" или "экспрессия нуклеиновой кислоты" обычно означает транскрипцию ДНК с образованием РНК (необязательно включая модификацию РНК, например, сплайсинг) или транскрипцию РНК с образованием мРНК, трансляцию РНК с образованием полипептида (необязательно включая последующую модификацию полипептида, например, посттрансляционную модификацию) или одновременно транскрипцию и трансляцию, в соответствии с контекстом.

"Открытая рамка считывания" или "ОРС" - это возможная трансляционная рамка считывания ДНК или РНК (например, гена), которая может быть транслирована в полипептид. То есть, рамка считывания не прерывается стоп-кодонами. Однако следует отметить, что термин ОРС не обязательно указывает, что полинуклеотид на самом деле транслируется в полипептид.

Термин "вектор" относится к способу, посредством которого нуклеиновая кислота может быть размножена и/или перенесена между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.п., которые реплицируются автономно или могут интегрироваться в хромосому клетки-хозяина. Вектор также может быть голым полинуклеотидом РНК, голым полинуклеотидом ДНК, полинуклеотидом, состоящим из ДНК и РНК в пределах одной и той же цепи, конъюгированной с полилизином ДНК или РНК, конъюгированной с пептидом ДНК или РНК, конъюгированной с липосомой ДНК и т.п., не реплицирующимися автономно. Во многих, но не во всех, стандартных вариантах осуществления векторы по настоящему изобретению являются плазмидами.

"Экспрессионный вектор" - это вектор, такой как плазмида, которые способен обеспечить экспрессию, а также репликацию внедренной в него нуклеиновой кислоты. Обычно, нуклеиновая кислота, которая будет экспрессироваться, "функционально соединена" с промотором и/или энхансером и подвержена контролю регуляции транскрипции со стороны промотора и/или энхансера.

"Двунаправленный экспрессионный вектор" характеризуется наличием двух альтернативных промоторов, ориентированных в противоположных направлениях относительно нуклеиновой кислоты, расположенной между этими двумя промоторами, таким образом, что экспрессия может быть инициирована в обоих направлениях, что приводит, например, к транскрипции как плюс (+) или смысловой нити, так и отрицательной (-) или антисмысловой нити РНК.

В контексте настоящего изобретения термин "выделенный" относится к биологическому материалу, такому как вирус, нуклеиновая кислота или белок, который по существу свободен от компонентов, которые в норме сопутствуют или взаимодействуют с ним в его естественной среде. Выделенный биологический материал необязательно содержит дополнительный материал, не обнаруживаемый вместе с биологическим материалом в его естественной среде, например, в клетке или в вирусе дикого типа. Например, если материал находится в своей естественной среде, такой как клетка, материал мог бы быть помещен в некотором месте в клетке (например, в геноме или генетическом элементе), не являющемся нативным для такого материала, обнаруженного в этой среде. Например, встречающаяся в природе нуклеиновая кислота (например, кодирующая последовательность, промотор, энхансер и т.д.) становится выделенной, если она внедрена не встречающимся с природе манером в локус генома (например, вектор, такой как плазмида или вирусный вектор, или ампликон), не являющийся нативным для этой нуклеиновой кислоты. Такие нуклеиновые кислоты также называют "гетерологичными" нуклеиновыми кислотами. Выделенный вирус, например, находится в окружающей среде (например, в системе культуры клеток или очищен из культуры клеток), отличной от нативной окружающей среды вируса дикого типа (например, носоглотка инфицированного человека).

Термин "химерный" или "химера", относительно вируса, указывает на то, что вирус содержит генетические и/или полипептидные компоненты, происходящие более чем от одного родительского вирусного штамма или источника. Схожим образом, термин "химерный" или "химера", относительно вирусного белка, указывает на то, что белок содержит полипептидные компоненты (т.е. аминокислотные подпоследовательности), происходящие более чем от одного родительского вирусного штамма или источника. Как будет очевидно из данного описания, такие химерные вирусы обычно являются реассортантными/рекомбинантными вирусами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения химера может необязательно содержать, например, последовательность (например, принадлежащую HA и/или NA) из вируса гриппа A, помещенную в скелетную часть, состоящую из, или сконструированную/происходящую от вируса гриппа B (например, B/AA/1/66 и т.д.), или последовательность вируса гриппа B, помещенную в скелетную часть вируса гриппа A (т.е. донорного вируса), такого как, например, A/AA/6/60 и т.д.

Термин "рекомбинантный" указывает, что материал (например, нуклеиновая кислота или белок) был искусственно или синтетически (не естественным путем) изменен в результате вмешательства человека. Изменение может быть проведено над материалом, находящимся в своей природной среде или состоянии, или над извлеченным материалом. В частности, например, вирус гриппа является рекомбинантным, когда он получен путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Например, "рекомбинантная нуклеиновая кислота" - это нуклеиновая кислота, которая получена путем рекомбинации нуклеиновых кислот, например, в ходе клонирования, пересортировки ДНК или других методик, или путем химического или иного мутагенеза; "рекомбинантный полипептид" или "рекомбинантный белок" - это полипептид или белок, которые получен в результате экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты; и "рекомбинантный вирус", например, рекомбинантный вирус гриппа, получают с применением экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты.

Термин "реассортантный", если относится к вирусу (обычно в данном описании к вирусу гриппа), указывает на то, что вирус содержит генетические и/или полипептидные компоненты, происходящие более чем от одного родительского вирусного штамма или источника. Например, реассортантный вирус с формулой генома 7:1 содержит 7 сегментов вирусного генома (или генных сегментов), происходящих от первого родительского вируса, и единичный комплементарный сегмент вирусного генома, например, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, описанные в данном описании. Реассортантный вирус с формулой генома 6:2 содержит 6 сегментов генома, обычно 6 внутренних сегментов генома, из первого родительского вируса, и два комплементарных сегмента, например, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу сегменты, из одного или нескольких других родительских вирусов. Реассортантные вирусы могут также, в зависимости от контекста в данном описании, называться "химерными" и/или "рекомбинантными".

Термин "внедренный", если он относится к гетерологичной или выделенной нуклеиновой кислоте, означает внедрение нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, в которой нуклеиновая кислота может быть внедрена в геном клетки (например, в хромосому, плазмиду, пластидную или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или подвержена временной экспрессии (например, в случае трансфицированной мРНК). Термин включает такие способы, как "инфекция", "трансфекция", "трансформация" и "трансдукция". В контексте настоящего изобретения могут быть применены различные способы внедрения нуклеиновых кислот в клетку, включая электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, опосредованную липидами трансфекцию (липофекцию) и т.д.

Термин "клетка-хозяин" означает клетку, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как вектор или вирус, и поддерживает репликацию и/или экспрессию нуклеиновой кислоты. Клетка-хозяин может быть представлена прокариотическими, такими как E. coli, или эукариотическими клетками, такими как дрожжи, клетки насекомых, амфибий, птиц или млекопитающих, в том числе клетки человека. Примеры клеток-хозяев могут включать, например, клетки Vero (почки африканской зеленой мартышки), клетки BHK (почки детеныша хомяка), клетки первичной почки цыпленка (PCK), клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK), клетки Мадин-Дарби почек коровы (MDBK), клетки 293 (например, клетки 293T) и клетки COS (например, клетки COS1, COS7) и т.д. В других вариантах осуществления изобретения клетки-хозяева необязательно включают яйца (например, яйца курицы, яйца курицы с развивающимся эмбрионом и т.д.)

"Иммунологически эффективное количество" вируса гриппа - это количество, достаточное для усиления собственного иммунного ответа пациента (например, человека) на последующее воздействие вируса гриппа. Уровни индуцированного иммунитета можно контролировать, например, измеряя количество нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, с применением анализа реакции нейтрализации бляшкообразования, фиксации комплемента, твердофазного иммуноферментного анализа или анализа реакции микронейтрализации.

"Защитный иммунный ответ" против вируса гриппа означает иммунный ответ, возникающий у пациента (например, у человека), который является защитным против заболевания, когда пациент впоследствии подвергается воздействию и/или инфицируется вирусом гриппа дикого типа. В некоторых случаях вирус гриппа дикого типа (например, циркулирующий в естественных условиях) может все еще вызывать инфекцию, но не способен быть причиной серьезной или опасной для жизни инфекции. Обычно, защитный иммунный ответ приводит к детектируемым уровням выработки хозяином сывороточных и секреторных антител, способных нейтрализовать вирус того же штамма и/или подгруппы (и, возможно, также других штаммов и/или подгрупп, отличных от использованных для получения вакцины) in vitro и in vivo.

Используемый в данном описании термин "антитело" означает белок, содержащий один или несколько полипептидов, по существу или частично кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Общепризнанные гены иммуноглобулинов включают гены консервативных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, ипсилон и мю, а также гены множества вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон, которые, в свою очередь, определяют принадлежность к классам иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Типичной структурной единицей иммуноглобулина (антитела) является тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара включает одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). N-конец каждой цепи образует вариабельная область из примерно 100-110 или более аминокислот, отвечающая в основном за распознавание антигена. Термины вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) относятся к этим легким и тяжелым цепям, соответственно. Антитела существуют в виде интактных иммуноглобулинов или как ряд хорошо охарактеризованных фрагментов, получаемых при расщеплении различными пептидазами. Таким образом, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с образованием F(ab)'2, димера Fab, который сам является легкой цепью, соединенной с VH-CH1 дисульфидной связью. F(ab)'2 может быть восстановлен в мягких условиях с разрывом дисульфидной связи в шарнирной области, и, таким образом, димер (Fab')2 превращается в мономер Fab'. Мономер Fab' в существенной мере является Fab с частью шарнирной области (см. Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999) для более подробного описания других фрагментов антител). Хотя различные фрагменты антител определяют в терминах расщепления интактного антитела, специалисту в данной области будет понятно, что такие Fab'-фрагменты могут быть синтезированы de novo либо химически, либо с применением методологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, термин антитело, при использовании в данном описании, включает антитела или фрагменты, полученные путем модификации целого антитела или синтезированные de novo с применением методологии рекомбинантных ДНК. Антитела включают, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, мульти- или одноцепочечные антитела, в том числе одноцепочечные Fv (sFv или scFv) антитела, в которых вариабельная область тяжелой и вариабельная область легкой цепи соединены друг с другом (напрямую или через пептидный линкер) с образованием непрерывного полипептида и гуманизированных или химерных антител.

ВИРУС ГРИППА

Полипептиды и полинуклеотиды по изобретению являются вариантами последовательностей HA и/или NA вируса гриппа. См., например, перечень последовательностей на фигурах 1 и 2 ниже. В общем случае вирусы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового кора, содержащего сегментированный геном из одноцепочечных РНК, и внешней липопротеиновой оболочки, подстилаемой белком матрикса. Геном вирусов гриппа состоит из восьми сегментов линейной (-) цепи рибонуклеиновой кислоты (РНК), кодирующих белки иммуногенного гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) и шесть полипептидов внутреннего кора: нуклеопротеин нуклеокапсида (NP); белки матрикса (M); неструктурные белки (NS); и 3 белка РНК-полимеразы (PA, PB1, PB2). В ходе репликации геномная вирусная РНК транскрибируется в (+) цепь матричной РНК и (-) цепь геномной кРНК в ядре клетки-хозяина. Каждый из восьми сегментов генома упакован в рибонуклеопротеиновые комплексы, которые содержат, в дополнение к РНК, белок NP и полимеразный комплекс (PB1, PB2 и PA). Молекула гемагглютинина состоит из поверхностного гликопротеина и действует посредством связывания с N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuNAc), называемой также сиаловой кислотой, на поверхностных рецепторах клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления изобретения в данном описании полипептиды по изобретению (и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по изобретению) могут действовать посредством связывания с NeuNAc либо in vitro, либо in vivo. Такое действие может также в некоторых вариантах осуществления изобретения осуществляться фрагментами гемагглютинина, которые сохраняют активность гемагглютинина. Гемагглютинин образован двумя субъединицами, HA1 и HA2, и полная структура составляет примерно 550 аминокислот в длину и примерно 220 кДа. Молекулы нейраминидазы отщепляют концевые остатки сиаловой кислоты от поверхностных клеточных рецепторов вируса гриппа, позволяя, тем самым, вирионам покинуть инфицированные клетки. Нейраминидаза также удаляет сиаловую кислоту с новообразованных молекул гемагглютинина и нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения в данном описании полипептиды по изобретению (и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по изобретению) могут действовать посредством отщепления остатков сиаловой кислоты либо in vitro, либо in vivo. Такое действие может также в некоторых вариантах осуществления изобретения осуществляться фрагментами нейраминидазы, которые сохраняют активность нейраминидазы. Полипептиды нейраминидазы по изобретению демонстрируют иммунологическую перекрестную реактивность с одной или несколькими известными молекулами нейраминидазы из вируса гриппа. Литературные источники изобилуют примерами таких известных нейраминидаз (например, в GenBank, в публикациях Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и т.д.) Схожим образом, полипептиды гемагглютинина по изобретению демонстрируют иммунологическую перекрестную реактивность с одной или несколькими известными молекулами гемагглютинина из вируса гриппа. Кроме того, литературные источники изобилуют примерами таких известных молекул гемагглютининов.

Грипп обычно подразделяют на категории гриппа A и гриппа B, а также менее важную категорию гриппа C. Каждый из вирусов гриппа A и гриппа B содержит восемь сегментов одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью. Геном вируса гриппа A кодирует одиннадцать полипептидов. Сегменты 1-3 кодируют три полипептида, составляющих РНК-зависимую РНК-полимеразу. Сегмент 1 кодирует белок PB2 полимеразного комплекса. Остальные белки полимеразы, PB1 и PA, кодируются сегментом 2 и сегментом 3, соответственно. Кроме того, сегмент 1 некоторых штаммов вируса гриппа кодирует небольшой белок, PB1-F2, образующийся с альтернативной рамки считывания в пределах кодирующей области PB1. Сегмент 4 кодирует поверхностный гликопротеин гемагглютинин (HA), вовлеченный в присоединение к клетке и проникновение в нее в ходе инфекции. Сегмент 5 кодирует полипептид нуклеопротеина нуклеокапсида (NP), основной структурный компонент, ассоциированный с вирусной РНК. Сегмент 6 кодирует гликопротеин оболочки нейраминидазу (NA). Сегмент 7 кодирует два белка матрикса, обозначаемых M1 и M2, которые транслируются с раздельно сплайсированных мРНК. Сегмент 8 кодирует NS1 и NS2, два неструктурных белка, которые транслируются с альтернативно сплайсированных вариантов мРНК. Восемь сегментов генома вируса гриппа B кодируют 11 белков. Три самых длинных гена кодируют компоненты РНК-полимеразы, PB1, PB2 и PA. Сегмент 4 кодирует белок HA. Сегмент 5 кодирует NP. Сегмент 6 кодирует белок NA и белок NB. Оба белка, NB и NA, транслируются с перекрывающихся рамок считывания бицистронной мРНК. Сегмент 7 вируса гриппа B также кодирует два белка: M1 и BM2. Самый короткий сегмент кодирует два продукта: NS1 транслируется с полноразмерной РНК, в то время как NS2 транслируется со сплайсированного варианта мРНК.

Грипп типов A и B обычно ассоциирован со вспышками гриппа в человеческой популяции. Однако вирусы гриппа типа A также инфицируют другие виды, например, птиц, свиней и других животных. Вирусы типа A подразделяют на подтипы на основании различий их антигенов поверхностных гликопротеинов гемагглютинина и нейраминидазы. Гемагглютинин вирусов типа A имеет 16 известных подтипов, и нейраминидаза имеет 9 известных подтипов. У человека в настоящее время известны только примерно 4 различных подтипов гемагглютинина и 2 различных подтипа нейраминидазы, например, H1, H2, H3, H5, N1 и N2. В частности, два основных подтипа вирусов гриппа A ранее проявляли активность у человека, а именно, H1N1 и H3N2. Однако недавно вызвал озабоченность подтип H1N2. Вирусы гриппа B также подразделяют на подтипы на основании их белков гемагглютинина и нейраминидазы.

Различные штаммы вируса гриппа могут быть разделены на категории на основании, например, способности вируса гриппа вызывать агглютинацию красных кровяных телец (RBC или эритроцитов). Антитела, специфичные к конкретному штамму вируса гриппа, могут связываться с вирусом и таким образом предотвращать такую агглютинацию. Методы анализа для определения типов штаммов на основании такого ингибирования обычно называют анализом ингибирования гемагглютинина (HI анализом или HAI анализом), и они являются стандартными и хорошо известными специалистам в данной области методами для характеристики штаммов вирусов гриппа. Конечно, специалисту в данной области известны и другие методы анализа, например, ELISA, опосредованный анализ с применением флуоресцентно меченых антител, иммуногистохимия, вестерн-блот анализ и т.д., используя которые можно охарактеризовать штаммы вирусов гриппа, а применение и обсуждение в данном описании HI анализа не следует рассматривать как ограничивающие.

