Способ ультраочистки альгинатов
Настоящее изобретение относится к способу ультраочистки альгинатов. Способ получения растворов солей альгината предусматривает добавление порошка технического альгината к солевому раствору для получения раствора альгината с концентрацией от 1,6 до 2,0% масс. и доведение pH до 7,4-7,6, фильтрование полученного раствора альгината на по меньшей мере одном гидрофильном фильтре и извлечение отфильтрованного раствора альгината. Затем отфильтрованный раствор альгината фильтруют на модифицированном зарядом гидрофобном нейлоновом фильтре и извлекают раствор альгината. Получают не подвергнутый структурной модификации конечный раствор альгината с содержанием эндотоксинов менее 20 EU/г. Изобретение позволяет получить раствор альгината с высокой степенью очистки от эндотоксинов и исключить стадию диализа при очистке. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу ультраочистки альгинатов, в частности предназначенных для микрокапсулирования при изготовлении трансплантатов клеток человека. Способ особенно удобен для очистки исходного порошка альгината натрия фармацевтической марки (фармацевтической степени чистоты) и позволяет удалять эндотоксины и эндогенные пирогены (факторы, вызывающие повышение температуры тела), но при этом позволяет сохранять в неизменном виде молекулярную структуру продукта.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Альгинат натрия (AG) представляет собой полисахарид, который экстрагируют из некоторых морских водорослей, в частности из Macrocystis pyrifera, которые по большей части распространены вдоль западного побережья Тихого океана; этот полисахарид широко используется в различных областях техники, включая биотехнологию. Соли биополимеров, очистка которых является предметом настоящего изобретения, представляют собой водорастворимые полисахариды, которые либо самопроизвольно выделяются из живых растительных организмов, либо для их извлечения требуется проведение экстракции. Фактически альгинаты представляют собой соли альгиновой кислоты, имеющие структуру сополимеров, включающих звенья D-маннуроновой кислоты (-М-) и L-глюкуроновой кислоты (-G-). Эти звенья образуют полимерные или димерные блоки типа ММ или GG, иногда чередующиеся внутри молекулы.
Молекулярная структура и состав альгинатов в основном определяются природой источника, из которого они извлечены. Например, наиболее часто используемые альгинаты получают из коричневых водорослей, и, в частности, продукты, полученные из Macrocystis pyrifera, имеют отношение M/G, равное 1,56:1, в то время как альгинаты, полученные из Laminaria Hyperborea, имеют отношение M/G, равное 0,45. Одновалентные соли (Na, К) альгинатов обычно растворимы в воде, в отличие от их двухвалентных солей (Ва, Са) или многовалентных солей (Fe, Al), которые существуют в виде гелей или твердых веществ.
Уже в течение многих лет AG используют в пищевой и фармацевтической промышленности для получения, соответственно, фруктовых желе и наполнителей для некоторых классов лекарственных средств (например, антацидных средств и т.д.). Тем не менее, для применения в некоторых областях техники, коммерчески доступный альгинат натрия недостаточно чист, в частности, для введения его в материалы, трансплантируемые человеку, которые должны соответствовать строгим и одобренным на международном уровне критериям контроля качества, например, стандартам Министерства Здравоохранения или Фармакопеи США.
Альгинат коммерчески доступен в виде сырого экстракта и в виде частично очищенного раствора. Химический состав порошка альгината может быть описан содержанием фракций (FG или FM) и отношением М/С. Например, уровень эндотоксина в продукте AG KELTONE LVCR, составляет приблизительно от 30000 EU/г (EU - единица эндотоксина, ЕЭ) до приблизительно 60000 EU/г, то есть как таковой он не пригоден для парентерального введения, для которого уровень эндотоксина должен составлять не более 100 EU/г, и при этом предпочтительными являются еще более низкие уровни.
Вследствие этого перед парентеральным введением AG KELTONE LVCR, уровень эндотоксина в нем должен быть значительно снижен.
