Стабилизирующий эксципиент для вакцины с инактивированными целыми вирусами
Группа изобретений относится к вакцинной композиции, содержащей: a) препарат инактивированных целых вирусов бешенства; b) стабилизирующий эксципиент, содержащий:
и полоксамер 188 в концентрации 0,02 г/л или 0,01 г/л, а также способу получения данной вакцинной композиции и стабилизирующему эксципиенту. Группа изобретений эффективна в стабилизации вакцин, содержащих трудно консервируемые инактивированные целые вирусы бешенства. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 16 табл., 3 пр.
Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей инактивированные целые вирусы и эксципиент, стабилизирующий вакцинную композицию, причем композиция эксципиента содержит буферный раствор, смесь незаменимых и заменимых аминокислот, дисахарид, полиол, хелатообразующий агент, мочевину или производное мочевины и неионогенное поверхностно-активное вещество. Изобретение относится также к способу получения этой вакцинной композиции, а также к композиции эксципиента.
В области вирусных вакцин традиционно различают 3 типа вирусных вакцин: вакцины с живыми вирусами, вакцины с инактивированными целыми вирусами и субъединичные вирусные вакцины. Эти 3 типа вакцин различаются характеристиками, свойственными им и обусловливающими композицию эксципиентов, используемых для их консервации. Субъединичные вакцины, содержащие ограниченное количество вирусных антигенов, в общем случае легче сохранять, чем вакцины с инактивированными целыми вирусами, в которых пытаются сохранять структурную целостность вирусов, даже если они убиты, или вакцины с живыми вирусами, в которых пытаются сохранять также инфицирующую способность вирусов. Для каждого типа вирусных вакцин получали соответствующие эксципиенты. Для вирусных вакцин с различными аттенуированными вирусами стабилизирующие эксципиенты получали в зависимости от препарата аттенуированных вирусов, подлежащих консервации. В JP 57007423 описан эксципиент на основе дисахарида и полиспирта в фосфатном буферном растворе для стабилизации аттенуированного штамма вируса кори. В EP 065905 описан эксципиент, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы одиннадцати аминокислот, лактозу и сорбит в фосфатном буферном растворе, для стабилизации аттенуированного штамма вируса лихорадки денге. Наконец, в EP 0869814 описана вакцинная композиция, содержащая аттенуированный штамм вируса ветряной оспы и стабилизирующий агент, содержащий сорбит, маннит, сахарозу, декстран, смесь аминокислот, мочевину и ЭДТА.
В области вакцин с инактивированными вирусами вакцинные композиции, готовые для введения, часто содержат белки животного происхождения, такие, как бычий или человеческий альбумин, желатин или казеин. Известны белки для улучшения консервации (стабилизации) таких вакцин, в частности, вакцин, содержащих трудно консервируемые вирусы. Вакцинные композиции, содержащие инактивированный вирус бешенства, представляют собой именно такой случай. Frazatti-Gallina и соавт. в публикации "Vaccine" (2004), vol. 23, pp. 511-517, подчеркивают важную роль белков в стабилизации антирабической вакцины, так как эксципиент содержит альбумин.
Тем не менее, присутствие белков в вакцинах, помимо того, что они могут представлять собой потенциальный риск передачи болезней, если их происхождение контролируется нестрого, может представлять собой также потенциальный риск аллергии, который пытаются избегать, в частности, в случае, когда вакцины содержат сывороточные белки, такие, как альбумин или производные альбумина.
Таким образом, существует потребность в стабилизирующем эксципиенте, композиция которого не содержит белок, для стабилизации вирусных вакцин с инактивированными целыми вирусами, в частности, для стабилизации вакцин, содержащих трудно консервируемые инактивированные целые вирусы, такие, как вирус бешенства.
Существует также потребность в стабилизирующем эксципиенте, который является приемлемым также для стабилизации вакцин с низким содержанием инактивированных вирусов, то есть вакцин, содержащих малое количество общего белка в эффективной дозе вакцины. Эта потребность еще более важна для высокоочищенных вакцин, имеющих очень малое содержание остаточных белковых примесей. Остаточные белковые примеси, даже если они представляют собой потенциальный риск аллергии, могут способствовать в некоторой мере стабилизации вакцин с низким содержанием инактивированных вирусов. Они могут препятствовать явлениям агрегации, структурной деградации или адсорбции вируса, которые могут снижать эффективность вакцины.
С этой целью настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей:
a) препарат инактивированных целых вирусов;
b) стабилизирующий эксципиент, содержащий:
i. буферный раствор;
ii. смесь незаменимых и заменимых аминокислот;
iii. дисахарид;
iv. полиол;
v. хелатообразующий агент;
vi. мочевину или производное мочевины;
vii. неионогенное поверхностно-активное вещество.
Инактивированный целый вирус предпочтительно представляет собой вирус бешенства.
Согласно варианту настоящего изобретения вакцинная композиция не содержит также никакого сывороточного белка.
Согласно другому варианту вакцинная композиция не содержит также никакого экзогенного белка животного происхождения и предпочтительно не содержит никакого экзогенного вещества животного происхождения.
В еще одном варианте белки вируса составляют по меньшей мере 70% общего белка, содержащегося в вакцинной композиции.
Согласно еще одному варианту концентрация общего белка в вакцинной композиции ≤100 мкг/мл и предпочтительно ≤80 мкг/мл.
В предпочтительном варианте количество общего белка, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, ≤100 мкг.
В другом предпочтительном варианте количество общего белка, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 1 до 50 мкг.
В другом варианте настоящего изобретения стабилизирующий эксципиент не содержит никакого белка или никакого белка и никакого пептида или предпочтительно не содержит никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида.
Согласно другому варианту смесь незаменимых и заменимых аминокислот, содержащаяся в вакцинной композиции, включает в себя по меньшей мере аргинин или соль аргинина и глутаминовую кислоту или соль глутаминовой кислоты.
Согласно предпочтительному варианту количество незаменимых и заменимых аминокислот, содержащихся в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 0,5 до 2,5 мг.
Согласно другому варианту дисахарид, содержащийся в эксципиенте, представляет собой мальтозу.
Согласно еще одному варианту полиол, содержащийся в вакцинной композиции, представляет собой сорбит.
Согласно предпочтительному варианту общее количество дисахарида и полиола, содержащихся в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 10 до 50 мг.
В другом варианте хелатообразующий агент, содержащийся в вакцинной композиции, представляет собой ЭДТА или соль ЭДТА.
Согласно предпочтительному варианту количество хелатообразующего агента, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 0,01 до 0,1 мг.
Согласно другому предпочтительному варианту количество мочевины или производного мочевины, содержащееся в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 0,3 до 1,5 мг.
В другом варианте неионогенное поверхностно-активное вещество, содержащееся в вакцинной композиции, представляет собой полоксамер.
Полоксамер предпочтительно представляет собой полоксамер 188.
Согласно предпочтительному варианту количество неионогенного поверхностно-активного вещества, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 0,001 до 0,5 мг.
Согласно другому варианту значение pH вакцинной композиции находится в интервале от 7,0 до 10,0 и предпочтительно в интервале от 7,0 до 9,0.
В другом варианте буферный раствор, содержащийся в вакцинной композиции, представляет собой фосфатный буферный раствор, буферный раствор Tris, буферный раствор HEPES или их смесь.
В предпочтительном варианте буферный раствор представляет собой фосфатный буферный раствор, молярность которого находится в интервале от 10 до 100 мМ.
Настоящее изобретение относится также к способу получения вакцинной композиции, содержащей препарат очищенных и инактивированных целых вирусов, по которому:
a. получают препарат целых вирусов, собирая надосадочную жидкость культуры клеток, инфицированных вирусом;
b. очищают и инактивируют препарат целых вирусов или альтернативно инактивируют и очищают препарат целых вирусов;
c. разбавляют препарат очищенных и инактивированных целых вирусов стабилизирующим эксципиентом, композиция которого содержит:
i. буферный раствор;
ii. смесь незаменимых и заменимых аминокислот;
iii. дисахарид;
iv. полиол;
v. хелатообразующий агент;
vi. мочевину или производное мочевины;
vii. неионогенное поверхностно-активное вещество.
Согласно предпочтительному варианту способ по настоящему изобретению осуществляют без введения экзогенного вещества животного происхождения.
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению вирус представляет собой вирус бешенства.
В другом варианте способ по настоящему изобретению после разбавления препарата очищенных и инактивированных целых вирусов включает в себя стадию распределения полученной таким образом вакцинной композиции по упаковочным единицам и при необходимости стадию лиофилизации вакцинной композиции.
Настоящее изобретение относится также к вакцинной композиции, содержащей препарат очищенных и инактивированных целых вирусов, в лиофилизованной форме, полученной согласно одному из вариантов осуществления способа по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится также к стабилизирующему эксципиенту для вакцины с инактивированными целыми вирусами, композиция которого содержит:
i. буферный раствор;
ii. смесь незаменимых и заменимых аминокислот;
iii. дисахарид;
iv. полиол;
v. хелатообразующий агент;
vi. мочевину или производное мочевины;
vii. неионогенное поверхностно-активное вещество.
Композиция стабилизирующего эксципиента предпочтительно также не содержит никакого белка или никакого белка и никакого пептида или предпочтительно не содержит никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида.
Более предпочтительно композиция стабилизирующего эксципиента не содержит также никакого вещества животного происхождения.
Подробное описание изобретения
Вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит инактивированные целые вирусы (или препарат инактивированных целых вирусов) и стабилизирующий эксципиент, композиция которого содержит буферный раствор, смесь незаменимых и заменимых аминокислот, дисахарид, полиол, хелатообразующий агент, мочевину или производное мочевины и неионогенное поверхностно-активное вещество. Композиция эксципиента с положительным эффектом заменяет эксципиенты предшествующего уровня техники, содержащие в своем составе белок. Особый интерес состоит в том, что она стабилизирует трудно консервируемые вакцинные композиции и наиболее предпочтительно вакцинные композиции, содержащие вирус бешенства в качестве целого инактивированного вируса, без необходимости прибавлять белок.
Вакцинная композиция по настоящему изобретению стабильна одновременно в жидком виде, в виде замороженной жидкости или в виде лиофилизата, что предоставляет очень большую гибкость при применении.
