Способ уменьшения мультилекарственной резистентности с использованием трипирофосфата инозита
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения рака. Для этого субъекту, который в этом нуждается, последовательно вводят терапевтически эффективное количество триспирофосфата инозита (ITPP) и терапевтически эффективное количество химиотерапевтического агента, выбранного из агента, нацеленного на микротрубочки (доцетаксел, паклитаксел), ДНК-интеркалирующего агента (цисплатин, доксорубицин) и нуклеозидного метаболического ингибитора (гемцитабин, капецитабин). Причем ITPP вводят перед введением химиотерапевтического агента. Изобретение позволяет снизить дозу противоракового химиотерапевтического средства при последовательном введении ITPP и химиотерапевтических агентов за счет синергетического действия этих лекарственных средств. 13 з.п. ф-лы, 1 табл., 13 ил., 16 пр.
РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА
По данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США № 61/223 583, поданной 7 июля 2009 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак представляет собой одну из ведущих причин смерти в развитых странах и приводит к смерти более 500 000 человек в год только в Соединенных штатах. Более миллиону человек ставят диагноз рака в США ежегодно, и, по общей оценке, более чем у 1 из трех человек в течение их жизни разовьется та или иная форма рака. Солидные опухоли отвечают более чем за 85% смертности от рака.
Ангиогенез связан с рядом различных типов рака. Ангиогенез контролируется хорошо регулируемой системой ангиогенных стимуляторов и ингибиторов. Контроль ангиогенеза изменяется при некоторых болезненных состояниях, и, во многих случаях, патологическое повреждение, связанное с заболеваниями, связано с неконтролируемым ангиогенезом. Полагают, что и контролируемый, и неконтролируемый ангиогенез происходят сходным образом. Эндотелиальные клетки и перициты, окруженные базальной мембраной, формируют кровеносные капилляры. Ангиогенез начинается с эрозии базальной мембраны ферментами, которые высвобождаются эндотелиальными клетками и лейкоцитами. Эндотелиальные клетки, выстилающие просвет кровеносных сосудов, затем выпячиваются через базальную мембрану. Ангиогенные стимуляторы индуцируют миграцию эндотелиальных клеток через эрозированную базальную мембрану. Мигрирующие клетки образуют «побег» из родительского кровеносного сосуда, в котором эндотелиальные клетки претерпевают митоз и пролиферируют. Эндотелиальные побеги сливаются друг с другом с образованием капиллярных петель, формируя новый кровеносный сосуд.
Постоянный, нерегулируемый ангиогенез наблюдается при многих болезненных состояниях, метастазах опухолей и патологическом росте эндотелиальных клеток. Различные патологические болезненные состояния, при которых имеет место нерегулируемый ангиогенез, подразделяют на ангиогенез-зависимые и ангиогенез-ассоциированные заболевания.
Гипотеза о том, что опухолевый рост является ангиогенез-зависимым, впервые была предложена в 1971 г. В простейших терминах указанная гипотеза гласит: «После того как появилась опухолевая «прививка» каждому увеличению популяции опухолевых клеток должно предшествовать увеличение количества новых капилляров, конвергирующих на опухоли». Под опухолевой «прививкой» в настоящее время понимают преваскулярную фазу роста опухоли, при которой популяция опухолевых клеток, занимающая объем в несколько кубических миллиметров и не превышающая нескольких миллионов клеток, может выживать с использованием существующих микрососудов хозяина. Экспансия опухолевого объема за пределы указанной фазы требует развития новых капиллярных кровеносных сосудов. Например, легочные микрометастазы на ранней преваскулярной стадии у мышей не выявляются, только на гистологических срезах с использованием мощного микроскопа.
Ангиогенез связан с рядом различных типов рака, включая солидные опухоли и гематогенные опухоли. Солидные опухоли, с которым связан ангиогенез, включают, без ограничения, рабдомиосаркомы, ретинобластомы, саркому Эвинга, нейробластому и остеосаркому. Ангиогенез также связан с гематогенными опухолями, такими как лейкозы, любые из острых или хронических неопластических заболеваний костного мозга, при которых наблюдается неограниченная пролиферация белых кровяных клеток, обычно сопровождающиеся анемией, нарушением свертываемости крови и увеличением лимфатических узлов, печени и селезенки. Полагают, что ангиогенез играет роль в патологических состояниях костного мозга, которые вызывают лейкозы и множественные миеломные болезни.
Как упоминалось выше, ряд свидетельств указывает на то, что ангиогенез является существенным для роста и персистенции солидных опухолей и их метастазов. После стимуляции ангиогенеза в опухолях появляется повышающая регуляция продукции ряда ангиогенных факторов, включая факторы роста фибробластов (aFGF и bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста/фактор проницаемости сосудов (VEGF/VPF).
Роль VEGF в регуляции ангиогенеза была объектом интенсивного изучения. В то время как VEGF представляет критический, ограничивающий скорость этап физиологического ангиогенеза, он, как представляется, является также важным при патологическом ангиогенезе, таком как ангиогенез, связанный с опухолевым ростом. VEGF известен также как фактор проницаемости сосудов, на основании его способности индуцировать просачивание из сосудов. Несколько солидных опухолей производят достаточные количества VEGF, который стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, индуцируя, таким образом, неоваскуляризацию. Как было показано, экспрессия VEGF достоверно влияет на прогноз различных видов рака у людей. Напряжение кислорода в опухоли играет ключевую роль в регуляции экспрессии гена VEGF. Экспрессия мРНК VEGF индуцируется воздействием низкого напряжения кислорода в ряде патофизиологических обстоятельств.
Растущие опухоли характеризуются гипоксией, которая индуцирует экспрессию VEGF, а также может служить прогностическим фактором возникновения метастатической болезни. Известно также, что, в отличие от нормальных кровеносных сосудов, сосудистая сеть опухолей имеет патологическую организацию, структуру и функцию. Сосуды опухоли, как было также установлено, протекают, а кровоток является неоднородным и часто скомпрометированным.
Поскольку раковым клеткам для роста и метастазирования требуется доступ к кровеносным сосудам, полагают, что ингибирование ангиогенеза дает надежду на лечение раковых заболеваний и опухолей. Однако антиангиогенные стратегии были изучены к настоящему времени без обеспечения продолжительного терапевтического эффекта из-за получающихся в результате селекции резистентных к лекарственным средствам высокоагрессивных метастатических раковых клеток. Указанные антиангиогенные лекарственные средства, которые нарушают васкуляризацию опухоли, в некоторых случаях, как было установлено, усиливают метастатическую инвазию.
Таким образом, то, что действительно необходимо, это практически нетоксичная композиция и способ, которые могут регулировать сосудистую сеть опухоли. Также требуется улучшение терапии рака.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данные, представленные в примерах, указывают, что нормализация кровеносных сосудов в комбинации с химиотерапией является потенциально благоприятным подходом к лечению рака. Трисфосфат инозита (ITPP), аллостерический эффектор гемоглобина, усиливает высвобождение кислорода, противодействует эффектам гипоксии и ингибирует ангиогенез in vitro. В экспериментах на мышах ITPP в красных кровяных клетках (ITPP-RBC) уменьшает легочные метастазы, индуцированные внутривенной инъекцией клеток мышиной меланомы. ITPP, связанный с химиотерапевтическим агентами цисплатином и паклитакселом, ингибировали рост первичной меланомы и легочных метастазов. В экспериментах на крысах с аденокарциномой поджелудочной железы ITPP, использовавшийся в комбинации с гемцитабином, вызывал достоверное повышение коэффициента выживаемости экспериментальных животных, демонстрируя сильный аддитивный эффект. ITPP также достоверно усиливает инфильтрацию опухолей макрофагами и клетками натуральными киллерами.
Настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества ITPP и введение субъекту терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента после частичной сосудистой нормализации опухоли.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей триспирофосфат инозита (ITPP) и химиотерапевтический агент, такой как агент, выбранный из паклитаксела, цисплатина и гемцитабина.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к схеме лечения рака у субъекта, включающей введение, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества ITPP и химиотерапевтического агента, такого как агент, выбранный из паклитаксела, цисплатина и гемцитабина.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ITPP и субтерапевтическое количество химиотерапевтического агента.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к схеме лечения рака у субъекта, включающей введение, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества ITPP и субтерапевтического количества химиотерапевтического агента.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения рака, который является резистентным к одному или более химиотерапевтическим агентам, введением терапевтически эффективного количества ITPP. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак является резистентным к паклитакселу и/или цисплатину.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения гиперпролиферативного состояния, включающему введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества ITPP, в котором гиперпролиферативное состояние не является раком или характеризуется нежелательным ангиогенезом.
