Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки



Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки
Способ и набор для диагностики гломерулонефрита у кошки

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2564122:

ХИЛЛ'С ПЕТ НЬЮТРИШН, ИНК. (US)

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ диагностики наличия гломерулонефрита у кошки предусматривает измерение уровня экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, в биологическом образце, полученном от кошки. При этом значимое отличие в экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце по сравнению с контрольным значением для экспрессии в образце, полученном от здорового животного, свидетельствует о наличии расстройства почек. В группу изобретений также входит набор для осуществления указанного способа, с возможным использованием для диагностики нуклеотидных последовательностей комплементарных указанным выше генам. Проведение диагностика гломерулонефрита с использованием данной группы изобретений позволяет выявлять и прогнозировать развитие гломерулонефрита на ранних стадиях. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 6 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям, веществам и способам диагностики и/или мониторинга заболеваний и расстройств почек у кошачьих, включая способы диагностики, выработки и контролирования плана лечения и мониторинга состояния в случае расстройства почек, характеризуемого аномальной утратой функции почек, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом, у кошачьих, посредством измерения экспрессии выбранных генов.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит список последовательностей, который был представлен в EFS-Web и включен в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 30 марта 2010 г., названа 8888POUS.txt и имеет размер 7809 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Нефрит является общим термином воспаления почек, которое может представлять собой очаговое или диффузное пролиферативное или деструктивное заболевание, в которое вовлечены клубочки, почечные канальцы или интерстициальная (или соединительная) ткань почек. Нефрит может прогрессировать, проходя ряд стадий, заканчивающихся терминальной стадией заболевания почек или терминальной стадией почечной недостаточности. Наиболее распространенной формой нефрита является гломерулонефрит.

Гломерулонефрит или гломерулярный нефрит («GN») является состоянием, характеризуемым воспалением клубочков или капиллярных петель почки. Состояние встречается в острой, подострой и хронической формах и может быть идиопатическим или вторичным после инфекции, заболевания или воздействия токсина.

Почечная недостаточность означает неспособность почек поддерживать свои нормальные функции. В результате конечные продукты обмена веществ и метаболиты накапливаются в крови. Такие конечные продукты обмена веществ и метаболиты могут отрицательно влиять на большинство систем организма. Нарушения в поддержании водно-электролитного баланса являются характерными в случае почечной недостаточности.

Острая почечная недостаточность может возникать внезапно вследствие травмы, инфекции, воспаления или воздействия нефротоксических веществ. Такое состояние может приводить к обезвоживанию, гипотонии и циркуляторному коллапсу. Острую почечную недостаточность часто делят на три категории: (1) преренальную недостаточность, которая ассоциирована с пониженным почечным кровотоком; (2) интраренальную недостаточность, которая ассоциирована с ишемией и токсинами; и (3) постренальную недостаточность, которая является результатом обструкции мочевыводящих путей.

Хроническая почечная недостаточность заключается в прогрессирующей утрате функции почек, которая в конечном итоге может прогрессировать до терминальной стадии заболевания почек или почечной недостаточности. Вначале хроническая почечная недостаточность проявляется в виде снижения функции почек без ощутимого накопления конечных продуктов метаболизма в крови. По мере замедления скорости клубочковой фильтрации вследствие воспаления конечные продукты начинают накапливаться. Заболевание прогрессирует до уремии вследствие пониженной функции почек, и высокие уровни белковых конечных продуктов начинают накапливаться и нарушать функции организма. Распространенные причины хронической почечной недостаточности включают: воспаление, инфекцию, обструкцию мочевых путей и некоторые системные заболевания и токсические явления, включая гиперкальцемию, красную волчанку, сахарный диабет и гипертонию.

Для терминальной стадии заболевания почек характерна необратимая хроническая почечная недостаточность. Уровни креатинина в сыворотке и азота мочевины в крови продолжают повышаться, и в результате уремия нарушает все системы организма. Почка может подвергаться непрерывной и почти полной потере функции, порядка 10% или меньше от нормальной функции почки. Одной из причин терминальной стадии заболевания почек является гломерулонефрит. Другие причины включают причины, указанные для хронической почечной недостаточности.