Коротко, при конкретном проведении HI анализа сыворотку, используемую для типирования или отнесения к категории, которую часто получают от хорьков, добавляют к пробам эритроцитов в различных разведениях, например, в 2 раза и т.д. Затем проводят оптическое определение того, происходит ли слипание эритроцитов друг с другом (т.е. агглютинация) или они остаются в суспензии (т.е. агглютинация отсутствует). Если клетки не слипаются, то агглютинация не происходит из-за ингибирования со стороны антител в сыворотке, специфичных для этого вируса гриппа. Таким образом, типы вирусов гриппа определяются как принадлежащие тому же штамму. В некоторых случаях один штамм описывают как "подобный" другому, например, штамм x является "y-подобным" штаммом и т.д. Например, если две пробы находятся в пределах 4-кратного титра друг относительно друга, согласно определению с применением HI анализа, то их можно описать как принадлежащие к одному и тому же штамму (например, оба принадлежат к штамму "New Caledonia" или оба являются "подобными штамму Moscow" и т.д.). Иначе говоря, штаммы обычно относят к категориям на основании их иммунологического или антигенного профиля. HAI-титр обычно определяют как наибольшую степень разведения сыворотки, при которой полностью ингибируется гемагглютинация. См., например, Schild, et al, Bull. Wld Hlth Org., 1973, 48:269-278, и т.д. Повторим еще раз, что специалист в данной области будет достаточно осведомлен об отнесении к категориям и классификации штаммов вирусов гриппа и способах их осуществления.

Из вышеизложенного понятно, что настоящее изобретение включает не только специфичные последовательности, перечисленные в данном описании, но также такие последовательности в составе различных векторов (например, векторов, применяемых для реассортации плазмид и плазмидной "помощи", см. ниже), а также последовательности гемагглютинина и нейраминидазы, принадлежащие к тем же штаммам, что и последовательности, перечисленные в данном описании. Кроме того, указанные те же самые штаммы, которые находятся в составе различных векторов (например, обычно векторов, применяемых для реассортации плазмид и плазмидной "помощи", таких как A/Ann Arbor/6/60 или B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, или B/England/2608/76 и т.д.) также включены.

Используемый в данном описании термин "схожие штаммы" следует понимать как указывающий на то, что первый вирус гриппа принадлежит к тому же или родственному штамму, что и второй вирус гриппа. В конкретных вариантах осуществления изобретения такое сходство обычно определяют путем применения HAI анализа. Вирусы гриппа, которые попадают в пределы четырехкратного титра друг относительно друга при HAI анализе, являются, таким образом, принадлежащими к "схожим штаммам". Однако специалисту в данной области известны и другие способы анализа и т.д. для определения схожих штаммов, например, FRID, анализ реакции нейтрализации и т.д. Настоящее изобретение также включает такие схожие штаммы (т.е. штаммы, схожие с таковыми, присутствующими в списке последовательностей в данном описании) в различных плазмидах, векторах, вирусах, при различных способах и т.д., указанных в данном описании. Таким образом, если контекст не указывает явно иное, описания в данном описании конкретных последовательностей (например, таковых из списка последовательностей) или их фрагментов следует также рассматривать как включающие последовательности из схожих им штаммов (т.е. штаммов, схожих со штаммами, имеющими эти последовательности в тех плазмидах, векторах, вирусах и т.д., которые указаны в данном описании). Кроме того, понятно, что полипептиды NA и HA в составе таких схожих штаммов являются, таким образом, "схожими полипептидами" при сравнении между "схожими штаммами".

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА

Последовательности, композиции и способы, указанные в данном описании, в основном, но не полностью, относятся к получению вирусов гриппа для вакцин. Ранее вакцины против вируса гриппа в основном получали из куриных яиц с развивающимся эмбрионом с применением отобранных штаммов вируса или на основании эмпирических прогнозов относительно значимых штаммов. Позже были получены реассортантные вирусы, которые содержали отобранные антигены гемагглютинина и/или нейраминидазы в контексте проверенного ослабленного температурочувствительного исходного вакцинного штамма. После множества пассажей культивирования вируса в куриных яйцах вирусы гриппа извлекают и, в некоторых случаях, инактивируют, например, с применением формальдегида и/или β-пропиолактона (или, в соответствии с другим вариантом, применяют в живых ослабленных вакцинах). Таким образом, понятно, что последовательности HA и (как в настоящем изобретении) являются достаточно полезными при конструировании вакцин против вируса гриппа.

Попытки получения рекомбинантных и реассортантных вакцин в культуре клеток затруднялись неспособностью некоторых штаммов, утвержденных для получения вакцин, эффективно развиваться в стандартных условиях культуры клеток. Однако проведенная ранее автором изобретения и его коллегами работа привела к созданию векторной системы и способов получения рекомбинантных и реассортантных вирусов в культуре, сделав, тем самым, возможным быстрое получение вакцин, соответствующих одному или нескольким выбранным антигенным штаммам вируса, например, штаммам A или B, различным подтипам и подштаммам и т.д., например, содержащим последовательности HA и NA, указанные в данном описании. См. заявку на патент США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку на патент США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г. и заявку на патент США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., все озаглавлены "Мультиплазмидная система для получения вируса гриппа". Обычно, культуры поддерживают в системе, такой как инкубатор для культивирования клеток, при контролируемых влажности и CO₂, при постоянной температуре, поддерживаемой с помощью регулятора температуры, такого как термостат, чтобы обеспечить условия, при которых температура не превышает 35°C. Реассортантные вирусы гриппа можно легко получить путем внедрения подгруппы векторов, соответствующих сегментам генома исходного вакцинного штамма вируса гриппа, в комбинации с комплементарными сегментами, полученными от нужного штамма (например, антигенными вариантами HA и NA, указанными в данном описании). Обычно исходные вакцинные штаммы выбирают на основании требуемых свойств, существенных для введения вакцины. Для получения вакцины, например, живой ослабленной вакцины, исходный вакцинный штамм донорного вируса может быть выбран для получения ослабленного фенотипа, адаптации к холоду и/или температурной чувствительности. Как объясняется в данном описании и, например, в заявке на патент США № 10/42328 и т.д., в различных вариантах осуществления изобретения применяют штамм вируса гриппа A/Ann Arbor (AA)/6/60 или B/Ann Arbor/1/66 или A/Puerto Rico/8/34, или B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76 в качестве "скелета", к которому добавляют гены HA и/или NA (например, такие как последовательности, перечисленные в данном описании и т.д.) для создания требуемых реассортантных вирусов. Таким образом, например, в реассортантном вирусе с формулой генома 6:2 два гена (т.е. NA и HA) происходили бы из штамма(ов) вируса гриппа, против которых желательна выработка иммуногенной реакции, в то время как другие 6 генов происходили бы из штамма Ann Arbor или другого скелетного штамма и т.д. Вирус Ann Arbor полезен благодаря его свойствам адаптации к холоду, ослабленности, температурной чувствительности. Несомненно, ясно, что последовательности HA и NA, указанные в данном описании, способны к реассортации с рядом других вирусных генов или вирусных типов (например, рядом различных "скелетов", таких как A/Puerto Rico/8/34 и т.д., содержащих другие гены вируса гриппа, представленные при реассортации, а именно, гены, не являющиеся генами HA и NA). Недавно в США была выдана лицензия на живые ослабленные вакцины на основе вируса гриппа A против вирусов гриппа человека. См. выше. Такие вакцины приготовлены на основе реассортантных вирусов H1N1 и H1N2, в которых гены внутренних белков адаптированного к холоду (ca) вируса A/Ann Arbor (AA)/6/60 (H2N2) придают фенотипы адаптации к холоду и температурной чувствительности вируса AA ca реассортантным вирусам (т.е. вирусам, несущим гены гемагглютинина и нейраминидазы из штамма, отличного от Ann Arbor). В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном описании, реассортантные вирусы также могут содержать реассортантные вирусы с формулой генома 7:1. Иначе говоря, только HA или NA происходят не из скелетного или MDV штамма. Сообщалось о проведении ранее работы с пригодными скелетными штаммами донорных вирусов, которые в некоторых случаях входят в различные варианты осуществления настоящего изобретения. См., например, заявку на патент США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку на патент США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г. и заявку на патент США № 60/574117, поданную 25 мая 2004 г., все озаглавлены "Мультиплазмидная система для получения вируса гриппа"; Maassab et al, J. of Inf. Dis., 1982, 146:780-790; Cox, et al, Virology, 1988, 167:554-567; Wareing et al, Vaccine, 2001, 19:3320-3330; Clements, et al, J Infect Dis., 1990, 161(5):869-77 и т.д.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в перечисленных в данном описании последовательностях могут быть в некоторых случаях удалены специфичные области (в последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности или в одной из этих последовательностей). Например, в случае молекул, которые содержат сайт расщепления, состоящий из основных аминокислот, такие сайты могут быть в некоторых случаях удалены. Такие сайты расщепления в некоторых вариантах осуществления изобретения, указанных в данном описании, например, модифицируют или изменяют их последовательности, по сравнению с последовательностями дикого типа, от которых такие последовательности происходят (например, для того, чтобы сделать невозможным расщепление или снизить степень расщепления по этим сайтам и т.д.) Такие модификации/изменения могут быть различными в разных штаммах и последовательностях из-за различия последовательностей сайтов расщепления в исходных последовательностях. Например, 4 основных остатка (RRKK) обычно удаляют в некоторых последовательностях HA (по сравнению с диким типом). В различных вариантах осуществления изобретения такие сайты расщепления, состоящие из основных аминокислот, могут быть модифицированы различными путями (все из которых включены в настоящее изобретение). Например, сайт расщепления, состоящий из основных аминокислот, может быть удален по одной аминокислоте за один раз (например, удален один остаток R, удалены два остатка R, удалены RRK или удалены RRKK). Кроме того, аминокислотный остаток непосредственно перед сайтом расщепления также может быть удален или изменен (например, с R на T и т.д.); кроме того, нуклеотиды, кодирующие аминокислотный остаток непосредственно после сайта расщепления, также могут быть модифицированы. Специалисту в данной области будут известны различные способы удаления таких специфичных областей. Полученные в результате укороченные последовательности также входят в объем настоящего изобретения. См., например, Li et al, J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999.

Термины "температурочувствительный", "адаптированный к холоду" и "ослабленный" применительно к вирусам (обычно используемым в качестве вакцин или для получения вакцин), которые в некоторых случаях включают имеющиеся в настоящее время последовательности, хорошо известны специалистам в данной области. Например, термин "температурочувствительный" (ts) обозначает, например, что вирус демонстрирует 100-кратное или более снижение титра при 39°C по сравнению с 33°C в случае штаммов вируса гриппа A, или что вирус демонстрирует 100-кратное или более снижение титра при 37°C по сравнению с 33°C в случае штаммов вируса гриппа B. Термин "адаптированный к холоду" (ca) означает, что вирус демонстрирует рост при 25°C в пределах 100-кратного снижения уровня относительно его роста при 33°C, а термин "ослабленный" (att) означает, что вирус реплицируется в верхних дыхательных путях хорьков, но не детектируется в тканях их легких и не вызывает гриппоподобное заболевание у животных. Понятно, что вирусы с промежуточными фенотипами, т.е. вирусы, демонстрирующие снижение титра менее чем в 100 раз при 39°C (для штаммов A вирусов) или при 37°C (для штаммов B вирусов), или демонстрирующие рост при 25°C со снижением уровня более чем в 100 раз относительно их роста при 33°C (например, со снижением в пределах 200 раз, 500 раз, 1000 раз, 10 000 раз), и/или демонстрирующие пониженный рост в легких относительно роста в верхних дыхательных путях хорьков (т.е. частично ослабленные) и/или пониженный уровень проявления гриппоподобного заболевания у животных, также являются полезными вирусами и могут применяться в сочетании с последовательностями HA и NA, указанными в данном описании.

Таким образом, настоящее изобретение может применять выращивание, например, в соответствующих условиях культивирования, штаммов вирусов (как штаммов A, так и штаммов B вирусов гриппа) со свойствами, необходимыми для получения вакцины (например, ослабленная патогенность или фенотип, адаптация к холоду, температурная чувствительность и т.д.), in vitro в культивируемых клетках. Вирусы гриппа могут быть получены путем внедрения множества векторов, содержащих клоны сегментов вирусного генома, в клетки-хозяева и культивирования этих клеток при температуре, не превышающей 35°C. При проведении трансфекции векторами, содержащими геном вируса гриппа, рекомбинантные вирусы, пригодные для применения в качестве вакцин, могут быть извлечены с применением стандартных способов очистки. Применяя векторные системы и способы по изобретению, можно легко и эффективно получать в культуре клеток реассортантные вирусы, содержащие шесть сегментов внутренних генов штамма, выбранного благодаря его требуемым свойствам по отношению к получению вакцины, и сегменты иммуногенных HA и NA из выбранного, например, патогенного, штамма, такого как штаммы, перечисленные в списке последовательностей в данном описании. Таким образом, система и способы, описанные в данном описании, полезны для быстрого получения в культуре клеток рекомбинантных и реассортантных вирусов гриппа A и B, включая вирусы, пригодные для применения в качестве вакцин, в том числе живых ослабленных вакцин, таких как вакцины, пригодные для интраназального введения.

В таких вариантах осуществления изобретения единичный штамм исходного донорного вируса (MDV) обычно выбирают для каждого из подтипов A и B. В случае живой ослабленной вакцины штамм исходного донорного вируса выбирают на основании его полезных свойств, например, температурной чувствительности, адаптации к холоду и/или ослабления, необходимых для получения вакцины. Например, характерные исходные вакцинные штаммы включают такие температурочувствительные, ослабленные и адаптированные к холоду штаммы как A/Ann Arbor/6/60 и B/Ann Arbor/1/66, соответственно, а также другие, упомянутые в данном описании.

Например, выбранный исходный донорный вирус типа A (MDV-A) или исходный донорный вирус типа B (MDV-B) получают из множества клонированных вирусных кДНК, составляющих вирусный геном. Варианты осуществления изобретения включают рекомбинантные вирусы, полученные из восьми клонированных вирусных кДНК. Восемь вирусных кДНК, представляющие выбранные последовательности для PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M и NS либо MDV-A, либо MDV-B, в некоторых случаях клонируют в двунаправленный экспрессионный вектор, такой как плазмида (например, pAD3000), таким образом, чтобы РНК вирусного генома могли быть транскрибированы с промотора для РНК-полимеразы I (пол I) с одной цепи, и вирусная мРНК могла быть синтезирована с промотора РНК-полимеразы II (пол II) с другой цепи. В некоторых случаях, любой генный сегмент может быть модифицирован, включая сегмент HA (например, с целью удаления сайта расщепления с высоким содержанием основных аминокислот (также известного как сайт расщепления, состоящий из основных аминокислот)).

Инфекционные рекомбинантные вирусы MDV-A или MDV-B могут быть выделены после трансфекции плазмид, несущих восемь вирусных кДНК, в соответствующие клетки-хозяева, например, клетки Veros, совместно культивируемые клетки MDCK/293T или MDCK/COS7. При применении плазмид и способов, описанных в данном описании, и, например, в заявке на патент США № 60/420708, поданной 23 октября 2002 г., заявке на патент США № 10/423828, поданной 25 апреля 2003 г., и заявке на патент США № 60/574117, поданной 24 мая 2004 г., все озаглавлены "Мультиплазмидная система для получения вируса гриппа"; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; опубликованной заявке на патент США № 20020164770, принадлежащей Hoffmann; и патенте США № 6544785, выданном 8 апреля 2003 г. Palese, et al, изобретение является полезным, например, для создания вакцин на основе реассортантного вируса гриппа с формулой генома 6:2 с применением котрансфекции 6 внутренних генов (PB1, PB2, PA, NP, M и NS) выбранного вируса (например, MDV-A, MDV-B) вместе с HA и NA, полученных из других вирусов гриппа соответствующего типа (A или B), например, таких как указано в списке последовательностей в данном описании. Например, сегмент HA, удачно выбранный из патогенетически родственного штамма H1, H3 или B, стандартно применяется для получения вакцин. Аналогичным образом, из штамма, который становится значимым в качестве патогенного штамма, может быть выбран такой сегмент HA, как в списке последовательностей в данном описании. Также могут быть получены реассортантные вирусы, содержащие семь сегментов генома, принадлежащих MDV, и либо ген HA, либо ген NA из выбранного штамма (реассортантные вирусы с формулой генома 7:1). Следует иметь в виду, и это подробно описано в данном описании, что молекулы по изобретению в некоторых случаях могут быть объединены в любую нужную комбинацию. Например, последовательности HA и/или NA, указанные в данном описании, могут быть помещены, например, в скелет реассортантного вируса, такого как A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34 (т.е. PR8) и т.д., в реассортантные вирусы с формулой генома 6:2 или в реассортантные вирусы с формулой генома 7:1 и т.д. Таким образом, как более полно объясняется ниже, присутствовало бы 6 внутренних сегментов генома от одного донорного вируса (например, A/AA/6/60 и т.д.) и 2 сегмента генома от второго штамма (например, штамма дикого типа, отличного от донорного вируса). Такие 2 сегмента генома предпочтительно являются генами HA и NA. Схожая ситуация возникает в случае реассортантных вирусов с формулой генома 7:1, в которых, однако, имеется 7 сегментов генома от донорного вируса и 1 сегмент генома (либо HA, либо NA) от другого вируса (обычно дикого типа или вируса, к которому требуется развить иммунный ответ). Кроме того, следует иметь в виду, что последовательности, указанные в данном описании (например, в списке последовательностей фигуры 1 и т.д.), могут быть скомбинированы рядом способов в различных вариантах осуществления изобретения, указанных в данном описании. Таким образом, любая из указанных в данном описании последовательностей может присутствовать как одиночная в реассортантном вирусе с формулой генома 7:1 (т.е. последовательность по настоящему изобретению присутствует совместно с 7 сегментами генома донорного вируса) и/или может присутствовать вместе с другой последовательностью по изобретению в реассортантном вирусе с формулой генома 6:2. В таких реассортантных вирусах 6:2 любая последовательность по изобретению может в некоторых случаях присутствовать с любой другой последовательностью по изобретению. Однако обычно и предпочтительно, варианты осуществления изобретения включают HA и NA из одних и тех же исходных штаммов дикого типа (или модифицированных штаммов дикого типа, таких как штаммы с модифицированным сайтом расщепления, состоящим из основных аминокислот). Например, конкретный вариант осуществления изобретения может включать реассортантный вирус с формулой генома 6:2, имеющий 6 внутренних сегментов генома от донорного вируса, такого как A/AA/6/60, и сегменты HA и NA генома, описанные в данном описании. Несомненно, следует иметь в виду, что изобретение также включает такие реассортантные вирусы, в которых сегменты HA и NA генома происходят от схожих штаммов. Указанные выше ссылки специально включены в данное описание полностью, например, специально для получения информации относительно плазмид, плазмидной "помощи" для вируса (вируса гриппа), мультиплазмидных систем для "помощи" вирусу/получения вируса и т.д.