Настоящее изобретение относится также к способу усиления иммунного ответа у субъекта, включающему введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества ITPP, в котором субъект не страдает раком или другой опухолью.
Помимо этого, настоящее изобретение включает применение композиций, описанных в настоящем документе, в медицине и применение композиций, описанных в настоящем документе, для производства лекарственного средства для лечения состояния, описанного в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
ФИГ. 1 показывает селективное повышение давление кислорода в развитой подкожной меланоме, индуцированное ITPP-красными кровяными клетками (RBC). (А) Сравнение между нелеченной опухолью, имплантированной 14 днями ранее, и такой же опухолью, леченной с использованием ITPP, на день 12 и 13. Обратите внимание на уровень рО2 через 24 часа после инъекции ITPP. (В) Измерение рО2 с промежутками времени в подкожно имплантированной опухоли до и после интраперитонеальной инъекции ITPP. Обратите внимание на повышение давления кислорода через 30 мин после воздействия. (С) ITPP не влияет на рО2 в мышце. Интраперитонеально инъецированный ITPP повышает рО2 в гипоксической подкожной опухоли (нижняя кривая), но не влияет на рО2 в здоровой мышце (верхняя кривая). Данные от одного репрезентативного эксперимента из десяти, проведенных с использованием десяти мышей на группу.
ФИГ. 2 показывает, что снабжение кислородом посредством ITPP-RBC ингибирует легочные метастазы и реверсирует индуцированный гипоксией генный каскад у экспериментальных животных с меланомой. Измерения белка и ферментативной активности в лизатах легких мышей с меланомой, не получавших лечения (серый цвет), и леченных ITPP-RBC (черный цвет), по сравнению со здоровыми контролями (белый цвет), на день 27 после инокуляции меланомы: (a) Количественное определение легочных метастазов с использованием исследования с люциферазой. (b) Экспрессия HIF-1α. (c) Экспрессия VEGF. (d) Экспрессия Tie-2 и (e) Экспрессия НО-1, оценка посредством ELISA на день 19 после инъекции клеток меланомы. (f) Содержание мРНК LOX, оценка. Данные представляют собой средние величины, рассчитанные по 8-10 отдельным мышам на группу, от одного репрезентативного эксперимента из 5.
ФИГ. 3 показывает, что схема лечения ITPP может влиять на антиметастатическую активность, сосудистую нормализацию и уменьшение уровня клеток с мультилекарственной резистентностью у мышей с подкожной меланомой. (А) Эффект времени начала и продолжительности лечения ITPP до введения лекарственного средства на дни 20, 21. ITPP уменьшает метастазы, если его введение начинают на день 7, и является менее эффективным позднее, с увеличением метастазов при постоянном лечении. Анализ с люциферазой проводили на день 25. Данные представляют собой средние величины, рассчитанные по десяти отдельным мышам на группу, от одного репрезентативного эксперимента из 10. (В) Влияние лечения ITPP на нормализацию сосудов опухоли, по оценке на день 20, с использованием: (а) ядерного магнитного резонанса архитектуры сосудов в подкожных нелеченных опухолях по сравнению с леченными ITPP мышами. Обратите внимание на хорошо организованную сосудистую сеть (стрелки) после лечения ITPP (дни 9, 14, 18, 19) по сравнению с дезорганизованными прерывистыми сосудами (стрелки) в нелеченных опухолях; (b) иммунологического окрашивания перицитов вокруг нормализованных сосудов по сравнению с контролем с использованием анти-SMA антител.
ФИГ. 4 показывает чувствительность к химиотерапевтическим агентам in vitro клеток мышиной меланомы после гипоксии и реоксигенации и эндотелия мышиного легкого. Чувствительность клеток меланомы к химиотерапевтическим лекарственным средствам: (А) паклитакселу; (В) цисплатину устранена гипоксией. Это стало обратимым после реоксигенации клеток. (С) Оценка чувствительности эндотелиальных клеток к цисплатину.
ФИГ. 5 показывает, что оксигенация и сосудистая нормализация опухоли улучшает химиотерапию меланомы. (А) Комбинация ITPP, паклитаксела и цисплатина уменьшает метастазы, согласно хронологии лечения. Ликвидация легочных метастазов была получена после реинъекции ITPP (дни после 18, 19) до реинъекции лекарственных средств (дни 20 и 21). (а) = нелеченные; (b) = ITPP дни 7, 12, 16; (с) = «b» + лекарственные средства дни 7, 12, 16; (d) = «с» + ITPP дни 18, 19 + лекарственные средства дни 20, 21; (е) = ITPP дни 9, 14; (f) = «е» + лекарственные средства дни 9, 14; (g) = «f» + ITPP дни 18, 19 + лекарственные средства дни 20, 21; (h) = ITPP 11, 16; (i) = «h» + лекарственные средства дни 11, 16; (j) = «i» + ITPP дни 18, 19 + лекарственные средства дни 20, 21. Активность люциферазы анализировали на день 25. Данные представляют собой средние величины, рассчитанные по десяти отдельным мышам на группу, от одного репрезентативного эксперимента из 10. (В) Равномерное комбинированное влияние ITPP-индуцированной нормализации на активность химиотерапевтических лекарственных средств. Две группы мышей лечили с использованием ITPP на дни 9, 14 или дни 9, 14, 18, 19. Две группы леченных ITPP мышей получали паклитаксел и цисплатин на дни 20, 21. Опухоли окрашивали на день 25. (а) Иммунологическое окрашивание сосудов с использованием CD31 (a1) в нелеченных опухолях по сравнению с ITPP-леченными и леченными лекарственными средствами мышами в а2 и а3 CD31 + окрашивание соответствует некротическим участкам. (b) Окрашивание гематоксилин-эозином опухолей у мышей, леченных как в (а). Обратите внимание на эффективную некротическую деструкцию опухоли после лечения (а3, b3). Данные являются репрезентативными для экспериментов, осуществленных с использованием 10 мышей на группу.
ФИГ. 6 показывает влияние лечения ITPP на выживаемость крыс с опухолью поджелудочной железы по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином или плацебо. В группе, получавшей ITPP, крыс с опухолью поджелудочной железы лечили ITPP (1,5 мг/кг) еженедельно, в течение периода времени с дня 14 по день 49. В группе, получавшей гемцитабин, крыс с опухолью поджелудочной железы лечили гемцитабином (100 мг/кг) в дни 16, 18 и 20. Животные в контрольной группе не получали лечения.
ФИГ. 7 показывает влияние на выживаемость крыс с опухолью поджелудочной железы при использовании триспирофосфата гекса-натрий-миоинозита (OXY111A) в комбинации с гемцитабином, по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином и плацебо. В группе комбинированного лечения крыс с опухолью поджелудочной железы лечили ITPP (1,5 мг/кг) в комбинации с гемцитабином (25 мг/кг или 50 мг/кг) еженедельно в течение периода времени с дня 14 по день 49. В группе лечения гемцитабином крыс с опухолью поджелудочной железы лечили гемцитабином (100 мг/кг) на дни 16, 18 и 20. Животные в контрольной группе не получали лечения.
ФИГ. 8 показывает влияние лечения ITPP на выживаемость бестимусных мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы человека Panc-1, по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином и плацебо. В группе лечения ITPP мышей с ксенотрансплантатом опухоли лечили ITPP (2 мг/кг) еженедельно в течение периода времени со дня 14 по день 49. В группе лечения гемцитабином мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы лечили гемцитабином (100 мг/кг) на дни 16, 18 и 20. Животные в контрольной группе не получали лечения.
ФИГ. 9 показывает влияние на выживаемость бестимусных мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы человека Panc-1 при использовании ITPP в комбинации с гемцитабином, по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином и плацебо. В группе комбинированного лечения мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы лечили ITPP (2 мг/кг) в комбинации с гемцитабином (25 мг/кг или 50 мг/кг) еженедельно в течение периода времени со дня 14 по день 49. В группе лечения гемцитабином мышей с ксенотрансплантатами опухоли поджелудочной железы лечили гемцитабином (100 мг/кг) на дни 16, 18 и 20. Животные в контрольной группе не получали лечения.
ФИГ. 10 показывает влияние лечения ITPP на экспрессию HIF-1α, VEGF, каспазы-3 и β-актина у крыс с опухолью поджелудочной железы, по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином и плацебо.