Клубочки являются одним из структурных компонентов нефрона почки и состоят из мелких кровеносных сосудов, часто описываемых как капиллярный пучок или гроздь. Нефрон является основной структурной и функциональной единицей почки, которая также состоит из структуры, известной как мальпигиева капсула или капсула Боумена, а также содержит артериолы и канальцы. Капсула Боумена содержит клубочковые петли и почечный каналец. Клубочки содержат очень мелкие капилляры, поэтому поток крови через такие сосуды является очень медленным, и молекулы крови могут легко осаждаться на стенках таких тонких капилляров. Почечные канальцы состоят из базальной мембраны и эпителиальной выстилки и служат для секреции, сбора и проведения мочи.

Клубочек функционирует в качестве фильтра в нефроне. Вода и небольшие молекулы в крови проходят через клубочек и фильтруются через структуру, называемую базальной мембраной, которая образована базальными мембранами клубочка и капсулы Боумена. Фильтрат, содержащий воду и небольшие молекулы, проходит через почечный каналец, подвергаясь абсорбции и реабсорбции перед тем как, наконец, превратиться в мочу. Базальная мембрана имеет поры разного размера, которые служат для фильтрации небольших молекул и предотвращения прохождения через базальную мембрану более крупных молекул. Специальной функцией нефрона является удаление из плазмы некоторых конечных продуктов метаболизма, таких как мочевая кислота, мочевина и креатинин, а также электролиты, например, ионы натрия, хлора и калия. Благодаря реабсорбции воды и электролитов нефрон играет важную роль в поддержании нормального водного баланса в организме.

Креатинин является азотсодержащим соединением, образуемым в результате метаболизма креатина. Креатин, в свою очередь, является небелковым веществом, которое синтезируется в организме из трех аминокислот, аргинина, глицина и метионина. Молекула встречается в мышцах в небольших количествах и в сочетании с фосфатом в виде фосфокреатина служит в качестве формы запасания высокоэнергетического фосфата, используемого в различных метаболических процессах. Креатинин всасывается в кровь и, в конце концов, экскретируется в мочу. Таким образом, простой лабораторный тест для измерения креатинина в крови можно использовать для определения функции почек. Тест часто называют тестом клиренса креатинина, и в таком тесте измеряют количество креатинина, выводимого из плазмы в течение заданного промежутка времени. Поскольку креатинин образуется из фосфокреатина в относительно постоянных количествах, повышение уровней креатинина в крови является показателем нарушения почек, т.е., утраты функции почек.

Гломерулонефрит может возникать в результате биологического поражения иммунной системы. Чужеродные вещества могут налипать на базальной мембране и вызывать иммунную реакцию, приводящую к продукции антител. Такие антитела могут объединяться с чужеродными веществами, образуя иммунные комплексы, которые откалываются на стенках тонких клубочковых капилляров, приводя к повреждению нефрона. Альтернативно, у некоторых индивидуумов иммунная система может образовывать аутоантитела, которые представляют собой иммуноглобулины, которые могут атаковать клетки почек, приводя к так называемой аутоиммунной реакции. Если белки в организме изменены, то может возникать ответ в виде аутоантител, поскольку аутоантитела распознают измененные белки как чужие. Такие комплексы аутоантитело-белок, вероятно, могут откладываться на базальной мембране клубочка, вызывая нарушение функционирования нефрона.

Гломерулонефрит является распространенной причиной протеинурии у кошек и может быть в форме либо идиотипического, либо вторичного состояния. В последнем случае состояние может развиваться вторично вследствие неоплазии, воспалительных заболеваний, эндокринных проявлений, инфекций или наследственной нефропатии. Как и у людей, гломерулонефрит у кошек часто опосредован иммунологически с вовлечением иммуноглобулинов и факторов комплемента в организме животного. В клубочках почки возникает повреждение, приводящее к морфологическим изменениям клубочков. В конечном итоге повреждение становится необратимым и приводит к нарушению функции нефрона.

Гломерулонефрит охарактеризован в научной литературе в различных формах на основе имеющих место гистопатологических изменений. Мембранозный гломерулонефрит заключается в утолщении базальной мембраны клубочков. Пролиферативный или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит характеризуется пролиферацией клеток в мезангиальном матриксе. Мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит заключается в сочетании указанных выше изменений. Гломерулосклероз характеризуется повышенным образованием и рубцеванием матрикса. В некоторых случаях имеются минимальные изменения клубочков и только небольшое повышение пролиферации мезангиальных клеток.

