Способ получения дезинфицированных суспензий клеток человека

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения дезинфицированного препарата клеток из ткани млекопитающего. Осуществляют перфузию ткани млекопитающего не содержащим фермент жидким составом антибиотика, содержащим по меньшей мере один антибиотик и буферный раствор для перфузии. По окончании предыдущей стадии обрабатывают ткань ферментами без антибиотиков для получения суспензии отдельных клеток. Получают дезинфицированный препарат клеток. Изобретение позволяет за короткое время достичь высокого выхода клеток, а также высокой жизнеспособности изолированных дезинфицированных клеток с содержанием микроорганизмов менее 10^-6 КОЕ в единице дезинфицированного препарата. 6 з.п. ф-лы, 2 пр.

 

Изобретение относится к способу получения дезинфицированных препаратов отдельных клеток и полученным таким образом препаратам.

Трансплантация печени является важнейшим жизнеспасающим мероприятием при острой или хронической недостаточности печени. Для того чтобы удовлетворить не покрываемую только донорскими органами потребность в материалах для трансплантации, в последние годы разрабатывались альтернативные полной трансплантации органов способы, например способы частичной трансплантации печени или трансплантации клеточных препаратов печени.

Особенно привлекательными являются препараты отдельных клеток потому, что они могут быть получены из непригодных для трансплантации донорских органов. Для получения гепатоцитов из ткани печени известен способ двухэтапной перфузии, в котором применяют содержащие коллагеназу и содержащие EDTA буферные растворы (Berry und Friend, 1969, The Journal of Cell Biology, часть 43, стр. 506-520). При этом с помощью перфузии ткани печени содержащим коллагеназу буферными раствором отдельные клетки ферментативно высвобождаются из соединения с тканью.

Так как полученные препараты отдельных клеток представляют собой лекарственное средство, то в любом случае должна быть обеспечена микробная стерильность. Однако этого не происходит в примерно от 70 до 80% препаратов, так как в большинстве случаев контаминация существует уже в транспортной среде органа, которая, как правило, происходит из органа или, соответственно, материалов ткани донора. Однако в случае такого ценного материала, как донорские органы человека, желательно, получать большой выход пригодных для трансплантации тканей или клеточных препаратов без микробной нагрузки. Традиционные способы обеззараживания такие, как нагревание, автоклавирование или облучение клеток, противостоят получению жизнеспособных клеток и поэтому не могут применяться для дезинфекции тканей.

Также уже известны способы обеззараживания тканей с помощью антибиотиков. Они разрабатывались, например, для хранения трансплантатов роговой оболочки глаза (US 4695536) или для обеззараживания трансплантатов клапанов сердца (WO 92/12632 и EP 0889690). Время воздействия применяемых при этом составов антибиотиков составляло от 24 часов до хранения в течение нескольких недель. Однако даже время воздействия 24 часа непригодно для высокочувствительных тканей, таких как ткани печени. Кроме того, обеззараживание в данном способе происходит только поверхностно. Следующее требование к основанному на антибиотиках способу обеззараживания тканей и клеток состоит в том, что способ, а также применяемые в нем материалы, не должны отрицательно влиять ни на получение клеток печени, ни на качество клеток и их жизнеспособность и должны быть совместимы с применяемой для контроля качества системой подтверждения стерильности.

В основе данного изобретения лежит техническая задача предоставить способ щадящего и эффективного обеззараживания, или, соответственно, дезинфекции тканей, в котором преодолевают упомянутые выше недостатки, в частности, такой, который обеспечивает эффективную и быструю дезинфекцию тканей при особенно щадящих условиях, в частности одновременно обеспечивает сохранение жизнеспособности тканей или клеток, даже если данные ткани или содержащиеся в них клетки являются очень чувствительными, такими как, например, ткани печени.