Стабилизирующий эксципиент по настоящему изобретению предохраняет биологическую активность вакцинной композиции во времени независимо от того, находится ли она в замороженной, жидкой или лиофилизованной форме. Температура хранения замороженных вакцинных композиций в общем случае ≤-35°C; она составляет от +2°C до +8°C для композиций в жидком виде и приблизительно +5°C для композиций в лиофилизованном виде. Преимущественно эксципиент предохраняет также биологическую активность и физическую целостность вирусов в вакцинных композициях, хранящихся в неблагоприятных условиях, например, при хранении вакцинных композиций в жидком виде при +37°C или в случае, когда вакцинные композиции подвергают последовательности размораживаний и замораживаний.
Биологическую активность вируса в вакцинной композиции оценивают, определяя в зависимости от времени количество конститутивного иммуногена вируса, являющегося существенным для индуцирования защитного иммунитета против вируса и/или испытывая его эффективность в испытании на официально признанной модели с животным. В случае вакцинной композиции, содержащей инактивированный вирус бешенства, стабильность вакцинной композиции оценивают, определяя в зависимости от времени (или в ходе последовательных размораживаний) титр вируса, который оценивают на основании измерения концентрации гликопротеина G в неденатурированной форме и/или испытывая эффективность вакцинной композиции в официальном тесте NIH. Для оценки содержания гликопротеина G можно использовать способ ELISA типа "сэндвич", при котором распознают по меньшей мере один и предпочтительно два конформационных эпитопа гликопротеина G соответственно описанию в примере 1. При использовании способа ELISA, при котором распознают два конформационных эпитопа белка G, в качестве антитела-ловушки традиционно используют нейтрализующее вирус бешенства антитело, которое распознает конформационный эпитоп, локализованный на антигенном сайте II гликопротеина G, (Journal of Clinical investigation (1989), vol. 84, p. 971-975), а в качестве антитела-проявителя используют нейтрализующее антитело, которое распознает конформационный эпитоп, локализованный на антигенном сайте III белка G (Biologicals (2003), vol. 31, p. 9-16). Результаты выражают в международных единицах, поскольку в качестве сравнительного образца традиционно используют эталон, откалиброванный относительно международного стандартного образца NIBSC. Также можно использовать технологию BIAcore, считающуюся интересной альтернативой способу ELISA и основанную на использовании поверхностного плазмонного резонанса для количественного определения титра вируса.
Стабилизирующий эксципиент по настоящему изобретению действует также в отношении сохранения физической целостности вирусных частиц. В частности, он препятствует образованию агрегатов и/или деградации структуры вирусных частиц с течением времени. Это свойство может быть проверено посредством прибора, такого, как Zetasizer Nano ZS (Malvern instrument), который позволяет детектировать агрегаты и выявлять профиль распределения размеров вирусных частиц в вакцинной композиции.
Вирус или препарат вируса находится в форме целых вирусных частиц, инактивированных в общем случае химической обработкой формалином, формальдегидом или β-пропиолактоном. Также могут быть использованы другие способы инактивации, такие, как способ, описанный в WO 2005/093049. Принципиально используемые препараты инактивированных целых вирусов содержат вирусы с оболочками, хотя они часто более трудно поддаются консервации и требуют использования специфических композиций эксципиентов для обеспечения их консервации. В частности, речь идет о препаратах инактивированных целых вирусов японского энцефалита. Препараты инактивированных целых вирусов более предпочтительно содержат вирус бешенства.
Препараты вирусов происходят из образцов, которые в общем случае представляют собой отбираемые фракции надосадочных жидкостей культур клеток, инфицированных вирусом. Для получения исходного материала клеток и инфицирования клеток можно использовать традиционные среды, содержащие сыворотку животного происхождения. Среды, используемые для культивирования и инфицирования клеток, предпочтительно не содержат сывороточный белок и также вещества животного происхождения. Белки, которые при необходимости содержатся в таких средах, в общем случае представляют собой низкомолекулярные белки (≤10 кД) или скорее пептиды в очень низких концентрациях, что соответственно уменьшает риски аллергии. Именно такие среды представляют собой, например, среды, реализуемые под названиями VP SFM (InVitrogen), Opti Pro™ serum-free (InVitrogen), Episerf (InVitrogen), Ex-cell® MDCK (Sigma-Aldrich), Ex-Cell™ Vero (SAFC biosciences), MP-BHK® serum free (MP Biomedicals), SFC-10 BHK express serum free (Promo cell), SFC-20 BHK express protein free (Promo cell), HyQ PF Vero (Hyclone, позиция по каталогу SH30352.02), Hyclone SFM4 Megavir, среда MDSS2 (Axcell biotechnology), модифицированная среда DMEM Iscove (Hyclone), питательные среды Ham (Ham-F10, Ham-F12), среда Лейбовица L-15 (Hyclone). Например, образцы вирусов бешенства получают исходя из исходного материала клеток Vero, которые были получены и затем инфицированы при использовании сред для культивирования и вирусного инфицирования, предпочтительно не содержащих никакого сывороточного белка, никакого белка животного происхождения и также никакого вещества животного происхождения, таких, как среда VP SFM.
Препарат целых и инактивированных вирусов, содержащийся в вакцинной композиции по настоящему изобретению, хорошо очищают. Традиционно сначала очищают и затем инактивируют или наоборот сначала инактивируют и затем очищают вирус, происходящий от образцов. В случае, когда все стадии продуцирования и очистки вируса осуществляют без использования сывороточного белка, без использования экзогенного белка животного происхождения или также без использования экзогенного вещества животного происхождения, вакцинная композиция по настоящему изобретению предпочтительно не содержит никакого сывороточного белка для максимального уменьшения рисков аллергии и не содержит никакого экзогенного белка животного происхождения или также никакого вещества животного происхождения для максимального уменьшения рисков передачи болезней. Под выражением "белок или вещество животного происхождения" понимают белок или вещество, способ получения которого включает в себя по меньшей мере одну стадию, на которой используют материал, происходящий от животного или человека. Под выражением "экзогенный белок или экзогенное вещество" понимают белок или вещество, вводимое на одной из стадий способа продуцирования и/или очистки вируса. Например, белки или вещества, содержащиеся при необходимости в композиции сред для культивирования, ферменты, такие, как трипсин или бензоназа, используемые на стадиях продуцирования и/или очистки вируса, представляют собой экзогенные белки или вещества. Экзогенные белки или вещества имеют животное происхождения, если их способ получения включает в себя по меньшей мере одну стадию, на которой используют материал, происходящий от животного или человека. Экзогенные белки или вещества имеют неживотное происхождение в том случае, когда они изготовлены иными способами, например, при использовании растительного материала, материала, полученного химическим синтезом или генетической рекомбинацией при использовании дрожжей, бактерий или растений. Белки или вещества, происходящие от клеток, исходя из которых получают вирусы для получения вакцинной композиции по настоящему изобретению, напротив, представляют собой эндогенные белки или вещества, поскольку они продуцируются (или высвобождаются) в то же самое время, что и вирус.
В рамках настоящего изобретения предпочтительно можно использовать особо эффективные способы очистки, которые позволяют получать очень чистые вирусные препараты. В качестве примера можно упомянуть способ очистки вирусов, включающий в себя последовательное осуществление анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и аффинной хроматографии, основанной на образовании хелатов металлов, и описанный в WO 97/06243. Для очистки и инактивации вируса бешенства исходя из надосадочной жидкости культуры инфицированных клеток наилучший способ представляет собой способ, описанный в заявке на патент, поданной во Франции 14 апреля 2009 года под номером 0952310, и включающий стадию катионообменной хроматографии на подложке, содержащей полиметакрилатную матрицу, к которой привиты сульфоизобутильные группы, стадию обработки бензоназой, стадию ультрацентрифугирования с градиентом сахарозы и стадию инактивации β-пропиолактоном. Полученные препараты целых и инактивированных вирусов бешенства являются особенно чистыми, но более трудно поддаются консервации (стабилизации), поскольку содержат очень малое количество остаточных белковых примесей. Это затруднение возрастает по мере уменьшения количества вирусов в вакцинной композиции.
Благодаря композиции эксципиента вакцинная композиция по настоящему изобретению остается стабильной даже в случае, когда концентрация общего белка ≤100 мкг/мл, ≤80 мкг/мл, ≤50 мкг/мл или даже ≤20 мкг/мл. В общем случае белки вируса составляют по меньшей мере 70% общего белка, предпочтительно по меньшей мере 80% общего белка и более предпочтительно по меньшей мере 90% общего белка, содержащегося в вакцинной композиции по настоящему изобретению. В эффективной дозе вакцины упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству общего белка ≤100 мкг или ≤50 мкг, или даже ≤20 мкг. Например, остаточное количество ДНК составляет <100 пг и предпочтительно <50 пг на эффективную дозу вакцины. Под выражением "эффективная доза вакцины (или эффективная доза вакцинной композиции)" понимают количество инактивированных вирусов, содержащихся в дозе, необходимой для индуцирования защитного иммунитета у человека или животного после введения в зависимости от пути и методики иммунизации, рекомендованных для первичной или повторной вакцинации. В случае вакцинации против вируса бешенства эффективность антирабической вакцины определяют в официальном испытании, принятом ВОЗ, а именно в тесте NIH (описан в статье ВОЗ "Бешенство" (WHO Technical Series Report 941, январь 2007 года)). Доза инактивированной антирабической вакцины является эффективной, если согласно данному тесту она содержит по меньшей мере 2,5 МЕ. Внутримышечное введение такой дозы человеку по традиционно рекомендуемым методикам вакцинации или серовакцинации индуцирует развитие защитного иммунитета против бешенства.
"Общий белок" соответствует количеству всех белков, содержащихся в вакцинной композиции. Он представлен вирусными белками, остаточными белками, которые не были удалены во время очистки, такими, как клеточные белки, белки сред для культивирования клеток и вирусного инфицирования, и белками, которые при необходимости были введены в процессе очистки (например, бензоназа в случае очистки упомянутого ранее вируса бешенства). В общем случае для количественного определения общего белка используют способ Брэдфорда. Для количественного определения доли вирусных белков в общем белке осуществляют электрофорез образца вакцинной композиции на полиакриламидном геле в денатурирующих и восстановительных условиях с последующим проявлением синим кумасси и денситометрическим анализом электрофоретического профиля. В случае вакцинной композиции, содержащей инактивированные целые вирусы бешенства, вирусные белки, представленные оболочечным гликопротеином G, нуклеопротеином N, фосфопротеином P, матричным белком M и РНК РНК-зависимой полимеразы L, легко идентифицируются при электрофорезе на полиакриламидном геле. Количество общего белка, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции по настоящему изобретению, в общем случае находится в интервале от 1 до 50 мкг и предпочтительно в интервале от 2 до 20 мкг. Более предпочтительно по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или даже по меньшей мере 90% общего белка составляют вирусные белки. Эксципиент по настоящему изобретению является особенно предпочтительным, поскольку он стабилизирует трудно консервируемые вакцинные композиции, такие, как вакцинные композиции, которые содержат инактивированные целые вирусы бешенства и в которых в эффективной дозе вакцины содержатся:
- вирусные белки в количестве, составляющем по меньшей мере 70% общего белка, и/или
- менее 100 мкг общего белка, причем наиболее часто количество общего белка находится в интервале от 1 до 50 мкг и предпочтительно в интервале от 2 до 20 мкг.