Кроме того, последовательности HA и NA по настоящему изобретению в некоторых случаях применяют в таких вакцинах на основе реассортации плазмид (и/или в других ts, cs, ca, и/или att вирусах и вакцинах). Однако следует отметить, что последовательности HA и NA, например, таковые последовательности по изобретению, не ограничены специфичными композициями вакцин или способами получения и могут, таким образом, применяться фактически в любом типе вакцин или способе получения вакцин, в которых применяются штамм-специфичные антигены HA и NA (например, последовательности по изобретению).

ФЛУМИСТ®

Как упоминалось ранее, существует множество примеров и типов противогриппозной вакцины. Примером противогриппозной вакцины может служить препарат ФлуМист (Medlmmune Vaccines Inc., Маунтин-Вью, Калифорния, США), который является живой ослабленной вакциной, которая защищает детей и взрослых от заболевания гриппом (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). В конкретных и предпочтительных вариантах осуществления изобретения способы и композиции по настоящему изобретению предпочтительно адаптированы к/применяются для получения вакцины ФлуМист. Однако специалисту в данной области понятно, что последовательности, способы, композиции и т.д., указанные в данном описании, также могут быть адаптированы для получения схожих или даже отличных противовирусных вакцин.

Вакцинные штаммы ФлуМист содержат, например, генные сегменты HA и NA, происходящие от штаммов дикого типа, против которых направлено действие вакцины (или, в некоторых случаях, против родственных штаммов), а также шесть генных сегментов, PB1, PB2, PA, NP, M и NS, от стандартно применяемого исходного донорного вируса (MDV). Таким образом, описанные в данном описании последовательности HA и NA в некоторых случаях являются частью различных рецептур препарата ФлуМист. MDV для штаммов вируса гриппа A препарата ФлуМист (MDV-A) был создан посредством серии пассажей штамма дикого типа A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) в первичной культуре ткани почки цыпленка при последовательном понижении температуры (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4). MDV-A эффективно реплицируется при 25°C (ca, адаптированный к холоду), но его рост ограничен при 38 и 39°C (ts, температурочувствительный). Кроме того, этот вирус не реплицируется в легких инфицированных хорьков (att, ослабление). Полагают, что фенотип ts обеспечивает ослабление вакцины в организме человека путем ограничения его репликации во всех, кроме обладающих самой низкой температурой, частях дыхательных путей. Стабильность этого свойства была продемонстрирована у модельных животных и в ходе клинических испытаний. В противоположность фенотипу ts штаммов вируса гриппа, созданных с применением химического мутагенеза, свойство температурочувствительности MDV-A не возвращается к исходному состоянию после пассажа в инфицированных хомяках или в изолятах из выделений, полученных от детей (см. недавно опубликованный обзор Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323).

Клинические исследования с участием более чем 20 000 взрослых пациентов и детей, с применением 12 различных штаммов реассортантных вирусов с формулой генома 6:2 показали, что эти вакцины являются ослабленными, безопасными и эффективными (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). Реассортантные вирусы, несущие шесть внутренних генов от MDV-A и два генных сегмента HA и NA от вируса дикого типа (т.е. реассортантный вирус с формулой генома 6:2) стабильно сохраняют фенотипы ca, ts и att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis. 146:780-900).

Получение таких реассортантных вирусов с применением штамма вируса гриппа B является более сложным процессом, однако в недавно опубликованной работе (см., например, заявку на патент США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку на патент США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г. и заявку на патент США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., все озаглавлены "Мультиплазмидная система для получения вируса гриппа") продемонстрирована система из восьми плазмид для получения вируса гриппа B целиком из клонированных кДНК. Также были продемонстрированы способы получения ослабленных жизнеспособных вирусов гриппа A и B, пригодных для применения в рецептурах вакцин, таких как рецептуры вакцин на основе жизнеспособных вирусов, полезные для интраназального введения.

Система и способы, описанные ранее, полезны для быстрого получения в культуре клеток рекомбинантных и реассортантных вирусов гриппа A и B, включая вирусы, пригодные для применения в качестве вакцин, в том числе живых ослабленных вакцин, таких как вакцины, пригодные для интраназального введения. Последовательности, способы и т.д. по настоящему изобретению в некоторых случаях применяются совместно или в сочетании с такими ранее проведенными работами, в которых исследовали, например, реассортантные вирусы гриппа для получения вакцин с целью получения вирусов для вакцин.

СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН

Как указано выше, в соответствии с другим вариантом или дополнительно к применению для получения вакцины ФлуМист™, настоящее изобретение можно использовать для разработки других рецептур вакцин. В общем случае рекомбинантные и реассортантные вирусы по изобретению можно вводить в профилактических целях в иммунологически эффективном количестве и в соответствующем носителе или эксципиенте для стимуляции иммунного ответа, специфичного к одному или нескольким штаммам вируса гриппа, что определяется последовательностью HA и/или NA. Обычно, носитель или эксципиент является фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, водный раствор хлорида натрия, водные буферированные растворы хлорида натрия, водные растворы декстрозы, водные растворы глицерина, этанол, аллантоисная жидкость из неинфицированных куриных яиц (т.е. нормальная аллантоисная жидкость или НАЖ) или их комбинации. Приготовление таких растворов с обеспечением стерильности, значения pH, изотоничности и стабильности, осуществляют в соответствии с протоколами, принятыми в данной области. В общем случае, носитель или эксципиент выбирают так, чтобы минимизировать аллергические и иные нежелательные эффекты и удовлетворить требованиям конкретного пути введения, например, подкожного, внутримышечного, интраназального и т.д.

Связанная с этим особенность изобретения состоит в том, что оно направлено на создание способов стимулирования иммунной системы пациента для выработки защитного иммунного ответа против вируса гриппа. В этих способах иммунологически эффективное количество рекомбинантного вируса гриппа (например, молекулы по изобретению HA и/или NA), иммунологически эффективное количество полипептида по изобретению и/или иммунологически эффективное количество нуклеиновой кислоты по изобретению вводят пациенту в физиологически приемлемом носителе.

В общем случае, вирусы гриппа по изобретению вводят в количестве, достаточном для стимулирования иммунного ответа, специфичного к одному или нескольким штаммам вируса гриппа (т.е. против штаммов с HA и/или NA по изобретению). Предпочтительно, введение вирусов гриппа вызывает защитный иммунный ответ к таким штаммам. Дозировки и способы индукции защитного иммунного ответа против одного или нескольких штаммов вируса гриппа известны специалистам в данной области. См., например, патент США 5922326; Wright et al, Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al, Pediatrics 52:56-63 (1973); и Wright et al, J. Pediatr. 88:931-936 (1976). Например, вирусы гриппа поставляются с содержанием в диапазоне примерно 1-1000 HID₅₀ (инфицирующих доз для человека), т.е. вводят примерно 10⁵-10⁸ БОЕ (бляшкообразующих единиц) на дозу. Обычно, доза будет корректироваться в пределах этого диапазона исходя из, например, возраста, физического состояния, массы тела, пола, диеты, времени введения и других клинических факторов. Препарат профилактической вакцины вводят системно, например, путем подкожной или внутримышечной инъекции с использованием шприца с иглой или безыгольного изделия для инъекций. В соответствии с другим вариантом, препарат вакцины вводят интраназально, в виде капель, аэрозоля с крупными частицами (более 10 микрон) или раствора, распыляемого в верхних дыхательных путях. Хотя любой из указанных выше путей доставки приводит к защитному системному иммунному ответу, интраназальное введение обладает дополнительным преимуществом, состоящим в том, что оно активирует мукозный иммунный ответ в месте внедрения вируса гриппа. В случае интраназального введения часто предпочтительными являются ослабленные вакцины на основе жизнеспособного вируса, например, ослабленного, адаптированного к холоду и/или температурочувствительного рекомбинантного или реассортантного вируса гриппа. См. выше. Хотя предпочтительной является стимуляция защитного иммунного ответа с применением разовой дозы, могут вводиться дополнительные дозировки, тем же самым или иным путем, для достижения требуемого профилактического эффекта.

Обычно, ослабленный рекомбинантный вирус гриппа по настоящему изобретению при применении в вакцине является существенно ослабленным таким образом, что симптомы инфекции или по меньшей мере симптомы серьезной инфекции не возникают у большинства пациентов, иммунизированных (или иначе инфицированных) ослабленным вирусом гриппа. В некоторых случаях ослабленный вирус гриппа может сохранять способность вызывать симптомы легкой степени заболевания (например, легкой степени заболевания верхних дыхательных путей) и/или диссеминации в отношении не вакцинированных пациентов. Однако его вирулентность в достаточной степени уничтожена таким образом, что у вакцинированного или случайного хозяина не возникает тяжелых инфекций нижних дыхательных путей.

Альтернативно, иммунный ответ может быть стимулирован путем ex vivo или in vivo нацеливания дендритных клеток с применением вирусов гриппа, содержащих указанные в данном описании последовательности. Например, пролиферирующие дендритные клетки подвергают воздействию вирусов в достаточном количестве и в течение достаточного периода времени для того, чтобы произошел захват антигенов вируса гриппа дендритными клетками. После этого клетки переносят пациенту, который должен быть вакцинирован, с применением стандартных способов внутривенной трансплантации.

Хотя предпочтительной является стимуляция защитного иммунного ответа с применением разовой дозы, могут вводиться дополнительные дозировки, тем же самым или иным путем, для достижения требуемого профилактического эффекта. У новорожденных и младенцев, например, может требоваться многократное введение для достижения достаточного уровня иммунного ответа. Введение может продолжаться с определенными интервалами в течение всего детства, если это необходимо для поддержания достаточного уровня защиты против инфекции вирусов гриппа дикого типа. Аналогичным образом, для взрослых пациентов, которые особенно чувствительны к повторяющимся или серьезным инфекциям гриппа, таких как, например, работники здравоохранения, работники центров дневного ухода за детьми, члены семей с маленькими детьми, пожилые люди и пациенты с аномальной сердечно-легочной функцией, может требоваться многократная иммунизация для выработки и/или поддержания защитных иммунных ответов. Уровни индуцированных иммунных ответов можно контролировать, например, измеряя количество нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, и, в случае необходимости, проводить корректировку дозировки или повторные вакцинации для выработки и поддержания требуемых уровней защиты.

В некоторых случаях, препарат для профилактического введения вирусов гриппа также содержит один или несколько адъювантов для усиления иммунного ответа на антигены вируса гриппа. Пригодные адъюванты включают: полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, бациллу Кальмета-Герена (БЦЖ), Corynebacterium parvum и синтетические адъюванты QS-21 и MF59.

Если требуется, профилактическое введение вирусов гриппа можно проводить в сочетании с введением одной или нескольких иммуностимулирующих молекул. Иммуностимулирующие молекулы включают различные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопотенциирующей и провоспалительной активностями, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, фактор колониестимулирования гранулоцит-макрофагов (ГМ)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как фактор воспаления макрофагов, лиганд Flt3, B7.1; B7.2 и т.д. Иммуностимулирующие молекулы можно вводить в составе того же препарата, что и вирусы гриппа, или их можно вводить отдельно. Для получения иммуностимулирующего эффекта могут вводиться как белок (например, полипептиды HA и/или NA по изобретению), так и экспрессионный вектор, кодирующий белок.

Описанные выше способы полезны для терапевтического и/или профилактического лечения заболевания или нарушения, обычно гриппа, путем внедрения вектора по изобретению, содержащего гетерологичный полинуклеотид, кодирующий терапевтически или профилактически эффективный полипептид (или пептид) HA и/или NA или РНК HA и/или NA (например, антисмысловую РНК или рибозим), в популяцию клеток-мишеней in vitro, ex vivo или in vivo. Обычно, полинуклеотид, кодирующий рассматриваемый полипептид (или пептид) или РНК, функционально присоединен к соответствующим регуляторным последовательностям, например, как описано в данном описании. В некоторых случаях, более одной гетерологичной кодирующей последовательности внедрено в единичный вектор или вирус. Например, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему терапевтически или профилактически активные полипептид HA и/или NA или РНК, вектор также может включать дополнительные терапевтические или профилактические полипептиды, например, антигены, ко-стимулирующие молекулы, цитокины, антитела и т.д. и/или маркеры и т.п.

Хотя вакцинация пациента ослабленным вирусом гриппа, принадлежащим к конкретному штамму конкретной подгруппы, может вызвать перекрестный иммунитет к вирусу гриппа, принадлежащему к другому штамму и/или подгруппе, перекрестный иммунитет можно усилить, если это необходимо, путем вакцинации пациента ослабленным вирусом гриппа, принадлежащим по меньшей мере к двум, по меньшей мере к трем или по меньшей мере к четырем штаммам или подгруппам вируса гриппа, например, по меньшей мере два из них могут представлять разные подгруппы. Например, вакцинация пациента с применением по меньшей мере четырех штаммов или подштаммов ослабленного вируса гриппа может включать вакцинацию пациента с применением по меньшей мере двух штаммов или подштаммов вируса гриппа A и по меньшей мере двух штаммов или подштаммов вируса гриппа B. Вакцинация пациента с применением по меньшей мере четырех штаммов или подштаммов ослабленного вируса гриппа может включать вакцинацию пациента с применением по меньшей мере трех штаммов или подштаммов вируса гриппа A и по меньшей мере одного штамма или подштамма вируса гриппа B. Вакцинация пациента с применением по меньшей мере четырех штаммов или подштаммов вируса гриппа может требовать введения одной тетравалентной вакцины, которая содержит все из по меньшей мере четыре штамма или подштамма ослабленных вирусов гриппа. Альтернативно, вакцинация может требовать введения нескольких вакцин, каждая из которых содержит один, два или три штамма или подштамма ослабленных вирусов гриппа. Кроме того, комбинации вакцин могут в некоторых случаях включать смеси пандемических вакцин и непандемических штаммов. Смеси вакцин (или многократные вакцинации) могут включать компоненты штаммов вируса гриппа человека и/или видов, отличных от человека (например, птиц и человека и т.д.) Аналогичным образом, ослабленные вакцины против вируса гриппа по настоящему изобретению могут быть в некоторых случаях скомбинированы с вакцинами, которые вызывают защитные иммунные ответы против других инфекционных агентов. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является тривалентной вакциной, содержащей три реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является тривалентной вакциной, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является тривалентной вакциной, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом варианте осуществления изобретения вакцина по изобретению является тетравалентной вакциной, содержащей четыре реассортантных вируса гриппа. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является тетравалентной вакциной, содержащей два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном из вариантов осуществления изобретения вакцина по изобретению является тетравалентной вакциной, содержащей реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Виктория и реассортантный вирус гриппа B линии Ямагата.