ФИГ. 11 показывает влияние лечения ITPP на инфильтрацию CD68 (тип М2) макрофагами опухоли В16. OXY111A инъецировали интраперитонеально на дни 7, 8, 14, 15, 21, 22, 29 и 30. Анализ опухоли В16 осуществляли на день 31. (а) нелеченная опухоль В16; (b) и (с) окрашивание с использованием CD68 леченной ITPP опухоли показало инфильтрацию макрофагами CD68 (тип М2) опухоли В16.
ФИГ. 12 показывает влияние лечения ITPP на инфильтрацию клетками натуральными киллерами (NK) CD49b и на присутствие эндотелиальных клеток (ЕС) CD31 в опухоли В16. С (а) по (b) нелеченная опухоль В16; с (d) по (f) опухоль В16, леченная ITPP. Зеленые стрелки показывают инфильтрирующие клетки NK; красные стрелки показывают стенки сосудов.
ФИГ. 13 показывает влияние лечения ITPP на инвазию клетками NK меланомы опухолей В16. Клетки опухоли В16 метили с использованием B16F10 DAPI; клетки NK метили с использованием анти-CD49bFITCl; а эндотелиальные клетки сосудов метили с использованием анти-CD31TRITC. (а) нелеченная опухоль В16; (b) и (с) опухоль В16, леченная ITPP.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
(1) Композиции по настоящему изобретению
Композиции, которые являются подходящими для настоящего изобретения, содержат кислоты и соли триспирофосфата инозита (ITPP); ITPP в настоящем документе представляет собой анион. Термин «триспирофосфат инозита», альтернативно известный как гексафосфат триспирофосфата инозита, относится к гексафосфату инозита с тремя внутренними пирофосфатными кольцами. Эквивалентный вид ITPP в настоящем документе называется противоионом, и комбинация ITPP с противоионом в настоящем документе называется кислотой или солью. Изобретение не ограничивается спариваниями, которые являются чисто ионными; действительно, специалистам хорошо известно, что спаренные ионы часто демонстрируют некоторую степень характеристики ковалентной или координационной связи между двумя компонентами пары. Кислоты и соли ITPP в композициях по настоящему изобретению могут содержать единственный тип противоиона или могут содержать смешанные противоионы, и могут, необязательно, содержать смесь анионов, одним из которых является ITPP. Композиции могут, необязательно, включать краун-эфиры, криптанды и другие виды, способные к хелатообразованию или к иному комплексированию с противоионами. Также композиции могут, необязательно, содержать кислотные макроциклы или другие виды, которые способны комплексироваться с ITPP через водородные связи или другие молекулярные притяжения. Способы получения кислот и солей с ITPP описаны в патенте США № 7 084 115, выданном Nicolau et al., содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Противоионы, которые предполагается использовать в изобретении, включают, без ограничения, следующие: катионные водородные виды, включая протоны и соответствующие ионы дейтерия и трития; одновалентные неорганические катионы, включая литий, натрий, калий, рубидий, цезий и медь (I); двухвалентные неорганические катионы, включая бериллий, магний, кальций, стронций, барий, марганец (II), цинк (II), медь (II) и железо (II); поливалентные неорганические катионы, включая железо (III); четвертичные азотистые соединения, включая аммоний, циклогептил аммония, циклооктил аммония, N,N-диметилциклогексил аммония и другие органические аммонийные катионы; соединения сульфония, включая триэтилсульфоний и другие органические соединения сульфония; органические катионы, включая пиридиний, пиперидиний, пиперазиний, хинуклидиний, пирролий, трипиперазиний и другие органические катионы; полимерные катионы, включая олигомеры, полимеры, пептиды, белки, положительно заряженные иономеры и другие макромолекулярные представители, которые имеют группы сульфония, четвертичные азотистые группы и/или заряженные органометаллические группы в боковых группах, концах цепи и/или каркасе полимера. Примером соли ITPP является монокальциевая тетранатриевая соль ITPP или смесь натрий-ITPP и кальций-ITPP, которая содержит 15-25 моль % кальция и 75-85 моль % натрия.
Предпочтительным изомером для ITPP, использующегося в настоящем изобретении, является миоинозит, который представляет собой цис-1,2,3,5-транс-4,6-циклогексангексил; однако изобретение этим не ограничивается. Так, изобретение предполагает использовать любой изомер инозита в ITPP, включая соответствующие трипирофосфаты природных сцилло-, хиро-, муко- и неоинозитных изомеров, а также трипирофосфаты натуральных алло-, эпи- и цис-инозитных изомеров.
Предполагается, что ITPP может образовываться in vivo из пролекарства, например, ферментативным расщеплением сложного эфира или перемещением удаляемой группы, такой как толилсульфонильная группа.
ITPP демонстрирует антиангиогенные и противоопухолевые свойства и является пригодным для контроля явлений, состояний или веществ, связанных с ангиогенезом или пролиферацией. Используемый в настоящем документе термин «контроль явлений, состояний или веществ, связанных с ангиогенезом или пролиферацией» относится к любому качественному или количественному изменению любого типа фактора, состояния, активности, индикатора, химического агента или комбинации химических агентов, мРНК, рецептора, маркера, медиатора, белка, транскрипционной активности и т.п., которое может или предполагается, что может быть связано с ангиогенезом или пролиферацией, и которое является результатом введения композиции по настоящему изобретению.
ITPP также повышает рО2 в микроокружении опухоли, ингибирует метастазы и неопластический неоангиогенез. Гипоксические опухолевые клетки, которые часто являются более инвазивными и устойчивыми к апоптозу, имеют тенденцию к резистентности к обычной химиотерапии. Так, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективность лечения химиотерапевтическим агентом повышается при комбинированном лечении с использованием ITPP. Далее, в некоторых аспектах, лечение ITPP индуцирует микрососудистую «нормализацию» опухоли.
ITPP, помимо этого, уменьшает количество помп, обеспечивающих отток лекарственных средств в опухолях, и, таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, лечит рак, резистентный к одному или более химиотерапевтическим агентам, и/или повышает эффективность химиотерапевтических агентов в отношении опухолевых клеток.
Настоящее изобретение относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим ITPP и химиотерапевтический агент. Химиотерапевтический агент, подходящий для настоящего изобретения, включает: аминоглутетимид, амсакрин, анастрозол, аспарагиназу, БЦЖ, бикалутамид, блеомицин, бузерелин, бусульфан, камптотецин, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, клодронат, колхицин, циклофосфамид, ципротерон, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, диэнестрол, диэтилстилбестрол, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, эстрадиол, эстрамустин, этопозид, экземестан, филграстим, флударабин, флудрокортизон, фторурацил, флуоксиместерон, флутамид, гемцитабин, генистеин, гозерелин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, интерферон, иринотекан, иронотекан, летрозол, лейковорин, лейпролид, левамизол, ломустин, мехлорэтамин, медроксипрогестерон, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, месну, метотрексат, митомицин, митотан, митоксантрон, нилутамид, нокодазол, октреотид, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат, пентостатин, пликамицин, порфимер, прокарбазин, ралтитрексед, ритуксимаб, стрептозоцин, сурамин, тамоскифен, темозоломид, тенипозид, тестостерон, тиогуанин, тиотепа, титаноцена дихлорид, топотекан, трастузумаб, третиноин, винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент представляет собой агент, нацеленный на микротрубочки, такой как паклитаксел. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент представляет собой ДНК-интеркалирующий агент, такой как агенты на основе платины (например, цисплатин), или доксорубицин. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент представляет собой нуклеозидный метаболический ингибитор, такой как гемцитабин или капецитабин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент композиции может содержаться в субтерапевтической дозе или количестве. Термин «субтерапевтическая доза или количество» означает, что доза или количество фармакологически активного вещества ниже дозы или количества указанного вещества, требующихся для введения в виде чистого вещества для достижения терапевтического эффекта. Субтерапевтическая доза указанного вещества будет варьироваться в зависимости от субъекта и болезненного состояния, подвергающихся лечению, массы тела и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и т.п., что легко может определить специалист. В одном варианте осуществления настоящего изобретения субтерапевтическая доза или количество химиотерапевтического агента составляет менее 90% рекомендованной полной дозы химиотерапевтического агента, описанной в одобренной администрацией по пищевым продуктам и лекарственным средствам США информации по данному химиотерапевтическому агенту. В других вариантах осуществления настоящего изобретения субтерапевтическая доза или количество химиотерапевтического агента составляет менее 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% и даже 10% рекомендованной полной дозы, например, от 20% до 90%, от 30% до 80%, от 40% до 70%, или другие пределы в рамках величин, представленных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится также к набору для лечения рака, включающему ITPP и химиотерапевтический агент. Набор может быть снабжен инструкциями по использованию ITPP и химиотерапевтического агента, в соответствии со схемой лечения или способом по настоящему изобретению, как обсуждается ниже. Химиотерапевтический агент, подходящий для набора, может включать агенты, упомянутые выше. Субтерапевтическую дозу или количество химиотерапевтического агента можно использовать в наборе по настоящему изобретению. Также настоящим изобретением предусматриваются имплантаты или другие устройства, содержащие соединения или лекарственные средства ITPP или его пролекарства, в которых лекарственное средство или пролекарство помещено в биоразлагаемый или бионеразлагаемый полимер для замедленного высвобождения. Бионеразлагаемые полимеры высвобождают лекарственное средство контролируемым образом, посредством физических или механических процессов, без разложения самого полимера. Биоразлагаемые полимеры изготавливают таким образом, чтобы они постепенно гидролизовались или солюбилизировались посредством естественных процессов в организме, что позволяет получать постепенное высвобождение смешанного с ними лекарственного средства или пролекарства. Лекарственное средство или пролекарство может быть химически связано с полимером или может быть инкорпорировано в полимер смешиванием. Как биоразлагаемые, так и бионеразлагаемые полимеры, а также способы инкорпорирования лекарственных средств в полимеры для контролируемого высвобождения хорошо известны специалистам. Пример указанных полимеров можно найти во многих источниках, таких как статья Brem et al., J. Neuroserg. 74: стр. 441-446 (1991), которая целиком включена в настоящий документ посредством ссылки. Указанные имплантаты или устройства можно имплантировать поблизости от того места, в которое желательно осуществить доставку, например, в область опухоли.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут содержать, или вводиться совместно (одновременно или последовательно), один или более фармакологических агентов, имеющих ценность для лечения одного или более болезненных состояний, упомянутых выше в настоящем документе.