Был разработан ряд способов для исследования дифференциальной экспрессии генов, например, микроматрицы ДНК, секвенирование с использованием маркерных экспрессируемых последовательностей (EST), серийный анализ экспрессии генов (SAGE), вычитающая гибридизация, вычитающее клонирование и дифференциальный дисплей (DD) мРНК, произвольно РНК-праймируемая ПЦР (RAP-ПЦР), ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР), репрезентативный дифференциальный анализ (RDA), двумерный гель-электрофорез, масс-спектрометрия и основанное на микроматрице белков связывание антител к белкам.

Из-за сложности биологических путей, вовлеченных в заболевание почек, и имеющихся молекулярных взаимодействий и процессов межклеточной передачи сигналов, весьма желательно понять взаимодействия, которые имеют место, на генетическом уровне. Определение генов с нарушенной регуляцией на ранних стадиях утраты функции почек у кошачьих полезно для понимания биологии почечного заболевания, особенно гломерулонефрита на основе анализа всего генома. Тот факт, что нарушение регуляции генов можно выявить на ранней стадии развития заболевания у животных, подвергаемых повторному ишемическому поражению, полезен для разработки способов диагностики, и выработки плана и мониторинга лечения аномальной утраты функции почек, почечной недостаточности, пониженной скорости клубочковой фильтрации или гломерулонефрита у кошек.

Более детальное понимание вовлеченных биологических путей с использованием получения профилей экспрессии генов поможет разработать диагностические способы, реагенты и наборы для тестирования, а также полезные средства фармацевтического, нутрицевтического и пищевого (диетарного) вмешательства в патологические пути. Такие способы могут обеспечить возможность раннего выявления и потенциального предотвращения или лечения лежащего в основе заболевания почек, в частности, гломерулонефрита, а также мониторинга прогноза почечной недостаточности и гломерулонефрита на ранней стадии, особенно у кошачьих. Гены с нарушенной регуляцией, вовлеченные в патологию таких расстройств, могут служить в качестве важных биомаркеров для диагностики и возможного предотвращения или лечения расстройства и для оптимизации подбора подходящих средств для фармацевтического, нутрицевтического и пищевого (диетарного) вмешательства.

Уровень экспрессии генов и/или определение уровня функционирования экспрессированного генного продукта у кошек можно использовать для подбора соответствующего средства для терапевтического или профилактического применения. Такие данные могут быть использованы специалистом для выбора подходящих лекарств в качестве средств профилактики или лечения почечных заболеваний у кошек посредством определения профиля экспрессии генов. Данные и анализ экспрессии генов также можно применять для подбора состава кормов, пищевых добавок и нутрицевтиков, оказывающих благотворное действие на эффективность работы почек, посредством использования биомаркеров, являющихся показателями нормального функционирования почек.

До настоящего времени была проведена очень ограниченная работа по скринингу генома кошек в отношении профилей экспрессии генов в связи с диагностикой заболеваний у кошек. Исследования на здоровых популяциях кошек по сравнению с популяциями, имеющими заболевание, такое как заболевание почек и утрата функции почек, которые описаны в настоящей публикации, ранее широко не проводились. Имеется мало данных в отношении профиля экспрессии генома кошек, особенно в отношении развития заболеваний почек у кошек с течением времени.