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА

Вирусы, содержащие минус нить РНК, могут быть созданы с применением генетической инженерии и извлечены с применением рекомбинантных методов обратной генетики (патент США 5166057, принадлежащий Palese et al). Такой способ первоначально был применен для конструирования геномов вирусов гриппа (Luytjes et al. (1989) Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567) и был успешно применен в отношении большого разнообразия вирусов, содержащих сегментированные и несегментированные минус-нити РНК, например, вируса бешенства (Schnell et al. (1994) EMBO J. 13: 4195-4203); VSV (Lawson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481); вируса кори (Radecke et al.(1995) EMBO J. 14:5773-5784); вируса чумы рогатого скота (Baron & Barrett (1997) J. Virol. 71: 1265-1271); вируса парагриппа человека (Hoffman & Banerjee (1997) J. Virol. 71: 32723277; Dubin et al. (1997) Virology 235:323-332); SV5 (He et al. (1997) Virology 237:249260); вируса чумы собак (Gassen et al. (2000) J. Virol. 74:10737-44) и вируса Сендай (Park et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al. (1996) Genes to Cells 1:5 69-5 79). Специалисту в данной области известны эти и другие способы получения вируса гриппа, содержащего последовательности HA и NA по изобретению. Рекомбинантные вирусы гриппа, полученные в соответствии с такими способами, также являются особенностью настоящего изобретения, как и рекомбинантный вирус гриппа, содержащий одну или несколько нуклеиновых кислот и/или полипептидов по изобретению. Несомненно, специалисту в данной области следует иметь в виду, что вирусы гриппа в целом (так же как и вирусы по изобретению) являются вирусами, содержащими минус-цепь РНК. Таким образом, когда в настоящем изобретении вирусы гриппа описываются как содержащие, например, последовательности с фигуры 1 и т.д., понятно, что это обычно означает версию последовательности, соответствующую минус-цепи РНК. Нуклеотидные последовательности на фигуре 1 включают ДНК-версии (например, кодирующую смысловую плюс-цепь и т.д.) генов (вместе с некоторыми нетранслируемыми участками в составе нуклеотидных последовательностей). Специалисты в данной области могут легко произвести преобразование между последовательностями РНК и ДНК (например, заменяя U на T и т.д.) и между комплементарными нуклеотидными последовательностями (как РНК, так и ДНК) и т.д. Таким образом, например, специалист в данной области сможет легко преобразовать нуклеотидную последовательность в соответствующую аминокислотную последовательность или в соответствующую комплементарную последовательность (как ДНК, так и РНК) и т.д. Также очевидно, что когда такие последовательности HA и/или NA описывают в составе ДНК-векторов, например, плазмид и т.д., то, в таком случае, подразумевается соответствующая ДНК-версия последовательностей. Кроме того, нуклеиновые кислоты по изобретению однозначно включают последовательности из списка последовательностей, приведенного в данном описании, а также последовательности, комплементарные таким последовательностям (как РНК, так и ДНК), двуцепочечную форму последовательностей из списка последовательностей, соответствующие РНК-формы последовательностей из списка последовательностей (либо в виде РНК, комплементарной последовательности, указанной в списке последовательностей, либо в виде РНК-версии последовательностей из списка последовательностей, например, с той же смысловой полярностью, но состоящую из РНК, с U вместо T и т.д.).

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ХОЗЯЕВА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, в которые внедрены (трансдуцированы, трансформированы или трансфицированы) векторы по изобретению, и получению полипептидов по изобретению с применением рекомбинантных способов. Клетки-хозяева с применением методов генной инженерии модифицируют (т.е. трансдуцируют, трансформируют или трансфицируют) вектором, таким как экспрессионный вектор, по настоящему изобретению. Как описано выше, вектор может существовать в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Примеры пригодных хозяев для проведения экспрессии включают: бактериальные клетки, такие как E. coli, Streptomyces, и Salmonella typhimurium; клетки грибов, таких как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Neurospora crassa; или клетки насекомых, таких как Drosophila и Spodoptera frugiperda.

Самым распространенным является применение для получения молекул HA и NA по изобретению клеток млекопитающих. Пригодные клетки-хозяева для репликации вируса гриппа (например, с описанными в данном описании последовательностями HA и/или NA) включают, например, клетки Vero, клетки BHK, клетки MDCK, клетки 293 и клетки COS, включая клетки 293T, клетки COS7 и им подобные. Обычно применяют ко-культуры, включающие две из вышеуказанных линий клеток, например, клетки MDCK и либо клетки 293T, либо COS, в соотношении, например, 1:1, с целью повышения эффективности репликации. Обычно клетки культивируют в стандартной коммерчески доступной культуральной среде, такой как среда Игла в модификации Дульбекко с добавлением сыворотки (например, 10% фетальной телячьей сыворотки) или в бессывороточной среде, в условиях контролируемой влажности и концентрации CO₂, пригодной для поддержания нейтрального значения pH буфера (например, при pH от 7,0 до 7,2). В некоторых случаях, среда содержит антибиотик для предотвращения бактериального роста, например, пенициллин, стрептомицин и т.д., и/или дополнительные питательные вещества, такие как L-глутамин, пируват натрия, аминокислоты, не являющиеся незаменимыми, дополнительные добавки для усиления полезных ростовых характеристик, например, трипсин, β-меркаптоэтанол и т.п.

Модифицированные генно-инженерными методами клетки-хозяева можно культивировать в стандартных питательных средах, соответствующим образом модифицированных для обеспечения активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации вставленных полинуклеотидных последовательностей, например, путем получения вирусов. Условия культивирования, такие как температура, pH и т.п., обычно являются такими же, которые применяются для конкретного типа клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и будут очевидны специалисту в данной области и приводятся в цитируемых в данном описании ссылках, включая, например, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3rd edition, Wiley-Liss, New York и приведенные там ссылки. Другие полезные литературные источники включают, например, Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Дополнительные сведения по способам культивирования тканей, которые, в частности, полезны для получения вируса гриппа in vitro, включают, например, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, специально включенные в данное описание полностью. Дополнительно, можно легко разработать варианты таких способов, адаптированные к настоящему изобретению, в ходе стандартной экспериментальной работы, и такие варианты известны специалисту в данной области.

Клетки для получения вируса гриппа (например, имеющего последовательности HA и/или NA по изобретению) можно культивировать в содержащей сыворотку или в бессывороточной среде. В некоторых случаях, например, для приготовления очищенных вирусов, желательно выращивать клетки-хозяева в условиях отсутствия сыворотки. Клетки можно культивировать в малых масштабах, например, менее 25 мл среды, в культуральных пробирках или флаконах, или в больших флаконах при перемешивании, в роллерных бутылях, или на микроносителях в форме бусин (например, ДЭАЭ-декстрановых микроносителях в форме бусин, таких как Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; микроносителях в форме бусин из стиренового сополимера-триметиламина, таких как Hillex, SoloHill, Ann Arbor) во флаконах, бутылях или ферментерах. Микроносители в форме бусин - это маленькие сферы (в диапазоне 100-200 микрон в диаметре), которые обеспечивают большую площадь поверхности для роста адгезивных клеток из расчета на единицу объема клеточной культуры. Например, один литр среды может содержать более 20 млн. микроносителей в форме бусин, обеспечивающих более 8000 см² площади для роста. Для получения вирусов в производственных масштабах, например, для получения вакцин, часто желательно проводить культивирование клеток в биореакторе или ферментере. Доступны биореакторы вместимостью от менее чем 1 л до более 100 л, например, Cyto3 Bioreactor (Osmonics, Миннетонка, Миннесота, США); NBS bioreactors (New Brunswick Scientific, Эдисон, Нью-Джерси, США); биореакторы для лабораторий и промышленного производства компании B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Мельзунген, Германия).

Независимо от объема культуры, для многих требуемых особенностей настоящего изобретения важно, чтобы культуры поддерживались при соответствующей температуре с целью обеспечения эффективного извлечения рекомбинантного и/или реассортантного вируса гриппа, применяя температуро-зависимую мультиплазмидную систему (см., например, заявку на патент США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку на патент США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г. и заявку на патент США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., все озаглавлены "Мультиплазмидная система для получения вируса гриппа"), нагревания содержащих вирус растворов для фильтрации и т.д. Обычно применяют регулятор, например, термостат или другое устройство для определения и поддержания температуры в системе клеточной культуры и/или другом растворе, чтобы обеспечить сохранение температуры на нужном уровне в течение необходимого периода (например, репликации вируса и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных в данном описании, (например, в случае, когда реассортантные вирусы необходимо получить из сегментов в векторах) векторы, содержащие сегменты генома вируса гриппа внедряют (например, трансфицируют) в клетки-хозяева с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области, для внедрения гетерологичных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, включая, например, ко-преципитацию с фосфатом кальция, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию и трансфекцию с применением полиаминных реагентов для трансфекции. Например, векторы, такие как плазмиды, могут быть трансфицированы в клетки-хозяева, такие как клетки COS, клетки 293T или комбинация клеток COS или 293T с клетками MDCK, с применением полиаминного реагента для трансфекции TransIT-LT1 (Mirus) согласно инструкциям производителя с целью получения реассортантных вирусов и т.д. Таким образом, в одном примере примерно 1 мкг каждого вектора внедряют в популяцию клеток-хозяев с примерно 2 мкл реагента TransIT-LT1, разведенного в 160 мкл среды, предпочтительно бессывороточной среды, в суммарном объеме 200 мкл. Смеси ДНК с реагентом для трансфекции инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин, после этого добавляют 800 мкл среды. Смесь для трансфекции добавляют к клеткам-хозяевам и культивируют клетки как описано в других способах, хорошо известных специалистам в данной области. В соответствии с этим, для получения рекомбинантных или реассортантных вирусов в клеточной культуре векторы, содержащие каждый из 8 сегментов генома, (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA и NA, например, по изобретению) смешивают с примерно 20 мкл реагента TransIT-LT1 и трансфицируют в клетки-хозяева. В некоторых случаях, среду с добавлением сыворотки заменяют перед трансфекцией на бессывороточную среду, например, Opti-MEM I, и инкубируют в течение 4-6 ч.

Альтернативно, для внедрения таких векторов, содержащих сегменты генома вируса гриппа, в клетки-хозяева может применяться электропорация. Например, плазмидные векторы, содержащие вирус гриппа A или B, успешно внедряют в клетки Vero с применением электропорации в соответствии со следующим способом. Кратко, 5×106 клеток Vero, например, выращенных в модифицированной среде Игла (MEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), ресуспендируют в 0,4 мл среды OptiMEM и помещают в кювету для электропорации. Двадцать микрограмм ДНК в объеме до 25 мкл добавляют к клеткам в кювету, после чего аккуратно перемешивают с помощью постукивания. Электропорацию проводят согласно инструкциям производителя (например, BioRad Gene Pulser II с присоединенным Capacitance Extender Plus) при 300 В, 950 микрофарадах с временной константой от 28 до 33 мсек. Клетки повторно перемешивают с помощью аккуратного постукивания, и примерно в течение 1-2 мин после электропорации добавляют 0,7 мл MEM с 10% FBS непосредственно в кювету. После этого клетки переносят в две лунки стандартного 6-луночного культурального планшета, содержащие 2 мл MEM, 10% FBS. Кювету промывают для извлечения оставшихся клеток, и промывную суспензию разделяют между двумя лунками. Конечный объем равен примерно 3,5 мл. После этого клетки инкубируют в условиях, подходящих для вирусного роста, например, при около 33°C в случае адаптированных к холоду штаммов.

В клетках-хозяевах, полученных от млекопитающих, можно применять ряд экспрессионных систем, таких как системы на основе вирусов. В случаях, когда в качестве экспрессионного вектора применяют аденовирус, кодирующую последовательность в некоторых случаях лигируют в аденовирусный транскрипционный/трансляционный комплекс, состоящий из позднего промотора и трехчастной лидерной последовательности. Внедрение в несущественную область E1 и E3 вирусного генома приведет к образованию различных вирусов, способных экспрессировать требуемые полипептиды в инфицированных клетках-хозяевах (Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659). Дополнительно, энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV), можно использовать для усиления экспрессии в клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим.

Линию клеток-хозяев в некоторых случаях выбирают по ее способности модулировать экспрессию внедренных последовательностей или процессировать экспрессированный белок нужным образом. Такие модификации белка включают в качестве неограничивающих примеров ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, присоединение липидов и ацилирование. Посттрансляционный процессинг белка, при котором предшественник расщепляется с образованием зрелой формы, иногда важен для правильного встраивания, фолдинга и/или функционирования. Кроме того, также важна правильная локализация в пределах клетки-хозяина (например, на поверхности клетки). Различные клетки-хозяева, такие как COS, CHO, BHK, MDCK, 293, 293T, COS7 и т.д., обладают специфичными клеточными механизмами и характерными механизмами для такой посттрансляционной активности, и могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг рассматриваемого внедренного, чужеродного белка.

Для длительного, с высоким выходом получения рекомбинантных белков, кодируемых, или имеющих подпоследовательности, кодируемые полинуклеотидами по изобретению, в некоторых случаях применяют стабильные экспрессионные системы. Например, клеточные линии, стабильно экспрессирующие полипептид по изобретению, трансфицируют с применением экспрессионных векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации или эндогенные экспрессионные элементы и ген селектируемого маркера. Например, после внедрения вектора клеткам дают расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед тем, как их переводят на селективную среду. Задача селектируемого маркера состоит в том, чтобы придать устойчивость к селекции, и его присутствие позволяет выращивать и извлекать клетки, которые успешно экспрессируют внедренные последовательности. Таким образом, устойчивые стабильно трансформированные клетки, например, полученные из одного типа клеток, можно размножать с применением способов культивирования тканей, соответствующих типу клеток.

Клетки-хозяева, трансформированные нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид по изобретению, в некоторых случаях, культивируют в условиях, пригодных для экспрессии и извлечения кодируемого белка из клеточной культуры. Клетки, экспрессирующие названный белок, могут быть рассортированы, выделены и/или очищены. Белок или его фрагменты, выработанные рекомбинантной клеткой, могут быть секретируемыми, мембран-связанными или находиться внутри клетки, в зависимости от последовательности (например, в зависимости от того, является ли белок химерным, несущим сигнал удержания на мембране и т.п.) и/или от применяемого вектора.

Продукты экспрессии, соответствующие нуклеиновым кислотам по изобретению, также могут быть получены в клетках, принадлежащих организмам, не являющимся млекопитающими, таким как растения, дрожжи, грибы, бактерии и т.п. Помимо работ Sambrook, Berger and Ausubel, все процитированы ниже, подробные сведения о клеточной культуре можно найти в Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

В бактериальной системе может быть выбран ряд экспрессионных векторов, в зависимости от намеченного применения экспрессированного продукта. Например, когда необходимы большие количества полипептида или его фрагментов для получения антител, успешно применяют векторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии химерных белков, которые легко могут быть очищены. Такие векторы включают в качестве неограничивающих примеров мультифункциональные клонирующие и экспрессионные векторы E. coli, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в которых представляющая интерес кодирующая последовательность, например, последовательности, включающие таковые, указанные в данном описании, и т.д., может быть лигирована в вектор в одной рамке считывания с последовательностями для инициирующего трансляцию метионина на N-конце и последующих 7 остатков бета-галактозидазы, что дает в результате каталитически активный химерный белок с бета-галактозидазой; векторы pFN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); векторы pET (Novagen, Madison WI) и им подобные. Аналогичным образом, в дрожжах Saccharomyces cerevisiae для получения требуемых продуктов экспрессии может быть применен ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как индуцируемые альфа-фактором, оксидазой спиртов и PGH. См. обзор в Ausubel, ниже, и Grant et al, (1987); Methods in Enzymology 153:516-544.

КЛОНИРОВАНИЕ, МУТАГЕНЕЗ И ЭКСПРЕССИЯ ПРЕДСТАВЛЯЮЩИХ ИНТЕРЕС БИОМОЛЕКУЛ

Общие публикации, описывающие молекулярно-биологические методики, которые применимы к настоящему изобретению, такие как клонирование, внесение мутаций, культура клеток и т.п., включают Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2002) ("Ausubel")). В этих публикациях описаны мутагенез, применение векторов, промоторы и многие другие существенные темы, относящиеся к, например, созданию молекул HA и/или NA и т.д.

Различные типы мутагенеза в некоторых случаях применяются в настоящем изобретении, например, с целью получения и/или выделения, например, новых или вновь выделенных молекул HA и/или NA, и/или с целью дополнительной модификации/мутации полипептидов (например, молекул HA и NA) по изобретению. Они включают в качестве неограничивающих примеров сайт-направленный, случайный точечный мутагенез, гомологичную рекомбинацию (пересортировку ДНК), мутагенез с применением урацилсодержащих матриц, олигонуклеотид-направленный мутагенез, мутагенез с применением фосфоротиоат-модифицированной ДНК, мутагенез с применением дуплексов ДНК с пропусками и т.п. Дополнительные пригодные способы включают точечную репарацию пар с нарушением комплементарности, мутагенез с применением дефицитных по системе репарации штаммов-хозяев, способы с применением рестрикции-селекции и рестрикции-очистки, делеционный мутагенез, мутагенез путем синтеза целого гена, репарацию двуцепочечных разрывов и т.п. Мутагенез, например, с применением химерных конструкций, также включен в настоящее изобретение. В одном из вариантов осуществления изобретения при мутагенезе руководствуются известной информацией о встречающейся в естественных условиях молекуле или измененной или мутированной встречающейся в естественных условиях молекуле, например, о последовательности, сравнении последовательностей, физических свойствах, кристаллической структуре или тому подобной.

Указанные выше публикации и примеры, приведенные в данном описании, описывают эти методики, так же как и следующие публикации (и приведенные в них ссылки): Sieber, et al, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); Ling et al, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2): 157-178 (1997); Dale et al, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol Biol 57:369-374 (1996); I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using MI3 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin)) (1987); Kunkel et al, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698 (1986); Wells et al, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423 (1986); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis usingM13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Grundstrom et al, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787 (1985); Wells et al, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 9441-9456 (1984); Kramer et al, Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into MI3 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); and Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using MI 3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500 (1982). Дополнительную информацию по многим из указанных выше способам можно найти в Methods in Enzymol, том 154, в котором также описаны полезные руководства по разрешению проблем, возникающих при осуществлении различных типов мутагенеза, выделения генов, экспрессии и других методов.

Олигонуклеотиды, например, для применения в мутагенезе по настоящему изобретению, например, для мутирования библиотек молекул HA и/или NA по изобретению или для их изменения обычно синтезируют химически, в соответствии с твердофазным фосфорамидитным триэфирным методом, описанным в Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20): 1859-1862, (1981), например, с применением автоматического синтезатора, как описано в Needham-VanDevanter et al, Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984).

