Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр



Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр
Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной ср-гена potato virus y методом от-пцр

 

C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2562106:

Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)

Изобретение относится к биохимии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров, инициирующий амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР. Набор представлен следующими праймерами - «PVY-CP-f1»: 5′-СТТАТGААGТАСАССАТСААG-3′ и «PVY-CP-r2»: 5′-TACAGGAAAAGCCAAAATACT-3′. Изобретение позволяет оценить полиморфизм концевых последовательностей гена оболочечного белка данного вируса. 4 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной диагностике и представляет собой сконструированный набор праймеров, инициирующий амплификацию полной нуклеотидной последовательности гена оболочечного белка (coat protein gene, CP) Y-вируса картофеля (Potato virus Y, PVY) методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Сфера применения изобретения: скрининг РVY-позитивных образцов пробирочных и полевых растений картофеля, а также решение научно-исследовательских задач по изучению генетического разнообразия данного вирусного патогена.

Существуют различные наборы праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР. Так, при использовании пары праймеров («fwd_seq»: 5′-GCAAATGACACAATTGAT-GC-3′ и «rev_seq»: 5′-TCACATGTTCTTGACTCCAAG-3′), отобранных S. Zheng & Z. Liu (2006) [1], достигается амплификация нуклеотидной последовательности СР-гена Y вируса картофеля. Однако, ввиду того, что данные праймеры [1] фактически фланкируют последовательность СР-гена, не представляется возможным оценить уровень полиморфизма его концевых участков с помощью последующей процедуры прямого секвенирования полученного ПЦР-продукта размером 804 bp, так как концевые участки амплификата будут полностью соответствовать нуклеотидным последовательностям праймеров.

В тоже время, знание молекулярного разнообразия концевых последовательностей СР-гена имеет принципиальное значение, поскольку именно концевые аминокислотные последовательности оболочечного белка (СР), детерминируемые нуклеотидной последовательностью СР-гена, определяют эффективность диагностики данного патогена при применении иммунобиологических методов исследования. Известно, что иммунологически-активными являются именно N- и С-концевые участки СР PVY. Данные концевые области экспонированы на поверхности вирусной частицы. Так, С-концевые участки содержат 18-20 аминокислотных остатков, N-концевые области - от 30 до 67 аминокислот. Наибольшая вариабельность характерна для N-концевых участков, а для С-областей характерны незначительные замены в 1-2 аминокислоты [2].

Цель изобретения - конструирование набора олигонуклеотидных праймеров, инициирующего амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена PVY методом ОТ-ПЦР, обеспечивающего возможность оценки полиморфизма концевых последовательностей гена оболочечного белка данного вируса.

Нами сконструирован набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности гена оболочечного белка Y-вируса картофеля методом обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции, отличающийся от прототипа [1] тем, что используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров, а именно:

инициирующие амплификацию полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato Virus Y с генерацией ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp, фланкированного по концам локусами NIb-гена и 3′-UTR, что обеспечивает возможность оценки полиморфизма концевых последовательностей СР-гена PVY.

Условия проведения реакции.

Для теоретического обоснования работоспособности сконструированных нами праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» были проведены практические исследования, направленные на доказательство эффективности амплификации ожидаемого специфичного ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp.

Экстракция нуклеиновой кислоты из исследуемого материала растений картофеля, инфицированных PVY, осуществлялась сорбционным способом («Рибосорб», ЦНИИЭМ, Россия).

ОТ-ПЦР выполняли согласно протоколам, представленным в табл. 1 и 2.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе Mastercycler GRADIENT (Eppendorf, Германия).

Детекцию результатов ОТ-ПЦР осуществляли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1.

Фланкируемые участки праймеров, используемых для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato virus Y

Пояснение к фиг. 2.

Электрофореграмма результата тестирования праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» в градиентной ОТ-ПЦР с температурой отжига 53°C-60°C.

Обозначение: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-8) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y: 1) Ta=53°C; 2) Та=54°C; 3) Ta=55°C; 4) Та=56°C; 5) Ta=57°C; 6) Ta=58°C; 7) Ta=59°C; 8) Та=60°C.

Пояснение к фиг. 3.

Электрофореграмма результата ОТ-ПЦР с праймерами «fwd_seq»+«rev_seq» и «PVY-CP-fl »+«PVY-CP-r2».