Уже в течение более чем 20 лет AG используют для изготовления микрокапсул, содержащих клетки гибридомы, применяемые для получения моноклональных антител (Damon Biotech, Inc.), а также для защиты трансплантированных панкреатических островков (островков Лангерганса) от реакции отторжения организмом хозяина (Патент US 4683092). Первые протоколы исследования микрокапсулярных трансплантатов в организмах грызунов и более высокоорганизованных млекопитающих, страдающих диабетом, ясно показывают, что чистота применяемого материала имеет фундаментальное значение для приживаемости трансплантата. Основные загрязняющие вещества, возможно отвечающие за отторжение микрокапсулярного трансплантата, представлены бактериальными липополисахаридными эндотоксинами, пирогенными материалами, присутствующими в мембране грам отрицательных бактерий. Такие вещества устойчивы к воздействию большинства систем, применяемых для стерилизации (например, автоклавов). Такие методики, как облучение гамма-излучением или стерилизация сухим жаром могут разрушить эндотоксины, но также могут повредить стерилизуемые материалы или продукты. Кроме того, обычно низкая молекулярная масса (10-20 кДальтон) загрязнений не позволяет удалять их способами обычного фильтрования. В любом случае, для устранения риска вторичного загрязнения, следует принять во внимание необходимость получения стерильного и, кроме того, не содержащего эндотоксинов продукта. Наконец, содержание эндотоксина в материалах, вводимых парентерально в организм человека, должно составлять менее 100 EU/г, и предпочтительно менее 50 EU/г. В случае использования AG для изготовления микрокапсул, содержащих панкреатические островки для трансплантации, наличие эндотоксина может аннулировать иммунологическую защиту, обеспечиваемую капсулами, то есть способствовать развитию серьезной воспалительной реакции.
В последние годы необходимость получения ультрачистого продукта (практически "не содержащего эндотоксинов") ускорила разработку некоторых способов очистки, которые, тем не менее, не отвечают всем требованиям промышленного производства и безопасности. Недостатком некоторых способов очистки, включающих использование ионообменных смол, как содержащих, так и не содержащих полимиксин-b, или применение фильтрования на фильтрах из ацетата целлюлозы и последующий диализ на мембранах, является несущественное снижение уровней эндотоксинов (приблизительно до 70-80 EU/г), при высокой стоимости; кроме того, эти способы не позволяют получать большие количества AG из-за значительных потерь массы исходного продукта, при том, что крупномасштабное получение совершенно необходимо для начальных протоколов клинического использования, и, в случае применения хлороформа, недостаток состоит в затруднительном удалении указанного растворителя, потенциально токсичного даже в умеренных количествах. Например, при использовании способа, включающего осаждение AG в этаноле и последующую экстракцию хлороформом, для того, чтобы получить 1 литр конечного продукта необходимо иметь приблизительно 10 литров исходного AG. Кроме того, низкий выход продукта означает, что различные партии AG могут иметь неодинаковые свойства, что неприемлемо для получения продуктов, применяемых в соответствии с клиническими протоколами, для которых нужны методики с высокой воспроизводимостью в крупных масштабах.
В Патенте US 6451772 по существу описан способ, включающий в качестве исходного материала сырой альгинат, обработку фильтрованием (и/или применение ионообменных смол) на полипропиленовых фильтрах и последующее осаждение из фильтрата органическими растворителями. Этот способ имеет следующие основные ограничения:
1. завышенная стоимость материалов относительно конечного объемного выхода получаемого альгината, но при этом выход остается неудовлетворительным,
2. тот факт, что описанная методика имеет чрезвычайно много вариантов и не позволяет систематически получать сам продукт, несмотря на то, что иногда удается получать альгинат с достаточно низким содержанием эндотоксинов; и
3. модифицирующее воздействие используемого растворителя на структуру альгината.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время неожиданно было обнаружено, что замена операции осаждения фильтрованием на картридже, содержащем фильтрующую мембрану с модифицированным зарядом, позволяет получать AG
1) с очень высокой и постоянной степенью чистоты (содержание эндотоксинов ≤20 EU/г),
2) ультрачистый при крупномасштабном выпуске,
3) полученный без использования растворителя, и, таким образом,
а. без модификации химической структуры альгината, и
b. без загрязнения альгината, который, таким образом, может соответствовать протоколам для парентерального применения.
