Способ подготовки тканей клеща для биологических исследований
Изобретение относится к способу подготовки биологических материалов для проведения исследований, в частности подготовки тканей клеща для дальнейшего определения наличия в них вируса клещевого энцефалита, и может быть использовано в здравоохранении, биотехнологиях и иммунологии. Способ пробоподготовки тканей клеща включает промывку тканей клеща в 70-80%-ном растворе этилового спирта, его высушивание, помещение в пробирку, и затем растирание и центрифугирование. Перед растиранием в пробирку добавляют 100-200 мкл лизирующего буфера, а само растирание тканей клеща проводят в растворе в этой же пробирке. Полученный гомогенат центрифугируют в течение 2-10 мин при 2000-6000 об/мин. Способ позволяет обеспечить технологичность процесса без использования дорогостоящего оборудования. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 1 табл.
Изобретение относится к способам подготовки биологических материалов для проведения исследований, в частности подготовки тканей клеща для дальнейшего определения наличия в них вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), и может быть использовано в здравоохранении, биотехнологиях и иммунологии.
Известен способ подготовки биологического материала для ПЦР генамплифакационной диагностики, который заключается в лизисе образцов раствором NaI, содержащим РНК-носитель, осаждении вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК изопропанолом, центрифугировании и их очистке (патент RU №2134871, МПК G01N 1/28, G01N 1/30, опубл. 20.08.1999).
Известный способ является весьма специфичным и не может быть применен для подготовки тканей клеща, поскольку в процессе его осуществления разрушается белковая структура вируса, которая в дальнейшем необходима для проведения исследования.
В качестве прототипа был выбран способ выделения ВКЭ из клеща (интернет-ресурс: http://www.bio-ua.com/index.php/prod?i=l66&PHPSESSID=3fl72c88947d863e65bb76f2a0ff3bb2). Данный способ заключается в том, что ткани клеща промывают в 70-80%-ном растворе этилового спирта, высушивают с помощью фильтровальной бумаги, помещают в пробирку типа "Эппендорф" и плотно закрывают, затем помещают в жидкий азот для замораживания, далее замороженные ткани клеща растирают при помощи пестика для гомогенизации и, добавив раствор для разведения образцов, центрифугируют.
Основным недостатком известного способа является его нетехнологичность, заключающаяся в использовании в нем жидкого азота, для получения и хранения которого требуется узкоспециализированное оборудование.
Задачей заявляемого технического решения является создание технологичного способа пробоподготовки тканей клеща.
Технический результат, получаемый от использования изобретения, заключается в обеспечении простого и надежного процесса пробоподготовки тканей клеща без использования дорогостоящей техники и снижении трудозатрат на стадии гомогонезации клеща.
Технический результат достигается за счет того, что в способе пробоподготовки тканей клеща ткани клеща промывают в 70-80%-ном растворе этилового спирта, высушивают при помощи фильтровальной бумаги или любой другой бумажной салфетки плотной текстуры и помещают в пробирку, затем в пробирку с клещом добавляют 100-200 мкл лизирующего буфера и производят растирание тканей клеща в растворе в этой же пробирке, а полученный гомогенат центрифугируют в течение 2-10 мин при 2000-6000 об/мин.
Высушивание можно осуществлять при помощи фильтровальной бумаги или любого бумажного полотенца.
Растирание тканей клеща можно осуществлять при помощи скальпеля или пестика для гомогенизации.
Лизирующий буфер включает NaCl 145 мМ, Na2HPО4 10 мМ, KH2PО4 1,76 мМ, pH 7,4, NP-40 0,5%, казеин 2,5%, Проклин 300 0,1%.
Для каждого образца клеща следует использовать отдельный пестик во избежание контаминации. Для повторного использования пестик необходимо инактивировать: смочить в 95% этиловом спирте и поджечь на спиртовке, а затем остудить.
Подготовленные для анализа образцы тканей клещей можно хранить в течение 3 ч при температуре 2-8°C или в течение 3-х месяцев при температуре не выше минус 20°C.
Использование в заявляемом способе определенных диапазонов режимов центрифугирования обусловлено достижением требуемых параметров растворения тканей клеща. Результаты опытов приведены в таблице 1.
Поскольку одним из применений описанной пробоподготовки клеща является полимеразная цепная реакция, поэтому помимо визуальной оценки состояния надосадочной жидкости и осадка, проводили проверку получаемой надосадочной жидкости методом полимеразной цепной реакции. Анализ образца методом полимеразной цепной реакцией проводили следующим образом: к гомогенизированному образцу клеща добавляли плазмиду pQE30, содержащую ген GFP. Далее, к 5 мкл образца затем добавляли 5 мкл 5×ПЦР-буфера, 0,5 мкл 10 мкМ dNTP, 0,75 мкл 100 мМ MgCl2, 1 мкл 5 мкМ прямого праймера, 1 мкл 5 мкМ обратного праймера, 3 мкл 5 мкМ флуоресцентно меченной пробы, 1 ед.акт. ДНК-полимеразы. Смесь тщательно перемешивали на вортексе и проводили полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени по программе: 45 циклов: 95°C 15 сек, 60°C 30 сек. Флуоресцентную детекцию проводили при 60°C. Детектируемые прибором значения порогового цикла (Ct) использовали для оценки состояния надосадочной жидкости.