Лежащую в основе данного изобретения техническую задачу решают с помощью технического решения согласно независимым пунктам формулы изобретения. В особенно предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения дезинфицированных препаратов, в частности, препаратов отдельных клеток из тканей млекопитающих, в частности человека, включающему следующие стадии: a) перфузия ткани млекопитающего жидким составом антибиотика; b) проведение обработки ткани ферментами, в частности для получения суспензии отдельных клеток; и c) получение дезинфицированных препаратов, в частности препаратов отдельных клеток, то есть препаратов, в которых клетки находятся не связанными в ткани, а изолированно друг от друга или необязательно в виде скоплений клеток или небольших агрегатов клеток. В соответствие с этим данное изобретение предоставляет предпочтительный способ, согласно которому из тканей, то есть, например, из связанных клеток или органов млекопитающих, в частности человека, можно получить в лабораторных условиях дезинфицированные препараты, в частности препараты отдельных клеток, предпочтительно суспензии отдельных клеток. Предпочтительно согласно данному изобретению можно получить препарат клеток, который особенно хорошо пригоден для достоверных проверок на стерильность. Поэтому способ по изобретению позволяет проводить проверки на стерильность, которые предоставляют высокую достоверность стерильности полученных препаратов.

Данное изобретение основывается на предоставленных тканях млекопитающих, которые могут происходить, например, от живых или мертвых млекопитающих, в частности от только недавно умерших млекопитающих. В особенно предпочтительном варианте осуществления под млекопитающими понимают человека или животных, например, сельскохозяйственных животных или подопытных животных, в частности свиней, коров, лошадей, собак, кошек, овец, коз, обезьян, приматов, птиц или грызунов.

Извлеченные из донора млекопитающего и предоставленные для данного изобретения ткани, в частности объединения клеток или органы, применяют как исходный материал в данном изобретении. В данном изобретении предусмотрено, чтобы таким образом предоставленные ткани приводили в контакт с составом антибиотика и подвергали перфузии, предпочтительно с использованием собственной сосудистой системы ткани, в частности органа. Далее в данном изобретении предусмотрено, чтобы либо во время, либо после перфузии ткани составом антибиотика ткань подвергалась обработке ферментами, во время которой распадается объединение клеток и получается суспензия отдельных клеток. Таким образом, достигают того, что в составе антибиотика находятся отдельные клетки, которые вследствие этого могут особенно эффективно обрабатываться антибиотиком и дезинфицироваться.

В связи с данным изобретением под препаратом отдельных клеток или суспензией отдельных клеток, в частности, понимают препарат или суспензию, в которых клетки находятся отдельно без постоянного физического контакта друг с другом. В следующем варианте осуществления под препаратом отдельных клеток или суспензией отдельных клеток также понимают то, что преобладающее количество имеющихся клеток, в частности более 50%, более 60%, более 70%, более 80%, более 90% или более 95% клеток, отделены друг от друга и находятся без постоянного физического контакта друг с другом, а недостающее до 100% количество клеток находится в форме скоплений клеток, маленьких или больших агрегатов клеток и не полностью разделенных остатков ткани.

В связи с данным изобретением под перфузией, в частности под перфузией тканей, понимают прохождение по полым органам или по содержащимся в ткани сосудам, в частности кровеносным сосудам, жидкости, в частности данного состава антибиотиков. В связи с данным изобретением перфузия в особенно предпочтительном варианте представляет собой инкубацию.

В связи с данным изобретением под тканью понимают объединенную структуру клеток, в частности с одинаковыми функциями и/или морфологией, в частности также органы, например печень, часть органа, объединение клеток или секционный материал, в частности из печени, в частности секционный материал печени. Согласно данному изобретению применяемая ткань является тканью печени, например целой печенью или ее частью, например секционным материалом печени. Полученная согласно данному изобретению суспензия отдельных клеток представляет собой предпочтительно суспензию клеток печени.

В особенно предпочтительном варианте осуществления предусмотрено проводить стадию a) совместно, что значит одновременно или частично совпадающей по времени со стадией b), что значит, что перфузию проводят составом антибиотика, предпочтительно находящимся в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии, причем одновременно в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии находится по меньшей мере один фермент для обработки ферментами ткани для получения суспензии отдельных клеток. Однако также предпочтительно сначала проводить перфузию не содержащим фермент составом антибиотика, находящимся предпочтительно в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии, а затем производить обработку ферментами без антибиотиков согласно стадии b), в рамках которой разъединяется ткань и получают отдельные клетки применяемой на стадии a) ткани, так что на стадии способа c) получают полностью дезинфицированные отдельные клетки.