Таким образом, объект настоящего изобретения относится к способу получения растворов солей альгината, не подвергшегося структурной модификации, содержание эндотоксинов в которых составляет не более 20 EU/г, включающему следующие этапы:
а. добавление порошка технического альгината (т.е. альгината технического сорта) к солевому раствору до получения раствора альгината, концентрация которого составляет от 1,6 до 2,0% масс., и доведение показателя рН до значений, составляющих 7.4-7.6;
b. фильтрование раствора, полученного при выполнении этапа а) на по меньшей мере одном гидрофильном фильтре и извлечение полученного раствора,
отличающемуся тем, что раствор, полученный при выполнении этапа b), фильтруют на гидрофобном фильтре, и полученный раствор извлекают.
В соответствии с настоящим изобретением, применяемый альгинат представляет собой альгинат натрия, имеющий состав, включающий 52,26% М и 47,74% G, что соответствует отношению M/G, составляющему 1,093. Предпочтительно в качестве альгината использует продукт Keltone® LVCR.
Фильтрование на этапе b) предпочтительно проводят, используя три фильтра из гидрофильных ацетатов целлюлозы, из которых предпочтительно первый фильтр представляет собой фильтр фармацевтической марки 30 с номинальным размером пор, равным 2 мкм, второй фильтр представляет собой фильтр фармацевтической марки 60 с номинальным размером пор, равным 2 мкм, а третий фильтр представляет собой фильтр 90 с номинальным размером пор, равным 2 мкм.
При выполнении второго фильтрования применяют гидрофобный фильтр; он предпочтительно представляет собой модифицированный зарядом нейлоновый фильтр, в частности, фильтр из нейлона 66, имеющий положительный электрический заряд.
В соответствии с настоящим изобретением, конечный продукт, получаемый из AG порошка фармацевтической марки после мольного разбавления и множественного фильтрования (как в виде раствора, так и порошка), имеет содержание эндотоксинов, не превышающее 20 EU/г, в полном соответствии с вышеуказанными критериями контроля качества. Конечный продукт, получаемый авторами настоящего изобретения, обычно доступный в виде раствора концентрацией 1,8% (масс./об.), который следует хранить в защищенном от света месте при температуре 4 - 6°С, стабилен приблизительно в течение 5 лет и практически не содержит белка (<0,4% - другой стандарт биодоступности Федерального управления США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов).
Изобретение основано на использовании свойств химической структуры липополисахаридных эндотоксинов (LPS), которые состоят из двух частей: гидрофильной (полисахаридной) и гидрофобной (липидной) части. В соответствии с настоящим изобретением, на завершающем этапе способа ультрафильтрации применяют нейлоновые фильтры (с положительным зарядом), способные селективно связывать (гидрофобную) липидную часть эндотоксинов, удерживая их, и при этом не изменять и/или повреждать структуру AG. Добавление четвертого фильтра позволяет устранять необходимость выполнения последующих манипуляций, которые были необходимы на существующем уровне техники, и, кроме того, гарантирует получение надежных и легко воспроизводимых результатов. Кроме того, химическая структура продукта не претерпевает изменений, чему было уделено особое внимание в вышеуказанном патенте США. Как неопровержимо доказано дейтериевым и углеродным спектрами ЯМР продукта, прилагаемыми к настоящему описанию, при сравнении спектра (неочищенного) исходного продукта и (ультрачистого, клинической марки) конечного продукта, видно, что в продукте отсутствуют даже самые незначительные структурные и молекулярные изменения.
Способ настоящего изобретения позволяет получать приблизительно 50% от количества исходного продукта, что можно сравнить с расчетными 10% извлеченного количества, получаемого другими способами.