Почечная недостаточность является лидирующей причиной смертности у кошек. Чтобы эффективно лечить заболевание почек, важно решать проблему раньше того, как почка будет серьезно повреждена. К тому моменту, когда у субъекта наблюдаются признаки почечной недостаточности, повреждение вполне может быть необратимым. Это может являться проблематичным, поскольку заболевание почек на таких ранних стадиях может не иметь никаких явных симптомов. Соответственно, существует потребность в улучшенных способах идентификации животных на ранних стадиях заболевания почек, так чтобы их можно было соответствующим образом лечить, например, обеспечивая им соответствующее питание в случае идиопатических состояний и/или условия лечения, например, инфекции или аутоиммунного заболевания, которые могут вносить вклад в проблему, чтобы помочь обратить или, по меньшей мере, замедлить и подавить прогрессирование состояния.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам диагностики, выработки и контролирования плана лечения и мониторинга состояния расстройства почек, характеризуемого аномальной утратой почечной функции, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом у кошек, при этом расстройство почек можно выявить с использованием, по меньшей мере, одного релевантного биомаркера, выделенного и измеренного из биологического тестируемого образца, взятого у такой кошки, при этом экспрессия биомаркера положительно или отрицательно коррелирует с заболеванием. Биомаркер, подходящий для практического осуществления композиций и способов согласно настоящему изобретению, включает полинуклеотид или белок, присутствующий в таком биологическом тестируемом образце от такой кошки. Биологический тестируемый образец для практического осуществления способа согласно изобретению может содержать, например, образец ткани почки такой кошки. Биомаркеры также выбирали на основе их секреции, так чтобы их можно было выявлять в сыворотке или плазме крови или в моче. Соответственно биологическим тестируемым образцом также может быть образец биологической жидкости, взятый у такой кошки, например, крови или мочи.

Изобретение отчасти основано на открытии того, что конкретные профили экспрессии генов у кошек коррелируют с изменением у такого животного биологического процесса в почке от нормального до аномального, что может приводить к снижению функции почек с течением времени. Корреляция конкретного профиля экспрессии генов со снижением почечной функции может быть предсказана, выявлена и диагностирована у кошки без осуществления обычной клинической диагностики на основе известных в данной области клинических признаков и симптомов заболевания почек. Следовательно, измененный профиль экспрессии генов у кошки является прогностическим признаком снижения почечной функции, которое в ином случае может быть диагностировано в более поздний период времени благодаря известным в данной области измерениям функции почек. Такие известные в данной области измерения функции почек обычно могут включать, например, одно из следующих измерений: скорости клубочковой фильтрации, скорости клиренса креатинина, уровней белков в моче, уровней креатинина в сыворотке, уровней креатинина в моче, уровней азота мочевины в крови (BUN), мечения метаболитов радиоактивными изотопами, томографию мягких тканей, включая сонографию, магнитно-резонансную томографию и/или компьютерную томографию. Неинтрузивные анализы, такие как анализы креатинина в сыворотке и уровней BUN, обычно плохо коррелируют с гистопатологией почек и, в общем, не могут быть прогностическим признаком будущих изменений в почке.

Изобретение относится, например, к способам измерения наличия расстройства почек, характеризуемого аномальной утратой почечной функции, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом, включающим в себя оценку уровня генной экспрессии или активности, по меньшей мере, одного гомологичного гена кошек или продукта трансляции такого гена, выбранного из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5); люмикана (LUM); декорина (DCN); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1); и матриксной металлопротеиназы-2, -7 и -19 (MMP2, MMP7 и MMP19).

Изобретение относится, например, к способам измерения наличия расстройства почек, характеризуемого аномальной утратой почечной функции, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом, включающим в себя оценку уровня генной экспрессии или активности, по меньшей мере, одного гомологичного гена кошек или продукта трансляции такого гена, выбранного из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5); и, необязательно, второй группы, по меньшей мере, одного гомологичного гена кошек или продукта трансляции такого гена, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM); декорина (DCN); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1); и матриксной металлопротеиназы-2, -7 и -19 (MMP2, MMP7 и MMP19).

В одном варианте настоящее изобретение относится к одному или нескольким генам или участкам генов («гены» имеют значение, которое определено в настоящем описании), которые по-другому экспрессируются у отклоняющихся от нормы животных по сравнению с нормальными животными. Изобретение основано на открытии полинуклеотидов, которые по-другому экспрессируются у животных с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными животными. Гены идентифицировали посредством сравнения экспрессии генов в образцах ткани, взятых у животных, которых диагностировали как животных с отклонениями от нормы, с генами в образцах ткани от животных, которые диагностированы как нормальные, с использованием методики Affymetrix GeneChip®.

Полинуклеотиды и гены идентифицировали, измеряя различия в экспрессии генов в образцах тканей, взятых от кошек, которых диагностировали как животных с отклонениями от нормы и имеющих расстройство почек, и экспрессии генов в образцах тканей от кошек, которые диагностировали как нормальных. Изменения в экспрессии генов можно определять любым способом, известным специалистам в данной области. В общем, изменения в экспрессии генов определяют, измеряя транскрипцию (определяя количество мРНК, продуцируемой геном) или измеряя трансляцию (определяя количество белка, продуцируемого геном). Количество РНК или белка, продуцируемого геном, можно определить, используя любой способ, известный специалистам в данной области для количественной оценки полинуклеотидов и белков.