Кроме того, по существу, любая нуклеиновая кислота может быть приобретена или заказана обычным путем из любого из множества коммерческих источников. Аналогичным образом, пептиды и антитела могут быть приобретены или заказаны из любого из множества источников.

Настоящее изобретение также относится к клеткам- и организмам-хозяевам, содержащим молекулу HA и/или NA или другой полипептид и/или нуклеиновую кислоту по изобретению, или таковые HA и/или другие последовательности в составе различных векторов, таких как реассортантные вирусы гриппа с формулой генома 6:2, плазмиды в системе плазмидной "помощи" и т.д. Клетки-хозяева изменены генно-инженерными способами (например, трансформированы, трансдуцированы или трансфецированы) с применением векторов по настоящему изобретению, которые могут быть, например, клонирующим вектором или экспрессионным вектором. Вектор может существовать, например, в форме плазмиды, бактерии, вируса, "голого" полинуклеотида или конъюгированного полинуклеотида. Векторы внедряют в клетки и/или микроорганизмы с применением стандартных способов, включающих электропорацию (см., From et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824 (1985), инфекцию вирусными векторами, высокоскоростное баллистическое проникновение с помощью мелких частиц, несущих нуклеиновую кислоту, либо в пределах матрикса маленьких бусин или частиц, либо на их поверхности (Klein et al, Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook и Ausubel описывают разнообразные пригодные способы трансформации. См. выше.

Имеется несколько хорошо известных способов внедрения представляющих интерес нуклеиновых кислот в бактериальные клетки, любой из которых может быть применен в рамках настоящего изобретения. Они включают: слияние реципиентных клеток с бактериальными протопластами, содержащими ДНК, электропорацию, бомбардировку микрочастицами и инфекцию вирусными векторами и т.д. Бактериальные клетки могут применяться для амплификации ряда плазмид, содержащих ДНК-конструкции по настоящему изобретению. Бактерии выращивают до достижения логарифмической фазы, и плазмиды, содержащиеся в бактериях, можно выделить с применением различных способов, известных специалистам в данной области (см., например, Sambrook). Кроме того, доступны для приобретения множество наборов для очистки плазмид из бактерий (см., например, EasyPrep™, FlexiPrep™, оба производства компании Pharmacia Biotech; StrataClean™, производства компании Stratagene и QIAprep™ производства компании Qiagen). С выделенными и очищенными плазмидами после этого проводят дополнительные манипуляции для получения других плазмид, используемых для трансфекции клеток или внедряемых в соответствующие векторы для инфицирования организмов. Конкретные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации транскрипции и трансляции и промоторы, полезные для регуляции экспрессии конкретной представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Векторы, в некоторых случаях, содержат характерные для данного вида экспрессионные кассеты, включающие по меньшей мере одну независимую терминаторную последовательность, последовательности, обеспечивающие репликацию кассеты в эукариотических или прокариотических клетках, или как в тех, так и в других (например, челночные векторы), и селектируемые маркеры как для прокариотической, так и для эукариотической систем. Векторы пригодны для репликации и интеграции в прокариотических клетках, эукариотических клетках или, предпочтительно, как в тех, так и в других. См., Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al, Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al, Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (все цитировались выше). Каталог бактерий и бактериофагов, полезных для клонирования, предоставляет ATCC, например, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds.), опубликованный ATCC. Дополнительные базовые методики секвенирования, клонирования и другие аспекты молекулярной биологии и лежащие в их основе теоретические соображения также можно найти у Watson et al. (1992) в Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. См. выше.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗВЛЕЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ

В некоторых вариантах осуществления изобретения после трансдукции пригодной линии или штамма клеток-хозяев и выращивания клеток-хозяев до соответствующей плотности клеток выбранный промотор индуцируют с применением соответствующего способа (например, температурным сдвигом или химической индукцией) и культивируют клетки в течение дополнительного периода времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения секретируемый полипептидный продукт, например, полипептид HA и/или NA в форме секретируемого химерного белка и т.д., после этого извлекают из культуральной среды. В других вариантах осуществления изобретения из клетки выходит вирусная частица, содержащая один или несколько полипептидов HA и/или NA по изобретению. В соответствии с другим вариантом, клетки могут быть собраны центрифугированием, разрушены физическими или химическими способами, и образовавшийся в результате грубый экстракт сохраняют для дальнейшей очистки. Эукариотические или микробные клетки, применяемые для экспрессии белков, могут быть разрушены любым стандартным способом, включая циклы замораживания-оттаивания, механическое разрушение или применение агентов, лизирующих клетку, или другими способами, хорошо известными специалистам в данной области. Дополнительно, клетки, экспрессирующие полипептидный продукт HA и/или NA по изобретению, могут быть применены без отделения полипептида от клеток. В таких случаях полипептид по изобретению в некоторых случаях экспрессируется на клеточной поверхности и его наличие проверяется (например, по наличию молекул HA и/или NA или их фрагментов, например, в составе химерных белков и т.п.) по связыванию с клеточной поверхностью антител и т.д. Такие клетки также являются особенностью настоящего изобретения.

Экспрессированные полипептиды могут быть извлечены и очищены из культур рекомбинантных клеток любым из ряда способов, известных специалистам в данной области, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анионо- и катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, (например, с использованием любой из известных специалистам в данной области систем введения меток), хроматографию на гидроксиапатитах и лектиновую хроматографию. Могут применяться стадии повторного фолдинга белка, если необходимо, для завершения образования конфигурации зрелого белка. Кроме того, на финальных стадиях очистки может применяться высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). В дополнение к ссылкам, указанным в данном описании, множество способов очистки хорошо известны специалистам в данной области, включая, например, изложенные в работах Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; and Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Когда экспрессируемые полипептиды по изобретению получают в вирусах, вирусы обычно извлекают из культуральной среды, в которой росли инфицированные (трансфицированные) клетки. Обычно, неочищенную среду осветляют перед проведением концентрирования вирусов гриппа. Стандартные способы включают ультрафильтрацию, адсорбцию на сульфате бария и элюирование, а также центрифугирование. Например, неочищенную среду от инфицированной культуры сначала могут осветлить центрифугированием, например, при 1000-2000×g в течение времени, достаточного для удаления клеточного детрита и других крупных механических включений, например, от 10 до 30 мин. В некоторых случаях, супернатант с осветленной средой после этого центрифугируют для осаждения вирусов гриппа, например, при 15000×g, в течение примерно 3-5 ч. После ресуспендирования осадка вирусов в соответствующем буферном растворе, таком как STE (0,01М трис-HCl; 0,15М NaCl; 0,0001М ЭДТА) или забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) при pH 7,4, вирус концентрируют путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (60%-12%) или тартрата калия (50%-10%). Пригодны как непрерывный, так и ступенчатый градиенты, например, градиент сахарозы от 12% до 60% в виде четырех ступеней по 12%. Градиент центрифугируют со скоростью и в течение времени, достаточных для того, чтобы вирусы сконцентрировались в видимую полосу для извлечения. Альтернативно и в случае большинства крупномасштабных коммерческих применений, вирус отделяют от градиента плотности с применением зонального центрифужного ротора, функционирующего в непрерывном режиме. Дополнительные сведения, достаточные для специалиста в области приготовления вирусов гриппа из тканевых культур представлены, например, в Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, и патенте США № 5 690 937. При необходимости извлеченные вирусы можно хранить при -80°C в присутствии буфера, содержащего сахарозу, фосфат и глутамат, (SPG) в качестве стабилизатора.

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ

Экспрессированные полипептиды по изобретению могут содержать одну или несколько модифицированных аминокислот. Присутствие модифицированных аминокислот может быть полезным, например, для (а) увеличения периода полувыведения полипептида из сыворотки, (б) снижения/повышения антигенности полипептида, (в) повышения стабильности полипептида при хранении и т.д. Аминокислоту(ы) модифицируют, например, ко-трансляционно или посттрансляционно во время выработки рекомбинантного продукта (например, N-гликозилирование мотивов N-X-S/T во время экспрессии в клетках млекопитающих) или модифицируют синтетическими способами (например, посредством пегилирования).

Неограничивающие примеры модифицированных аминокислот включают гликозилированную аминокислоту, сульфатированную аминокислоту, пренилированную (например, фарнезилированную, геранил-геранилированную) аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, ацилированную аминокислоту, пегилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту, карбоксилированную аминокислоту, фосфорилированную аминокислоту и т.п., а также аминокислоты, модифицированные конъюгацией, например, с липидными остатками или другими агентами органического происхождения. В литературе встречается множество ссылок, дающих достаточную информацию для специалиста в области модификации аминокислот. Примеры протоколов можно найти в Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJ.

ХИМЕРНЫЕ БЕЛКИ

Настоящее изобретение также направлено на создание химерных белков, включающих слияние последовательностей по изобретению (например, кодирующих полипептиды HA и/или NA) или их фрагментов, например, с иммуноглобулинами (или их частями), последовательностями, кодирующими, например, GFP (зеленый флуоресцентный белок) или другие схожие маркеры, и т.д. Нуклеотидные последовательности, кодирующие такие химерные белки, являются еще одной особенностью изобретения. Химерные белки по изобретению в некоторых случаях применяют, например, для схожих прикладных задач (включая, например, терапевтическое, профилактическое, диагностическое, экспериментальное и т.д. применения, как описано в данном описании), что и не химерные белки по изобретению. В дополнение к слиянию с последовательностями иммуноглобулинов и последовательностями маркеров, белки по изобретению также могут быть в некоторых случаях слиты, например, с последовательностями, которые делают возможным сортинг химерных белков и/или нацеливание химерных белков на специфичные типы клеток, области и т.д.

АНТИТЕЛА

Полипептиды по изобретению могут применяться для получения антител, специфичных к полипептидам, указанным в данном описании, и/или полипептидам, кодируемым полинуклеотидами по изобретению, например, указанными в данном описании, и их консервативными вариантами. Антитела, специфичные к указанным выше полипептидам полезны, например, для диагностических и терапевтических целей, например, связанных с активностью, распределением и экспрессией представляющих интерес полипептидов. Например, такие антитела могут в некоторых случаях быть использованы для определения других вирусов в пределах того же штамма(ов), что и последовательности HA/NA, указанные в данном описании.

Антитела, специфичные к полипептидам по изобретению могут быть получены способами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие антитела могут включать в качестве неограничивающих примеров поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные, одноцепочечные, Fab фрагменты и фрагменты, полученные с применением экспрессионной библиотеки Fab.

Полипептидам не требуется иметь биологическую активность для получения антител (например, не требуются полноразмерные функционально активные гемагглютинин или нейраминидаза). Однако полипептид или олигопептид должен быть иммуногенным. Пептиды, используемые для индукции специфичных антител, обычно имеют аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере примерно 4 аминокислоты, и часто по меньшей мере 5 или 10 аминокислот. Короткие отрезки полипептида могут быть слиты с другим белком, таким как гемоцианин фиссуреллы, и антителом, выработанным против химерной молекулы.

Специалистам в данной области известны многочисленные способы получения поликлональных и моноклональных антител, которые могут быть адаптированы для получения антител, специфичных к полипептидам по изобретению и/или кодируемых полинуклеотидными последовательностями по изобретению и т.д. См., например, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, и приведенные здесь ссылки; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; and Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Другие пригодные способы получения антител включают отбор библиотек рекомбинантных антител в фагах или схожих векторах. См. Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; и Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Специфичные моноклональные и поликлональные антитела и антисыворотка обычно связываются с K_D, равной, например, по меньшей мере примерно 0,1 мкМ, по меньшей мере примерно 0,01 мкМ или предпочтительнее по меньшей мере примерно 0,001 мкМ или с лучшим значением.

Для некоторых терапевтических прикладных задач желательно применение гуманизированных антител. Подробное описание способов приготовления химерных (гуманизированных) антител можно найти в патенте США 5482856. Дополнительную подробную информацию о гуманизации и других способах получения и конструирования антител можно найти в Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, 2^nd Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), и Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul). Дополнительную подробную информацию о специфичных способах можно найти, например, у Ostberg et al. (1983), в Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, патент США 4634664, и Engelman et al, патент США 4634666.

ВАРИАНТЫ НУКЛЕОТИДНЫХ И ПОЛИПЕПТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Как описано в данном описании, настоящее изобретение направлено на создание полинуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей полипептидов, например, последовательностей гемагглютинина и нейраминидазы и, например, композиций и способов, включающих указанные последовательности. Примеры указанных последовательностей раскрыты в данном описании. Однако специалисту в данной области будет понятно, что изобретение необязательно ограничено теми последовательностями, которые раскрыты в данном описании, и что настоящее изобретение также направлено на создание многих родственных и неродственных последовательностей с функциями, описанными в данном описании, например, кодирующих молекулу HA и/или NA.

Специалисту также будет понятно, что многие варианты описанных последовательностей включены в настоящее изобретение. Например, консервативные вариации раскрытых последовательностей, которые дают функционально идентичные последовательности, также включены в настоящее изобретение. Предполагается, что варианты полинуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот, где варианты гибридизуются по меньшей мере с одной описанной последовательностью, включены в настоящее изобретение. Уникальные подпоследовательности последовательностей, описанных в данном описании, что определяется, например, стандартными способами сравнения последовательностей, также включены в настоящее изобретение.

МОЛЧАЩИЕ ВАРИАЦИИ

Вследствие вырожденности генетического кода необязательно получают любую из множества последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды и/или вирусы по изобретению, некоторые из которых имеют более низкие уровни идентичности последовательности относительно последовательностей нуклеиновых кислот и полипептидов HA и NA, описанных в данном описании. Далее приведена таблица конкретных кодонов, точно определяющая генетический код, которую можно найти во многих биологических и биохимических публикациях.

Таблица 1 Таблица кодонов
Аминокислоты	Кодон
Аланин	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Цистеин	Cys	C	UGC	UGU
Аспарагиновая кислота	Asp	D	GAC	GAU
Глутаминовая кислота	Glu	E	GAA	GAG
Фенилаланин	Phe	F	UUC	UUU
Глицин	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Гистидин	His	H	CAC	CAU
Изолейцин	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Лизин	Lys	K	AAA	AAG
Лейцин	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Метионин	Met	M	AUG
Аспарагин	Asn	N	AAC	AAU
Пролин	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Глутамин	Gln	Q	CAA	CAG
Аргинин	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Серин	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Треонин	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Валин	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Триптофан	Trp	W	UGG
Тирозин	Tyr	Y	UAC	UAU

Таблица кодонов демонстрирует, что многие аминокислоты кодируются более чем одним кодоном. Например, кодоны AGA, AGG, CGA, CGC, CGG и CGU все кодируют аминокислоту аргинин. Таким образом, в каждом положении в составе нуклеиновых кислот по изобретению, где аргинин определяется конкретным кодоном, этот кодон может быть заменен на любой из соответствующих кодонов, описанных выше, без изменения кодируемого полипептида. Понятно, что U в последовательности РНК соответствует T в последовательности ДНК.

Такие "молчащие вариации" являются одним из видов "вариаций с консервативными модификациями", обсуждаемых ниже. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в составе нуклеиновой кислоты (за исключением ATG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TTG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован с применением стандартных способов таким образом, чтобы кодировался функционально идентичный полипептид. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подразумевается для любой описанной последовательности. Таким образом, изобретение явно направлено на создание каждой и любой возможной вариации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, которая может быть получена с применением молчащих комбинаций на основе возможных вариантов выбора кодонов. Эти комбинации производят в соответствии со стандартным триплетным генетическим кодом (например, как изложено в таблице 1 или стандартно доступно в данной области знаний) применительно к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид гемагглютинина или нейраминидазы по изобретению. Все такие вариации каждой нуклеиновой кислоты, описанной в данном описании, явно представлены и описаны посредством приведения последовательности в сочетании с генетическим кодом. Специалист в данной области способен произвести такие молчащие замены с применением указанных в данном описании способов.

КОНСЕРВАТИВНЫЕ ВАРИАЦИИ

Вследствие вырожденности генетического кода "молчащие замены" (т.е. замены в последовательности нуклеиновой кислоты, которые не приводят к изменению кодируемого полипептида), являются подразумеваемой особенностью каждой последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению, которая кодирует аминокислоту. Аналогичным образом, "консервативные аминокислотные замены", при которых одна или несколько аминокислот в аминокислотной последовательности заменены на другие аминокислоты с очень схожими свойствами, также легко идентифицируются как очень схожие с раскрытыми конструкциями, такими как описано в данном описании. Такие консервативные вариации каждой описанной последовательности являются особенностью настоящего изобретения.

"Консервативная вариация" конкретной последовательности нуклеиновой кислоты относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или, например, в случае, если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к существенно идентичным последовательностям, см. таблицу 2 ниже. Специалисту в данной области будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки, которые изменяют, добавляют или делетируют единичную аминокислоту или небольшой процент аминокислот (обычно менее чем 5%, более конкретно менее чем 4%, 3%, 2% или 1%) в кодируемой последовательности, являются "вариациями с консервативными модификациями", где изменения приводят к делеции аминокислоты, вставке аминокислоты или замене аминокислоты химически схожей аминокислотой. Таким образом, "консервативные вариации" перечисленных последовательностей полипептидов по настоящему изобретению включают замены небольшого процента, обычно менее чем 5%, более типично менее чем 4%, 3%, 2% или 1%, аминокислот последовательности полипептида консервативно выбранной аминокислотой из той же самой группы консервативных замен. Наконец, добавление последовательностей, которое не изменяет кодирующую способность молекулы нуклеиновой кислоты, такое как добавление нефункциональной последовательности, является консервативной вариацией базовой нуклеиновой кислоты.