Композиция эксципиента по настоящему изобретению предпочтительно не содержит никакого белка, никакого пептида и также никакого олигопептида и в общем случае не содержит вещества животного происхождения для максимального уменьшения проблем биологической и/или аллергической безопасности, которые могут быть связаны с их применением.
В контексте настоящего изобретения выражение "стабилизирующий эксципиент не содержит никакого белка" следует понимать как выражение, означающее стабилизирующий эксципиент, композиция которого не содержит никаких биологических макромолекул, имеющих цепи из более 50 аминокислот, связанных между собой посредством пептидных связей. Выражение "стабилизирующий эксципиент не содержит никакого белка и никакого пептида" следует понимать как выражение, означающее стабилизирующий эксципиент, композиция которого не содержит никаких биологических макромолекул, имеющих цепи из более 20 аминокислот, связанных между собой посредством пептидных связей. Выражение "стабилизирующий эксципиент не содержит никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида" следует понимать как выражение, означающее стабилизирующий эксципиент, композиция которого не содержит никаких биологических молекул, включающие в себя аминокислоты, связанные между собой одной или несколькими пептидными связями. Например, дипептид, содержащий две аминокислоты, связанные между собой только одной пептидной связью, исключен из композиции стабилизирующего эксципиента, не содержащего никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида, но может входить в композицию стабилизирующего эксципиента, не содержащего никакого белка и никакого пептида.
Смесь аминокислот, входящих в композицию эксципиента, содержит по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту из группы незаменимых аминокислот, представляющих собой цистин, тирозин, аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан и валин, и по меньшей мере одну заменимую аминокислоту из группы заменимых аминокислот, представляющих собой аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аланин, аспарагин, глутамин, глицин, пролин и серин. Аминокислоты, обладающие кислотной функциональной группой, могут находиться в виде кислот или солей. Аналогичным образом данное положение относится к аминокислотам с основным характером.
Эксципиент по настоящему изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере аргинин или соль аргинина, такую, как гидрохлорид аргинина, и глутаминовую кислоту или соль глутаминовой кислоты, такую, как глутамат натрия. Как результат, смесь аминокислот предпочтительно содержит от 1 до 12 незаменимых аминокислот, в число которых входит по меньшей мере аргинин или его соль, и от 1 до 8 заменимых аминокислот, в число которых входит по меньшей мере глутаминовая кислота или ее соль. Общая концентрация аминокислот в вакцинной композиции в общем случае ≤20 г/л и наиболее часто находится в интервале от 2 до 10 г/л. В эффективной дозе вакцинной композиции по настоящему изобретению упомянутые концентрации соответствуют общему количеству незаменимых и заменимых аминокислот ≤5 мг, предпочтительно в интервале от 0,5 до 2,5 мг и более предпочтительно в интервале от 0,8 до 1,8 мг. Соотношение между количеством аргинина (в виде гидрохлорида) и общим количеством аминокислот, содержащихся в эксципиенте, в общем случае больше 0,5, в то время как соотношение между количеством глутаминовой кислоты (в виде глутамата натрия) и общим количеством аминокислот, содержащихся в эксципиенте, меньше 0,5.
Эксципиент по настоящему изобретению содержит также дисахарид. Дисахариды, полученные из исходного материала животного происхождения, такого, как молоко, исключаются. В качестве дисахарида, приемлемого для цели настоящего изобретения, можно упомянуть сахарозу, мальтозу или трегалозу, но предпочтительно используют мальтозу индивидуально или в комбинации с другим дисахаридом, таким, как сахароза. Полиол, который также включен в композицию эксципиента, представляет собой полиол неживотного происхождения. Предпочтительно речь идет о шестиатомном спирте, таком, как сорбит и/или маннит. Предпочтительно используют сорбит, поскольку маннит обладает тем недостатком, что он кристаллизуется в случае, когда вакцинная композиция по настоящему изобретению находится в лиофилизованной форме. Общая концентрация дисахарида и полиола в вакцинной композиции в общем случае находится в интервале от 30 до 100 г/л. Эксципиент по настоящему изобретению предпочтительно содержит мальтозу и сорбит. В эффективной дозе вакцинной композиции упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству в интервале от 10 до 50 мг и предпочтительно в интервале от 20 до 25 мг. Количество мальтозы в общем случае составляет по меньшей мере 70% общего количества мальтозы и сорбита.
Хелатообразующий агент является также одним из компонентов эксципиента по настоящему изобретению. Предпочтительно речь идет о ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или о ее соли (Na+, K+ и т.п.). Концентрация ЭДТА или соли ЭДТА в вакцинной композиции в общем случае находится в интервале от 0,02 до 0,5 г/л и предпочтительно в интервале от 0,02 до 0,2 г/л. В эффективной дозе вакцинной композиции упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству в интервале от 0,01 до 0,1 мг, предпочтительно в интервале от 0,01 и 0,05 мг и более предпочтительно в интервале от 0,01 до 0,04 мг ЭДТА или соли ЭДТА.
Мочевина или производное мочевины, такое, как аллилмочевина, ацетамид, метилкарбамат или бутилкарбамат, также входят в композицию эксципиента. Предпочтительно вакцинная композиция содержит мочевину с концентрацией в общем случае в интервале от 1 до 10 г/л и предпочтительно с концентрацией в интервале от 1 до 5 г/л. В эффективной дозе вакцинной композиции упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству в интервале от 0,3 до 3 мг, предпочтительно в интервале от 0,3 до 1,5 мг и более предпочтительно в интервале от 0,4 до 1,2 мг мочевины.
Эксципиент по настоящему изобретению содержит также неионогенное поверхностно-активное вещество, способствующее стабилизации вакцинной композиции. Вне зависимости от привязки к теории оно способствует сохранению биологической активности вирусов и сохранению физической целостности вирусных частиц, препятствуя образованию агрегатов или деградации структуры вирусов. Оно может также противодействовать адсорбции вирусов на стенках упаковки, в частности, в случае, когда стенки выполнены из стекла или пластмассы. Неионогенное поверхностно-активное вещество, приемлемое для цели настоящего изобретения, получают из исходного материала неживотного происхождения, при этом оно совместимо в фармацевтическом отношении с введением парентеральным путем. В качестве класса неионогенных поверхностно-активных веществ, предпочтительно приемлемых для цели настоящего изобретения, можно упомянуть полоксамеры, которые представляют собой этиленоксидные и пропиленоксидные "блок-сополимеры", имеющие химическую формулу HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, где a означает число этиленоксидных звеньев, а b означает число пропиленоксидных звеньев. Полоксамеры имеют молекулярную массу в общем случае в интервале от 1000 до 16000 дальтон. Полоксамеры, представляющие особый интерес, имеют молекулярную массу в интервале от 5000 до 15500 дальтон. Полоксамеры коммерчески реализуются, в частности, под торговым названием Pluronic®, среди которых pluronic® F68 или полоксамер 188, который при комнатной температуре представляет собой полоксамер в виде твердого вещества и молекулярная масса полиоксипропиленовой части которого составляет приблизительно 1750 дальтон, а полиоксиэтиленовая часть которого составляет приблизительно 80% общей массы молекулы. Среди полоксамеров предпочтительно можно рекомендовать полоксамер 188 (pluronic® F68). При необходимости можно использовать сложный эфир сорбитана, в частности, сложный полиоксиэтиленированный эфир сорбитана, реализуемый под коммерческим названием Tween®, такой, как tween® 20 (сорбитанполиоксиэтилен(20)монолаурат или полисорбат 20) или tween® 80 (сорбитанполиоксиэтилен(20)моноолеат или полисорбат 80). Неионогенное поверхностно-активное вещество, приемлемое для цели настоящего изобретения, используют в очень низкой концентрации, предохраняющей структуру и размер инактивированных вирусных частиц, который должен оставаться подобным размеру живых вирусов. При очень высокой концентрации поверхностно-активное вещество может разрушать или изменять структуру вирусных частиц, в частности, структуру вирусов с оболочками, что может влиять на иммуногенность вакцинной композиции. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества pluronic® F68 общая концентрация в вакцинной композиции ≤1 г/л и в общем случае находится в интервале от 0,005 до 1 г/л и более предпочтительно в интервале от 0,01 до 0,1 г/л. В данном диапазоне концентраций полоксамер 188 не оказывает адъювантного действия на иммунную систему. В эффективной дозе вакцинной композиции упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству в интервале от 0,001 до 0,5 мг и предпочтительно в интервале от 0,003 до 0,3 мг. Наиболее предпочтительно вакцинная композиция содержит полоксамер 188 или при необходимости смесь полоксамера 188 и полисорбата 20.
Буферный раствор эксципиента по настоящему изобретению выбирают так, чтобы значение pH вакцинной композиции находилось в интервале от 7,0 до 10,0 и предпочтительно в интервале от 7,0 до 9,0 и более предпочтительно в интервале от 7,3 до 8,3. Именно в данном диапазоне значений pH физическая термостабильность частиц инактивированных вирусов, в частности, термостабильность частиц вирусов бешенства максимальна. Изучение фазовой диаграммы показывает, что препарат вирусов бешенства необходимо нагревать до температуры по меньшей мере 60°C, чтобы наблюдать агрегацию частиц вирусов бешенства в случае, когда значение pH находится в интервале от 7,3 до 8,3, тогда как при pH <6,0 наблюдается значительная агрегация при комнатной температуре. Буферный раствор традиционно представляет собой фосфатный буферный раствор, буферный раствор Tris или буферный раствор HEPES или их смесь. Их концентрация в общем случае находится в интервале от 10 до 100 мМ. Композиция эксципиента предпочтительно содержит фосфатный буферный раствор, молярность которого традиционно находится в интервале от 10 до 100 мМ, или смесь фосфатного буферного раствора и буферного раствора Tris.