Обычно экспрессию мРНК определяют, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (включая без ограничения ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественную ПЦР в реальном времени (кПЦР)), матрицы коротких и длинных олигонуклеотидов, матрицы кДНК, EST-секвенирование, Нозерн-блоттинг, SAGE, MPSS, MC, матрицы на шариках и другие способы гибридизации. Измеряемая РНК обычно находится в форме мРНК или обратно транскрибированной мРНК.

Экспрессию белка или полипептида определяют, используя различные колориметрические и спектроскопические анализы и способы, такие как количественные Вестерн-блоты, ELISA, двумерные гели, газовая или жидкостная хроматография, масс-спектроскопия, анализ по Лоури, биуретовый анализ, флуоресцентные анализы, турбидиметрические способы, бицинхониновый анализ, методику белковых чипов, поглощение инфракрасного излучения, нингидриновый анализ, анализ по Бредфорду и поглощение ультрафиолетового излучения.

Генные чипы обеспечивают возможность крупномасштабного исследования биологических процессов и измерения активности в клетке в определенной временной точке. Анализ микроматриц позволяет оценивать различия в фенотипах на генетической основе в крупном масштабе. Фактическое измерение продуктов экспрессии генов является более точным показателем функционирования гена, чем определение последовательностей как таковых. Анализ на микроматрицах основан на количественном определении концентрации РНК-транскрипта гена в клетке в данный момент времени. ДНК иммобилизуют на среде и меченую мРНК-мишень гибридизуют с зондами на матрице. Связывание меченой мРНК с зондами измеряют, используя лазерный анализ. Измерение представляет собой подсчет испускаемых фотонов. Весь чип сканируют и получают цифровые изображения. Изображение обрабатывают, чтобы определить положение зондов и получить измерения интенсивности для каждого зонда. Таким образом можно определить подвергаемые повышающей и понижающей регуляции гены. Анализ позволяет специалисту найти группы генов со сходными профилями экспрессии и определить ткани со сходными профилями экспрессии. Таким образом можно идентифицировать гены, которые объясняют наблюдаемые различия.

Для генных чипов Affymetrix обычно используют зонды длиной 25 п.н. и наборы зондов, состоящие из 11-20 зондов, соответствующих конкретному гену или EST. Чип конструируют с идеально совпадающим и несовпадающим зондом, каждый из которых имеет длину 25 п.н., при этом первый является абсолютно комплементарным конкретной области гена, а последний имеет замену 13-ой п.н. для получения ошибочного спаривания. Используют алгоритм суммирования зондов, чтобы определить поправку на фон, осуществить нормализацию и суммирование зондов, который представляет собой преобразование значений, полученных для зондов с получением значений экспрессии для набора зондов. RMA является одним из алгоритмов, который можно использовать для такой цели. Алгоритм осуществляет две последние стадии анализа, нормализацию и суммирование измерений интенсивности на уровне зондов. Следовательно, идеально совпадающие значения являются скорректированными относительно фона, нормализованы и суммированы с получением набора измерений экспрессии.

Исходные данные анализируют, используя компьютерную программу GeneSpring версии 7.0 (GS) (Agilent Corporation), и подтверждают, используя бесплатное программное обеспечение R-Bioconductor (RB). Оба пакета компьютерных программ использовали для расчета интенсивностей для зондов из CEL-файлов, созданных на приборе Affymetrix. Наличие/отсутствие/пограничные сигналы на зонд и P-значения оценивали, используя компьютерные программы R-Bioconductor и GeneSpring по отдельности.

В общем, по-разному экспрессируемые гены у животных с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными животными определяют, измеряя экспрессию, по меньшей мере, одного гена. Предпочтительно измеряют экспрессию двух или более дифференциально экспрессируемых генов, чтобы получить картину экспрессии генов или профиль экспрессии генов. Более предпочтительно измеряют экспрессию множества дифференциально экспрессируемых генов, чтобы получить дополнительную информацию для более значимой картины или профиля экспрессии генов.