Таблица 2 Группы консервативных замен
1	Аланин (A)	Серин (S)	Треонин (T)
2	Аспарагиновая кислота (D)	Глутаминовая кислота (E)
3	Аспарагин (N)	Глутамин (Q)
4	Аргинин (R)	Лизин (K)
5	Изолейцин (I)	Лейцин (L)	Метионин (M)	Валин (V)
6	Фенилаланин (F)	Тирозин (Y)	Триптофан (W)

СРАВНЕНИЕ, ИДЕНТИЧНОСТЬ И ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов означают две или несколько последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании с достижением максимального соответствия, согласно оценке с применением одного из алгоритмов сравнения последовательностей, описанных ниже (или других алгоритмов, доступных специалисту в данной области) или согласно визуальной проверке.

Выражение "по существу идентичные" в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов (например, ДНК и/или РНК, кодирующих молекулу HA или NA, или аминокислотных последовательностей молекулы HA или NA) означает две или несколько последовательностей или подпоследовательностей, которые обладают по меньшей мере примерно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или более идентичностью нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании до достижения максимального соответствия, согласно оценке с применением алгоритма сравнения последовательностей или при визуальной проверке. В данном случае, подразумевается, что такие "по существу идентичные" последовательности являются "гомологичными", без ссылки на фактическое происхождение. Предпочтительно, "существенная идентичность" существует на протяжении области аминокислотных последовательностей, которая имеет длину по меньшей мере примерно 200 остатков, более предпочтительно на протяжении области длиной по меньшей мере примерно 250 остатков, и наиболее предпочтительно последовательности являются по существу идентичными на протяжении по меньшей мере примерно 300 остатков, 350 остатков, 400 остатков, 425 остатков, 450 остатков, 475 остатков, 480 остатков, 490 остатков, 495 остатков, 499 остатков, 500 остатков, 502 остатков, 559 остатков, 565 остатков или 566 остатков, или на протяжении полной длины двух сравниваемых последовательностей, если аминокислоты принадлежат гемагглютинину или фрагментам гемагглютинина, или последовательности являются по существу идентичными на протяжении по меньшей мере примерно 350 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 400 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 436 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 450 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 451 аминокислоты; на протяжении по меньшей мере примерно 465 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 466 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 469 аминокислот; на протяжении по меньшей мере примерно 470 аминокислот; или на протяжении по меньшей мере примерно 566 аминокислот, расположенных друг за другом, если аминокислоты принадлежат нейраминидазе или фрагментам нейраминидазы.

При сравнении последовательностей и определении гомологии, обычно одна последовательность выступает в качестве референсной последовательности, с которой сравнивают исследуемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей исследуемую и референсную последовательности вносят в компьютер, задают координаты подпоследовательностей, если это необходимо, и задают параметры программы применения алгоритма сравнения последовательностей. После этого алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательности для исследуемой последовательности(ей) по отношению к референсной последовательности на основании заданных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с применением алгоритма локальной гомологии, предложенного Smith & Waterman, Adv Appl Math 2:482 (1981), алгоритма выравнивания на основании гомологии, предложенного Needleman & Wunsch, J Mol Biol 48:443 (1970), метода поиска сходства, предложенного Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85:2444 (1988), компьютеризированных вариантов алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин, или визуальной оценки (см., в целом, Ausubel et al, ранее).

Одним из примеров алгоритмов, пригодных для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в работе Altschul et al, J Mol Biol 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализа BLAST свободно доступно на сайте Национального центра биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov/). В данном алгоритме сначала определяются пары последовательностей с высокими оценками (HSP) путем нахождения коротких "слов" с длиной W во введенной последовательности, которые либо совпадают, либо соответствуют некоему положительному значению пороговой оценки T при выравнивании со "словом" той же длины в последовательности из базы данных. T называют пороговым значением оценки соседних слов (см. Altschul et al, выше). Эти первоначально полученные совпавшие образцы соседних слов служат в качестве затравок для начала поиска более длинных HSP, которые их содержат. После этого совпавшие образцы слов пытаются продлить в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока суммарная оценка выравнивания может быть повышена. Суммарные оценки вычисляют, применяя для нуклеотидных последовательностей параметры M (оценка вознаграждения для пары совпавших остатков; всегда >0) и N (оценка штрафа для двух не совпавших остатков; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей для вычисления суммарной оценки применяют матрицу замен. Продление совпавших образцов слов в каждом направлении прекращают, когда: суммарная оценка выравнивания снижается на величину X от ее максимального достигнутого значения; суммарная оценка падает до нуля или ниже из-за суммирования значений одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными оценками; или при достижении конца любой последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 11, ожидание (E), равное 10, порог, равный 100, M=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. В случае аминокислотных последовательностей, программа BLASTP использует в качестве значений по умолчанию длину слова (W), равную 3, ожидание (E), равное 10, и матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915).

Помимо вычисления процента идентичности последовательностей алгоритм BLAST также проводит статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc Natl Acad Sci USA 90:5873-5787 (1993)). Одним показателем сходства, предоставляемым алгоритмом BLAST, является вероятность наименьшей суммы (P(N)), которая обеспечивает идентификацию вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями могло бы произойти случайным образом. Например, считается, что нуклеиновая кислота схожа с референсной последовательностью, если вероятность наименьшей суммы при сравнении исследуемой нуклеиновой кислоты с референсной нуклеиновой кислотой составляет менее чем примерно 0,1, более предпочтительно менее чем примерно 0,01, и наиболее предпочтительно менее чем примерно 0,001.

Еще одним примером полезного алгоритма выравнивания последовательностей служит PILEUP. PILEUP проводит множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с применением прогрессивного попарного выравнивания. Он также может представлять в виде древовидного графика кластерные связи, использованные для проведения выравнивания. PILEUP применяет упрощенную версию метода прогрессивного выравнивания, предложенного Feng & Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. Используемый метод схож с методом, описанным Higgins & Sharp (1989) CABIOS5:l5l-l53. Программа способна выровнять, например, до 300 последовательностей с максимальной длиной 5000 букв. Методика множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее схожих последовательностей, в результате чего получается кластер из двух выровненных последовательностей. Потом этот кластер может быть выровнен относительно следующей наиболее родственной последовательности или кластера выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей могут быть выровнены простым расширением попарного выравнивания двух единичных последовательностей. Заключительное выравнивание достигается в результате серии прогрессивных попарных выравниваний. Программу также можно применять для построения дендрограммы или дерева для представления взаимосвязей между кластерами. Для запуска программы указываются специфичные последовательности и их координаты аминокислот или нуклеотидов в областях, предназначенных для сравнения.

Дополнительным примером алгоритма, пригодного для множественного выравнивания нуклеотидных или аминокислотных последовательностей является программа CLUSTALW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW проводит множественное попарное сравнение между группами последовательностей и выстраивает их множественное выравнивание на основании гомологии. Штрафы за внесение пропуска и удлинение пропуска могут составлять, например, 10 и 0,05, соответственно. При выравнивании аминокислотных последовательностей, в качестве матрицы сравнения аминокислотных остатков можно применять алгоритм BLOSUM. См., например, Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.

ЦИФРОВЫЕ СИСТЕМЫ

Настоящее изобретение направлено на создание цифровых систем, например, компьютеров, машиночитаемых носителей и интегрированных систем, содержащих строки символов, соответствующих информации о последовательностях, описанных в данном описании, для нуклеиновых кислот и выделенных или рекомбинантных полипептидов, описанных в данном описании, например, последовательностей указанных в данном описании, и различных их вариаций с молчащими и консервативными заменами. Интегрированные системы могут дополнительно включать, например, оборудование для синтеза генов с целью получения генов, соответствующих строкам символов.

Различные способы, известные специалистам в данной области, могут применяться для определения гомологии или сходства между различными строками символов, или могут применяться для осуществления других необходимых функций, таких как контроль файлов с результатами, обеспечение основы для подготовки представления информации, включая последовательности и т.п. Примеры включают BLAST, который обсуждался выше. Компьютерные системы по изобретению могут содержать такие программы, например, совместно с одним или несколькими файлами данных или базами данных, содержащими такую последовательность как указана в данном описании.

Таким образом, различные типы гомологии и сходства различной степени проявления и длины между различными последовательностями HA или NA или их фрагментами и т.д. могут быть выявлены и распознаны в описанных в данном описании интегрированных системах. Например, многие способы определения гомологии были разработаны для сравнительного анализа последовательностей биополимеров, для проверки орфографии при электронной обработке текста и для поиска и выборки данных из различных баз данных. При понимании принципов попарных комплементарных взаимодействий в двойной спирали между четырьмя основными азотистыми основаниями в природных полинуклеотидах модели, которые симулируют отжиг комплементарно гомологичных полинуклеотидных нитей, также могут применяться в качестве основы для выравнивания последовательностей или других операций, обычно выполняемых на строках символов, соответствующих последовательностям, описанным в данном описании (например, манипуляций электронной обработки текста, создания фигур, содержащих строки символов последовательности или подпоследовательности, таблиц результатов и т.д.).

Таким образом, стандартные приложения для настольной компьютерной системы, такие как программное обеспечение для электронной обработки текста (например, Microsoft Word™ или Corel WordPerfect™) и программное обеспечение для работы с базами данных (например, программное обеспечение для работы с электронными таблицами, такое как Microsoft Excel™, Corel Quattro Pro™, или программы для работы с базами данных, такие как Microsoft Access™, Paradox™, Gene Works™ или MacVector™ или другие похожие программы) могут быть адаптированы для настоящего изобретения путем внесения строк символов, соответствующих одному или нескольким полинуклеотидам и полипептидам по изобретению (либо нуклеиновым кислотам, либо белкам, либо обоим). Например, система по изобретению может содержать вышеупомянутое программное обеспечение, имеющее соответствующую информацию в виде строк символов, например, применяемое совместно с пользовательским интерфейсом (например, графический пользовательский интерфейс стандартной операционной системы, такой как система Windows, Macintosh или LINUX) для манипуляции со строками символов, соответствующими описанным в данном описании последовательностям. Как уже упоминалось, специализированные программы для выравнивания, такие как BLAST, также могут быть интегрированы в системы по изобретению для выравнивания нуклеиновых кислот или белков (или соответствующих строк символов).

Системы по настоящему изобретению обычно включают цифровой компьютер с наборами данных, введенных в систему программного обеспечения и включающих любую из описанных в данном описании последовательностей. Компьютер может быть, например, персональным компьютером (совместимым с микросхемами Intel x86 или Pentium DOS™, OS2™ WINDOWS™ WFNDOWSNT™, WINDOWS95™, WINDOWS2000™, WINDOWS98™, машиной на основе LFNUX, MACINTOSH™, Power PC, или машиной на основе UNIX (например, рабочей станцией SUN™)) или другим коммерчески доступным компьютером, известным специалистам в данной области. Программное обеспечение для выравнивания и иных манипуляций с последовательностями доступно или легко может быть разработано специалистом в данной области с применением стандартного языка программирования, такого как Visualbasic, PERL, Fortran, Basic, Java или им подобного.

Любой контроллер или компьютер может включать монитор, который часто является дисплеем с электронно-лучевой трубкой ("CRT"), индикаторной панелью (например, жидкокристаллическим дисплеем с активной матрицей, жидкокристаллическим дисплеем) или другим типом монитора. Схемы компьютера часто расположены в модуле, который содержит многочисленные кристаллы интегральных схем, таких как микропроцессор, память, схемы сопряжения и др. Модуль также необязательно включает жесткий диск, дисковод для гибких дисков, дисковод для съемных дисков большой емкости, таких как записываемый CD-ROM, и другие стандартные периферийные устройства. Устройства ввода, такие как клавиатура или мышь, необязательно предусмотрены для ввода информации пользователем и для выбора пользователем последовательностей для сравнения или иных манипуляций в соответствующей компьютерной системе.

Компьютер обычно включает соответствующее программное обеспечение для получения инструкций от пользователя, либо в форме ввода данных пользователем в заданные поля для параметров, например, в графическом пользовательском интерфейсе, либо в форме предварительно запрограммированных инструкций, например, предварительно запрограммированных для выполнения множества различных специфичных операций. После этого программное обеспечение конвертирует эти инструкции на соответствующий язык задания для выполнения тех или иных действий, например, соответствующих механизмов или контроллеров передачи данных, для выполнения требуемой операции. Программное обеспечение также может содержать элементы вывода данных для контроля синтеза нуклеиновых кислот (например, на основании последовательности или выравнивания последовательностей, описанных в данном описании), сравнения проб по дифференциальной экспрессии генов или для других операций.

НАБОРЫ И РЕАГЕНТЫ

Настоящее изобретение необязательно предусмотрено для применения в виде набора. Например, набор по изобретению содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, полипептид, антитело или клеточную линию, описанные в данном описании (например, включающие или имеющие в составе молекулу HA и/или NA по изобретению). Набор может содержать диагностическую нуклеиновую кислоту или полипептид, например, антитело, набор зондов, например, в виде кДНК микрочипа, упакованного в пригодный контейнер, или другую нуклеиновую кислоту, такую как один или несколько экспрессионных векторов. Набор обычно дополнительно содержит один или несколько дополнительных реагентов, например, субстраты, метки, праймеры для мечения продуктов экспрессии, пробирки и/или другие расходные материалы, реагенты для сбора проб, буферные растворы, камеры для гибридизации, покровные стекла и т.д. Набор в некоторых случаях дополнительно содержит набор инструкций или руководство пользователя с подробным описанием предпочтительных способов применения компонентов набора для исследований или применения диагностических комплектов и т.д.

При условии следования инструкциям набор может применяться, например, для оценки степени тяжести заболевания или состояния, для оценки эффектов фармацевтического агента или другого терапевтического вмешательства в прогрессирование степени тяжести заболевания или состояния на уровне клетки или организма, или для применения в качестве вакцины и т.д.

Дополнительной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание системных наборов, включающих способы, композицию, системы и приборы, описанные в данном описании. Системный набор по изобретению в некоторых случаях содержит один или несколько из следующих компонентов: (1) прибор, систему, системный компонент или компонент прибора; (2) инструкции для практического осуществления способов, описанных в данном описании, и/или для управления прибором или его компонентами, описанными в данном описании, и/или для применения композиций, описанных в данном описании. Дополнительной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на применение любого прибора, компонента прибора, композиции или набора, описанных в данном описании, для практического осуществления любого способа или анализа, описанного в данном описании, и/или на применение любого прибора или набора для практического осуществления любого анализа или способа, описанного в данном описании.

Дополнительно, наборы могут включать одну или несколько систем трансляции, как указано выше (например, клетку), с соответствующим упаковочным материалом, контейнеры для сохранения компонентов набора, учебные материалы для практического выполнения способов, описанных в данном описании, и/или т.п. Аналогичным образом, продукты систем трансляции (например, белки, такие как молекулы HA и/или NA) могут поставляться в форме набора, например, с контейнерами для сохранения компонентов набора, учебными материалами для практического выполнения способов, описанных в данном описании, и/или т.п. Дополнительно, наборы могут содержать различные вакцины (например, полученные с применением протокола плазмидной "помощи"), такие как живая ослабленная вакцина (например, ФлуМист), содержащая последовательности HA и/или NA, описанные в данном описании.

Для облегчения применения способов и композиций по изобретению любой из компонентов и/или композиций вакцины, например, реассортантный вирус в аллантоисной жидкости и т.д., и дополнительные компоненты, такие как буферные растворы, клетки, культуральная среда, полезные для упаковки и инфекции вирусами гриппа для экспериментальных целей и целей терапевтической вакцинации, могут быть упакованы в форме набора. Обычно, набор содержит, в дополнение к названным выше компонентам, дополнительные материалы, которые могут включать, например, инструкции для осуществления способов по изобретению, упаковочный материал и контейнер.

ПРИМЕРЫ

Изобретение описано со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом, и должны трактоваться как включающие любой и все варианты, которые очевидны в результате применения приведенных в данном описании способов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Создание рекомбинантных вирусов: Вирусы гриппа A H1N1 дикого типа (wt), A/CA/4/09, выделенные из клеток MDCK, и A/CA/7/09, выделенные из яиц, были получены из Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC). Вирусная РНК A/CA/4/09, адаптированного к росту в яйцах, была получена д-ром Ziping Ye из Администрации по пищевым и лекарственным продуктам США (FDA). Генные сегменты HA и NA вирусов A/CA/4/09 и A/CA/7/09 амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР с применением праймеров, универсальных для концевых последовательностей генов HA и NA, и клонировали в плазмидный вектор pAD3000 (Hoffman (2000) PNAS 97:6108-6113). Сайт-направленный мутагенез проводили для внесения специфичных изменений в гены HA с использованием набора QuikChange® Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), и подтверждали последовательности HA с помощью анализа секвенированием. Вакцинные штаммы реассортантного вируса с формулой генома 6:2 получали котрансфекцией 8 плазмид с кДНК, кодирующих HA и NA вируса H1N1 и 6 внутренних генных сегментов адаптированного к холоду (ca) A/Ann Arbor/6/60 (MDV-A, исходного донорного вируса гриппа типа A), в совместно культивируемые клетки 293T и MDCK. Вакцинные штаммы, используемые для производства, получают в бессывороточной культуре клеток Vero/CEK с применением электропорации. Размножение вирусов проводили в аллантоисных полостях яиц с 10-11-дневным развивающимся эмбрионом. Последовательности HA и NA извлеченных вирусов подтверждали секвенированием амплифицированной с помощью ОТ-ПЦР кДНК, полученной на матрице вирусной РНК.