Композиции обычно можно изготавливать и вводить с использованием стандартных методик, как, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 17-е издание. Например, композиции, описанные в настоящем документе, можно изготавливать обычными способами, с использованием одного или более физиологически или фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Композиции по настоящему изобретению и их фармацевтически приемлемые соли, и сольваты могут изготавливаться, например, для введения путем инъекции (например, подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной), ингаляции или инсуффляции (через рот или нос) или для перорального, трансбуккального, сублингвального, чрескожного, назального, парентерального или ректального введения. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию можно вводить локально, в участок, где находятся клетки-мишени, т.е. в конкретную ткань, орган или жидкость (например, кровь, спинномозговую жидкость и т.п.). Следует понимать, что, помимо ингредиентов, упомянутых выше, композиции по настоящему изобретению могут включать другие агенты, обычные для изготовления композиции того типа, который рассматривается, например, композиции, подходящие для перорального введения, могут включать корригенты или другие агенты, которые делают композицию более привлекательной и легко проглатываемой.
Композиции по настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены как дискретные единицы, такие как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, содержащие заранее определенное количество активного ингредиента; как порошок или гранулы; как раствор или суспензия в водной жидкости или неводной жидкости; или как жидкая эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле» и т.п. Таблетки можно изготавливать прессованием или формовкой, необязательно, с одним или более дополнительных ингредиентов. Таблетки могут, необязательно, иметь покрытие или насечки и могут изготавливаться таким образом, чтобы обеспечивать медленное или контролируемое высвобождение содержащегося в них активного ингредиента.
Композиции, подходящие для местного введения в рот, включают леденцы, содержащие ингредиенты в корригирующей основе, обычно в сахарозе или аравийской камеди или трагаканте; пастилки, содержащие активные ингредиенты в инертной основе, такой как желатин или глицерин, или в сахарозе и аравийской камеди; и ополаскиватели для полости рта, содержащие ингредиент, предназначенный для введения, в подходящем жидком носителе.
Композиции, подходящие для местного введения на кожу, могут быть представлены в виде мазей, кремов, гелей и паст, содержащих ингредиент, предназначенный для введения, в фармацевтически приемлемом носителе. Другая система для местной доставки представляет собой чрескожный пластырь, содержащий ингредиент, предназначенный для введения.
Композиции для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория на подходящей основе, включающей, например, масло какао и/или салицилат.
Композиции, подходящие для назального введения, в которых носитель представляет собой твердое вещество, включают крупный порошок, имеющий размер частиц, например, в пределах от 20 до 500 микрон, который вводят, втягивая носом, как нюхательный табак; т.е. посредством быстрого вдоха через носовой проход из контейнера с порошком, который держат вплотную к носу. Подходящие композиции, в которых носитель представляет собой жидкость, для введения в виде, например, назального спрея или назальных капель, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.
Композиции, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих, помимо активного ингредиента, такие ингредиенты как носители, известные специалистам как подходящие для указанных целей.
Композиции, подходящие для ингаляции, могут быть представлены в виде аэрозолей, пылевидных порошков, порошков или спреев, содержащих, помимо активного ингредиента, такие ингредиенты как носители, известные специалистам как подходящие для указанных целей.
Композиции, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Композиции могут быть представлены в виде контейнеров, содержащих одну дозу или множество доз, например, герметичных ампул и флаконов, и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) виде, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии, получаемые непосредственно перед введением, могут изготавливаться из стерильных порошков, гранул и таблеток, описанных ранее.
Композиции, рассматриваемые как часть настоящего изобретения, включают композиции из наночастиц, изготовленные способами, описанными в публикации США № 2004/003367, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления частицы соединений по настоящему изобретению имеют эффективный средний размер частиц менее приблизительно 2 микрон, менее приблизительно 1500 нм, менее приблизительно 1000 нм, менее приблизительно 500 нм, менее приблизительно 250 нм, менее приблизительно 100 нм или менее приблизительно 50 нм, по результатам измерения методами рассеяния света, микроскопии или других подходящих способов, хорошо известных специалистам.
(2) Схема и способ лечения по настоящему изобретению
ITPP индуцирует внутриопухолевую сосудистую нормализацию. ITPP-индуцированная сосудистая нормализация противодействует гипоксии опухоли, ключевой причине резистентности опухолевых клеток к облучению и цитотоксическим лекарственным средствам и метастазирования опухоли.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к схеме или способу лечения рака или опухолей у субъекта, которые включают введение, одновременно или последовательно, терапевтически эффективного количества ITPP и химиотерапевтического агента. Фраза «терапевтически эффективное количество» означает такое количество указанного вещества, композиции, набор или схему лечения в целом, которые оказывают некоторый желательный локальный или системный эффект, обычно при разумном соотношении польза/риск, в контексте схемы или способа лечения. Терапевтически эффективное количество указанного вещества будет варьироваться в зависимости от субъекта и болезненного состояния, подвергающихся лечению, массы тела и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и т.п., что легко может определить специалист. Например, определенные композиции, описанные в настоящем документе, можно вводить в количестве, достаточном для того, чтобы получить желательный эффект при разумном соотношении польза/риск, применимом для указанного лечения.
Подходящие химиотерапевтические агенты, подходящие для использования в способах по настоящему изобретению, могут включать агенты, упомянутые выше. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент представляет собой паклитаксел, цисплатин или гемцитабин.