Настоящее изобретение относится к множеству маркеров, которые вместе или в отдельности являются или могут быть использованы в качестве маркеров заболевания почек. В особенно применимых вариантах осуществления изобретения можно выбрать множество таких маркеров, и экспрессия их мРНК может быть измерена одновременно, чтобы получить профили экспрессии для применения в различных аспектах изобретений, описанных в настоящей заявке. В предпочтительном варианте предлагаемых способов и композиций, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 маркеров выбраны из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), и могут быть использованы для определения профилей экспрессии генов, применяемых при практическом осуществлении способов согласно изобретению. Каждый маркер может быть, в частности, связан с определенными аспектами заболевания почек.

Настоящее изобретение относится к множеству маркеров, которые вместе или в отдельности являются или могут быть использованы в качестве маркеров заболевания почек. В другом особенно применимом варианте осуществления изобретения может быть выбрано множество таких маркеров, и экспрессия их мРНК может быть измерена одновременно для получения профилей экспрессии для применения в различных аспектах изобретений, описанных в настоящей заявке. В предпочтительном варианте предлагаемых в настоящем изобретении способов и композиций, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 маркеров выбраны из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей из, по меньшей мере, одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), и могут быть использованы для определения профилей экспрессии генов, применяемых при практическом осуществлении способов согласно изобретению. Каждый маркер может быть, в частности, связан с некоторыми аспектами заболевания почек.

В другом аспекте изобретение относится к устройству, подходящему для детекции экспрессии множества генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками. Устройство включает в себя подложку, имеющую множество олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов согласно настоящему изобретению, фиксированных на подложке в известных положениях. Устройство по существу представляет собой иммобилизованный вариант олигонуклеотидных или полинуклеотидных зондов, описанных в настоящей публикации. Устройство применимо для быстрой и специфичной детекции генов и полинуклеотидов и картин и профилей их экспрессии. Обычно такие зонды связаны с подложкой или сходным твердым носителем, и образец, содержащий один или несколько полинуклеотидов (например, ген, продукт ПЦР, продукт лигазной цепной реакции (LCR), последовательность ДНК, которая была синтезирована с использованием способов амплификации, или их смесь) подвергают воздействию зондов, чтобы полинуклеотид(-ы) в образце мог гибридизоваться с зондами. Зонды, полинуклеотид(-ы) в образце, или и то и другое метят, обычно флуорофором или другой меткой, такой как стрептавидин, и выявляют, используя способы, известные специалистам в данной области. Если метят полинуклеотид(-ы) в образце, то гибридизацию можно выявлять, регистрируя связанную флуоресценцию. Если метят зонды, то гибридизацию обычно выявляют, используя гашение метки. Если метят и зонд и полинуклеотид(-ы) в образце, то гибридизацию обычно выявляют, наблюдая за сдвигом окраски, возникающим в результате близости двух связанных меток. Множество методик мечения и меток известны специалистам в данной области, в частности, в случае флуоресцирующих меток. Предпочтительно зонды иммобилизуют на подложках, подходящих для создания матрицы (известных под несколькими названиями, включая микроматрицу ДНК, генный чип, биочип, ДНК-чип и генную матрицу), сравнимых с подложками, известными в данной области.

Способы определения количества или концентрации белка в образце известны специалистам в данной области. Такие способы включают радиоиммуноанализы, анализы конкурентного связывания, Вестерн-блот-анализ и анализы ELISA. В случае способов, в которых используют антитела, подходящими являются поликлональные и моноклональные антитела. Такие антитела могут быть иммунологически специфичными для белка, эпитопа белка или фрагмента белка.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используют антитела для выявления и количественной оценки белков, продуцируемых при экспрессии полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. Хотя белки можно выявлять с использованием иммунопреципитации, аффинного разделения, Вестерн-блот-анализа, белковых матриц и тому подобного, при этом в предпочтительном способе используют методику ELISA, в которой антитело иммобилизуют на твердой подложке, и белок-мишень или пептид подвергают взаимодействию с иммобилизованным антителом. Либо зонд, либо мишень, либо и то и другое можно метить, используя известные способы.