Способ настоящего изобретения прост в осуществлении, включает ограниченное число ручных манипуляций, и, таким образом, материал имеет более низкий риск загрязнения по сравнению с известными способами, поскольку для его осуществления необходимо сборное устройство из подходящих фильтров, находящееся в герметичном контейнере для стерильных изделий ("боксе") и соединение со сборником, снабженное перекачивающей системой. Рассматриваемая последовательность операций может быть полностью выполнена в ламинарном вытяжном шкафу класса II с биозащитой. Содержание белка в получаемых образцах составляет от 0 до 0,016 мг/мл. Эти данные были рассчитаны на основании значений, полученных в 21 различных опытах по фильтрованию, выполненных в течение 2 лет, и представлены в следующей Таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Содержание белка в различных образцах, полученных в соответствии со способом настоящего изобретения. Среднее: 0,090846 | |
| (Очистка внутренний номер) | Белки (мг/мл) |
| 1 | 0,0072 |
| 2 | 0,0087 |
| 3 | 0,0179 |
| 4 | 0,0095 |
| 5 | 0,0116 |
| 6 | 0,0121 |
| 7 | 0,0077 |
| 8 | 0,0062 |
| 9 | 0,0098 |
| 10 | 0,0118 |
| 11 | 0,0125 |
| 12 | 0,0124 |
| 13 | 0,0138 |
| 14 | 0,0089 |
| 15 | 0,0120 |
| 16 | 0,0131 |
| 17 | 0,0088 |
| 18 | 0,0063 |
| 19 | 0,0110 |
| 20 | 0,0157 |
| 21 | 0,0079 |
Способ настоящего изобретения включает два этапа:
1) Растворение порошка AG в растворе хлорида натрия, контроль рН и пропускание через три гидрофильных фильтра.
Предпочтительно, в качестве гидрофильного фильтрующего материала применяют ацетат целлюлозы или другие коммерчески доступные фильтры, например, фильтры марки "zetaplus" Cuno с размерами пор, составляющими от 1 микрона до 0,1 микрона, имеющие широкую фильтрующую поверхность, например, такие как фильтры, используемые авторами настоящего изобретения, преимуществом которых является снижение давления фильтрования, отсутствие модификации продукта и удаление фрагментов клеток и так называемых "инертных" микрочастиц. Продукт, получаемый таким образом, является стерильным и в любом случае имеет содержание эндотоксинов, превышающее 100 EU/г;
2) уникальность второго этапа состоит в удалении остаточных эндотоксинов на гидрофобном нейлоновом фильтре, имеющем положительный электрический заряд, который позволяет связывать отрицательную часть липополисахарида, что позволяет не использовать осаждение растворителем или другие методики и получать продукт, который может быть использован в различных областях, имеющий содержание эндотоксинов, всегда составляющее менее 30 EU/г.
Настоящее изобретение может быть использовано в области биотехнологий, включающих трансплантацию, в частности, для получения AG микрокапсул, на которые подходящим образом может быть нанесено покрытие, содержащее полиаминокислоты и разбавленный AG, которое, как было показано, обеспечивают иммунную защиту трансплантированных островков от воздействия клеток иммунной системы хозяина. Уже в течение нескольких лет изобретатели исследуют применение трансплантированных микрокапсулированных панкреатических островков в лечении сахарного диабета 1 типа (инсулинозависимого диабета или T1DM), и это исследование отражено во множестве научных публикаций, в основном, международных. Кроме того, благодаря чистоте и высокой биосовместимости применяемых материалов Итальянский институт Istituto Superiore di Sanita разрешил авторам настоящего изобретения начать I фазу клинических исследований, связанных с трансплантацией микрокапсулированных панкреатических островков человека пациентам, страдающим T1DM, не получающим фармакологических иммуносупрессивных препаратов. Результаты, полученные к настоящему моменту, показывают, что микрокапсулы, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют высокую биосовместимость, и эффективность применения продукта была оценена в различных международных исследовательских лабораториях.
СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Примеры
Для приготовления ультрачистого раствора альгината натрия с содержанием эндотоксинов, не превышающим 20 EU/г, требуются следующие материалы:
- Химический стакан из пирекса,
- Мерные цилиндры из пирекса,
- Магнитная мешалка,
- Силиконовая трубка HW 155 - внутренний диаметр 5, внешний диаметр 8,
- Перистальтический насос,
- Стерильные пипетки,
- Сертифицированные не содержащие эндотоксина стерильные бутылки,
- Фильтры из ацетата целлюлозы фармацевтической марки 30, 60 и 90, содержащие вспомогательный материал для фильтрования, включающий диатомит и перлит, высотой 20 дюймов (50,8 см) и диаметром 12 дюймов (30,48 см),
- Фильтры, содержащие фильтрующую мембрану из модифицированного зарядом Нейлона 66 с размером пор 0,2 мкм, высотой 20 дюймов (50,8 см) и диаметром 8 дюймов (20,32 см),
- Герметичный контейнер для стерильных изделий из нержавеющей стали AISI316 для фильтрующего картриджа высотой 20 дюймов (50,8 см) и диаметром 12 дюймов (30,48 см),
- Герметичный контейнер для стерильных изделий из нержавеющей стали AISI316 для фильтрующего картриджа высотой 20 дюймов (50,8 см) и диаметром 8 дюймов (20,32 см).