Из полученных данных видно, что при скорости центрифугирования 1000 об/мин в диапазоне продолжительности центрифугирования от 2 до 10 мин наблюдалось неполное осаждение фрагментов клеща, формирование неплотного (подвижного) осадка (что затрудняло отбор надосадочной жидкости без частиц осадка), что, в конце концов, приводило к сдвигу Ct в сторону больших циклов при анализе образца методом ПЦР.
В диапазоне скоростей центрифугирования от 2000 до 6000 об/мин при временах от 2 до 10 мин наблюдалось формирование прозрачной надосадочной жидкости, плотного осадка, приемлемые значения Ct при анализе образцов методом ПЦР.
При больших (более 6000 об/мин) значениях центрифугирования при продолжительности центрифугирования от 2 до 10 мин не наблюдалось заметных отличий получаемых результатов от тех, что получены при скорости центрифугирования 6000 об/мин при 2-10 мин.
Простота описанного способа обусловлена тем, что для его реализации требуется проведение 3 последовательных этапов: 1. Промывка клеща в 70% спирте, 2. Высушивание клеща фильтровальной бумагой или бумажным полотенцем, 3. Гомогенизация клеща в лизирующем буфере, в то время, как для реализации способов-аналогов требуется либо большее количество стадий (например, патент RU №2134871), либо привлечение специализированного оборудования для работы и хранения жидкого азота, специальных одноразовых гомогенизаторов, предназначенных для работы с жидким азотом, что не всегда реализуемо в условиях лаборатории (http://www.bio-ua.com/index.php/prod?i=166&PHPSESSID=3fl72c88947d863e65bb76f2a0ff3bb2).
Надежность реализации способа оценивали методом ПЦР. Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что в указанном диапазоне параметров центрифугирования образцы определялись как положительные.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Клеща промывают 70%-ным раствором этанола, выкладывают на чистую бумажную салфетку и высушивают клеща 2 минуты. Помещают в пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. В пробирку с клещом добавляют 150 мкл лизирующего буфера. Клеща в растворе тщательно гомогенизируют при помощи скальпеля. Полученную суспензию центрифугируют в течение 2 минут при 3000 об/мин.
Пример 2.
Клеща промывают 75%-ным раствором этанола, выкладывают на чистую бумажную салфетку и высушивают клеща 2 минуты. Помещают в пробирку типа «Эппендорф» объемом 0,6 мл. В пробирку с клещом добавляют 120 мкл лизирующего буфера. Клеща в растворе тщательно гомогенизируют при помощи скальпеля или пестика для гомогенизации клещей (каталожный №Е-9259 ЗАО «Вектор-Бест»). Полученную суспензию центрифугируют в течение 5 минут при 2000 об/мин.
Пример 3.
Пинцетом захватывают клеща и помещают в емкость с 80% этанолом, затем клеща перемещают на чистую сухую фильтровальную бумагу для высушивания клеща. Клеща переносят в одноразовую пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл. В пробирку с клещом добавляют 200 мкл лизирующего буфера. Клеща тщательно гомогенизируют при помощи пестика для гомогенизации клещей (каталожный №Е-9259 ЗАО «Вектор-Бест»).
Полученную суспензию перемешивают на Vortex в течение 30 секунд. Далее гомогенизат центрифугируют в течение 3 минут при 4000 об/мин.
Таким образом, заявляемый способ пробоподготовки тканей клеща позволяет обеспечить технологичность процесса без использования дорогостоящего оборудования.
1. Способ пробоподготовки тканей клеща, включающий промывку тканей клеща 70-80% раствором этилового спирта, его высушивание, помещение в пробирку, растирание и центрифугирование, отличающийся тем, что перед растиранием в пробирку добавляют 100-200 мкл лизирующего буфера, само растирание тканей клеща производят в растворе в этой же пробирке, а полученный гомогенат центрифугируют в течение 2-10 мин при 2000-6000 об/мин.
2. Способ пробоподготовки тканей клеща по п.1, отличающийся тем, что для высушивания используют фильтровальную бумагу.
3. Способ пробоподготовки тканей клеща по п.1, отличающийся тем, что для высушивания используют бумажное полотенце.
4. Способ пробоподготовки тканей клеща по п.1, отличающийся тем, что для растирания клеща используют пестик для гомогенизации.
5. Способ пробоподготовки тканей клеща по п.1, отличающийся тем, что для растирания клеща используют скальпель.