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-2) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y: 1) ОТ-ПЦР с праймерами «fwd_seq»+«rev_seq» [амплификация специфичного фрагмента длиной 809 bp] (S. Zheng & Z. Liu, 2006). 2) ОТ-ПЦР с праймерами «PVY-CP-fl»+«PVY-СР-r2» [амплификация специфичного фрагмента длиной 890 bp] (предложенный набор праймеров).

Пояснение к фиг. 4.

Электрофореграмма результата ОТ-ПЦР с праймерами PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» исследуемых образцов картофеля.

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим). 1-2) Исследуемые образцы картофеля: 1) сорт Сказка, 2) Сорт Жуковский ранний, 3) Положительный контрольный образец (ПКО): сорт картофеля Невский, инфицированный Potato virus Y.

Пояснение к фиг. 5.

Нуклеотидные последовательности 5/-терминального (а) и 3′-терминального фрагментов СР-гена изолятов PVY. Представлено сравнение с прямым («fwd_seq»), и обратным («rev_seq») праймерами-аналогами.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию сконструированного набора праймеров «PVY-CP-fl» и «PVY-CP-r2» для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato virus Y нами получен обеспечиваемый заявленным набором олигонуклеотидных праймеров технический результат, выраженный в эффективной генерации ожидаемого специфичного ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp у PPY-позитивных образцов растений картофеля.

Полученный набор праймеров был использован для определения нуклеотидной последовательности СР-гена изолятов, выделенных на территории Среднего Поволжья и прилегающих регионов России. Эффективность разработанных праймеров была подтверждена в ходе секвенирования, при котором были выявлены однонуклеотидные замены в 5 - (фиг. 5а) и 3′-терминальных участках (фиг. 5б), которые невозможно обнаружить с помощью праймеров-аналогов.

Анализ результатов секвенирования ДНК подтвердил целесообразность применения разработанных праймеров. В 5′- и 3′-терминальных районах СР-гена был выявлен однонуклеотидный полиморфизм C2G и C792T, а также обнаружено несоответствие между структурой праймера «fwd_seq» и нуклеотидной последовательностью всех исследованных изолятов в позиции T15C.

Источники информации

1. National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: EF063710 - Potato vims Y isolate SL053 coat protein (cp) gene, partial cds // Zheng, S. and Liu, Z. - Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2010, - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ EF063710, свободный.

2. Гнутова, Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений / Р.В. Гнутова // М.: Наука, 1993. - 301 с.

Набор праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности СР-гена Potato virus Y методом ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что используются другие последовательности олигонуклеотидов:
«PVY-CP-f1»: 5′-CTTATGAAGTACACCATCAAG-3′ (SEQ ID NO:1)
«PVY-CP-r2»: 5′-ТАСАGGААААGССААААТАСТ-3′ (SEQ ID NO:2),
инициирующие амплификацию полной нуклеотидной последовательности гена оболочечного белка Potato virus Y с генерацией ОТ-ПЦР-продукта размером 890 bp.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой дипептид-продуцирующую бактерию рода Escherichia, которая модифицирована таким образом, что она содержит ДНК, кодирующую белок с дипептид-синтезирующей активностью.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus, где указанный вариант субтилизина является зрелой формой, обладающей активностью субтилизина и содержащий замену в положениях 118 и 213, где нумерация положений соответствует аминокислотной последовательности субтилизина BPN′ В.

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии. Описано получение синтетических генов D3S, D3E и D3D, оптимизированных для гетерологичной экспрессии в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложен выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) в присутствии антигенпредставляющих клеток (АПК), несущих HLA-A*2402, и представляющий собой фрагмент белка FOXM1.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, молекулярной генетики и клеточной биологии, в частности к применению ДНК-конструкции для индуцирования в мезенхимных стволовых клетках выраженного адаптивного ответа.