Примеры рака включают, без ограничения, гематологические новообразования, включая лейкозы, миеломы и лимфомы; карциномы, включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы; меланомы и саркомы. Карциномы и саркомы часто называют «солидными опухолями». Типы опухолей, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, являются, предпочтительно, солидными опухолями, включающими, без ограничения, саркомы, карциномы и другие солидные раки, включая, без ограничения, опухоли из зародышевых линий клеток, опухоли центральной нервной системы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак матки, рак легкого, рак яичника, рак семенника, рак щитовидной железы, астроцитому, глиому, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак печени, рак толстой кишки, меланому, рак почки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак гортани, рак околоушной слюнной железы, рак желчевыводящих путей, рак прямой кишки, рак эндометрия, плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы, нейробластомы, мезотелиомы, адренокортикальные карциномы, эпителиальные карциномы, десмоидные опухоли, десмопластические мелко-круглоклеточные опухоли, эндокринные опухоли, опухоли семейства саркомы Эвинга, опухоли из зародышевых клеток, гепатобластомы, печеночно-клеточные карциномы, лимфомы, меланомы, саркомы мягких тканей, не являющиеся рабдомиосаркомами, остеосаркомы, периферические примитивные нейроэктодермальные опухоли, ретинобластомы, рабдомиосаркомы и опухоли Вильмса.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ITPP и химиотерапевтический агент вводят одновременно. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ITPP и нуклеозидный метаболический ингибитор, такой как гемцитабин, химиотерапевтический агент, вводят одновременно. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения рак представляет собой рак поджелудочной железы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения рак представляет собой меланому.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения ITPP и химиотерапевтический агент вводят последовательно. Например, ITPP вводят до введения химиотерапевтического агента. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения химиотерапевтический агент вводят после того, как получают частичную сосудистую нормализацию опухоли. Используемый в настоящем документе термин «частичная сосудистая нормализация» относится к физиологическому состоянию, во время которого существующая сосудистая сеть опухоли демонстрирует улучшенную структуру сосудистого эндотелия и базальной мембраны, и, следовательно, имеет уменьшенное просачивание, расширение и/или гипоксию. Указанную частичную сосудистую нормализацию можно определить выявлением и/или мониторингом изменения в уровне одного или более из рО2, индуцируемого гипоксией фактора 1 альфа (HIF-1α), VEGF, тирозин-киназы Tie-2 и гемооксигеназы 1 (НО-1) или мониторингом физиологического состояния опухолевых сосудов с использованием методик, включающих ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) и ядерно-магнитную ангиографию (ЯМА).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ITPP вводят приблизительно за 2 часа и до 5 дней перед введением химиотерапевтического агента. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ITPP вводят приблизительно за 1 и до 4 дней перед введением химиотерапевтического агента, например, за 2-3 дня до введения химиотерапевтического агента (например, агента, нацеленного на микротрубочки, такого как паклитаксел, или интеркалятора ДНК, такого как цисплатин).
Можно проводить множество курсов ITPP и химиотерапевтического агента. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения проводят только один курс. В других вариантах осуществления настоящего изобретения проводят два или более курсов (например, два, три, четыре или более курсов) ITPP и химиотерапевтического агента. Курсы можно проводить с интервалом от 1 дня до 6 месяцев, например, от 1 дня до 3 месяцев, от 1 недели до 2 недель, от 2 недель до 3 недель, от 3 недель до 1 месяца, от 1 месяца до 2 месяцев или от 2 месяцев до 3 месяцев.
Химиотерапевтический агент можно вводить в субтерапевтической дозе или количестве, основываясь на той дозе, при которой агент является единственным активным агентом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения введенная субтерапевтическая доза или количество химиотерапевтического агента составляет менее 90% рекомендованной полной дозы химиотерапевтического агента или другую дозу, как описано выше.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения лекарственно-резистентного рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственно-резистентный рак представляет собой рак, который не поддается лечению одним или более химиотерапевтических агентов. Например, лекарственно-резистентный рак может не показывать существенного уменьшения размеров опухоли после лечения агентом и/или не ингибировать значимым образом прогрессирование опухоли (например, со стадии II до стадии III или со стадии III до стадии IV). Примеры химиотерапевтических агентов, к которым некоторые вида рака, особенно, меланома, являются резистентными, включают агенты, нацеленные на микротрубочки (например, паклитаксел), и ДНК-интеркаляторы (например, агенты на основе платины, такие как цисплатин). Исследования, посвященные лекарственной резистентности, описаны, например, в статье Lowe et al. (1993) Cell 74:95 7-697, включенной в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственно-резистентный рак представляет собой рак, имеющий достоверно повышенные уровни канальцевого мультиспецифичного транспортера органических анионов I и/или Р-гликопротеиновых помп, обеспечивающих отток лекарственных средств, по сравнению с нерезистентной раковой клеткой.
Способы лечения лекарственно-резистентного рака могут включать введение только ITPP или ITPP в комбинации с другим химиотерапевтическим агентом, таким как агенты, описанные в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится также к способам лечения гиперпролиферативного состояния, включающим введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества ITPP, в которых гиперпролиферативное состояние не является раком или характеризуется нежелательным ангиогенезом. Гиперпролиферативные состояния, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, включают, без ограничения, диабетическую нефропатию, гломерулосклероз, нефропатию IgA, цирроз, билиарную атрезию, застойную сердечную недостаточность, склеродермию, индуцированный облучением фиброз, фиброз легких (идиопатический фиброз легких, коллагеновая сосудистая болезнь, саркоидоз, интерстициальные заболевания легких и легочные расстройства, вызванные внешними факторами), псориаз, остроконечные кондиломы и гиперпролиферативные болезни клеточного роста, включая гиперпролиферативные заболевания кератиноцитов, такие как гиперкератоз, ихтиоз, кератодермия или красный плоский лишай. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань или орган, демонстрирующие гиперпролиферативное состояние, является гипоксическим. В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ лечения гиперпролиферативного состояния дополнительно включает введение дополнительного антигиперпролиферативного агента. Антигиперпролиферативные агенты включают доксорубицин, даунорубицин, митомицин, актиномицин D, блеомицин, цисплатин, VP16, энедин, таксол, винкристин, винбластин, кармустин, меллфалан, циклофосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, ломустин, 5-фторурацил, гемцитабин, BCNU или камптотецин.
Настоящее изобретение относится также к способу усиления иммунного ответа у субъекта, включающему введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества ITPP, в котором субъект не страдает от рака или другой опухоли. В одном варианте осуществления настоящего изобретения субъект не страдает от нежелательного ангиогенеза.
(3) Определения
Используемые в настоящем документе следующие термины и фразы будут иметь значения, указанные ниже. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют общепринятые значения, известные специалистам.
Термин «агент» используется в настоящем документе для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы (такой как нуклеиновая кислота, антитело, белок или его часть, например, пептид) или экстракта, изготовленного из биологических материалов, таких как бактерии, растения, грибы или животные (особенно, от млекопитающих) клетки или ткани. Активность указанных агентов может сделать его подходящим в качестве «терапевтического агента», который является биологически, физиологически или фармакологически активной субстанцией (или субстанциями), которая действует местно или системно в организме субъекта.
Термины «парентеральное введение» и «введенный парентерально» представляют собой известный специалистам термин и относятся к способам введения, отличающимся от энтерального и местного введения, обычно, путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и интрастернальную инъекции и инфузию.
«Пациент», «субъект», «индивидуум» или «хозяин» относятся к человеку или животному, которое не является человеком.
«Цитотоксическое лекарственное средство или агент» представляет собой любой агент, способный разрушать клетки, предпочтительно, раковые клетки.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» известен специалистам и относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или носителю, такому как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в доставке или транспортировке любой рассматриваемой композиции или ее компонента. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он должен быть совместимым с рассматриваемой композицией и ее компонентами и не причинять вреда пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, масло семян хлопка, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) физиологический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатные буферные растворы и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, использующиеся в фармацевтических композициях.
Термин «терапевтический агент» известен специалистам и относится к любой химической группе, которая представляет собой биологически, физиологически или фармакологически активное вещество, которое действует местно или системно в организме субъекта. Термин означает также любое вещество, предназначенное для использования для диагностики, излечения, облегчения, лечения или профилактики заболевания или для усиления желательного физического или умственного развития и/или состояний у животного или человека.
«Лечение» состояния или заболевания относится к излечению, а также к облегчению по меньшей мере одного симптома состояния или заболевания. Лечение включает введение композиции, которая уменьшает частоту или задерживает возникновение симптомов медицинского состояния у субъекта по сравнению с субъектом, который не получает композицию. Так, лечение рака включает, например, уменьшение количества и/или размеров поддающихся обнаружению раковых новообразований в популяции пациентов, получающих лечение, по сравнению с нелеченной контрольной популяцией, и/или задержку возникновения поддающихся обнаружению раковых новообразований в леченной популяции по сравнению с нелеченной контрольной популяцией, например, на статистически и/или клинически значимое количество.