Методика изготовления ультрачистого раствора альгината натрия, содержащего не более 20 EU/г эндотоксина, включает следующие этапы:
Стерилизация "Боксов", фильтров и используемых материалов
Стеклянные контейнеры (градуированные химические стаканы, мерные цилиндры, бутылки и т.д.), соединительные силиконовые трубки, контейнеры для стерильных изделий из нержавеющей стали AISI316, называемые "Боксами", и любые другие материалы (магнитные крепления, стеклянные стержни и т.д.), используемые при приготовлении раствора альгината и при проведении этапов фильтрования, обрабатывают в течение 24 часов 1%-ным раствором этоксата (etoxate) (E-Toxa-Clean®, Номер по каталогу Е9029, Sigma-Aldrich, Milan, Italy), затем тщательно промывают деионизованной водой и, наконец, автоклавируют при 120°С в течение 1 часа. Целлюлозные фильтры фармацевтической марки 30, 60 и 90, имеющие размер пор 0,2 мкм, и картридж, содержащий фильтрующую мембрану из модифицированного зарядом Нейлона 66 с размером пор 0,2 мкм, автоклавируют отдельно от Бокса при 120°С в течение 1 часа.
Приготовление 1,8%-ного раствора AG
Используемый AG (натриевая соль альгиновой кислоты (Е400)) представлял собой материал Keltone® LVCR (Keico) с низкой вязкостью, предоставляемый изготовителем Monsanto-KeIco (20N Wacker Dr, Chicago IL USA) в виде ультрачистого порошка. Химический состав порошка альгината описывается фракциями (FG или FM) и отношением M/G, и альгинат, используемый авторами настоящего изобретения, имел следующие параметры, определяемые анализом ЯМР (ядерный магнитный резонанс): доля М - 52,26%, доля G - 47,74% и отношение M/G - 1,093. Все процедуры приготовления 1,8%-ного раствора альгината производят в ламинарном вытяжном шкафу класса II с биозащитой. После взвешивания, порошок альгината помещают в химический стакан, и к нему медленно, при умеренном перемешивании магнитной мешалкой с магнитным креплением, избегая образования комков, добавляют физиологический раствор (0,9% NaCl) (используют стерильный, анитипирогенный физиологический раствор, специально предназначенный для инъецируемых препаратов) до получения гомогенного раствора.
Фильтровальная система (Бокс)
Для использования в бокс помещают подходящий фильтр; при этом всю указанную операцию проводят в вытяжном шкафу с биозащитой, и указанный фильтр герметизируют и помещают на специальную опору. К выпускному и впускному отверстиям бокса присоединяют силиконовые трубки. Трубка, находящаяся на впускном отверстии фильтровального устройства пристыкована к перистальтическому насосу, в то время как ее свободный конец погружен в химический стакан, содержащий раствор альгината. Свободный конец силиконовой трубки, находящейся на выпускном отверстии фильтровальной системы, помещен в стерильную бутылку для сбора материала.
Фильтрование
Раствор пропускают через 4 различных этапа фильтрования, каждый из которых выполняют в фильтровальной системе, заключенной в "Бокс", и без перерывов.
При выполнении первого этапа раствор фильтруют через капсулу из целлюлозного волокна фармацевтической марки 30 (номинальный размер пор 2 мкм). При помощи перистальтического насоса бокс заполняют приблизительно 7 литрами продукта и начинают сбор фильтрата. Скорость перекачивания насосом устанавливают очень небольшой для лучшего взаимодействия между материалом и фильтром, и фактическое давление внутри бокса устанавливают приблизительно равным 1,5 бар (1,5×105 Па). Первую фракцию фильтрата, примерно составляющую 2 литра, отбрасывают из-за повышенного содержания экстрагированных веществ. Остаток собирают в стерильные пластиковые бутылки, сертифицированные на отсутствие эндотоксинов.