Настоящее изобретение относится к миметикам ПАР и способу их получения для создания новых медицинских препаратов общей формулы где Y - остаток нуклеозида, аминопроизводного алифатического соединения, флуоресцентного красителя; Z - остаток нуклеозида, (k+1)·m=1-200; X является О или S; R1 и R2 являются остатком дисахаридного нуклеозида или остаток формул где n=2-6; 2-6 или 1-4 соответственно, N=остаток нуклеозида, или -((CH2)nO)m-(P=X(OH))O-N-, где n=2-6, m=1-6, R3 представляет собой разветвитель формулы где N′- остаток дисахаридного нуклеозида, n число до 100, или остаток формул n=2-6; или n=2-6; или n=1-4 где В=аденин-9-ил, урацил-1-ил, цитозин-1-ил или гуанин-9-ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к использованию антисмыслового олигонуклеотида ISIS 301012 для долгосрочного понижения уровней АроВ, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к генной инженерии, а также к медицине, а именно к нейрохирургии и травматологии. Описана геннотерапевтическая конструкция, кодирующая эндотелиальный сосудистый фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF-2).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения растения с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей по сравнению с диким видом растения путем снижения экспрессии/функции белка-фактора транскрипции у растения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к кодон-оптимизированным последовательностям ДНК. Заявлены кодон-оптимизированные кДНК, кодирующие фактор стромальных клеток 1 альфа и сосудистый эндотелиальный фактор роста изоформы 165, а также содержащая их рекомбинантная плазмида.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к соединениям и композициям для ослабления экспрессии гентингтина. Заявлены варианты одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида, ингибирующего экспрессию гентингтина. Олигонуклеотид содержит гэп-сегмент из десяти дезоксинуклеозидов, 5′-фланкирующий сегмент из пяти нуклеозидов и 3′-фланкирующий сегмент из пяти нуклеозидов. Гэп-сегмент расположен между 5′- и 3′-фланкирующими сегментами, где все нуклеозиды фланкирующих сегментов содержат 2′-O-метоксиэтил-модифицированный сахар. Межнуклеозидные связи в гэп-сегменте, связи, соединяющие гэп-сегмент с 5′- или 3′-фланкирующим сегментом, и связи для самого крайнего с 5′-конца и самого крайнего с 3′-конца нуклеозидов каждого из фланкирующих сегментов являются фосфоротиоатными связями; межнуклеозидные связи, соединяющие остальные нуклеозиды обоих фланкирующих сегментов, являются фосфодиэфирными связями. Все цитозины являются 5-метилцитозинами. Также заявлены композиция и способы для лечения, профилактики, замедления или облегчения болезни Гентингтона или ее симптомов. Изобретение позволяет повысить ингибирующую активность в ингибировании экспрессии гентингтина. 10 ил., 95 табл., 21 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ получения представляющего интерес белка, включающему введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные Tol1 или Tol2 последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего СНО, адаптированную к суспензионному культивированию, или клетку PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.Р2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0), или клетку мышиной миеломы NS0, адаптированную к суспензионному культивированию; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего; при этом суспензионная клетка млекопитающего способна экспрессировать представляющий интерес белок, а также предложены способ получения клетки млекопитающего, соответствующая рекомбинантная клетка и применение вектора экспрессии. 6 н. и 23 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии и генной терапии и может быть использовано для стимуляции роста и регенерации нервов и восстановления иннервации ишемизированных тканей. Изобретение представляет собой способ стимуляции восстановления иннервации поврежденной ткани у млекопитающих с использованием оптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих гена, кодирующиего активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназу, uPA). Изобретение также касается плазмидной конструкции, содержащей указанный оптимизированный ген урокиназы и последовательность Козак. Изобретение позволяет ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм и ишемии путем трансфекции мышц, иннервируемых поврежденным нервом. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Предложен способ доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, предусматривающий трансфекцию методом кальций-фосфатной преципитации в присутствии гистона Н1.3 в эффективном количестве. Способ повышает эффективность трансфекции. 9 ил.