ПРИМЕРЫ
Изобретение, которое далее будет описано в общих чертах, будет понятнее при использовании следующих примеров, которые приводятся просто с целью иллюстрации определенных аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1. Получение клеточной линии B16F10LucGFP
Трансдукцию мышиной меланомы B16F10 осуществляли с использованием ретровирусных векторов: кДНК люциферазы светлячка, управляемой промотором 5'LTR, затем последовательности IRES и кДНК EGFP. Векторы получали с использованием плазмиды pBMN-Luc-I-GFP (любезно предоставленной д-ром Магнусом Эссандом, Уппсала, Швеция) и пакующей клеточной линии РТ67 (Clontech), стабильно экспрессирующей гены gag, pol и env. Помимо этого, плазмиду рМ13, предоставляющую гены gag и pol (любезно предоставленную д-ром Кристиной Бростян, Вена, Австрия), использовали для повышения эффективности продукции. Пакующие клетки культивировали в среде DMEM HG (PAA Laboratories) с добавлением 10% ФБС, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 мкг/л) и котрансфектировали плазмидами pBMN-Luc-I-EGFP и рМ13 с использованием реагента SuperFect (Qiagen), согласно инструкциям производителя. После трансфекции клетки культивировали при 32°С в течение 48 ч. Затем среды, содержавшие ретровирусные векторы, собирали, смешивали с полной средой RPMI в объемном соотношении 1:1 и использовали для трансдукции клеток B16F10. Три дня спустя эффективность трансдукции оценивали с использованием флуоресцентного микроскопа, согласно присутствию EGFP (приблизительно 5%). После нескольких пассажей EGFP-позитивных колоний и трех циклов сортировки с использованием проточного цитометра MoFlo (Dako Cytomation) получали клеточную линию B16F10LucGFP с чистотой более 99%.
Пример 2. Чувствительность клеток к химиотерапии в соответствии с давлением О 2
Кривые доза-ответ на цисплатин (цис-дихлордиамин платины) (Sigma-Aldrich) или паклитаксел (Calbiochem) получали при различных значениях рО2 % в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием теста с аламаром синим (Biosource), как описано производителем.
Пример 3. Экспериментальное исследование метастазов
После внутривенной инъекции клеток мышиной меланомы B16F10LucGFP (105 клеток в 0,1 мл физиологического раствора) в хвостовую вену мышей (восьминедельных самок C57BL/6 от Janvier) лечили и/п инъекциями ITPP в дозе 1,5 г/кг каждые 5 дней (по 10 мышей в экспериментальной группе). Лечение начинали на день 5 после инокуляции опухолевых клеток. Через 19 или 27 дней мышей умерщвляли и брали у них легкие по отдельности. Макроскопические очаги в легких подсчитывали и определяли люциферазу с использованием хемолюминесцентного анализа (Promega), с целью количественной оценки меланомных клеток в тканях. Все процедуры исследования на животных и использования животных были одобрены комитетом по этике Comite d'Ethique pour l'experimentation animale, кампус CNRS Орлеана, Франция.
Пример 4. Модель подкожной меланомы
Клетки B16F10LucGFP выращивали как подкожные опухоли, после инъекции 100 мкл массы, состоявшей из 105 клеток в 25% Matrigel™ (50% в OptiMEM). Matrigel получали от компании BD Biosciences, а OptiMEM от компании Invitrogen. Мышей умерщвляли через 25 дней после инокуляции, а опухоли и легкие иссекали. Использовали различные протоколы лечения по времени и дозе ITPP (от 100 мкг/кг до 2,0 г/кг в физиологическом растворе, интраперитонеально), в комбинации с цисплатином (10 мг/кг в физиологическом растворе, интраперитонеально) и паклитакселом (2 мг/кг в 50% этаноле 50% Cremophor EL; Sigma-Aldrich, перорально). Лечение начинали на 7, 9 или 11 день после инокуляции меланомных клеток.
Пример 5. Биохимическая количественная оценка маркеров, связанных с гипоксией, ангиогенезом и меланомой
Легкие гомогенизировали в лизисном буфере (Active motif). После центрифугирования собирали прозрачную надосадочную жидкость. Определяли общее количество белка с использованием набора для анализа белков ВСА (Thermo Scientific). Определяли количество HIF-1α, VEGF, Tie-2 и НО-1 в лизатах легких с использованием колориметрического сандвич ELISA, согласно инструкциям производителя. Наборы ELISA для HIF-1α, VEGF и Tie-2 приобретали в компании R&D. Набор ELISA для НО-1 приобретали в компании Takara.
Пример 6. Полуколичественный анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой
Праймерные последовательности полимеразной цепной реакции Taqman для LOX были следующие: 5'-ATCGCCACAGCCTCCGCAGCTCA-3' (SEQ ID NO:1) и 5'-AGTAACCGGTGCCGTATCCAGGTCG-3' (SEQ ID NO:2). Для β-актина (внутренний контроль) праймерные последовательности были следующие: 5'-CCAGAGCAAGAGAGGCATCC-3' (SEQ ID NO:3) и 5'-CTGTGGTGGTGAAGCTGAAG-3' (SEQ ID NO:4). Полосы амплифицированных кДНК определяли количественно с использованием компьютерной программы ImageQuant (Becton and Dickinson). Уровни мРНК LOX стандартизировали относительно мРНК β-актина.
Пример 7. Иммуногистологическое окрашивание
Опухолевые ткани заливали в Tissue-Tek (Sakura), помещали в среду для замораживания тканей и подвергали быстрой заморозке в жидком азоте. Криосрезы фиксировали и окрашивали с использованием крысиных моноклональных антител IgG2a против мышиного CD31 (PECAM-1, тромбоцитарная/эндотелиальная адгезивная молекула) от eBiosciences, кроличьего IgG анти-SMA (гладкомышечного актина) антитела (AbCAM) или мышиного IgG2a анти-Р-гликопротеин (С219) (Calbiochem), разбавленных 1:200 в ФБС 5% в PBS. Козий IgG-FITC-меченный антикрысиный иммуноглобулин, козий IgG-FITC-меченный антикроличий иммуноглобулин или козий IgG-FITC-меченный антимышиный иммуноглобулин (разбавленный 1:200 в PBS) использовали в качестве вторичных антител, соответственно. Для обнаружения клеточных ядер срезы инкубировали с бис-бензимидом Н 33258 (Sigma-Aldrich) 1:1000 в PBS. Образцы монтировали в Vectashield (Vector) и осуществляли обнаружение с использованием флуоресцентной микроскопии на инвертированном флуоресцентном микроскопе Zeiss 200M. Некроз опухоли анализировали после окрашивания гематоксилин-эозином срезов опухоли.
Пример 8. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
Исследования ЯМР осуществляли с использованием 9,4 Т горизонтального магнита для животных малого размера (94/21 USR Bruker Biospec), оборудованного градиентным устройством 950 мТ/м. Мышей помещали в линейную гомогенную катушку (линейный диаметр: 35 мм). Животным давали ингаляционный наркоз (50% N2O: 0,7 л/мин - 50% О2: 0,7 л/мин - изофлуран 1,5%), температуру поддерживали постоянной 36°С и мониторировали частоту дыхательных движений во время сбора данных с использованием воздушного баллона, помещенного на грудную клетку мыши, для подбора анестетического выхода. Измерение васкуляризации опухоли осуществляли МР-ангиографией с использованием последовательности Fast Low Angle Shot (FLASH) как в осевой, так и в параллельной передней плоскости. Последовательность импульсов FLASH адаптировали для исследования эволюции ангиогенеза опухоли. Данная методика позволяет отслеживать пространственную структуру сосудистого древа опухоли по прошествии длительного времени у одного и того же животного.
Пример 9. Измерение рО 2 с использованием оксилита
Система оксилит рО2 2000Е (Oxford Optronics) измеряет рО2 путем определения О2-зависимой продолжительности флуоресценции хлорида рутения, который иммобилизован на конце фиброоптического зонда диаметром 230 мкм. Продолжительность флуоресценции обратно пропорциональна напряжению кислорода на конце. Мышам давали наркоз интраперитонеальной инъекцией ксилазина/кетамина перед установкой кончика оксилитового зонда в опухоль и измерением давления кислорода, как описано.
Пример 10. ITPP-RBC избирательно противодействуют гипоксии в микроокружении опухоли
Для того чтобы подтвердить, что ITPP-RBC противодействуют гипоксии in vivo, осуществляли сравнение величин напряжения кислорода внутри меланомных опухолей, имплантированных подкожно над левой задней конечностью, у леченных ITPP и нелеченных мышей. Напряжение кислорода (рО2) вычисляли путем определения О2-зависимой продолжительности флуоресценции хлорида рутения на конце фиброоптического зонда. Продолжительность флуоресценции обратно пропорциональна напряжению кислорода на конце. В то время как опухоли у нелеченных животных были сильно гипоксическими с величиной напряжения кислорода менее 2 мм рт.ст. (фиг. 1), в опухолях леченных ITPP мышей рО2 достигало 40 мм рт.ст. (фиг. 1А). Указанное повышение рО2 наблюдалось всего через 30 минут после интраперитонеальной инъекции ITPP (фиг. 1В, С) и сохранялось на высоком уровне, до 40 мм рт.ст., как показано, через 24 часа после инъекции (фиг. 1А) в течение по меньшей мере 48 часов. Более того, ITPP-RBC были нацелены конкретно на гипоксические опухоли, поскольку, как показано на мышце, соответствующей задней конечности (правой) того же самого животного, не было выявлено изменений или любого влияния на рО2 при параллельных и сопутствующих измерениях (фиг. 1С), в то время как в опухоли уровень рО2 повышался через 30 минут после инъекции ITPP.