Согласно данному изобретению также можно предусмотреть необязательную стадию, на которой применяемую ткань перед соответствующей изобретению перфузией поверхностно промывают составом антибиотика, предпочтительно применяемым согласно данному изобретению составом антибиотика, в частности без перфузии, то есть проводят первичное поверхностное обеззараживание. При этом время инкубации составляет предпочтительно только от 5 до 60 минут, предпочтительно от 5 до 45 минут, особенно предпочтительно от 5 до 30 минут. При необходимости при таком коротком времени инкубации применяют более высокую концентрацию антибиотика, чем во время перфузии. В одном варианте осуществления данного изобретения можно поверхностную промывку также проводить во время стадии a) и/или b).

В предусмотренной согласно данному изобретению обработке ткани ферментами для получения суспензии отдельных клеток применяют предпочтительно по меньшей мере один или предпочтительно по меньшей мере два фермента, которые предпочтительно находятся в виде водных растворов, в частности в буферизированном растворе, в частности в предпочтительном варианте в жидком составе антибиотика. Применяемые для обработки ферментами ферменты могут разъединять объединения клеток, в частности разъединять контакты клетка-клетка и контакты клетка-внеклеточная матрица, и получать из них без повреждения или разрушения клеток суспензии отдельных клеток. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения особенно пригодными ферментами являются коллагеназа, протеиназа и их смеси. В связи с данным изобретением под протеиназой понимают также протеазу.

Предпочтительными являются смеси из коллагеназы и протеазы, в частности нейтральной протеазы, в соотношении ферментных активностей - 1 единица коллагеназы на от 40 до 60, предпочтительно 50 единиц протеазы.

На перфузию предпочтительно применять примерно от 2000 до 4000 желаемых единиц коллагеназы в комбинации с 100000 единиц казеина или с от 400 до 2500 единицами клостридиопептидазы I.

В особенно предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению ткань в лабораторных условиях подвергают перфузии составом антибиотика, находящегося предпочтительно в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии, который содержит по меньшей мере один фермент для разъединения ткани на отдельные клетки, в частности a) по меньшей мере одну коллагеназу или b) по меньшей мере одну коллагеназу и по меньшей мере одну протеиназу, в частности нейтральную протеиназу. Это приводит к дезинфекции и отделению отдельных клеток от ткани и вместе с этим к получению дезинфицированного препарата отдельных клеток. Альтернативно в другом предпочтительном варианте осуществления коллагеназа или коллагеназа и протеиназа могут отдельно от по меньшей мере одного антибиотика, предпочтительно от антибиотиков, находящихся в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии, предпочтительно фосфатно-HEPES буферном растворе, находиться в собственном растворителе, например, в буферном растворе, и применяться отдельно от стадии перфузии антибиотиками, то есть после нее.

Согласно данному изобретению применяемый состав антибиотиков находится в жидкой форме, например в виде раствора или суспензии, предпочтительно в виде водного раствора или суспензии, особенно предпочтительно в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии.

В особенно предпочтительном варианте осуществления жидкий состав антибиотиков имеет по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, в частности по меньшей мере три, предпочтительно по меньшей мере четыре или более различных антибиотиков. Данные антибиотики можно выбирать из группы, которая состоит из непенициллиновых β-лактамных антибиотиков, аминогликозидов, гликопептидных антибиотиков и полипептидных антибиотиков.

Применяемые согласно данному изобретению составы антибиотиков в предпочтительном варианте осуществления не имеют отрицательного или ингибирующего действия на применяемую обработку ферментами, в частности на обработку коллагеназой или протеиназой.

В одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения может быть предусмотрено, чтобы состав антибиотиков не содержал коллагеназы и протеиназы.

Предпочтительные применяемые согласно данному изобретению составы антибиотиков, в частности комбинаций антибиотиков, предпочтительно отличаются тем, что они не имеют отрицательного влияния на жизнеспособность и морфологию изолированных клеток.

По меньшей мере один антибиотик, в частности антибиотики, находятся в составе по изобретению в таком количестве, которое способствует тому, что рост, размножение и/или жизнеспособность микроорганизмов, таких как бактерии, предпочтительно таких, которые существуют в транспортной среде донорских органов, по существу уменьшаются или сдерживаются, в то время как жизнеспособность тканей клеток по существу поддерживается.