При выполнении второго этапа фильтрования используют капсулу из целлюлозного волокна фармацевтической марки 60 (номинальный размер пор 2 мкм). Скорость перекачивания насосом в этом случае также устанавливают таким образом, чтобы давление в фильтровальной системе составляло 1,5 бар (1,5×105 Па). Сбор осуществляют в пластиковые бутылки типа, описанного выше.
При выполнении третьего этапа фильтрования используют капсулу из целлюлозного волокна фармацевтической марки 90 (номинальный размер пор 2 мкм). Скорость перекачивания насосом в этом случае также устанавливают таким образом, чтобы давление в фильтровальной системе составляло 1,5 бар (1,5×105 Па). Сбор осуществляют в пластиковые бутылки типа, описанного выше.
При выполнении четвертого и последнего этапа фильтрования используют картридж, содержащий модифицированную зарядом фильтрующую мембрану из Нейлона 66 с размером пор 0,2 мкм. В этом случае давление, создаваемое перистальтическим насосом, устанавливают приблизительно равным 0,3-0,5 бар (0,3-0,5×105 Па), контролируя скорость насоса. В этом случае фильтрат собирают в стеклянные бутылки, предварительно обработанные таким образом, что они не содержат эндотоксинов и стерилизованные в автоклаве при 120°С в течение 1 часа.
Оценка свойств конечного продукта
Пример 2
В аликвотах полученного продукта были проведены следующие анализы: анализ на присутствие эндотоксинов производили, отбирая подходящую аликвоту и направляя ее в Компанию, специализирующуюся в обнаружении эндотоксинов при помощи способа Limulus (Lonza Verviers, SPRL); анализ на содержание белка производили способом Брэдфорда (Bradford); значение рН оценивали при +4°С и при +20°С с помощью микрометрического способа, а химический состав и относительное содержание мономерных фракций определяли с помощью ЯМР анализа. Было обнаружено, что содержание эндотоксинов составляет менее 20 EU/г. Наличие тяжелых металлов и стерильность продукта оценивали в соответствии со стандартными протоколами.
Настоящее изобретение может быть использовано в области биотехнологий, включающих трансплантацию. В частности, в случае настоящего изобретения, было показано, что AG микрокапсулы, на которые подходящим образом может быть нанесено покрытие, содержащее полиаминокислоты и разбавленный AG, обеспечивают иммунную защиту клеток от воздействия иммунной системы хозяина. Уже в течение нескольких лет авторы исследуют в своей лаборатории применение трансплантированных микрокапсулированных панкреатических островков в лечении сахарного диабета 1 типа (инсулинозависимого диабета), и это исследование отражено во множестве научных публикаций, в основном, международных. Кроме того, благодаря чистоте и высокой биосовместимости применяемых материалов, Итальянский институт Istituto Superiore di Sanita разрешил авторам настоящего изобретения начать I фазу клинических исследований, связанных с трансплантацией микрокапсулированных панкреатических островков человека индивидуумам, страдающим диабетом, не получающим фармакологических иммуносупрессивных препаратов. Результаты, полученные к настоящему моменту, показывают, что микрокапсулы, получаемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют высокую биосовместимость, и эффективность применения продукта была оценена в различных международных исследовательских лабораториях.
Капсулы и искусственные внеклеточные матрицы для выращивания и дифференцировки различных клеточных штаммов
Стандартная рабочая процедура (SOP) для получения микрокапсул из альгината/полиорнитина (AG/PLO) с использованием альгината натрия, получаемого в соответствии с настоящим изобретением
Реактивы
- стерильный и антипирогенный физиологический раствор;
- 1,2%-ный раствор CaCl2 в дистиллированной воде;
- раствор цитрата Na в дистиллированной воде концентрацией 55 мМ;
- 0,12% м 0,06% растворы полиорнитина в физиологическом растворе; (вышеуказанные растворы были стерилизованы фильтрованием)
- 1,6% NAG, полученный при помощи описанного выше способа фильтрования;
- 0,05% NAG, полученный разбавлением 1:10 вышеуказанного раствора в физиологическом растворе.
Способ
Островки промывали физиологическим раствором для удаления содержащегося белка.
Затем на каждый мл гранул добавляли 0,5 мл физиологического раствора и 10 мл 1,6% NAG, и суспензию доводили до гомогенного состояния.