Более предпочтительная вакцинная композиция по настоящему изобретению содержит:
препарат целых и инактивированных вирусов бешенства и стабилизирующий эксципиент, содержащий:
фосфатный буферный раствор;
смесь незаменимых и заменимых аминокислот, включающая в себя по меньшей мере аргинин или соль аргинина и глутаминовую кислоту или соль глутаминовой кислоты;
мальтозу;
сорбит;
ЭДТА или соль ЭДТА;
мочевину;
полоксамер 188;
причем значение pH вакцинной композиции находится в интервале от 7,3 до 8,3.
В эту вакцинную композицию при необходимости может быть введен Tween 20 в качестве дополнительного неионогенного поверхностно-активного вещества. Эта вакцинная композиция предпочтительно не содержит никакого сывороточного белка и никакого экзогенного вещества животного происхождения и в общем случае содержит высокоочищенный препарат вирусов бешенства. Концентрация полоксамера 188 в вакцинной композиции <1 г/л и более предпочтительно находится в интервале от 0,01 до 0,1 г/л. Молярность фосфатного буферного раствора в общем случае находится в интервале от 10 до 100 мМ. Аргинин и глутаминовая кислота или их соответствующие соли представляют собой очень важные компоненты смеси аминокислот, поскольку в общем случае по массе они составляют по меньшей мере 2/3 общего количества незаменимых и заменимых аминокислот. Смесь незаменимых и заменимых аминокислот обычно содержится с концентрацией в интервале от 2 до 10 г/л, общая концентрация мальтозы и сорбита традиционно находится в интервале от 50 до 100 г/л, концентрация ЭДТА или соли ЭДТА традиционно находится в интервале от 0,02 до 0,2 г/л, а мочевина традиционно содержится с концентрацией в интервале от 1 до 5 г/л. Концентрация общего белка в вакцинной композиции традиционно находится в интервале от 5 до 50 мкг/мл. В эффективной дозе антирабической вакцины упомянутые концентрации традиционно соответствуют количеству незаменимых и заменимых аминокислот в интервале от 0,5 до 2,5 мг, количеству мальтозы и сорбита в интервале от 10 до 50 мг, количеству ЭДТА или соли ЭДТА в интервале от 0,01 до 0,1 мг, количеству мочевины в интервале от 0,3 до 1,5 мг, количеству полоксамера 188 в интервале от 0,001 до 0,5 мг и количеству общего белка в интервале от 2 до 20 мкг.
Способ получения вакцинной композиции по настоящему изобретению помимо стадии продуцирования, очистки и инактивации препарата вируса включает стадию, на которой в препарат очищенных и инактивированных целых вирусов вводят стабилизирующий эксципиент, и стадию распределения полученной таким образом композиции по упаковочным единицам. В общем случае препарат вирусов разбавляют стабилизирующим эксципиентом по настоящему изобретению перед распределением вакцинной композиции по упаковочным единицам.
Вакцинная композиция по настоящему изобретению может находиться в форме балк-продукта: в данном случае концентрация инактивированных целых вирусов является более высокой, чем концентрация, имеющаяся в вакцинной композиции после распределения, но состав эксципиента остается тем же. Балк-продукт в общем случае хранят в замороженном виде при температуре <-35°C. При этом стадию распределения вакцинной композиции осуществляют, размораживая балк-продукт, который разбавляют затем стабилизирующим эксципиентом с целью получения требуемой концентрации вирусов. При этом получают конечный балк-продукт, который затем распределяют по упаковочным единицам. Для гарантирования стерильности вакцинной композиции перед стадией распределения также можно включать стадию стерилизующего фильтрования, например, через фильтрующую мембрану с порами 0,2 мкм.
Балк-продукт в общем случае получают, подвергая диафильтрации препарат очищенных и инактивированных вирусов, полученный в конце процесса очистки, в буферном растворе, соответствующем в общем случае буферному раствору эксципиента. Если, например, буферный раствор эксципиента представляет собой 50 мМ фосфатный буферный раствор, то в качестве буферного раствора при диафильтрации используют 50 мМ фосфатный буферный раствор. Если требуется увеличить концентрацию вирусов, то стадии диафильтрации предшествует стадия ультрафильтрации. Используют ультрафильтрующую мембрану с низким пределом разделения и в общем случае в интервале от 5 до 100 кД, предпочтительно в интервале от 8 до 50 кД и более предпочтительно около 10 кД, чтобы таким образом удерживать максимальное количество вирусов в ретентате и удалять соли, которые могут отрицательно действовать на процесс лиофилизации. Затем ретентат, содержащий препарат вируса, смешивают со стабилизирующим эксципиентом для получения балк-продукта, композиция которого соответствует вакцинной композиции по настоящему изобретению. Для получения балк-продукта только в одну стадию в качестве буферного раствора при диафильтрации также можно использовать буферный раствор, имеющий такой же состав, что и стабилизирующий эксципиент.
Способ получения вакцинной композиции по настоящему изобретению, содержащей целые и инактивированные вирусы бешенства, включает следующие стадии: получают препарат целых вирусов, собирая надосадочную жидкость культуры клеток Vero, инфицированных вирусом, и используя среды для культивирования клеток и вирусного инфицирования, предпочтительно не содержащие никакого сывороточного белка и никакого вещества животного происхождения, используя, например, среду VP SFM. Очищают и инактивируют вирус, предпочтительно используя способ, описанный в заявке на патент, поданной во Франции 14 апреля 2009 года под номером 0952310, и включающий стадию катионообменной хроматографии на подложке, предпочтительно содержащей матрицу на основе полиметакрилата, к которой привиты сульфоизобутильные группы, стадию обработки рекомбинантной бензоназой, стадию ультрацентрифугирования с градиентом сахарозы и стадию инактивации β-пропиолактоном. Полученный препарат целых и инактивированных вирусов бешенства является высокочистым и не содержит никакого сывороточного белка и никакого экзогенного вещества животного происхождения; остаточное содержание ДНК <100 пг/мл, а вирусные белки составляют по меньшей мере 70% общего белка. Затем согласно условий, описанных в предыдущем параграфе, получают балк-продукт, который в общем случае хранят при температуре <-35°C. Далее балк-продукт разбавляют до требуемой концентрации вирусов эксципиентом по настоящему изобретению перед распределением по упаковочным единицам. В каждую упаковочную единицу традиционно вносят от 0,1 до 1 мл вакцинной композиции, так чтобы композиция после распределения содержала по меньшей мере одну эффективную дозу вакцины. Упаковочные единицы, служащие для распределения конечного балк-продукта, традиционно имеют форму флаконов (из стекла или пластмассы) или шприцев, но также могут быть использованы любые другие упаковочные единицы, приемлемые для осуществления вакцинации.
Гранулометрический анализ вакцинных композиций по настоящему изобретению, содержащих очищенный вирус бешенства, посредством прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrument), регистрирующего броуновское движение частиц на основе "квазиупругого" рассеяния света (Dynamic Light scattering (динамическое рассеяние света)), показывает существование только одной однородной популяции вирусных частиц в интервале от 100 до 300 нм со средним значением около 180 нм, что соответствует среднему размеру исходного вируса бешенства. При этом не обнаружено ни наличие агрегатов, ни изменений профиля распределения размеров вирусных частиц в ходе хранения вакцинных композиций по настоящему изобретению.
Вакцинные композиции стабильны в жидком виде в течение по меньшей мере 3 месяцев при температуре 2-8°C и в течение по меньшей мере 1 месяца при 23-27°C (см. пример 3). Они могут также храниться в течение по меньшей мере 12 месяцев и предпочтительно в течение по меньшей мере 24 месяцев в замороженном виде при температуре ≤-35°C. Вакцинные композиции могут также храниться в лиофилизованном виде при использовании традиционного способа лиофилизации. Композиция эксципиента по настоящему изобретению не вызывает значительную потерю вирусов в течение стадии лиофилизации. Способ лиофилизации состоит в замораживании композиции при температуре ниже -40°C с последующим высушиванием вещества в две стадии, причем первую стадию высушивания осуществляют при температуре около -15°C при 80 мкбар, а вторую стадию высушивания осуществляют при температуре около +40°C при 80 мкбар. Дозы лиофилизованных вакцин имеют остаточную влажность ≤3% и стабильны при температуре 2-8°C в течение по меньшей мере 18 месяцев (см. пример 3). Как результат, антирабическая вакцинная композиция, соответствующая настоящему изобретению, также стабильна, как и вакцинная композиция предшествующего уровня техники, реализуемая под названием VeroraB™ и содержащая в дозе вакцины общий белок, количество которого по меньшей мере в 100 раз больше количества, которое может содержаться в эффективной дозе предлагаемой вакцинной композиции и в общем случае ≤50 мкг. В то же время, композиция эксципиента по настоящему изобретению предпочтительно позволяет надежно хранить вакцинные композиции в жидком или замороженном виде и также в случае, когда предпочтительная форма хранения представляет собой лиофилизованную форму.
Вакцинная композиция может быть введена непосредственно пациенту, подлежащему вакцинации, в случае, когда она хранилась в жидком виде, или после размораживания, если она хранилась в замороженном виде. В случае, когда композиция находится в лиофилизованной форме, лиофилизат экстемпорально растворяют в разбавителе, традиционно представляющем собой солевой раствор, такой, как, например, гипотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, разбавитель может содержать в очень низкой концентрации поверхностно-активное вещество, химическая структура которого совместима в фармацевтическом отношении с применением парентеральным путем. Обычно используют tween® 20, tween® 80 или pluronic® F68, которые используют с концентрацией, являющейся слишком низкой для того, чтобы оказывать адъювантное действие. Концентрация поверхностно-активного вещества в разбавителе в общем случае ≤0,1% (масс.).
В случае, когда вакцина находится в лиофилизованной форме, она обычно находится в виде набора из двух упаковочных единиц, причем первая упаковочная единица (в общем случае в форме флакона) содержит лиофилизованную вакцинную композицию, а вторая упаковочная единица (в общем случае в форме флакона или шприца) содержит разбавитель. Также можно использовать шприц двухкамерного типа, в котором вакцинная композиция находится в нижней части, а в верхней части содержится разбавитель.
В последнем аспекте настоящее изобретение относится к стабилизирующему эксципиенту для вакцины с инактивированными целыми вирусами, в частности, для вакцины с инактивированными целыми вирусами бешенства, содержащему:
a. буферный раствор;
b. смесь незаменимых и заменимых аминокислот;
c. дисахарид;
d. полиол;
e. хелатообразующий агент;
f. мочевину или производное мочевины;
g. неионогенное поверхностно-активное вещество.