В связи с данным изобретением под составом антибиотиков понимают состав веществ, который проявляет антибиотическую активность. В связи с данным изобретением под антибиотической активностью понимают повреждающее воздействие, в частности антимикробное повреждающее воздействие, такое как подавление, препятствование размножению, сокращение размножения, сдерживание роста или снижение роста, в частности подавляющее действие на микроорганизмы, в частности бактерии, а именно как на грамположительные, так и на грамотрицательные аэробные и анаэробные бактерии, грибы, простейшие или их продукты размножения, такие как споры или микроорганизмы. Особенно предпочтительно состав антибиотиков особенно эффективен против микроорганизмов, которые существуют в или на донорской ткани, или органе млекопитающего, или в транспортной среде.

Поэтому в связи с данным изобретением под антибиотической активностью предпочтительно понимают, что подавляется жизнедеятельность микроорганизмов, что означает, что состав антибиотиков имеет микробиоцидное, предпочтительно бактерицидное действие. Согласно данному изобретению в одном варианте осуществления данного изобретения антибиотическая активность не обязательно сопровождается микробиоцидным действием, а также может означать то, что микроорганизмы только ограничиваются в их жизненных функциях, например в росте, обмене веществ или размножении, что означает микробостатическое, в частности бактериостатическое, действие.

В связи с данным изобретением под понятием антибиотическая активность также предпочтительно понимают дезинфицирующее действие, что означает, что особенно предпочтительно состав антибиотиков является дезинфицирующим, что означает, что он освобождает применяемые материалы, например ткани и/или клетки, от живых микроорганизмов, предпочтительно полностью или почти полностью, или соответственно уничтожает их. При этом дезинфекция включает не только удаление или уничтожение зародышей, что означает микроорганизмов на ранних стадиях развития, а также микроорганизмов на всех других стадиях развития и состояниях, включая их постоянные формы или инфекционные части микроорганизмов. Под дезинфекцией также понимают существенное уменьшение числа способных к размножению микроорганизмов, в частности то, что остаточное содержание способных к размножению микроорганизмов в единице дезинфицируемого образца составляет самое большее 10^-6 колониеобразующих единиц. В связи с данным изобретением под дезинфекцией также понимают обеззараживание.

В особенно предпочтительном варианте осуществления жидкий состав антибиотиков находится в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии.

Данное изобретение относится также к способу, в котором применяют состав антибиотиков, включающий предпочтительно состоящий из непенициллиновых β-лактамных антибиотиков, аминоглюкозидов, гликопептидных антибиотиков и/или полипептидных антибиотиков предпочтительно в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии. Применяемый согласно данному изобретению состав антибиотиков пригоден, в частности пригоден и предназначен, для проводимой в лабораторных условиях дезинфекции тканей и клеток млекопитающих, предпочтительно тканей, органов или частей органов человека и клеток человека, в частности тканей печени и клеток печени. Дезинфекции изолированных тканей достигают перфузией применяемым согласно данному изобретению составом антибиотика, при этом используют естественную систему сосудов. Таким образом, достигают микробной дезинфекции всех, даже внутренних и труднодоступных частей тканей, а не только их поверхностей. Это особенно важно в случае печени, так как у умершего пациента бактерии в разном количестве проходят стенки кишечника и таким образом могут попадать через систему воротной вены в изымаемые органы посредством перфузии. Также может происходить ретроградная контаминация через систему желчных протоков, которая физиологически находится в открытом контакте с микрофлорой кишечника. Поэтому несмотря на оптимальные технические приемы такую контаминацию нельзя предотвратить полностью и особенно необходимо щадящее и эффективное обеззараживание применяемым согласно данному изобретению составом антибиотика. Кроме того, такая «внутренняя» контаминация при некоторых условиях может вести к тому, что сначала наличие возбудителей не подтверждается в транспортной среде, а высвобождаются они только в процессе ферментативной диссоциации материалов тканей. Поэтому дезинфекция изолированных тканей посредством перфузии составом антибиотика по изобретению приводит к предпочтительному заблаговременному исключению такой «внутренней» контаминации. Без добавления антибиотиков почти 100% препаратов клеток печени, полученных из печени с контаминированной транспортной средой, также подвергаются контаминации. Однако с помощью обеззараживания по изобретению можно получить более 65% дезинфицированных препаратов клеток печени.