Пример 11. ITPP-RBC предотвращают образование метастазов меланомных клеток В16 в легких
Для того чтобы подтвердить, что ITPP является антиметастатическим агентом, использовали «искусственную» модель легочного метастаза, полученную внутривенной инъекцией меланомных клеток мышам. Использовали клеточную линию B16F10LucGFP, которая представляет собой линию меланомы B16F10, трансдуцированную генами-репортерами GFP и люциферазы, позволяющими отслеживать и количественно определять меланомные клетки путем анализа активности люциферазы в тканях. Эксперименты, сравнивающие биологическое поведение меланомной клеточной линии B16F10 с клетками B16F10LucGFP с точки зрения пролиферации, ангиогенеза и развития метастазов, не показали значимой разницы и отсутствия чувствительности люциферазы к гипоксии, что обосновывает ее применение.
Эксперименты in vivo продолжали до 27 дня после инокуляции меланомных клеток. Метастатические узлы значимо уменьшались, когда лечение ITPP начинали с 5 дня после инъекции клеток В16. Указанный эффект можно было определить количественно путем измерения активности люциферазы в легких (фиг. 2a). Указанное измерение позволяло осуществлять биохимическую количественную оценку микрометастазов, не выявляемых при визуальном осмотре. Для того чтобы исследовать связь эффекта ITPP с изменениями парциального давления кислорода в узлах, анализировали экспрессию HIF-1α изоформы субъединицы индуцируемого гипоксией фактора α, которая является ключевой для ответа клеток млекопитающих на уровни кислорода и считается сенсором клеточного О2. После связывания с элементом ответа на гипоксию (HRE) она запускает связанный с гипоксией генный каскад. Фиг. 2b показывает, что уровни HIF-1α, которые отчетливо демонстрировали повышающую регуляцию в легких нелеченных мышей с меланомой, резко уменьшались в легких леченных ITPP мышей.
Уровень сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) зависит от HIF-1α и, главная цель для лекарственных средств против ангиогенеза, уменьшался до контрольных уровней (фиг. 2c), по результатам анализа ELISA, под влиянием ITPP-RBC. Данные результаты были подтверждены исследованиями экспрессии Tie-2. Tie-2 представляет собой специфический эндотелиальный рецептор тирозин-киназы, необходимый для созревания нормальных кровеносных сосудов, который уменьшается при гипоксии. Указанный маркер, который значимо уменьшается в гипоксических легких, был повторно индуцирован при лечении с использованием ITPP (фиг. 2d), что указывает на то, что сосуды в метастатических узлах были подвержены дезорганизованному ангиогенезу, и, когда ангиогенез регулировался ITPP-RBC, более зрелые сосуды реэкспрессировали маркер Tie-2. После лечения ITPP гемеоксигеназа-1 (НО-1), цитопротективный фермент, индуцированный HIF-1α, также достоверно уменьшался по сравнению с нелеченными мышами (фиг. 2e). Чрезмерная экспрессия НО-1 повышает жизнеспособность, пролиферацию клеток и ангиогенный потенциал меланомных клеток, усиливает метастазы и уменьшает выживаемость контрольных мышей с опухолями. Дополнительные исследования с использованием анализа мРНК лизил-оксидазы с помощью полуколичественной ПЦР (фиг. 2f), фермента, участвующего в инвазивном процессе раковых клеток и регулирующегося гипоксией, также показали благоприятный эффект лечения ITPP, результатом которого было появление «RBC с низкой аффинностью к О2».
Пример 12. ITPP-RBC устраняют ортотопические метастазы меланомы в легких
Влияние ITPP-RBC на метастазы оценивали после подкожной имплантации первичной опухоли. При краткосрочном лечении (3 инъекции ITPP с интервалами в 5 дней), которое начинали на 7 день после инокуляции опухоли, ITPP значимо уменьшал легочные метастазы (фиг. 3А). Начало лечения ITPP на 7 день было оптимальным как при краткосрочном, так и постоянном протоколах введения (дни 7, 12, 16, 18, 19). Начало на 9 или 11 день было менее эффективным, постоянные введения даже приводили к усилению легочных метастазов (фиг. 3А). Хотя причина данного явления не ясна, постоянное введение, ведущее к полному ингибированию ангиогенеза, могло дополнительно изменить фенотип опухолей, увеличив их инвазивность и метастазирование.
Пример 13. ITPP-RBC индуцируют внутриопухолевую сосудистую нормализацию
Структурные изменения микроциркуляции в опухолях оценивали с помощью ядерно-магнитной ангиографии (ЯМА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) для слежения за пространственной структурой сосудистого древа опухоли.
Через 21 день после развития меланомы опухоли демонстрировали типичную хаотичную сосудистую архитектуру (фиг. 3Ва). У мышей, леченных ITPP на день 9 и 14, сосудистая сеть становилась менее плотной и значительно нормализовалась после дополнительных повторных введений на день 18 и 19. Внутриопухолевое исследование выявило многочисленные сосуды на периферии; нормализация была показана рекруитментном перицитов, окружающих сосуды и меченных антителами против гладкомышечного антигена (фиг. 3Bb), в то время как подобное упорядочивание не наблюдалось в нелеченной опухоли (фиг. 3Ba,b). Указанная тенденция к «нормализации» сопровождалась выраженным уменьшением размера опухоли (фиг. 3Ba).
В тех же самых имплантированных первичных опухолях изучали влияние лечения ITPP на мультилекарственные помпы, обеспечивающие отток, ответственные за лекарственную резистентность. ITPP регулирует в сторону понижения Р-гликопротеиновую помпу, обеспечивающую отток лекарственных средств. Указанный эффект может противодействовать химиорезистентности и неудаче взаимодействий лекарственное средство-мишень, благодаря уменьшению эффективной внутриклеточной концентрации лекарственного средства. Так, ITPP-индуцированная нормализация сосудов коррелирует с уменьшением помп, обеспечивающих отток лекарственных средств, в опухолях, и, таким образом, может повышать эффективность лекарственных средств в отношении опухолевых клеток.
Пример 14. ITPP-RBC устраняет ортотопические метастазы меланомы в легких и равномерно усиливает действие химиотерапии
Вследствие способности ITPP улучшать доставку кислорода эритроцитами в гипоксические ткани, изучали его влияние на лечение меланомы такими лекарственными средствами как паклитаксел и цисплатин. Влияние лекарственных средств на клетки меланомы В16 при нормоксии, гипоксии и после реоксигенации сначала изучали in vitro. Фиг. 4 показывает, что цитотоксичность лекарственных средств в отношении клеток В16 уменьшалась с уменьшением напряжения кислорода (1% или 11%). Однако после реоксигенации (от 1% до 11% и 20%) клеток цитотоксичность лекарственных средств восстанавливалась до степени, зависящей от уровня рО2 (фиг. 4А, В). Указанные данные, при сравнении с in vivo модуляцией п-гликопротеина в опухолевых клетках, предполагают, что чувствительность к лекарственным средствам, которая контролируется индуцированным гипоксией усилением MDR, может быть восстановлена ITPP-индуцированной реоксигенацией опухоли.
Лечение ITPP комбинировали с паклитакселом и цисплатином in vivo. Легочные метастазы резко увеличивались (фиг. 5А) после одновременного лечения ITPP, паклитакселом и цисплатином, с профилем, сходным с профилем, наблюдавшимся при постоянном лечении только ITPP (см. выше). Паклитаксел и цисплатин сами по себе ингибировали рост эндотелиальных клеток (фиг. 4С), поддерживая антиангиогенный эффект указанных соединений in vivo. Указанные антиангиогенные лекарственные средства, которые разрушают сосудистую сеть опухоли, усиливают, как было установлено, метастатическую инвазию путем селекции устойчивых к гипоксии опухолевых клеток, подтверждая, таким образом, данные, показанные на фиг. 3, и указывая, что скорее сосудистая нормализация, чем нарушение или устранение опухолевого неоангиогенеза, как полагают, является более релевантным и потенциально полезным подходом к лечению рака.