Эксципиент предпочтительно не содержит никакого белка, более предпочтительно никакого пептида и никакого белка и наиболее предпочтительно никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида. Также более предпочтительно он не содержит никакого вещества животного происхождения.
Настоящее изобретение может быть лучше понято из приведенных далее примеров, служащих для пояснения изобретения без ограничения тем не менее его сущности.
На фиг.1 сопоставлены профили распределения размеров вирусных частиц, полученные способом "dynamic light scattering (DLS)" (динамического рассеяния света (ДРС)) в ходе 3 циклов последовательных размораживаний и замораживаний антирабической вакцинной композиции, в которой композиция стабилизирующего эксципиента представляла собой F04+0,001% полоксамера 188. ● D0 (перед замораживанием), ■ D1 (после первого размораживания), ▲ D2 (после второго размораживания) и + D3 (после третьего размораживания).
На фиг.2 сопоставлены профили распределения размеров вирусных частиц, полученные способом "динамического рассеяния света (ДРС)" в ходе 3 циклов последовательных размораживаний и замораживаний антирабической вакцинной композиции, в которой композиция стабилизирующего эксципиента представляла собой F04 + 0,01% полоксамера 188. ● D0 (перед замораживанием), ■ D1 (после первого размораживания), ▲ D2 (после второго размораживания) и + D3 (после третьего размораживания).
Пример 1. Влияние эксципиента на стабильность вакцинной композиции, содержащей очищенный и инактивированный вирус бешенства, в форме балк-продукта
1.1. Получение балк-продукта
Вирус бешенства продуцировали в клетках Vero, используя бессывороточную среду для вирусного инфицирования. Клетки линии Vero адаптировали к условиям культивирования в бессывороточной среде соответственно описанию заявки WO 01/40443. Затем их переносили в биореактор, содержавший микроносители цитодекс 1 в среде VP SFM (Invitrogen). После культивирования в течение от 3 до 4 дней при 37°C и при поддержании значения pH около 7,2±0,2, насыщения кислородом до 25±10% при слабом перемешивании среды клетки инфицировали вирусом бешенства (штамм Питмана-Мура) с множественностью инфицирования 0,01, используя бессывороточную среду для вирусного инфицирования, содержащую среду VP SFM (Invitrogen). Отбирали надосадочную жидкость культуры инфицированных клеток в дни J7 (R1), J11 (R2) и J15 (R3). После каждого отбора вводили новую среду для вирусного инфицирования. Надосадочные жидкости культуры, содержавшие инфицирующий вирус, осветляли посредством двух последовательных фильтрований: при первом фильтровании использовали полипропиленовый префильтр с порами 8 мкм (Sartopure PP2, SARTORIUS), позволяющий удалять микроносители, в небольшом количестве всасываемые при отборе, клетки Vero, отделившиеся от носителей, и крупные фрагменты клеток; при втором фильтровании использовали фильтр PES, представляющий собой комбинацию двух фильтров с порами 0,8 и 0,45 мкм (Sartopore 2, SARTORIUS) и позволяющий удалять агрегаты. Количество вирусов бешенства, содержавшихся в осветленных фракциях, определяли по измерению количества гликопротеина G (gpG), осуществляемому способом ELISA следующим образом.
В лунки микропланшета ELISA вносили приблизительно по 0,12 мкг/100 мкл раствора моноклонального антитела 1112-1 анти-gpG (характеристики которого описаны в Journal of Clinical investigation (1989), volume 84, pages 971-975), предварительно разбавленного "покровным" буферным раствором (0,2 M карбонатно-гидрокарбонатный буферный раствор, pH=9,6). После инкубации в течение ночи в холодной камере с последующим осуществлением нескольких промывок промывочным буферным раствором (фосфатный буферный раствор, дополненный 0,05% Tween 20) в каждую из лунок вносили по 100 мкл насыщающего буферного раствора (фосфатный буферный раствор, дополненный 1% бычьего сывороточного альбумина). После инкубации в течение часа при 37°C с последующим осуществлением нескольких промывок готовили серию разведений каждого испытуемого образца в разбавляющем буферном растворе (фосфатный буферный раствор, дополненный 0,05% Tween 20 и 0,1% сывороточного альбумина). Параллельно в каждом микропланшете готовили серию разведений эталонного сравнительного образца, откалиброванного относительно международного эталонного образца NIBSC (например, PISRAV). После новой инкубации в течение часа при 37°C с последующим осуществлением нескольких промывок в каждую из лунок вносили по 100 мкл раствора моноклонального антитела D1 мыши анти-gpG (характеристики которого описаны в Biologicals (2003), volume 31, pages 9-16), который был биотинилирован и использован после разведения в соотношении 1/5000 в разбавляющем буферном растворе. Планшеты оставляли стоять в течение 1 часа при 37°C и затем промывали несколько раз перед внесением в каждую из лунок по 100 мкл раствора стрептавидина в сочетании с пероксидазой (Southern Biotechnology Associates), предварительно разбавленного в соотношении 1/15000 разбавляющим буферным раствором. После новой инкубации в течение часа при 37°C с последующим осуществлением нескольких промывок в каждую из лунок вносили по 100 мкл 0,05 M цитратного буферного раствора, pH=5, содержавшего проявляющий субстрат (O-фенилендиамин). После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре без доступа света реакцию проявления останавливали, прибавляя по 50 мкл/лунка 2 н. раствора H2SO4. Спектрофотометрию микропланшетов осуществляли при двух длинах волн (492 и 620 нм). Измеренная оптическая плотность представляет собой разницу между двумя измерениями для учета поглощения, обусловленного пластмассой. Расчет относительной активности осуществляли способом параллельных прямых согласно рекомендациям Европейской фармакопеи. Определение титра вируса бешенства в образце основано на определении концентрации гликопротеина G вируса бешенства, выражаемой в МЕ/мл по отношению к стандартному образцу.
После определения проводимости и pH осветленной жидкости на хроматографический носитель Fractogel® EMD SO3- (Merck), предварительно кондиционированный буферным раствором Tris, 20 мМ, NaCl, 150 мМ, pH=7,5, наносили аликвоту, соответствовавшую приблизительно 50 МЕ гликопротеина G (определенного способом ELISA), из расчета на 1 мл носителя. Затем хроматографический носитель промывали кондиционирующим буферным раствором и далее вирус бешенства элюировали буферным раствором Tris, 20 мМ, NaCl, 600 мМ, pH=7,5, с отбором отдельной фракции, соответствующей пику содержания вирусов. Затем осуществляли стадию ультрафильтрации через мембрану PES Medium Screen 100KD (PALL) с последующей диафильтрацией с буферным раствором Tris, 20 мМ, NaCl, 150 мМ, pH=7,5. Далее прибавляли раствор MgCl2, так чтобы концентрация в диафильтрате составила 2 мМ. Обработку бензоназой осуществляли, прибавляя 15 ед./мл необработанной осветленной фракции к реакционной смеси и оставляя реакционную смесь стоять в течение 2 часов при комнатной температуре. Стадию ультрацентрифугирования осуществляли на слое сахарозы, 34-60%, на центрифуге rotor 45 типа Ti при 21000 об/мин в течение 2 ч при +5°C. Градиентные фракции, содержавшие очищенный вирус, собирали, объединяли и затем разбавляли фосфатным буферным раствором, 50 мМ, NaCl, 150 мМ, pH=7,5, так чтобы конечный объем суспензии очищенных вирусов был приблизительно в 12,5 раз меньше объема осветленной фракции. Затем суспензию очищенных вирусов инактивировали обработкой β-пропиолактоном с последующим подавлением активности β-пропиолактона нагреванием при температуре около 37°C в течение 2 часов. Препарат очищенных и инактивированных вирусов концентрировали в 6 раз ультрафильтрацией через мембрану 10 кД (Omega medium screen PALL) с последующей диафильтрацией с фосфатным буферным раствором, 50 мМ, NaCl, 150 мМ, pH=7,5. Полученный препарат вируса бешенства находился в форме концентрированного балк-продукта, титр которого, определенный по концентрации гликопротеина G, составил около 80 МЕ/мл. Затем осуществляли диализ аликвоты балк-продукта против одного из 4 эксципиентов (от F01 до F04), композиции которых описаны далее.
1.2. Композиции испытуемых эксципиентов
F01: фосфатный буферный раствор, 50 мМ, NaCl, 150 мМ, мальтоза (5% масс.), pH=8,0.
F02: фосфатный буферный раствор, 50 мМ, мальтоза (5% масс.), pH=8,0.
F03: фосфатный буферный раствор, 50 мМ, мальтоза (5% масс.), полоксамер 188 (BASF) (0,001% масс.), pH=8,0.
F04: буферный раствор 489 PM, pH=8,0, следующего состава:
| Компоненты | Объем/количество |
| Незаменимые аминокислоты | 40 мл |
| Заменимые аминокислоты | 40 мл |
| Сорбит (Roquette) | 20 г |
| Гидрохлорид аргинина (Jerafrance) | 4 г |
| ЭДТА (Prolabo) | 0,148 г |
| Глутамат натрия (SAFC) | 1,6 г |
| Na2HPO4·2H2O | 8,428 г |
| NaHPO4·2H2O | 0,413 г |
| Мальтоза (Hayashibara) | 50 г |
| Мочевина | 4 г |
| Доведение значения pH до 8,0 прибавлением 10 н. раствора гидроксида натрия | |
| Деминерализованная вода в количестве, необходимом до: | 1000 мл |
Раствор незаменимых аминокислот готовили, растворяя вещество из флакона, содержавшего 111,5 г незаменимых аминокислот (Gibco, позиция по каталогу 074-90680N, партия №14773), в 5 л воды для инъекций, подкисленной 100 мл 12 н. раствора HCl (Prolabo).
Раствор заменимых аминокислот готовили, растворяя вещество из флакона, содержавшего 40,7 г заменимых аминокислот (Gibco, позиция по каталогу 074-90681N, партия №14775), в 5 л воды для инъекций.