Скорость перистальтического насоса устанавливали равной 15 мл/мин, а расход воздуха - 5 л/мин, и сначала через систему пропускали физиологический раствор.
В 250 мл химический стакан, содержащий 200 мл 1,2% CaCl2, собирают микрокапли альгината, которые при образовании геля образуют альгинатные микрокапсулы, содержащие островки. Критическим параметром является расстояние от иглы до мениска раствора CaCl2, которое должно приблизительно составлять 3 см. Капсулы оставляют на 5 минут в CaCl2, затем 100 мл 1,2%-ного CaCl2 заменяют физиологическим раствором и снова оставляют на 5 минут. Затем, после повторных промывок физиологическим раствором, капсулы переносят в пробирку объемом 50 мл. Затем последовательно добавляют следующие реагенты в количестве, в два раза превышающем объем, занимаемый капсулами, каждый раз удаляя вещество, добавленное в предыдущем этапе, перемешивая и проводя промывку физиологическим раствором между добавлением реагента и другого подходящего вещества:
0,12% полиорнитин в течение 10 минут;
0,06% полиорнитин в течение 5 минут;
0,1% NAG в течение 6 минут;
55 мМ цитрата Na в течение 2 минут.
Серию повторных промывок проводят дважды, что позволяет, с одной стороны, удалить реагенты или осколки клеток, а, с другой стороны, удалить большую часть более мелких, пустых или разрушенных капсул, которые вследствие их меньшей массы медленнее оседают на дно сосуда. По окончании указанной обработки, капсулы повторно суспендируют в среде CMRL 1066. Перед имплантацией капсулы промывают физиологическим раствором, в котором их также повторно суспендируют при проведении имплантации.
1. Способ получения растворов солей альгината, не подвергшихся структурной модификации, содержание эндотоксинов в которых составляет не более 20 EU/г, включающий следующие этапы:
a) добавление порошка технического альгината к солевому раствору для получения раствора альгината, концентрация которого составляет от 1,6 до 2,0% масс. и доведение показателя pH до значений, составляющих 7,4-7,6;
b) фильтрование раствора альгината, полученного при выполнении этапа a) на по меньшей мере одном гидрофильном фильтре и извлечение отфильтрованного раствора альгината; и
c) фильтрование отфильтрованного раствора альгината, полученного при выполнении этапа b), на модифицированном зарядом гидрофобном нейлоновом фильтре, и извлечение раствора альгината, содержание эндотоксинов в котором составляет менее 20 EU/г.
2. Способ по п. 1, в котором порошок альгината представляет собой порошок альгината натрия.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором состав альгината включает 52,26% звеньев D-маннуроновой кислоты (-M-) и 47,74% звеньев L-глюкуроновой кислоты (-G-), что соответствует отношению M/G, составляющему 1,093.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором применяемый альгинат представляет собой Keltone® LVCR.
5. Способ по п. 3, в котором применяемый альгинат представляет собой Keltone® LVCR.
6. Способ по п. 1, в котором фильтрование выполняют на трех гидрофильных фильтрах, изготовленных из гидрофильных ацетатов целлюлозы.
7. Способ по п. 6, в котором первый из трех фильтров представляет собой фильтр фармацевтического класса 30 с номинальным размером пор, равным 2 мкм, второй из трех фильтров представляет собой фильтр фармацевтического класса 60 с номинальным размером пор, равным 2 мкм, и третий из трех фильтров представляет собой фильтр фармацевтического класса 90 с номинальным размером пор, равным 2 мкм.
8. Способ по п. 1, в котором модифицированный зарядом гидрофобный фильтр представляет собой фильтр из Нейлона 66, имеющий положительный электрический заряд.
9. Солевой раствор альгината, получаемый способом по пп. 1-8.
10. Альгинат натрия, получаемый в растворе по п. 9.
11. Применение раствора альгината натрия по п. 9 и/или альгината натрия по п. 10 для изготовления медицинских устройств для парентерального введения в организм человека в составе трансплантатов.
12. Применение по п. 11, в котором указанные устройства представляют собой микрокапсулы альгината-полиорнитина, которые используют в составе клеточных трансплантатов человека.