Титрование вирусов: Титр вирусов определяли флуоресцентным анализом бляшек и выражали как lgБОЕ (флуоресцентные бляшкообразующие единицы)/мл (Forrest et al. (2008) Clin Vaccine Immunol 15:1042-1053). Морфологию вирусных бляшек проводили с применением анализа бляшек, описанного ранее (Jin et al, (2003) Virology 306, 18-24).

Количественное определение связывания с рецептором: Красные кровяные тельца цыплят (cRBC) (HEMA Resource and Supply, Inc.) десиалилировали и повторно сиалилировали, как описано ранее (). 100 мкл 10% cRBC инкубировали с 50 мЕ нейраминидазы холерного вибриона (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) при 37°C в течение 1 ч для удаления сиаловой кислоты. После трехкратного промывания 1 мл PBS клетки ресуспендировали в 1 мл PBS, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), инкубировали с 2,5 мЕ α2,3(N)-сиалилтрансферазы (Calbiochem, Ла-Хойя, Калифорния, США) или 2 мЕ α2,6(N)-сиалилтрансферазы (Calbiochem, Ла-Хойя, Калифорния, США) в течение 1,5 ч при 37°C, с добавлением 1,5 мМ CMP-сиаловой кислоты (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Повторно сиалилированные cRBC ресуспендировали до содержания 0,5% об. в PBS после трех промывок с использованием PBS. Количественный анализ гемагглютинации (HA) проводили в 96-луночных планшетах для микротитрования с V-образным дном, исследуя активность связывания. 50 мкл последовательных двукратных разведений проб вирусов инкубировали с 50 мкл 0,5% cRBC, повторно сиалилированных по α2,3 или α2,6 cRBC, при комнатной температуре в течение 60 мин. Титр HA определяли как наибольшее разведение, при котором сохраняется способность вызывать гемагглютинацию RBC.

Исследования на хорьках: Самцов и самок хорьков в возрасте 8-10 недель, полученных из компании Simonson (Гилрой, Калифорния, США), разделенных на группы по 3 особи, использовали для оценки репликации вирусов в дыхательных путях и для исследования иммуногенности вакцин. Каждого хорька содержали в отдельной клетке и проводили интраназальную инокуляцию дозой 7,0 lgБОЕ вируса на 0,2 мл. Через три дня после инфекции хорькам проводили эвтаназию и собирали легкие и носовые раковины (NT). Титр вирусов в легких и NT определяли с помощью анализа EID₅₀ и выражали как 50% инфекционную дозу для куриных эмбрионов на грамм ткани (lgEID₅₀/г). У хорьков, предназначенных для исследования иммуногенности, брали пробы крови на 14, 21 и 28 день после инфекции и анализировали сыворотку на титр антител с применением HAI анализа.

Определение содержания антител в сыворотке с помощью HAI анализа: Уровень специфичных к H1N1 антител в постинфекционной сыворотке хорьков против гомологичных и гетерологичных вирусов определяли с применением HAI анализа. Перед проведением серологического анализа сыворотку хорьков обрабатывали разрушающим рецепторы ферментом (RDE) (Denka Seiken, Токио, Япония), разведенным в 10 мл 0,9% NaCl на флакон. 0,1 мл сыворотки смешивали с 0,15 мл RDE и инкубировали при 37°C в течение 18 ч и доводили до конечного разведения 1:4 добавлением 0,15 мл 0,9% цитрата натрия с последующей инкубацией при 56°C в течение 45 мин. Штамм-специфичные HAI титры сыворотки определяли с применением 0,5% tRBC, и представляли HAI титры как обратное значение наибольшего разведения сыворотки, при котором происходило ингибирование гемагглютинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

СОЗДАНИЕ КАНДИДАТНЫХ РЕАССОРТАНТНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ

Генные сегменты HA и NA из A/CA/4/09 дикого типа клонировали из РНК инфицированных клеток MDCK после амплификации с помощью ОТ-ПЦР. Было обнаружено, что в сумме 12 кДНК-клонов для каждого из HA или NA были идентичны согласно анализу нуклеотидных последовательностей. Плазмиды, представляющие эту последовательность HA и последовательность NA из A/CA/4/09 дикого типа трансфицировали в клетки 293/MDCK совместно с плазмидами, представляющими шесть сегментов генов внутренних белков из MDV-A, однако жизнеспособных реассортантных потомков не удалось получить ни в клетках MDCK, ни в яйцах. кДНК HA, клонированные из изолята A/CA/4/09 дикого типа из яйца, были гетерогенными по двум положениям аминокислот (таблица 3). У 12 проанализированных клонов были обнаружены следующие изменения: 42% L191I, 50% Q223R, один (8%) содержал как L191I, так и Q223R. Плазмиды, представляющие эти различающиеся последовательности HA, объединяли и трансфицировали в клетки 293/MDCK совместно с генами внутренних белков MDV-A и легко получили реассортантные вирусы.

Плазмиду с HA, клонированную из A/CA/7/09, которая не несла аминокислотных замен по остаткам 222 или 223, можно было применять с получением вирусного потомства. Это указывает на то, что замена T197A в CA/7/09 была ответственна за эффективное спасение A/CA/7/09. Другие клоны A/CA/7/09 несли замену либо D222G, либо Q223R, вирусы, содержавшие D222G или Q223R в HA, также были способны к спасению. Благодаря высокой степени сходства между HA штаммов A/CA/4/09 и A/CA/7/09 и последовательности NA у этих двух штаммов были идентичными, варианты, полученные от A/CA/7/09 также были разработаны дополнительно.

Таблица 3 Последовательности HA и титры вирусов для новых вариантов H1N1
Вирус	История пассажей вируса wt	Аминокислота в положении	Титр вируса в яйцах* (lgБОЕ/мл±ст.ошиб.)
		H1#	191	197	222	223	% клонов
		H3#	194	200	225	226
A/CA/04/09	MDCK2x	swt	L	T	D	Q	NA	NA
		вариант 1	L	T	D	Q	100	Спасение не происходило
	Яйцо 2x	вариант 2	I	T	D	Q	42	7,4±0,09
		вариант 3	L	T	D	R	50	7,8±0,15
		вариант 7	I	T	D	R	8	7,8±0,40
A/CA/07/09	Яйцо 2x	swt	L	A	D/G	Q/R	NA	NA
		вариант 4	L	A	D	Q	45	7,8±0,27
		вариант 5	L	A	G	Q	34	7,4±0,14
		вариант 6	L	A	D	R	21	7,7±0,14
* Титры вирусов приведены как среднее значение титров не менее чем для трех исходных препаратов вирусов; NA - неприменимо.

Отбор вакцинных штаммов с наилучшим ростом в яйцах кур с развивающимся эмбрионом.

Как показано в таблице 3, спасенные реассортантные вакцинные штаммы A/CA/4/09 и A/CA/7/09 реплицировались в яйцах кур с развивающимся эмбрионом с титром от 7,4 до 7,8 lgБОЕ/мл, который был ниже, чем у вакцинных штаммов сезонного H1N1, по меньшей мере в 10 раз. Дополнительно, спасенные реассортантные A/CA/7/09 кандидаты в вакцинные штаммы формировали очень мелкие бляшки на слое клеток MDCK. Для улучшения роста вакцинных штаммов вируса в клетках MDCK и яйцах проводили два пассажа кандидатов A/CA/7/09 (V5 и V6) в клетках MDCK при множественности заражения 4,0, 0,4 и 0,04, после этого вирусы, присутствовавшие в супернатантах, исследовали с помощью анализа бляшек. Все вирусы, прошедшие пассажи в клетках MDCK, формировали бляшки размером намного больше (2-4 мм), чем исходные вирусы (фиг.1). Генный сегмент HA из двенадцати бляшек из пассажей в клетках MDCK кандидатов в вакцинные штаммы V5 и V6 секвенировали. HA каждого изолята, формировавшего крупные бляшки, нес единичную аминокислотную замену в одном из следующих положений: K119N или K1119E, K153E, K154E у происходящих от V5 и A186D у происходящих от V6.

Последовательность HA из A/CA/7/09 также сравнили с двумя более ранними вирусами H1N1, происходящими от вирусов свиньи, A/swine/Iowa/1/1976 и A/swine/1931, и недавним вирусом человека H1N1, A/South Dakota/6/07 (A/SD/07). Как показано на фиг.2, K119, K153 и K154 являются высоко консервативными среди вирусов H1N1 свиньи. A/SD/6/07 также содержал остатки K119 и K154. Аминокислоты в положении 186 являются более разнообразными при сравнении четырех вирусов, представленных на фиг.2. В проведенном ранее исследовании (Both et al. (1983) Proc Natl Acad Sci U SA 80:6996-7000) было показано, что замена G155E отвечает за высокую скорость роста вирусов в яйцах. Эти данные демонстрируют, что отрицательно заряженный остаток E в области 153-155 является предпочтительным для репликации вируса в клетках MDCK и яйцах. Для проверки того, может ли замена G155E, о которой ранее сообщали в связи с вирусом A/NJ/76, также улучшить показатели репликации вируса A/CA/7/09 в яйцах, была проведена замена G155E в V5 и V6. Кроме того, для подтверждения факта, что аминокислоты, идентифицированные в вирусах, образующих крупные бляшки, способствуют росту вирусов в яйцах, каждую из обнаруженных мутаций ввели в HA, и были спасены реассортантные кандидаты в вакцинные штаммы. Более того, замена A186D, обнаруженная у V6, также была внесена в V5 и V5-119E. Аналогичным образом, мутация 119N, обнаруженная у V5, была также внесена в V6 и V6-186D для оценки влияния одиночной и двойной аминокислотной замены на репликацию вируса в яйцах. Аналогичным образом, мутация 119N, обнаруженная у V5, была также внесена в V6 и V6-186D для оценки влияния одиночных и двойных аминокислотных замен на репликацию вируса в яйцах. Анализ последовательности HA также показал, что штаммы A/CA/09 содержали уникальный сайт гликозилирования по остатку 278 (фиг.2). Для оценки того, влияет ли дополнительный сайт гликозилирования на рост вируса, замена T278K была внесена в V5 и V6, соответственно.

Спасенные вирусы исследовали на способность роста в яйцах. Как показано в таблице 4, большинство вариантов, содержащих внесенные в HA мутации, росли существенно лучше, чем V5 и V6. V5-278K и V6-278K имели титры 7,6 и 7,7 lgБОЕ/мл, которые были схожи с титрами у V5 и V6. Таким образом, удаление сайта гликозилирования в положении 278 имело минимальное влияние на титр вирусов в яйцах. Изменения в положениях 119, 186, 153, 154, 155 и 186 повышали титр вирусов на величину от 0,2 до 1,2 lgБОЕ/мл. Комбинированные замены 119E и 186D в V5 привели к немного более высокому титру, чем 119E или 186D по отдельности.

Таблица 4 Варианты HA из A/CA/07/09, идентифицированные из клеток MDCK и внесенные методами обратной генетики. Номера аминокислотных остатков для H1 HA показаны во 2 ряду; номера соответствующих аминокислотных остатков для H3 HA показаны в 3 ряду
Вирус	Аминокислота в положении (H1# и H3#)	Титр вируса в яйцах (lgБОЕ/мл± ст.ошиб.)
					18			27
	119	153	154	155	6	222	223	8
					18			28
	122	156	157	158	9	225	226	0
V5	K	K	K	G	A	G	Q	T	7,4±0,14
V6							R		7,7±0,14
V5-119N	N					G			8,3±0,06
V5-119E	E					G			8,3±0,07
V5-153E		E				G			8,3±0,05
V5-154E			E			G			8,6±0,05
V6-186D					D		R		8,4±0,06
V5-186D					D	G			8,3±0,15

V5-119E/186D	E		D	G			8,5±0,06
V6-119N	N				R		7,9±0,20
V6-119N/186D	N		D		R		8,1±0,09
V5-155E		E		G			8,4±0,11
V5-278K				G		K	7,6±0,19
V6-155E		E			R		8,4±0,19
V6-278K					R	K	7,7±0,27
* Титры вирусов приведены как среднее значение титров не менее чем для трех исходных препаратов вирусов.

ОЦЕНКА ВАРИАНТОВ ВАКЦИНЫ ПО ИХ АНТИГЕННОСТИ

Для определения того, влияют ли какие-либо аминокислотные замены, внесенные в H1 HA, на антигенность вируса, варианты A/CA/7/09 оценивали по их способности реагировать с различными постинфекционными пробами сыворотки хорьков с применением HAI анализа (таблица 5). Адаптированные к холоду (ca) вирусы, A/CA/4/07 с остатком 223R (V3), A/CA/7/09 с остатком 222G (V5) и A/CA/7/09 с остатком 223R (V6), реагировали аналогичным образом с 4 референсными пробами сыворотки, полученными от хорьков, иммунизированных вирусами A/CA/4/09 дикого типа, ca A/CA/4/09 (V3), ca A/CA/7/09 (V5) и ca A/CA/07/09 (V6). Варианты с аминокислотными заменами, внесенными в V5 в положениях 119 и 186, имели антигенность, схожую с таковой V5. Однако вирусы с заменами в положениях 153, 154 и 155 имели намного более низкий уровень реактивности по отношению к этим пробам сыворотки, было обнаружено снижение титра более чем в 4 раза. Таким образом, эти данные демонстрируют, что мутации по остаткам 153-154 не должны присутствовать в вакцинном штамме. Замены в положениях 119 и 186 могут быть внесены в вакцинный штамм без изменения антигенности вируса.

Таблица 5 Антигенность вариантов HA из A/CA/7/09. HAI анализ проводили с применением красных кровяных клеток индейки
Вирус	Постинфекционная сыворотка хорьков
	A/CA/4/09 Дикий тип	A/CA/4/09 ca 223R (V3)	ACA/7/09 222G (V5)	A/CA/7/09 223R (V6)
CA04 V3	8192	1024	2048	1024
CA07 V5	8192	1024	1024	1024
CA07 V6	4096	1024	1024	512
V5-119N	8192	512	2048	1024
V5-119E	4096	512	1024	512
V5-153E	256	<32	128	64
V5-154E	512	<32	128	128
V5-155E	256	<32	128	128
V5-186D	8192	1024	2048	1024
V5-278K	4096	512	1024	512
V5-119E/186D	8192	1024	2048	1024

Кандидатные штаммы A/CA/7/09 для вакцины являются ослабленными, но проявляют иммуногенные свойства в организме хорьков

Для оценки вариантов вакцинных штаммов A/CA/7/09 по их ослабленному фенотипу и способности вызывать гуморальные иммунные ответы хорькам инокулировали 7,0 lgБОЕ вируса интраназально в объеме дозы 0,2 мл и определяли репликацию вируса в верхних и нижних дыхательных путях хорьков с применением анализа EID₅₀. Как показано в таблице 6, все варианты A/CA/7/09 эффективно реплицировались в тканях NT, но вирусы не выявлялись в легких. Эти данные подтверждают, что эти вирусы были ослабленными в организме хорьков, что является характерным фенотипом, придаваемым шестью генными сегментами внутренних белков из MDV-A.

Постинфекционные пробы сыворотки хорьков собирали на 14 день после интраназальной инокуляции и оценивали титры антител с применением HAI анализа (таблица 6). Все варианты V5 были высоко иммуногенными и вызывали образование антител, специфичных к H1N1, с титром согласно HAI в диапазоне от 256 до 1024. Несколько вариантов V6 также были оценены по их иммуногенности, и было обнаружено, что они менее иммуногенны, чем V5 (данные не приведены). Варианты с мутациями по остаткам 119 и 186 сохраняли антигенность, схожую с таковой вируса дикого типа и не показывали достаточную реакцию с вариантами 154E и 155E. Сыворотка, полученная от хорьков, инфицированных вариантами 154E и 155E, также не показывала достаточную реакцию с вирусом дикого типа, V5 и вариантами V5 с заменами 119E и 186D; различия их титров были в пределах 2-кратных. Пробы сыворотки хорьков после инфекции V5-154E и 155E имели гомологичные титры согласно HAI, которые более чем в 4 раза превышали титры других вариантов. Интересно, что мутация в положении 186D приводила к большему снижению реактивности с вариантами 154E и 155E. Эти данные демонстрируют, что варианты HA с заменами по 119 и 186 положению из вируса A/CA/07/09 (H1N1) придают свойство усиленного роста в яйцах, не изменяя антигенность или иммуногенность вируса, что делает их потенциальными кандидатами на роль вакцины против вируса H1N1, ведущего происхождение от вируса свиней.