1.3. Испытания c 4 рецептурами балк-продукта
Готовили балк-продукт с 4 композициями испытуемых эксципиентов. Стабильность четырех рецептур (вакцинных композиций) оценивали во времени при различных температурах хранения: -70°C, +5°C и +37°C, определяя через регулярные интервалы титр гликопротеина G (выражаемый в МЕ/мл). Полученные результаты представлены в таблицах I-III и выражены в МЕ/мл.
| Таблица I Стабильность 4 рецептур балк-продукта при +37°C |
|||
| Время (недели) | 0 | 1 | 2 |
| F01* | 41,25* | 30,21 | 17,51 |
| F02 | 60,41 | 23,15 | 5,12 |
| F03 | 60,29 | 23,16 | 5,2 |
| F04 | 57,26 | 52,37 | 52,68 |
| Таблица II Стабильность 4 рецептур балк-продукта при +5°C |
||||
| Время (недели) | 0 | 3 | 12 | 24 |
| F01 | 41,25** | 39,71 | 45,56 | 38,55 |
| F02 | 60,41 | 53,29 | 42,27 | 38,92 |
| F03 | 60,29 | 52,64 | 47,75 | 41,33 |
| F04 | 57,26 | 62,19 | 61,06 | 61,32 |
| Таблица III Стабильность 4 рецептур балк-продукта при -70°C |
||||
| Время (недели) | 0 | 3 | 12 | 24 |
| F01 | 41,25 | 33,81 | 37,61 | 27,59 |
| F02 | 60,41 | 53,52 | 53,06 | 53,62 |
| F03 | 60,29 | 57,87 | 60,15 | 56,46 |
| F04 | 57,26 | 57,48 | 59,92 | 56,56 |
| *: F01, F02, F03 и F04 указывают на соответствие композициям эксципиентов, с которыми были получены балк-продукты; **: в МЕ/мл. |
Полученные результаты показывают, что эксципиент F04 представляет собой эксципиент, наилучшим образом стабилизирующий препарат очищенных и инактивированных вирусов бешенства, в частности, в случае повышенной температуры хранения. Результаты показывают также, что эксципиент, содержащий сахар (мальтозу) и неионогенное поверхностно-активное вещество, такое, как полоксамер 188, в буферном растворе с pH=8,0, не в состоянии эффективно стабилизировать препарат вируса бешенства.
Пример 2. Роль поверхностно-активного вещества в стабилизации вакцинных композиций, содержащих очищенный вирус бешенства
2.1. Получение вакцинных композиций
Суспензию очищенных вирусов бешенства получали, используя такой же способ, что и в примере 1. На стадии ультрацентрифугирования очищенный препарат вируса находился в высококонцентрированной форме. Концентрация общего белка составляла 7 мг/мл при определении по способу Брэдфорда. Данный препарат вируса распределяли по 3 полипропиленовым сосудам и затем разбавляли 3 различными эксципиентами, подлежавшими оценке в отношении их стабилизирующей роли, так чтобы конечная концентрация общего белка в каждом из испытуемых эксципиентов была снижена до 10 мкг/мл (фактор разведения 1/700). Композиции 3 испытуемых эксципиентов отличались только содержанием в них полоксамера 188, при этом все композиции содержали буферный раствор 489 PM, pH=8,0, состав которого описан в примере 1. Эксципиент без полоксамера 188 имел такой же состав, что и эксципиент F04, описанный в примере 1. Два других эксципиента были дополнены соответственно 0,01 г/л полоксамера 188 (эксципиент, обозначенный "F04+0,01% полоксамера") и 0,1 г/л полоксамера 188 (эксципиент, обозначенный "F04+0,1% полоксамера").
2.2. Исследование стабильности и результаты
Стабильность 3 вакцинных композиций оценивали, помещая их в неблагоприятные условия хранения, то есть подвергая последовательности замораживаний и размораживаний по следующей методике.
3 вакцинные композиции замораживали при -70°C в тот же день (день J0). Затем каждую из 3 композиций подвергали 3 размораживаниям при +5°C с последующим замораживанием при -70°C в промежутке от 7 до 14 часов, следовавшем за размораживанием, в 1-й, 2-й и 3-й дни (J1, J2 и J3 соответственно). Стабильность вакцинных композиций после каждого размораживания оценивали, определяя общую концентрацию вирусного белка.
Определение осуществляли, используя технологию BIAcore, основанную на использовании поверхностного плазмонного резонанса. Также анализировали профиль распределения размеров частиц в ходе последовательных размораживаний с использованием методики квазиупругого рассеяния (динамического рассеяния света или также способа ДРС).
Для осуществления технологии BIAcore на первой стадии моноклональное антитело D1 мыши анти-gpG связывали ковалентной связью с чувствительным элементом, используя набор для связывания, поставляемый изготовителем (Reference amine coupling kit, BR-1000-50). Затем 30 мкл анализируемого образца автоматически вводили в прибор на 3 минуты. Взаимодействие вируса бешенства, содержавшегося в образце, с моноклональным антителом, зафиксированном на чувствительном элементе, вызывало изменение показателя преломления поверхности чувствительного элемента, проявлявшееся в изменении регистрируемого сигнала (RU). Полученные результаты регистрировали в произвольных единицах (ΔRU) и сравнивали с результатами, полученными с эталонной серией сравнительного образца, содержавшего известное количество очищенных вирусов бешенства. Значение ΔRU, определенное для каждого образца, пересчитывали в общую концентрацию вирусного белка по эталонной кривой, полученной со сравнительным образцом. Для каждого испытуемого образца определения осуществляли 4 раза (в четырех пробах). После каждого определения чувствительный элемент очищали, осуществляя два последовательных ввода по 10 мкл глицинового буферного раствора (10 мМ, pH=1,5). Результаты, полученные для каждой испытуемой вакцинной композиции, представлены в таблице IV. Значения выражены в мкг/мл вирусного белка.
| Таблица IV Исследование стабильности 3 вакцинных композиций в ходе 3 циклов последовательных размораживаний и замораживаний |
|||||
| Стабилизирующий эксципиент | D0 | D1 | D2 | D3 | Снижение титра вирусов |
| F04 | 11* (0,5)** | 3,4 (0,4) | 2,1 (0,3) | 1,4 (0,3) | 88% |
| F04+0,001% полоксамера 188 | 14,8 (0,3) | 11,2 (0,5) | 10,8 (0,5) | 9,9 (0,6) | 33% |
| F04+0,01% полоксамера 188 | 18,9 (0,0) | 15,7 (0,3) | 15,2 (0,4) | 14,7 (0,4) | 23% |
| *: средний титр вирусного белка, полученный по 4 определениям, осуществленным с испытуемым образцом, мкг/мл; **: в скобках указано среднее квадратичное отклонение, рассчитанное по 4 определениям, осуществленным с испытуемым образцом. |
Полученные результаты ясно показывают, что эксципиент F04 в отсутствие полоксамера не способен эффективно предохранять препарат вирусов бешенства, поскольку снижение титра вируса равно 88% относительно титра D0 и титра, определенного после третьего размораживания (D3). Напротив, как только эксципиент F04 немного дополняют полоксамером 188, то снижение титра вируса сильно уменьшается (оно составляет 33% при дополнении F04 0,001 г/л полоксамера 188 и 23% при дополнении F04 0,01 г/л полоксамера 188). Полученные результаты показывают, что эксципиент должен одновременно содержать компоненты, содержащиеся в буферном растворе 489 PM, и полоксамер 188, чтобы эффективно консервировать вакцинную композицию, содержащую вирус бешенства.
Профиль распределения размеров частиц каждой из 3 вакцинных композиций также анализировали после каждого размораживания способом ДРС, используя прибор Zetasizer Nano Zs (Malvern Instrument). В полистироловую кювету однократного использования вводили 450 мкл анализируемого образца, который затем облучали монохроматическим лазером (лазер HeNe, λ=632,8 нм). Регистрируемый прибором сигнал соответствовал флуктуациям рассеянного света, обусловленным броуновским движением частиц. Зарегистрированные данные обрабатывали с привлечением компьютерной программы. В заключение результаты представляли в виде кривой распределения размеров частиц для каждого испытуемого образца. На 2 фигурах представлено наложение 4 кривых распределения размеров частиц, полученных соответственно для композиции вирусов бешенства, стабилизированной эксципиентом "F04+0,001% полоксамера 188" в день J0 (перед замораживанием), J1, J2 и J3 (фигура 1), и для композиции вирусов бешенства, стабилизированной эксципиентом "F04+0,01% полоксамера 188" (фиг.2).
На обеих фигурах ясно видно, что:
1) кривые распределения размеров частиц являются унимодальными и имеют профиль кривой Гаусса, медиана которой находится около 180 нм. Это означает, что популяция вирусных частиц в вакцинной композиции, стабилизированной эксципиентом "F04+0,001% полоксамера 188" или эксципиентом "F04+0,01% полоксамера 188", является однородной, не содержит агрегатов и содержит популяцию целых вирусов бешенства, подобную популяции исходных вирусов бешенства;
2) кривые распределения размеров частиц не изменяются в случае, когда вакцинные композиции вирусов бешенства подвергаются нескольким последовательным размораживаниям и замораживаниям.
Присутствие неионогенного поверхностно-активного вещества, такого, как полоксамер 188, в композиции эксципиента предохраняет также физическую целостность популяции вирусов бешенства даже в случае, когда вакцинную композицию помещают в плохие условия хранения.
2.3. Исследование стабильности лиофилизованных вакцинных композиций
2.3.1. Получение лиофилизованных вакцинных композиций
Сначала получали балк-продукт исходя из препарата очищенных инактивированных целых вирусов, который получали используя способ, описанной в примере 1. После стадии инактивации вирусов препарат очищенных и инактивированных вирусов бешенства подвергали диафильтрации через мембрану 10 кД (Omega medium screen PALL), используя эксципиент под названием 488 TM, полученный исходя из среды 488 со следующим составом (см. приведенную далее таблицу):
| Компоненты | Объем/количество |
| Смесь незаменимых и заменимых аминокислот | 200 мл |
| Сорбит (Roquette) | 50 г |
| Гидрохлорид аргинина (Jerafrance) | 10 г |
| ЭДТА (Prolabo) | 0,37 г |
| Глутамат натрия (SAFC) | 4 г |
| Мочевина | 10 г |
| Tris-NaH2PO4·2H2O (SAFC) | 2,42 г |
| Деминерализованная вода в количестве, необходимом до: | 1000 мл |
| Соляная кислота, 6 н. (Sanofi), в количестве, необходимом до: | pH=8,0 |
Смесь незаменимых и заменимых аминокислот получали, смешивая 2,5 л раствора незаменимых аминокислот, приготовленного соответственно примеру 1, с 2,5 л раствора заменимых аминокислот, приготовленного соответственно примеру 1, и доводя значение pH приблизительно до 7,2 посредством 30%-го раствора гидроксида натрия.