Предпочтительно ткани подвергают перфузии в по меньшей мере одной стадии перфузии, предпочтительно в двух, трех, четырех или более стадиях перфузии, например в трех стадиях перфузии. В предпочтительном варианте осуществления можно на каждой стадии перфузии применять от 3 до 5 литров содержащего антибиотики и/или коллагеназу/протеиназу буферного раствора для перфузии, предпочтительно фосфатно-HEPES буферного раствора. Особенно предпочтительно в случае трехстадийной перфузии все три буферных раствора для перфузии, предпочтительно сначала содержащий EGTA или EDTA фосфатно-HEPES буферный раствор, а затем два фосфатно-HEPES буферных раствора, содержат антибиотики, причем коллагеназу/протеиназу предпочтительно применяют только на последней стадии перфузии. Особенно предпочтительно также, чтобы при трехстадийной перфузии только два первых буферных раствора для перфузии содержали антибиотики, а коллагеназа/протеиназа применялась на последней стадии перфузии в не содержащем антибиотики буферном растворе для перфузии.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления состав антибиотиков находится в по меньшей мере двух буферных растворах для перфузии, в частности или именно в по меньшей мере одном содержащем EGTA или EDTA фосфатно-HEPES буферном растворе и по меньшей мере одном фосфатно-HEPES буферном растворе или в других пригодных буферных растворах.

Предпочтительными для перфузии, то есть применяемыми для пропускания через материалы тканей буферными растворами для перфузии являются фосфатно-HEPES (2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил)-этансульфоновая кислота) буферный раствор, а также содержащие EGTA (этиленгликоль-бис-(аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота) или EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) фосфатно-HEPES буферные растворы. Применяемый буферный раствор для перфузии имеет предпочтительно физиологическое значение pH от 7 до 8, особенно предпочтительно от 7,3 до 7,8, в частности 7,5.

В особенно предпочтительном варианте осуществления как продолжительность перфузии, так и продолжительность обработки ферментами составляет от 10 до 360 минут, предпочтительно от 20 до 240 минут, в частности от 30 до 120 минут. В особенно предпочтительном варианте осуществления перфузия тканей и обработка тканей ферментами происходят предпочтительно совместно, в частности в течение от 10 до 360 минут, предпочтительно от 20 до 240 минут, в частности от 30 до 120 минут.

В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления температура как при перфузии, так и при обработке ферментами составляет от 9 до 39°C, предпочтительно от 10 до 37°C, в частности от 25 до 37°C. Во время перфузии и необязательно ферментативной обработки в одном предпочтительном варианте осуществления температуру состава антибиотиков для перфузии и органа, подвергаемого перфузии повышают, особенно предпочтительно с исходной температуры, которая находится в области менее 10°C, например от 4°C до 10°C, до конечной температуры, которая находится в области от 30°C до 39°C, например до 37°C.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения применяемый состав антибиотиков содержит a) по меньшей мере одну коллагеназу или b) по меньшей мере одну коллагеназу и по меньшей мере одну протеиназу, в частности нейтральную протеиназу. При наличии коллагеназы или, соответственно, коллагеназы и протеиназы во время инкубации, в частности перфузии, достигают диссоциации материалов тканей, и таким образом можно получить суспензию отдельных клеток.

Данное изобретение в предпочтительном варианте осуществления предоставляет также способ дезинфекции тканей или получения дезинфицированных препаратов клеток млекопитающих в лабораторных условиях, при этом a) ткань млекопитающего подвергают перфузии составом антибиотика по изобретению при подходящих условиях, в частности в течение подходящего периода времени и при подходящей температуре, b) проводят частично совмещенную во времени с перфузией, что означает одновременно по меньшей мере в течение определенного периода времени, или после перфузии, обработку ферментами для получения суспензии отдельных клеток из ткани и c) получают дезинфицированный препарат клеток.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления данного изобретения предусмотрено полученный с помощью способа по изобретению дезинфицированный препарат клеток подвергать затем по меньшей мере одной, например одной, двум, трем или больше, промывкам, изолированным или совмещенным, которые снижают концентрацию применяемых антибиотиков, ферментов или тех и других, или полностью, или почти полностью удаляют их из полученных препаратов. Особенно предпочтительно по окончании стадии b), например, перед или после стадии c) проводить одну или несколько промывок, предпочтительно не содержащим антибиотиков промывочным буферным раствором. Это приводит к тому, что применяемые в способе по изобретению антибиотики и ферменты полностью или почти полностью удаляются и получают препараты отдельных клеток, пригодные к последующим испытаниям на стерильность.