Изучалось влияние схемы инъекций ITPP и лекарственного средства на лечение как развившихся солидных опухолей (фиг. 5В), так и легочных метастазов (фиг. 5А). Мышам, леченным только ITPP до дня 14, вводили снова только ITPP на дни 18 и 19, в попытке нормализовать сосуды, с последующим лечением цисплатином плюс паклитакселом на дни 20 и 21 перед анализом на день 25. Результаты были впечатляющими: легочные метастазы были ликвидированы, что находится в прямом контрасте с одновременным лечением (фиг. 5А), но подтверждает важность регулярного параметра в протоколе для некоторых противораковых лекарственных средств. Действительно, анализ опухолевых микрососудов с использованием окрашивания CD31 (PECAM-1), который является специфичным маркером эндотелия, показал, после лечения химиотерапевтическими лекарственными средствами, уменьшенную плотность внутриопухолевых микрососудов у леченных ITPP животных, по сравнению с большими количествами плохо структурированных микрососудов неправильной формы и заметным окрашиванием CD31 эндотелиальных клеток в контролях (фиг. 5Ва). Более того, на фиг. 5В показано, что в результате продления регулярного лечения ITPP на дни 18 и 19, имеющего своей целью нормализацию сосудов и напряжения кислорода перед лекарственным лечением на дни 20 и 21, цитотоксичность сильно повышалась, индикатором чего был некроз на день 25, показывающий некротические участки, которые соответствуют диффузной CD31-позитивности (фиг. 5Ва3) и которые очерчиваются окрашиванием Г/Э (фиг. 5Ва3 и фиг. 5Bb3), и подтверждалась уменьшением размеров опухоли и индукцией некроза. Это указывает на сильный эффект лечения ITPP, комбинированного с химиотерапией.
Пример 15. ITPP в комбинации с лечением гемцитабином показывает сильный аддитивный эффект у экспериментальных животных
На крысах с опухолью поджелудочной железы и мышах с ксенотрансплантатом человеческой опухоли поджелудочной железы Panc-1 ITPP в комбинации с гемцитабином показал сильный аддитивный эффект. Эффект лечения только ITPP сначала изучали на обеих моделях по сравнению с эффектом гемцитабина и плацебо (фигуры 6 и 8). Затем изучали эффект ITPP в комбинации с гемцитабином на обеих моделях по сравнению с эффектом лечения только гемцитабином и плацебо.
При использовании модели опухоли поджелудочной железы у крыс, крысы из группы комбинированного лечения получали ITPP (1,5 мг/кг) в комбинации с гемцитабином (25 мг/кг или 50 мг/кг) еженедельно в течение периода времени со дня 14 по день 49. Крысы из группы лечения гемцитабином получали только гемцитабин (100 мг/кг) в дни 16, 18 и 20. Крысы из контрольной группы лечения не получали. Выживаемость экспериментальных животных была достоверно увеличена в группе комбинированного лечения. Профиль выживания животных также показал дозозависимость от гемцитабина (фигура 7).
При использовании модели с ксенотрансплантатами опухоли мыши из группы комбинированного лечения получали ITPP (2 мг/кг) в комбинации с гемцитабином (25 мг/кг или 50 мг/кг) еженедельно в течение периода времени со дня 14 по день 49. Мыши из группы лечения гемцитабином получали гемцитабин (100 мг/кг) в дни 16, 18 и 20. Мыши из контрольной группы лечения не получали. Было показано, что комбинированное лечение увеличивало коэффициент выживания животных по сравнению с лечением только гемцитабином, хотя и без какой бы то ни было дозозависимости от гемцитабина (фигура 9).
Медианное время выживания животных с аденомой протоков поджелудочной железы, которых лечили OXY111A и/или гемцитабином, отмечали и суммировали в таблице 1 ниже:
| Модель | Только OXY111A | Только гемцитабин | OXY111A + гемцитабин | Нелеченный контроль |
| Сингенная крысиная опухоль у крысы | 102 д (1,5 мг/кг) |
58 д (100 мг/кг) |
> 300 д | 45 д |
| Крысиная опухоль у бестимусной мыши | 107 д (2 мг/кг) |
89 д (100 мг/кг) |
76 д (50 мг/кг) 102 д (25 мг/кг) |
69 д |
| Человеческая Panc-1 у бестимусной мыши | 155 д (2 мг/кг) |
141 д (100 мг/кг) |
150 д( 50 мг/кг) 154 д (25 мг/кг) |
127 д |
| Человеческая MiaPaca у бестимусной мыши | 155 д (2 мг/кг) |
140 д (100 мг/кг) |
n/a | 75 д |
При использовании модели опухоли поджелудочной железы у крыс далее изучали экспрессию HIF-1α, VEGF, каспазы-3 и β-актина после лечения ITPP, гемцитабином или плацебо (фигура 10).
Пример 16. Лечение ITPP усиливает инфильтрацию иммунными клетками и инвазию опухолей
На модели опухоли В16 было показано, что лечение OXY111A достоверно усиливало инфильтрацию макрофагами CD68 (тип М2) опухоли В16 после интраперитонеальных инъекций OXY111A в дни 7, 8, 14, 15, 21, 22, 29 и 30 (фигура 11).
На той же модели лечение ITPP также достоверно усиливало инфильтрацию клетками CD49b NK и присутствие клеток CD31 EC в опухоли В16, а также инвазию клеток NK в меланомные опухоли В16 (фигуры 12 и 13).
1. Способ лечения рака, включающий последовательное введение субъекту, который в этом нуждается, терапевтически эффективного количества триспирофосфата инозита (ITPP) и терапевтически эффективного количества химиотерапевтического агента, выбранного из агента, нацеленного на микротрубочки, ДНК-интеркалирующего агента и нуклеозидного метаболического ингибитора, причем ITPP вводят перед введением химиотерапевтического агента.
2. Способ по п. 1, где триспирофосфат инозита (ITPP) вводят приблизительно за 2 часа - 5 дней перед введением одного или более химиотерапевтических агентов.
3. Способ по п. 1, где химиотерапевтический агент вводят в субтерапевтической дозе.
4. Способ по п. 3, где субтерапевтическая доза химиотерапевтического агента составляет менее 70% утвержденной дозы.
5. Способ по п. 1, где рак резистентен к одному или более терапевтическим агентам, и эффективность химиотерапевтических агентов в отношении опухолевых клеток повышается.
6. Способ по 1, где проводят два или более курсов введения триспирофосфат инозита (ITPP) и химиотерапевтического агента.
7. Способ по п. 6, где триспирофосфат инозита (ITPP) вводят приблизительно за 2 часа - 5 дней перед введением одного или более химиотерапевтических агентов и проводят два или более курсов введения триспирофосфат инозита (ITPP) и химиотерапевтического агента.
8. Способ по п. 1, где соль ITPP представляет собой монокальциевую тетранатриевую соль ITPP, или смесь натрий-ITPP и кальций-ITPP, которая содержит 15-25 моль % кальция и 75-85 моль % натрия.
9. Способ по п. 1, где рак выбирают из гематологических новообразований, включая лейкозы, миеломы и лимфомы; карцином, включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы; меланом и сарком, солидных опухолей, включая саркомы, карциномы, опухоли из зародышевых линий клеток, опухоли центральной нервной системы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак матки, рак легкого, рак яичника, рак семенника, рак щитовидной железы, астроцитому, глиому, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак печени, рак толстой кишки, меланому, рак почки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак гортани, рак околоушной слюнной железы, рак желчевыводящих путей, рак прямой кишки, рак эндометрия, плоскоклеточные карциномы, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы, нейробластомы, мезотелиомы, адренокортикальные карциномы, эпителиальные карциномы, десмоидные опухоли, десмопластические мелко-круглоклеточные опухоли, эндокринные опухоли, опухоли семейства саркомы Эвинга, опухоли из зародышевых клеток, гепатобластомы, печеночно-клеточные карциномы, лимфомы, меланомы, саркомы мягких тканей, не являющиеся рабдомиосаркомами, остеосаркомы, периферические примитивные нейроэктодермальные опухоли, ретинобластомы, рабдомиосаркомы и опухоли Вильмса.
10. Способ по п. 1, где химиотерапевтический агент представляет собой агент, нацеленный на микротрубочки, который выбран из доцетаксела и паклитаксела.
11. Способ по п. 1, где химиотерапевтический агент представляет собой ДНК-интеркалирующий агент, который выбран из агентов на основе платины и доксорубицина.
12. Способ по п. 11, где агент на основе платины представляет собой цисплатин.
13. Способ по п. 12, где цисплатин комбинируют с паклитакселом.
14. Способ по п. 1, где нуклеозидный метаболический ингибитор выбран из гемцитабина и капецитабин.