Эксципиент 488 TM имеет следующий состав:
| Компоненты | Объем/количество |
| Среда 488 | 400 мл |
| Мальтоза (Hayashibara) | 50 г |
| Tris-NaH2PO4·2H2O (SAFC) | 1,45 г |
| Деминерализованная вода в количестве, необходимом до: | 1000 мл |
| Соляная кислота, 6 н. (Sanofi), в количестве, необходимом до: | pH=8,0 |
Полученная вакцинная композиция находилась в форме балк-продукта в эксципиенте 488 TM, титр вирусов которого, соответствующий концентрации гликопротеина G, определенной способом ELISA, составлял около 12 МЕ/мл. Затем балк-продукт хранили в замороженном виде при -70°C до момента получения лиофилизованных вакцинных композиций.
Непосредственно перед стадией лиофилизации часть балк-продукта размораживали и разбавляли для доведения конечного титра гликопротеина G приблизительно до 8 МЕ/мл, используя:
- эксципиент F'04, композиция которого содержала 1 объем эксципиента 488 TM на 3 объема фосфатного буферного раствора, 50 мМ, причем концентрацию мальтозы доводили до 50 г/л, pH=8,0;
- или эксципиент F'05, который был идентичен эксципиенту F'04, но к которому был прибавлен полоксамер 188 до конечной концентрации 0,01 г/л.
Затем обе вакцинные композиции распределяли по флаконам для лиофилизации из расчета 0,4 мл/флакон и далее осуществляли цикл традиционной лиофилизации, включавший в себя стадию замораживания при температуре <-40°C с последующим осуществлением двух последовательных стадий высушивания, причем первую стадию высушивания осуществляли при температуре около -15°C и давлении около 80 мкбар, а вторую стадию высушивания осуществляли при температуре около +40°C и давлении около 80 мкбар.
Каждый флакон для лиофилизации содержал дозу испытуемой вакцинной композиции. Полученные лиофилизованные вакцинные композиции различались только присутствием или отсутствием поверхностно-активного вещества в зависимости от того, разбавляли ли балк-продукт эксципиентом F'04 или F'05.
Далее приведен состав эксципиента, содержавшегося в дозе вакцинной композиции в лиофилизованном виде, полученной исходя из эксципиента F'05.
| Компонент | Количество, мг/доза |
| Смесь незаменимых и заменимых аминокислот | 0,12 |
| Полоксамер 188 | 0,004 |
| Мальтоза | 20,00 |
| Гидрохлорид аргинина | 0,41 |
| Сорбит | 2,05 |
| Динатриевая соль ЭДТА | 0,01 |
| Мочевина | 0,41 |
| Глутамат натрия | 0,16 |
| Na2HPO4·2H2O | 2,53 |
| NaH2PO4·2H2O | 0,12 |
| Tris | 0,24 |
| HCl | в необходимом количестве |
| NaOH | в необходимом количестве |
2.3.2. Эффективность лиофилизованных вакцинных композиций
Обе лиофилизованные вакцинные композиции, полученные с использованием двух различных стабилизирующих эксципиентов, были испытаны на эффективность в официальном тесте NIH. "Эффективность" обеих лиофилизованных вакцинных композиций определяли непосредственно после лиофилизации (J0), после хранения в течение недели при 45°C и также после хранения в течение месяца при 37°C. Использовали единственный официально признанный тест на испытание активности, а именно тест NIH, который позволяет определить число МЕ, содержащихся в каждой из доз испытуемых вакцинных композиций. Если число МЕ ≥2,5 МЕ, то доза испытуемой вакцины является эффективной. Тест NIH осуществляли в каждом случае в "двух образцах" для каждого из испытуемых условий, случайным образом отбирая два флакона с лиофилизатом из партии флаконов, произведенных и хранившихся в одних и тех же условиях, и осуществляя с отобранными образцами тест NIH. Использованная методика соответствует статье 0216 Европейской фармакопеи. Данный тест представляет собой испытание, осуществляемое на мышах и основанное на сравнении защиты, придаваемой дозой испытуемой вакцины, с защитой, придаваемой известным количеством сравнительной антирабической вакцины. Сравнительная антирабическая вакцина откалибрована в международных единицах (МЕ). Международная единица (МЕ) представляет собой активность, соответствующую количеству, определенному международным стандартом. Эквивалентность в МЕ международного стандарта была установлена ВОЗ. После проверки того, что контрольные параметры теста на эффективность надлежащим образом соблюдены, исходя из значений защитной дозы, соответствующих 50% и полученных для каждого испытуемого образца и для сравнительного образца (откалиброванного в МЕ), определяли число МЕ, содержащихся в дозе испытуемой вакцины.
Полученные результаты представлены в приведенной далее таблице V.
| Таблица V Эффективность лиофилизованных вакцинных композиций в зависимости от состава эксципиента, использованного при лиофилизации, и условий хранения |
|||
| Продолжительность (дни) и температура хранения лиофилизованной композиции | J0/+4°C | J7/+45°C | J30/+37°C |
| F'04 | 0,8* (0,4; 1,8)** | 0,9 (0,4; 2,1) | н.о. |
| F'05 | 6,1 (1,6; 41,3) | 2,8 (0,9; 7,9) | 3,5 (1,4; 8,7) |
| *: полученное среднее значение, выраженное в МЕ (все группы мышей, использованных в испытании, включали в себя 16 мышей); **: полученные граничные значения, выраженные в МЕ; н.о.: значение не определено. |
Данные результаты согласуются с результатами, рассмотренными в предыдущем параграфе (2.2), и показывают, что полоксамер 188 должен быть включен в композицию эксципиента, используемого для консервации лиофилизованных вакцинных композиций. Таким образом, только лиофилизованные вакцинные композиции, включающие в себя эксципиент F'05 (содержащий полоксамер 188), содержат эффективную дозу вакцины, так как среднее значение в МЕ превышает 2,5 МЕ. Данные вакцинные композиции остаются стабильными, так как их эффективность не уменьшилась с течением времени в условиях хранения, принятых для испытаний.
Таким образом, результаты, изложенные в примере 2, показывают, что вакцинные композиции, содержащие вирус бешенства, могут быть хорошо законсервированы стабилизирующим эксципиентом, композиция которого содержит фосфатный буферный раствор, смесь незаменимых и заменимых аминокислот, сахар, такой, как мальтоза, полиол, такой, как сорбит, ЭДТА и мочевину, в комбинации с неионогенным поверхностно-активным веществом, таким, как полоксамер 188. Кроме того, представляющим интерес образом, "стабилизирующий эффект" полоксамера 188 проявляется при очень низкой концентрации, которая является слишком низкой для того, чтобы полоксамер 188 мог активировать иммунную систему или действовать в качестве адъюванта иммунного ответа.
Пример 3. Исследование стабильности вакцинных композиций, содержащих очищенный и инактивированный вирус бешенства
С учетом того, в примерах 1 и 2 показана важность комбинирования компонентов эксципиента, содержащего смесь незаменимых и заменимых аминокислот, мальтозу, сорбит, ЭДТА, мочевину в буферном растворе на основе фосфата и/или Tris, с полоксамером 188, цель исследований, представленных в данном разделе, состояла в подтверждении того, что такая комбинация эффективно стабилизировала вакцинные композиции вирусов бешенства в различных формах (жидкая, замороженная или лиофилизованная форма) в широком диапазоне температур хранения (+37°C, +25°C, +5°C, -70°C) и в течение длительного периода времени. Данные исследования осуществляли с несколькими вакцинными композициями вирусов бешенства, законсервированных в форме балк-продукта, замороженного при температуре ≤-35°C, в форме конечного жидкого балк-продукта при +5°C или в лиофилизованной дозированной форме, хранившейся при +5°C, +25°C или +37°C.
3.1. Исследование стабильности партий антирабических вакцин в форме замороженного балк-продукта
Вирус бешенства, использованный для получения партий балк-продукта, получали способом, описанным в примере 1. После стадии инактивации вирусов препарат очищенного и инактивированного вируса подвергали диафильтрации через мембрану 10 кД, используя в качестве буферного раствора при диафильтрации 50 мМ фосфатный буферный раствор. На второй стадии смешивали 1 объем ретентата с 1 объемом стабилизирующего эксципиента, композиция которого соответствовала композиции буферного раствора 489 PM, описанного в примере 1 (за исключением того, что концентрация каждого из компонентов была в два раза больше), и к которому прибавляли полоксамер 188 до концентрации 0,02 г/л, pH≈8,0. Таким образом, получали балк-продукт, имевший концентрацию общего белка 50 мкг/мл, больше 70% которого составляли белки вируса бешенства, и содержавший меньше 100 пг/мл остаточной ДНК. Стабильность балк-продукта в зависимости от времени исследовали в ходе хранения при -35°C и при -70°C, определяя каждые 3 месяца титр гликопротеина G. Полученные результаты представлены в приведенной далее таблице VI.
| Таблица VI Стабильность партии балк-продукта, хранившейся при -35°C или -70°C |
|||||
| Температура хранения | T0 | T0+3 месяца | T0+6 месяцев | T0+9 месяцев | T0+12 месяцев |
| -35°C | 20,4* | 20,84 | 24,4 | 24,3 | 22,4 |
| -70°C | 21,3 | н.о. | 22,4 | 22,8 | 21,8 |
| *: титр выражен в МЕ/мл; н.о.: значение не определено. |
Через 12 месяцев хранения при -35°C или -70°C не замечена деградация гликопротеина G, представляющего собой основной антиген вируса бешенства, что подтверждает хорошую стабильность вакцинной композиции в форме замороженного балк-продукта. Кроме того, анализ распределения размеров вирусных частиц способом ДРС после хранения в течение 12 месяцев при -35°C или -70°C показал, что профили сохраняли характер кривой Гаусса, имеющей центр при медианном значении 180 нм (профили подобны профилям, показанным на фиг.1 и 2). Отсутствовало расщепление профилей, указывающее на присутствие вирусных агрегатов. Результаты показали также, что численность частиц вирусов бешенства с течением времени не изменялась. Не замечена ни деградация, ни агрегация вирусных частиц с течением времени.