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к антисмысловым олигомерам, используемым в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения мышечной дистрофии. Антисмысловой олигомер состоит из нуклеотидной последовательности, 100% комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени или нуклеотидной последовательности, в которой 1 или 2 нуклеотида, не комплементарные нуклеотидной последовательности-мишени, содержатся в нуклеотидной последовательности, 100% комплементарной нуклеотидной последовательности-мишени. Нуклеотидная последовательность-мишень представляет собой любую из последовательностей, состоящую из нуклеотидов с 32-го по 56-й или с 36-го по 56-й с 5′-конца 53-го экзона в гене дистрофина человека. При этом 53-й экзон в гене дистрофина человека обладает нуклеотидной последовательностью, выбранной из (a) и (b): (a) нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1 и (b) нуклеотидная последовательность, обладающая по меньшей мере 90% идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Данный олигомер эффективно обеспечивает вызов пропуска 53-го экзона в гене дистрофина человека. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 19 ил., 7 табл., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлен лиганд гликопротеина VI (GPVI), представляющий собой нуклеиновую кислоту, который взаимодействует с гликопротеином тромбоцитов GPVI и модулирует его активность с регуляцией функции тромбоцитов. Лиганд имеет вторичную структуру, содержащую в направлении от 5′ к 3′ первый стебель, первую петлю, второй стебель, вторую петлю, третью петлю, третий стебель и четвертую петлю. Четвертая петля содержит UAA. Последовательность лиганда модифицирована для увеличения устойчивости к нуклеазам. Лиганд может применяться для ингибирования агрегации тромбоцитов. Также представлены модуляторы, ингибирующие активность лиганда, с восстановлением функции GPVI. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим лиганд или модулятор, предназначенным для лечения опосредуемых тромбоцитами нарушений. 8 н. и 15 з.п. ф-лы, 39 ил., 7 табл., 8 пр.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии. Сущность изобретения состоит в подавлении активности активированного онкогена AML-ETO методом РНК-интерференции в злокачественных кроветворных клетках, полученных от больных лейкозом, с использованием конструкции малой шпилечной РНК, встроенной в лентивирусный вектор pLSLP-AML-ETO-shRNA, кодируемой нуклеотидной последовательностью двухцепочечной ДНК, представляющей собой: 5′-р-gatccgCCTCGAAATCGTACTGAGActtcctgcaa TCTCAGTACGATTTCGAGGtttttg-3′ (смысловая цепь), 5′-р-aattcaaaaaCCTCGAAATCGTACT GAGAttgcaggaagTCTCAGTACGATTTCGAGGcg-3′ (антисмысловая цепь). Ингибирование активности конкретного онкогена посредством малой шпилечной РНК позволяет определить спектр изменения экспрессии генов, ответственных за рост и дифференцировку кроветворных клеток, и обнаружить те из них, изменение активности которых напрямую связано с активацией данного онкогена, и определить, в какой мере воздействие на такие гены - потенциальные мишени оказывает влияние на способность злокачественных клеток к неконтролируемому росту. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл. 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулам нуклеиновой кислоты для модуляции экспрессии генов-мишеней. Заявлена двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты для ингибирования экспрессии гена белка теплового шока 47 (hsp47). Также представлены композиция, включающая указанную молекулу нуклеиновой кислоты, и способ лечения пациента, страдающего от заболевания, связанного с hsp47. Изобретение может быть использовано для лечения ассоциированных с hsp47 состояний и нарушений, таких как фиброз печени, фиброз легких, фиброз брюшины и фиброз почек. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 27 ил., 31 табл., 10 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный вариант субтилизина Bacillus. Изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариант субтилизина, вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину, способной экспрессировать вариант субтилизина, а также к чистящей композиции, содержащей вариант субтилизина и способу очистки. Изобретение позволяет получать вариант субтилизина с улучшенными моющими свойствами. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 17 табл., 17 пр.

Изобретение относится к биохимии. Раскрыты способы повышения экспрессии полинуклеотида PAR4, включающие осуществление контакта с по меньшей мере одним олигонуклеотидом длиной от 15 до 30 нуклеотидов, который нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотида PAR4, и при этом указанная природная антисмысловая последовательность имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Представлен синтетический модифицированный олигонуклеотид длиной от 15 до 30 нуклеотидов и фармацевтическая композиция, содержащая указанный олигонуклеотид. Раскрыт способ индукции апоптоза в биологической системе, экспрессирующей или с приобретенной способностью экспрессировать продукты генов PAR4, включающий введение олигонуклеотида длиной от 15 до 30 нуклеотидов в указанную систему, который нацелен на природную антисмысловую последовательность SEQ ID NO: 2 полинуклеотида PAR4 и повышает экспрессию указанного полинуклеотида PAR4. Изобретение позволяет повышать экспрессию полинуклеотида PAR4. 6 н. и 22 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 3 пр.
Наверх