В предпочтительном варианте осуществления может быть предусмотрено, чтобы полученные дезинфицированные препараты клеток были криоконсервированы для хранения. Для этого препараты хранят в пригодной для кроиконсервации среде при надлежащей низкой температуре.

Согласно данному изобретению можно обнаружить, что с помощью способа по изобретению за достаточно короткое время можно достичь высокого выхода клеток (полученное общее количество клеток), высокого удельного выхода клеток (число клеток на грамм использованной ткани печени), а также высокой жизнеспособности изолированных дезинфицированных клеток печени (количество живых клеток в суспензии).

Применение состава антибиотиков по изобретению приводит преимущественно к тому, что, например, из донорских органов, которые предоставляются для трансплантации, но, однако, являются не пригодными для этого, особенно быстро, щадяще и эффективно можно получить дезинфицированные препараты отдельных клеток, в частности предпочтительно суспензии клеток, например, в питательной среде, которые до сих пор нельзя было получить, в частности из клеток печени.

Способ по изобретению имеет преимущество, заключающееся в том, что проводимая обработка антибиотиками не причиняет вред проводимой либо одновременно, либо после нее обработке ферментами, в частности обработке коллагеназой и/или протеиназой, и сверх того также не влияет отрицательно на проводимый затем контроль стерильности. Поэтому в особенно предпочтительном варианте осуществления применяемые согласно данному изобретению составы антибиотиков пригодны для получения дезинфицированных суспензий клеток из тканей, то есть не соединенных в ткань или орган отдельных клеток в среде носителе. Для прохождения через изолированные ткани млекопитающих или изолированные органы предпочтительно применяют подходящий к размеру ткани или, соответственно, органа объем применяемого согласно данному изобретению состава антибиотиков, находящегося в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии. Данный объем можно установить эмпирически, как это известно специалистам.

Также данное изобретение относится к дезинфицированному препарату клеток, то есть к клеткам, суспензиям клеток или суспензиям отдельных клеток млекопитающих, которые получают способом согласно данному изобретению.

Следующие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.

Данное изобретение разъясняется ближе с помощью следующих примеров. Данные примеры не являются ограничивающими, а скорее служат для более подробного разъяснения преимуществ данного изобретения, которые поясняются конкретными примерами.

Примеры

Пример 1: получение дезинфицированной суспензии клеток печени с одновременной обработкой антибиотиками и ферментами.

A. Проведение

Для получения дезинфицированной суспензии клеток печени из печени получали следующий состав антибиотиков:

Антибиотики в следующих концентрациях добавляли ко всем указанным буферным растворам для перфузии:

Антибиотик	Концентрация
Меропенем	0,2 мг/мл
Ванкомицин	0,05 мг/мл

Непригодную для полной трансплантации печень мультидонора сначала поверхностно 30 минут промывали 5 л содержащего антибиотик фосфатно-HEPES буферного раствора при комнатной температуре, а затем подвергали трем стадиям перфузии следующими объемами содержащих антибиотики буферных растворов, pH 7,25-7,45:

1) 5 л содержащего EDTA фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 10 мин; 20-40°C;

2) 5 л фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 10 мин; 25-40°C;

3) 3 л содержащего коллагеназу/протеазу фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 24 мин; 25-40°C

Концентрация коллагеназы/протеазы: комбинация из 2000 желаемых единиц коллагеназы I и от 400 до 2500 единиц протеазы (клостридиопептидазы I).

Продолжительность перфузии содержащим фермент и антибиотики буферным раствором составляла всего 44 мин. Для перфузии использовали естественную систему сосудов используемой печени.

Во время перфузии температуру органа, подвергающегося перфузии, и окружающей среды медленно повышали с <10°C до 37°C (температура буферного раствора между комнатной температурой и 40°C).

Клетки после изолирования из ткани несколько раз промывали не содержащим антибиотики буферным раствором до тех пор, пока концентрация антибиотиков не составила менее 1/1000 от применяемой концентрации антибиотиков.

Пробы для контроля стерильности брали как из транспортной среды, в которой поставлялся орган, так и из дезинфицированной суспензии клеток после криоконсервации.