Таблица 6 Репликация вариантов HA из A/CA/7/09 в дыхательных путях хорьков и их иммуногенность. Пробы сыворотки хорьков собирали на 14 день после инфекции и проводили HAI анализ с применением красных кровяных клеток индейки
Вирус	Титр вируса (lgEID₅₀/г± ст.ошиб.)	Геометрическое среднее значение титра ингибирующих HA антител к указанному антигену
Носовые раковины	Легкие	V5	119E	119N	186D	119E 186D	154E	155E
V5	4,0±0,23	<1,5	512	406	406	323	323	64	256
V5-119E	4,2±0,33	<1,5	813	645	645	323	406	64	256
V5-119N	4,5±0,33	<1,5	256	203	256	256	323	64	161
V5-186D	4,9±0,20	<1,5	813	645	645	645	645	128	256
V5-119E/186D	4,7±0,29	<1,5	512	406	512	512	645	64	256
V5-154E	5,7±0,29	<1,5	161	323	323	64	81	512	1024
V5-155E	5,0±0,20	<1,5	128	203	161	51	64	203	1024
A/CA/7/09 wt	NA	NA	512	512	645	645	406	102	323

Специфичность связывания с рецепторами для вариантов A/CA/7/09

Рост вирусов дикого типа A/CA/4/09 и A/CA/7/09 в яйцах привел к аминокислотной замене в составе HA в сайте связывания с рецептором, D222G и Q223R. Эти положения были ранее идентифицированы в других штаммах H1N1 после пассажей в яйцах, и они отвечают за специфичность связывания HA с рецепторами. Для проверки того, обладают ли варианты вирусов вакцинных штаммов различной специфичностью связывания с рецепторами, проводили оценку вариантов V5, V6 и V5-119 и V5-186 по их специфичности связывания с рецепторами с применением анализа связывания красных кровяных клеток (таблица 7). V4 (без замен по положениям 222 и 223) имеет большее предпочтение к связыванию с α2-6 сиаловой кислотой, чем с α2-3 сиаловой кислотой. V5 (D222G) одинаково хорошо связывается с α2-3 и α2-6 сиаловой кислотой на повторно сиалилированных красных кровяных клетках. Однако V6 (Q223R) способен связываться только с α2-3 сиаловой кислотой на повторно сиалилированных красных кровяных клетках, и это подтверждает, что данные два остатка влияют на специфичность связывания вируса с рецепторами. Вирусы V5-119E/N и V5-186D обладают специфичностью связывания, схожей со специфичностью связывания у V5. Двойной мутант HA V5-119E/186D имеет большее предпочтение к связыванию с α2-6 сиаловой кислотой, чем с α2-3 сиаловой кислотой. Остатки 119E и 186D, внедренные в V6, не были способны восстановить связывание с α2-6 сиаловой кислотой (данные не приведены). Таким образом, замена по остаткам 119 и 186 не оказывает существенного влияния на специфичность связывания вирусов с рецепторами.

Таблица 7 Специфичность связывания с рецепторами для вариантов вакцинных штаммов A/CA/07/09
Вирус	Без обработки	α2,3-сиаловая кислота	α2,6-сиаловая кислота	Десиалилированные
V4	128	16	128	<2
V5	512	64	64	<2
V6	512	512	<2	<2
V5-119N	512	64	64	<2
V5-119E	512	128	128	<2
V5-186D	512	32	64	<2
V5-119E/186D	512	16	64	<2

Белковый состав реассортантных вирусов A/CA/7/09

Проводили осаждение из 13 мл аллантоисной жидкости, собранной из инфицированных яиц, через 2 мл подушки из 30% сахарозы при 25000 об./мин в течение 1 ч. Осадок вирусов ресуспендировали в 0,2 мл PBS. 5 мкл суспензии вирусов наносили на 4-20% полиакриламидный гель и окрашивали кумасси голубым. Порядок проб был следующим:

Фиг.3A

Дорожка 1. Рекомбинантный HA A/NC/20/99 0,5 мкг

Дорожка 2. Рекомбинантный HA A/NC/20/99 2 мкг

Дорожка 3. MDVA-V5-119E/186D (FFA 8,6)

Дорожка 4. MDVA-V6 (FFA 7,9)

Дорожка 5. MDVA-V6-186D (FFA 8,1)

Дорожка 6. PR8-V5-119E/186D (FFA 8,2)

Дорожка 7. PR8-V6 (FFA 7,8)

Дорожка 8. PR8-V6-186D (FFA 8,5)

Дорожка 9. NYMC X-179A (FFA 8,5)

Дорожка 10. PR8 South Dakota (FFA 8,7)

Фиг.3B

Дорожка 1. NYMC X-179A (FFA 8,5)

Дорожка 2. MDVA-V5-119E/186D (FFA 8,6)

Дорожка 3. MDVA-V5-119E/186D/PA-S395N (FFA 8,9)

Дорожка 4. South Dakota (FFA 8,7)

Показатели флуоресцентного анализа бляшкообразования (FFA) и максимальные значения титров определяли с применением стандартных способов. Реассортантные вирусы, содержащие в названии "MDVA", содержат 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60. Реассортантные вирусы, содержащие в названии "PR8", включают 6 внутренних сегментов генома из PR8.

Сравнение выхода белка HA при получении из вариантов A/California/7/09

Были созданы реассортантные вирусы гриппа с формулой генома 6:2, содержащие 6 внутренних сегментов генома из PR8 и сегменты генома HA и NA из A/CA/7/09. Были созданы дополнительно реассортантные вирусы с формулой генома 6:2, содержащие 6 внутренних сегментов генома из PR8, сегмент генома NA из A/CA/7/09 и сегмент генома HA, кодирующий вариант полипептида H1 HA, описанных в данном описании. Реассортантные вирусы с формулой генома 6:2, содержащие различные варианты HA из A/CA/7/09, а также A/Texas/5/2009 RG15 (A/TX/7/09 RG15) и A/California/07/09 NYMC X179A, размножали в яйцах кур с развивающимся эмбрионом и определяли их максимальное значение титра с применением флуоресцентного анализа бляшкообразования. Исследованные штаммы вирусов приведены в таблице 8. 6:2 PR8-South Dakota - это реассортантный вирус с формулой генома 6:2, содержащий 6 внутренних сегментов генома из PR8 сегменты генома HA и NA из A/South Dakota/6/07. 6:2AA-V5-119E/186D - это реассортантный вирус с формулой генома 6:2, содержащий 6 внутренних сегментов генома из A/Ann Arbor/6/60, сегмент генома NA из A/CA/7/09 и вариант V5-119E/186D сегмента генома HA. Реассортантные вирусы PR8, содержащие варианты сегментов генома H1 HA, описанные в данном описании, имели значения титров, сопоставимые со значениями для X179A, штамма с наибольшим выходом среди всех доступных для получения трехвалентной инактивированной вакцины (TIV).

Таблица 8 Максимальные значения титра для реассортантных вирусов H1N1 в яйцах с развивающимся эмбрионом
Вирус	Максимальное значение титра (lgБОЕ/мл)
6:2 PR8-V6	8,1
6:2 PR8-V6-186D	8,5
6:2 PR8-V5-119E/186D	8,6
A/CA/7/09 X179A.	8,5
A/TX/7/09 RG15	6,6
6:2AA-V5-119E/186D	8,6
6:2 PR8-South Dakota	9,2

Помимо измерения максимальных значений титров также определяли выход белка HA для некоторых их реассортантных вирусов, перечисленных в таблице 8. Выбранные вирусы амплифицировали, проведя инфекцию 50 яиц, каждого с множественностью заражения, равной 10³ БОЕ/яйцо. Вирусы собирали после инкубации при 33°C в течение 62 ч. После этого равное количество аллантоисной жидкости (250 мл) очищали с использованием градиента сахарозы. Вирусные белки анализировали в ДСН-ПААГ с последующей окраской кумасси голубым.

Результаты для представительной пробы показаны на фиг.4. Как видно на фиг.4A, суммарный выход белка для X179A, 6:2 PR8-V6-186D и 6:2AA-V5-119E/186D составил 460, 300 и 350 мкг, соответственно. У 6:2 AA-V5-119E/186D был наибольший выход белка HA, несмотря на то, что у 6:2 AA-V5-119E/186D был более низкий суммарный выход белка, чем у A/CA/7/09 X179A. Более низкий суммарный выход белка, наблюдаемый для 6:2AA-V5-119E/186D в этом эксперименте, вероятно, объясняется изменчивостью аналитического метода. Как видно на фиг.4B, суммарный выход белка для 6:2 PR8-V5-119E/186D и X179A составил 780 и 720 мкг, соответственно. Выход белка HA для 6:2 PR8-V5-119E/186D также был выше, чем для A/CA/7/09 X179A.

Реассортантные вирусы, содержащие скелет PR8 и вариант полипептида H1 из A/California/7/09

Были созданы дополнительно реассортантные вирусы гриппа с формулой генома 6:2, содержащие 6 внутренних сегментов генома из PR8, вариант сегмента генома H1 HA из A/CA/7/09 и сегмент генома NA из A/CA/7/09. Вариации аминокислотной последовательности H1 HA резюмированы в таблице 9.

Таблица 9 Реассортантные вирусы, содержащие варианты H1 HA из A/CA/7/09 и скелет из PR8
Вирус (HA)	№ остатка H1 HA	Антигенность
	119	186	190	222	223	273
PR8-A (V6-186D)	K	D	R	D	R	H	Без изменений
PR8-B (V5-119E/186D/190R)	E	D	S	G	Q	H	Пониженная
PR8-C (V6-186D/273Y)	K	D	R	D	R	Y	Без изменений
PR8-D (V5-119E/186D)	E	D	R	G	Q	H	Без изменений

Из исследованных вариантов гемагглютининов только замены в V5-119E/186D/190R снижали антигенность (таблица 9). Различные варианты HA из A/CA/7/09 у реассортантных вирусов с формулой генома 6:2 выращивали в яйцах кур с развивающимся эмбрионом для определения выхода белка HA. Вирусы обирали после инкубации при 33°C в течение 48 ч (фиг.5A) или 60 ч (фиг.5B). После этого вирусы очищали осаждением в градиенте сахарозы. Белковый состав очищенных вирусов анализировали в ДСН-ПААГ с последующей окраской кумасси голубым. На отдельные дорожки нанесли пробы, содержавшие либо одинаковое количество очищенных вирусов (фиг.5A), либо вирусы, очищенные из равных объемов собранной аллантоисной жидкости (фиг.5B). Пробы, приготовленные из вирусов AA-V5-ED (содержащих вариант HA из V5-119E/186D и скелет из A/Ann Arbor/6/60) и X179A, были включены в качестве контрольных. Вирус PR8-C продемонстрировал более высокий выход полипептида HA, чем X179A.

Выход HA для PR8-C и AA-V5-ED, относительно выхода HA для X179A, дополнительно измерили с применением ДСН-ПААГ с последующей окраской кумасси голубым. Различные объемы (10, 7,5, 5 и 2,5 мкл) проб PR8-C и AA-V5-ED и 10 мкл пробы X179A проанализировали в ДСН-ПААГ. Относительное количество белка HA1, обнаруженного в каждой пробе, измеряли с применением программного обеспечения для анализа изображений. Результаты измерений показаны на фиг.6. Вирусы AA-V5-ED и PR8-C вырабатывали в 1-1,5 раза больше белка HA, чем X179A.

Хотя вышеизложенное изобретение описано в подробностях с целью сделать его ясным и понятным, специалисту в данной области при прочтении настоящего изобретения будет понятно, что могут быть произведены различные изменения формы и конкретных характеристик, которые не приведут к отходу от объема настоящего изобретения. Например, все способы и приборы, описанные выше, могут применяться в различных комбинациях. Все публикации, патенты, заявки на патенты или другие документы, процитированные в настоящем описании, фактически включены сюда полностью в качестве ссылок, в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент или другой документ индивидуально включены сюда полностью в качестве ссылок. В частности, следующие заявки на патент фактически включены сюда полностью в качестве ссылок: предварительная заявка на патент США №№ 61/220 426, поданная 25 июня 2009 г.; 61/227 986, поданная 23 июля 2009 г. и 61/234 021, поданная 14 августа 2009 г.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jin, Hong

<120> ВАРИАНТЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ ВИРУСА СВИНОГО ГРИППА

<130> FL265PCT/MED0459.PCT

<140> PCT/US2010/039826

<141> 2010-06-24

<150> 61/258,890

<151> 2009-11-06

<150> 61/234,021

<151> 2009-08-14

<150> 61/227,986

<151> 2009-07-23

<150> 61/220,426

<151> 2009-06-25

<160> 9

<170> Патентная Версия 3.5

<210> 1

<211> 549

<212> БЕЛОК

<213> Гемофильная палочка

<400> 1

Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val

1 5 10 15

Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu

20 25 30

Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala

35 40 45

Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val

65 70 75 80

Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu

100 105 110

Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser

115 120 125

Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe

130 135 140

Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys

145 150 155 160

Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu

165 170 175

Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr

180 185 190

Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Lys

195 200 205

Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln Glu

210 215 220

Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile

225 230 235 240

Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala

245 250 255

Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val

260 265 270

His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr

275 280 285

Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro

290 295 300

Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn

305 310 315 320

Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

325 330 335

Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His

340 345 350

His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr

355 360 365

Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu

370 375 380

Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu

385 390 395 400

Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu

405 410 415

Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu

420 425 430

Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys

435 440 445

Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys

450 455 460

Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys

465 470 475 480

Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn

485 490 495

Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln

500 505 510

Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val

515 520 525

Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln

530 535 540

Cys Arg Ile Cys Ile

545

<210> 2

<211> 1777

<212> ДНК

<213> Гемофильная палочка

<400> 2

agcaaaagca ggggaaaaca aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat 60

atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa 120

cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt aacacactct gttaaccttc 180

tagaagacaa gcataacggg aaactatgca aactaagagg ggtagcccca ttgcatttgg 240

gtaaatgtaa cattgctggc tggatcctgg gaaatccaga gtgtgaatca ctctccacag 300

caagctcatg gtcctacatt gtggaaacac ctagttcaga caatggaacg tgttacccag 360

gagatttcat cgattatgag gagctaagag agcaattgag ctcagtgtca tcatttgaaa 420

ggtttgagat attccccaag acaagttcat ggcccaatca tgactcgaac aaaggtgtaa 480

cggcagcatg tcctcatgct ggagcaaaaa gcttctacaa aaatttaata tggctagtta 540

aaaaaggaaa ttcataccca aagctcagca aatcctacat taatgataaa gggaaagaag 600

tcctcgtgct atggggcatt caccatccat ctactagtgc tgaccaacaa agtctctatc 660

agaatgcaga tgcatatgtt tttgtggggt catcaagata cagcaagaag ttcaagccgg 720

aaatagcaat aagacccaaa gtgaggggtc aagaagggag aatgaactat tactggacac 780

tagtagagcc gggagacaaa ataacattcg aagcaactgg aaatctagtg gtaccgagat 840

atgcattcgc aatggaaaga aatgctggat ctggtattat catttcagat acaccagtcc 900

acgattgcaa tacaacttgt caaacaccca agggtgctat aaacaccagc ctcccatttc 960

agaatataca tccgatcaca attggaaaat gtccaaaata tgtaaaaagc acaaaattga 1020

gactggccac aggattgagg aatatcccgt ctattcaatc tagaggccta tttggggcca 1080

ttgccggttt cattgaaggg gggtggacag ggatggtaga tggatggtac ggttatcacc 1140

atcaaaatga gcaggggtca ggatatgcag ccgacctgaa gagcacacag aatgccattg 1200

acgagattac taacaaagta aattctgtta ttgaaaagat gaatacacag ttcacagcag 1260

taggtaaaga gttcaaccac ctggaaaaaa gaatagagaa tttaaataaa aaagttgatg 1320

atggtttcct ggacatttgg acttacaatg ccgaactgtt ggttctattg gaaaatgaaa 1380

gaactttgga ctaccacgat tcaaatgtga agaacttata tgaaaaggta agaagccagc 1440

taaaaaacaa tgccaaggaa attggaaacg gctgctttga attttaccac aaatgcgata 1500

acacgtgcat ggaaagtgtc aaaaatggga cttatgacta cccaaaatac tcagaggaag 1560

caaaattaaa cagagaagaa atagatgggg taaagctgga atcaacaagg atttaccaga 1620

ttttggcgat ctattcaact gtcgccagtt cattggtact ggtagtctcc ctgggggcaa 1680

tcagtttctg gatgtgctct aatgggtctc tacagtgtag aatatgtatt taacattagg 1740

atttcagaag catgagaaaa acacccttgt ttctact 1777

<210> 3

<211> 1777

<212> ДНК

<213> Гемофильная палочка

<400> 3

agcaaaagca ggggaaaaca aaagcaacaa aaatgaaggc aatactagta gttctgctat 60

atacatttgc aaccgcaaat gcagacacat tatgtatagg ttatcatgcg aacaattcaa 120

cagacactgt agacacagta ctagaaaaga atgtaacagt aacacactct gttaaccttc 180

tagaagacaa gcataacggg aaactatgca aactaagagg ggtagcccca ttgcatttgg 240

gtaaatgtaa cattgctggc tggatcctgg gaaatccaga gtgtgaatca ctctccacag 300

caagctcatg gtcctacatt gtggaaacac ctagttcaga caatggaacg tgttacccag 360

gagatttcat cgattatgag gagctaagag agcaattgag ctcagtgtca tcatttgaaa 420

ggtttgagat attccccgag acaagttcat ggcccaatca tgactcgaac aaaggtgtaa 480

cggcagcatg tcctcatgct ggagcaaaaa gcttctacaa aaatttaata tggctagtta 540

aaaaaggaaa ttcataccca aagctcagca aatcctacat taatgataaa gggaaagaag 600

tcctcgtgct atggggcatt caccatccat ctactagtga tgaccaacaa agtctctatc 660