3.2. Исследование стабильности партий антирабических вакцин в форме жидкого конечного балк-продукта (PFV)
Готовили 3 партии вакцины в форме жидкого PFV, исходя из 3 партий балк-продукта после разведения в буферном растворе 489 PM (состав описан в примере 1), к которому прибавляли полоксамер 188 до конечной концентрации 0,01 г/л, pH≈8,0. Вакцины содержали меньше 100 пг/мл остаточной ДНК (определенной способом количественной ПЦР). По результатам денситометрического анализа электрофорезом на полиакриламидном геле концентрация общего белка составляла приблизительно 15 мкг/мл, причем больше 70% общего белка составляли вирусные белки. Стабильность партий PFV, хранившихся при +5°C и +25°C, исследовали, определяя через регулярные интервалы содержание гликопротеина G способом ELISA в течение 3 месяцев для партий PFV, хранившихся при +5°C, и в течение 30 дней для партий PFV хранившихся при +25°C. Полученные результаты, выраженные в МЕ/мл, представлены в таблицах VII и VIII, приведенных далее.
| Таблица VII Стабильность 3 партий PFV, хранившихся при +5°C |
||||
| № партии | T0 | T0+1 месяц | T0+2 месяца | T0+3 месяца |
| №1 | 10,5 | 12,0 | 8,6 | 10,8 |
| №2 | 11,1 | 10,7 | 9,3 | 11,9 |
| №3 | 13,9 | 11,1 | 11,6 | 11,2 |
| Таблица VIII Стабильность 3 партий PFV, хранившихся при +25°C |
|||
| № партии | T0 | T0+15 дней | T0+30 дней |
| №1 | 12,0 | 10,9 | 10,9 |
| №2 | 10,7 | 11,4 | 10,1 |
| №3 | 11,1 | 12,0 | 11,5 |
Полученные результаты показывают, что деградация гликопротеина G в ходе хранения партий PFV в жидкой форме при +5°C и +25°C в течение испытательных периодов отсутствует. Это подтверждает, что антирабические вакцины могут храниться в жидкой форме на холоде (+5°C) в течение по меньшей мере 3 месяцев и при комнатной температуре (+25°C) в течение по меньшей мере 30 дней без деградации вирусов.
3.3. Исследование стабильности партий антирабических вакцин в лиофилизованной форме
2 партии антирабических вакцин в лиофилизованной форме (LL1 и LL2) получали исходя из партий PFV примера 3.2, которые распределяли по стеклянным флаконам для лиофилизации из расчета 0,3 мл/флакон перед осуществлением цикла лиофилизации, в ходе которого осуществляли замораживание при температуре ≤-40°C, первую стадию высушивания при температуре около -15°C и давлении около 80 мкбар до полной сублимации льда и вторую стадию высушивания при температуре около +40°C и давлении около 80 мкбар до тех пор, пока остаточная влажность лиофилизатов не становилась ≤3%. Снижение титра вирусов на стадии лиофилизации было <5%.
Эксципиент, содержавшийся в дозе вакцины в лиофилизованной форме, имел следующий состав:
| Компонент | Количество, мг/доза |
| Смесь незаменимых и заменимых аминокислот | 0,37 |
| Полоксамер 188 | 0,003 |
| Мальтоза | 15,00 |
| Гидрохлорид аргинина | 1,20 |
| Сорбит | 6,00 |
| Динатриевая соль ЭДТА | 0,04 |
| Мочевина | 1,2 |
| Глутамат натрия | 0,15 |
| Na2HPO4·2H2O | 2,53 |
| NaH2PO4·2H2O | 0,12 |
| HCl | в необходимом количестве |
| NaOH | в необходимом количестве |
Полученные лиофилизованные дозированные образцы представляли собой однородное вещество белого цвета. Значение pH суспензии вирусов бешенства после растворения лиофилизатов в 0,5 мл 0,4%-го раствора хлорида натрия находилось в интервале 7,8±0,5. Стабильность двух лиофилизованных партий в зависимости от времени исследовали при 3 температурах хранения: 35-39°C, 23-27°C и 2-8°C, проверяя внешний вид лиофилизатов до и после восстановления, определяя остаточную влажность, pH, титр вирусов и испытывая эффективность лиофилизованных дозированных образцов в тесте NIH. Первое разведение в серии разведений, осуществленных для испытания лиофилизованных дозированных образцов в тесте NIH после растворения в хлориде натрия, осуществляли в 0,9%-м растворе хлорида натрия, содержавшем 2 г/л альбумина человека. Титры вирусов определяли по содержанию гликопротеина G, определяемого способом ELISA и выражаемого в МЕ/мл.
Результаты испытаний, относящиеся к внешнему виду лиофилизатов, остаточной влажности и pH, соответствовали техническим требованиям (то есть однородное вещество белого цвета для лиофилизата, прозрачный бесцветный раствор после восстановления в гипотоническом физиологическом растворе и остаточная влажность <3%) независимо от температуры и продолжительности испытательного хранения. Значения pH оставались стабильными в интервале 7,8±0,5 в течение всего периода исследования стабильности. Результаты, относящиеся к титрам вирусов и испытаниям эффективности (NIH), осуществленным с дозированными образцами, представлены в таблицах IX-XI, приведенных далее
| Таблица IX Стабильность двух партий антирабических вакцин, хранившихся в лиофилизованной форме при +5°C |
||||||||
| Партия | Испытание | T0 | 1 M | 3 M | 6 M | 9 M | 12 M | 18 M |
| LL1 | Титр вирусов | 7,1* | 7,7 | 7,8 | 7,9 | 7,3 | 8,8 | 7,8 |
| NIH | 3,4** (1,9-6,1) |
н.о. | н.о. | 6,3 (3,6-10,9) |
н.о. | 6,0 (3,5-10,3) |
6,3 (3,3-11,9) |
|
| LL2 | Титр вирусов | 6,1 | 6,6 | 6,7 | 6,5 | 6,9 | 6,4 | н.о. |
| NIH | 4,7 (2,6-8,6) |
н.о. | н.о. | 7,9 (4,5-14) |
н.о. | 6,7 (3,7-12) |
н.о. |
| Таблица X Стабильность двух партий антирабических вакцин, хранившихся в лиофилизованной форме при +25°C |
|||||
| Партия | Испытание | T0 | 1 M | 3 M | 6 M |
| LL1 | Титр вирусов | 7,7 | 7,1 | 7,8 | 6,9 |
| NIH | н.о. | н.о. | н.о. | 7,0 (4,0-12,2) |
|
| LL2 | Титр вирусов | 6,6 | 6,1 | 6,0 | 6,2 |
| NIH | н.о. | 6,8 (3,9-11,8) |
н.о. | 8,9 (5,1-15,6) |
| Таблица XI Стабильность двух партий антирабических вакцин, хранившихся в лиофилизованной форме при +37°C |
|||||
| Партия | Испытание | T0 | 1 M | 3 M | 6 M |
| LL1 | Титр вирусов | 7,7 | 7,5 | 10,1 | 10,3 |
| NIH | н.о. | 7,1 (3,1-16,1) |
н.о. | 8,6 (5,0-14,9) |
|
| LL2 | Титр вирусов | 6,6 | 7,2 | 7,5 | 7,7 |
| NIH | н.о. | 8,8 (3,7-20,9) |
н.о. | 6,2 (3,5-11,3) |
|
| M: означает число месяцев; н.о.: значение не определено; *: значение выражено в МЕ/мл; **: среднее значение выражено в МЕ с указанием найденных граничных значений, приведенных в скобках. |
Совокупность полученных результатов подтверждает, что антирабические вакцины, хранящиеся в лиофилизованной форме, являются очень стабильными и не теряют эффективность с течением времени в условиях испытательных температур. Титры гликопротеина G и результаты теста NIH (очевидно превышающие 2,5 МЕ) стабильны во времени.
Таким образом, все испытания стабильности, осуществленные с партиями антирабических вакцин, хранившихся в замороженной, жидкой или лиофилизованной форме, показывают, что такие партии остаются стабильными во времени в условиях испытательных температур. Это подтверждает, что эксципиент, композиция которого содержит буферный раствор, смесь незаменимых и заменимых аминокислот, мальтозу, сорбит, ЭДТА, мочевину и полоксамер 188, эффективно стабилизирует антирабическую вакцинную композицию независимо от ее формы (замороженной, жидкой или лиофилизованной) и в широком диапазоне температур хранения.
1. Вакцинная композиция, содержащая:
a) препарат инактивированных целых вирусов бешенства;
b) стабилизирующий эксципиент, содержащий:
и полоксамер 188 в концентрации 0,02 г/л или 0,01 г/л.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она не содержит также никакого сывороточного белка.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что она не содержит также никакого экзогенного белка животного происхождения и предпочтительно не содержит никакого экзогенного вещества животного происхождения.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что белки вируса составляют по меньшей мере 70% общего белка, содержащегося в вакцинной композиции.
5. Композиция по п. 4, отличающаяся тем, что концентрация общего белка ≤100 мкг/мл и предпочтительно ≤80 мкг/мл.
6. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что количество общего белка, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, ≤100 мкг.
7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что количество общего белка, содержащегося в эффективной дозе вакцинной композиции, находится в интервале от 1 до 50 мкг.
8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что стабилизирующий эксципиент не содержит никакого белка или никакого белка и никакого пептида или предпочтительно не содержит никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида.
9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что смесь незаменимых и заменимых аминокислот содержит по меньшей мере аргинин или соль аргинина и глутаминовую кислоту или соль глутаминовой кислоты.
10. Способ получения вакцинной композиции, содержащей препарат очищенных и инактивированных целых вирусов бешенства, согласно которому:
a) получают препарат целых вирусов, собирая надосадочную жидкость культуры клеток, инфицированных вирусом;
b) очищают и инактивируют препарат целых вирусов или альтернативно инактивируют и затем очищают препарат целых вирусов;
c) разбавляют препарат очищенных и инактивированных целых вирусов стабилизирующим эксципиентом, композиция которого содержит:
и полоксамер 188 в концентрации 0,02 г/л или 0,01 г/л.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что его осуществляют без введения экзогенного вещества животного происхождения.
12. Способ по п. 10, согласно которому после разбавления препарата очищенных и инактивированных целых вирусов в стабилизирующем эксципиенте полученную таким образом вакцинную композицию распределяют по упаковочным единицам и при необходимости лиофилизуют вакцинную композицию.
13. Вакцинная композиция, содержащая препарат очищенных и инактивированных целых вирусов в лиофилизованной форме, полученная способом по п. 12.
14. Стабилизирующий эксципиент для вакцины с инактивированными целыми вирусами бешенства, композиция которого содержит:
и полоксамер 188 в концентрации 0,02 г/л или 0,01 г/л.
15. Стабилизирующий эксципиент по п. 14, отличающийся тем, что он не содержит также никакого белка или никакого белка и никакого пептида или предпочтительно не содержит никакого белка, никакого пептида и никакого олигопептида.
16. Стабилизирующий эксципиент по п. 15, отличающийся тем, что он не содержит также никакого вещества животного происхождения.