B. Результаты

В транспортной среде были обнаружены следующие микроорганизмы: Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii, при этом время в течение непроизвольной инкубации до тех пор, пока не устанавливали рост микробов, так называемое «Time to positivity», составляло 1,67 ч.

В дезинфицированной суспензии клеток по изобретению после криоконсервации даже после 14-дневного термостатирования не обнаруживалось никаких микроорганизмов.

После достаточного количества промывок не содержащим антибиотики буферным раствором можно с полученными суспензиями клеток проводить испытания на стерильность.

Пример 2: Получение дезинфицированной суспензии клеток печени с последовательными обработкой антибиотиками и обработкой ферментами.

A. Проведение

Непригодную для полной трансплантации печень мультидонора сначала поверхностно 3 минуты промывали 5 л содержащего двойную концентрацию антибиотиков фосфатно-HEPES буферного раствора при комнатной температуре, а затем подвергали двум стадиям перфузии содержащими антибиотики буферными растворами и одной следующей стадии перфузии содержащим коллагеназу и не содержащим антибиотики буферным раствором со следующими объемами, pH 7,25-7,45:

1) 10 л содержащего EDTA фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 68 мин; 20-40°C;

2) 5 л фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 10 мин; 25-40°C;

3) 3 л содержащего коллагеназу/протеазу и не содержащего антибиотики фосфатно-HEPES буферного раствора; перфузия 24 мин; 25-40°C.

Концентрация коллагеназы/протеазы: комбинация из 2000 желаемых единиц коллагеназы I и от 400 до 2500 единиц протеазы (клостридиопептидазы I).

Продолжительность перфузии содержащими ферменты и антибиотики буферными растворами составляла всего 102 мин. Для перфузии использовали естественную систему сосудов применяемой печени.

Во время перфузии температуру органа, подвергающегося перфузии, и окружающей среды медленно повышали с <10°C до 37°C (температура буферного раствора между комнатной температурой и 40°C).

Клетки после изолирования из ткани несколько раз промывали не содержащим антибиотики буферным раствором до тех пор, пока концентрация антибиотиков не составила менее 1/1000 от применяемой концентрации антибиотиков.

Пробы для контроля стерильности брали как из транспортной среды, в которой поставлялся орган, так и из дезинфицированной суспензии клеток после криоконсервации.

B. Результаты

В транспортной среде можно было обнаружить Staphylococcus Aureus. Время в течение непроизвольной инкубации до тех пор, пока не устанавливали рост микробов, так называемое «Time to positivity», составляло 3,85 ч.

В дезинфицированной суспензии клеток по изобретению после криоконсервации даже после 14-дневного термостатирования не обнаруживалось никаких микроорганизмов.

После достаточного количества промывок не содержащим антибиотики буферным раствором с полученными суспензиями клеток можно проводить испытания на стерильность.

1. Способ получения дезинфицированного препарата из ткани млекопитающего, включающий следующие стадии:
a) перфузия ткани млекопитающего не содержащим фермент жидким составом антибиотика, содержащим по меньшей мере один антибиотик и находящимся в по меньшей мере одном буферном растворе для перфузии,
b) проведение обработки ткани ферментами без антибиотиков для получения суспензии отдельных клеток, и
c) получение дезинфицированного препарата,
причем обработка ферментами на стадии b) происходит по окончании стадии а) при условии, что клетки не являются эмбриональными клетками человека.

2. Способ по п.1, причем ткань представляет собой ткань печени.

3. Способ по одному из п.1 или 2, причем обработка ферментами представляет собой обработку коллагеназой и/или протеиназой.

4. Способ по п.1, причем продолжительность перфузии на стадии a) составляет от 30 до 120 мин, а температуру во время перфузии повышают.

5. Способ по п.1, причем жидкий состав антибиотиков находится в по меньшей мере двух буферных растворах для перфузии, а именно в по меньшей мере одном содержащим EGTA или EDTA фосфатно-HEPES буферном растворе и в по меньшей мере одном фосфатно-HEPES буферном растворе.

6. Способ по п.1, причем перед стадией a) поверхность ткани промывают жидким составом антибиотиков.

7. Способ по п.1, причем по окончании стадии b) проводят по меньшей мере одну промывку не содержащим антибиотики промывочным буферным раствором.