В следующем аспекте изобретение относится к способу выявления в образце дифференциальной экспрессии одного или нескольких генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками. Способ включает в себя (a) гибридизацию сочетания, содержащего множество полинуклеотидных зондов, которые по-разному экспрессируются у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками, с полинуклеотидами в образце с образованием одного или нескольких гибридизационных комплексов; (b) необязательно гибридизацию сочетания, содержащего множество полинуклеотидных зондов, которые по-разному экспрессируются у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками, с полинуклеотидами в стандарте с образованием одного или нескольких гибридизационных комплексов; (c) выявление гибридизационных комплексов в образце и, необязательно, в стандарте со стадии (b); и (d) сравнение гибридизационных комплексов в образце с гибридизационными комплексами в стандарте, при этом различие в количестве гибридизационных комплексов между стандартом и образцом свидетельствует о дифференциальной экспрессии в образце генов, по-другому экспрессируемых у животных с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными животными.

Стадия (b) и часть стадии (c) являются необязательными, и их используют в том случае, если необходимо осуществить относительно одновременное сравнение двух или более тест-систем. Однако в предпочтительном варианте стандарт, используемый для сравнения, основан на данных, полученных ранее с применением такого способа.

Указанные зонды выдерживают с образцом для образования гибридизационных комплексов, которые выявляют и сравнивают с гибридизационными комплексами стандарта. Различия между гибридизационными комплексами в образце и стандарте свидетельствуют о дифференциальной экспрессии в образце полинуклеотидов и, следовательно, генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками. В предпочтительном варианте получают зонды для специфичного выявления полинуклеотидов или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицированными в настоящем изобретении. Способы выявления гибридизационных комплексов известны специалистам в данной области.

В другом аспекте изобретение относится к способу выявления в образце дифференциальной экспрессия генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками. Способ включает в себя (a) взаимодействие сочетания, содержащего множество полипептидных зондов с белками в образце в условиях, которые обеспечивают возможность осуществления специфичного связывания между зондами и белками, при этом белки, связываемые зондами по-разному экспрессируются у кошки с отклонениями от нормы по сравнению с нормальной кошкой; (b) необязательно взаимодействие сочетания, содержащего множество полипептидных зондов с белками в стандарте в условиях, которые обеспечивают возможность осуществления специфичного связывания между зондами и белками, при этом белки, связываемые зондами, по разному экспрессируются у кошки с отклонениями от нормы по сравнению с нормальной кошкой; (c) выявление специфичного связывания в образце и необязательно в стандарте со стадии (b); и (d) сравнение специфичного связывания в образце со специфичным связыванием в стандарте, при этом различия между специфичным связыванием в стандарте и образце свидетельствуют о дифференциальной экспрессии в образце генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками.

Указанные зонды подвергают взаимодействию с образцом, чтобы происходило специфичное связывание, которое выявляют и сравнивают со специфичным связыванием в стандарте. Различия между специфичным связыванием в образце и стандарте свидетельствуют о дифференциальной экспрессии в образце белков и, следовательно, генов, по-разному экспрессируемых у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками, особенно генов, ассоциированных с отклонениями от нормы. В предпочтительном варианте получают зонды для специфичного выявления белков или их фрагментов, продуцируемых одним или несколькими генами или фрагментами генов, идентифицированными в настоящем изобретении.

В одном варианте способ дополнительно включает в себя воздействие на кошку или образец тестируемым веществом перед взаимодействием полипептидов с белками. Затем сравнение является показателем того, изменяет ли тестируемое вещество экспрессию в образце генов, по-разному экспрессированных у кошек с отклонениями от нормы по сравнению с нормальными кошками, особенно генов, ассоциированных с отклонениями от нормы.

Животных, у которых способами согласно настоящему изобретению диагностировано наличие заболеваний почек, например, таких как гломерулонефрит, предпочтительно содержат на защищающем почки рационе. Защищающие почки рационы включают, например, рационы, которые описаны выше и в WO 20067119049 A2, WO 2006/071952, содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Таким образом, изобретение относится к способу (способу 1) диагностики наличия заболевания почек у кошек, включающему в себя измерение уровня экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана (LUM); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1); декорина (DCN); секретируемого родственного frizzled белка 2 (SFRP2); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5); MMP-2; MMP-7 и MMP-19, в биологическом образце, взятом у кошки, при этом различия в экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце по сравнению с контрольным значением для экспрессии в образце от нормального животного свидетельствует о наличии заболевания почек, например, согласно любому из следующих способов:

1.1. Способ 1, в котором уровень экспрессии одного или нескольких биомаркеров определяют измерением экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров с использованием либо (i) ДНК-микроматрицы, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, комплементарных мРНК или кДНК, соответствующей одному или нескольким биомаркерам, которые необходимо измерить, либо (ii) количественной полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами для мРНК или кДНК, соответствующим одному или нескольким биомаркерам, которые необходимо измерить, например,

a. Указанный выше способ, в котором стадия измерения экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров включает в себя (i) выделение РНК из образца ткани, (ii) обратную транскрипцию РНК для получения соответствующей кДНК, (iii) выделение и фрагментацию кДНК, полученной таким образом, (iv) осуществление контакта фрагментов кДНК с ДНК-микроматрицей, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, комплементарных кДНК, соответствующей одному или нескольким биомаркерам, которые необходимо измерить, и (v) выявление гибридизации между фрагментами кДНК и одним или несколькими олигонуклеотидами на ДНК-микроматрице.

b. Указанный выше способ, в котором олигонуклеотиды на ДНК-микроматрице содержат один или несколько зондов, способных гибридизоваться с одной или несколькими последовательностями SEQ ID NO: 9-16.

c. Указанный выше способ, в котором олигонуклеотиды на ДНК-микроматрице содержат один или несколько зондов, содержащих последовательности, выбранные из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 1-8.

d. Любой из предшествующих способов, включающий в себя выявление гибридизации, где гибридизацию между фрагментами кДНК и одним или несколькими олигонуклеотидами на ДНК-микроматрице проводят в жестких условиях.

1.2. Способ 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют с использованием антитела к экспрессированному белку.

a. Способ 1.2, в котором биомаркер выявляют с использованием иммуноанализа, выбранного из анализа конкурентного связывания, анализа неконкурентного связывания, радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), «сэндвич»-анализа, реакции преципитации, анализа иммунодиффузии в геле, анализа агглютинации, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа, иммуноанализа иммуно-ПЦР, иммуноанализа с использованием белка A или белка G и иммуноэлектрофоретического анализа.

b. Указанный выше способ, который представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

c. Способ 1.2, в котором анализ представляет собой анализ на основе латеральной проточной иммунохроматографии.

d. Способ 1.2, в котором биологическим образцом является кровь или моча.

1.3. Способ 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют, используя количественную масс-спектроскопию, измеряющую экспрессированный белок в биологическом образце, например, когда биологическим образцом является кровь или моча.

1.4. Способ 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют, используя узнавание аптамером экспрессированного белка.

a. Способ 1.4, в котором аптамером является олигонуклеотид.

b. Способ 1.4, в котором аптамером является пептид.

c. Способ 1.4, в котором биологическим образцом является кровь или моча.

1.5. Любой из предшествующих способов, в котором уровень экспрессии одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце по сравнению с контрольным значением экспрессии в нормальном образце является более чем двукратным, например, более чем пятикратным или составляет менее половины.

1.6. Любой из предшествующих способов, в котором уровень экспрессии одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце выше или ниже, по меньшей мере, в пределах одного стандартного отклонения, чем средняя экспрессия биомаркеров в нормальном образце.

1.7. Любой из предшествующих способов, в котором уровень экспрессии одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце нормализуют по отношению к экспрессии одного или нескольких генов, которые, как известно, имеют относительно постоянную экспрессию.

1.8. Любой из предшествующих способов, в котором биологическим образцом является образец ткани почек.

1.9. Любой из предшествующих способов, в котором биологическим образцом является кровь.

1.10. Любой из предшествующих способов, включающий в себя выявление уровней экспрессии секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающего белка 5 (rbp5).

1.11. Любой из предшествующих способов, включающий в себя выявление уровней экспрессии секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) и, необязательно, уровней экспрессии, по меньшей мере, одного гена, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM); декорина (DCN); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1)); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19).

1.12. Любой из предшествующих способов, в котором расстройство почек находится на ранней стадии, например, когда кошка имеет по существу нормальную функцию почек, например, измеряемую по одному или нескольким из следующих показателей: нормальной скорости клубочковой фильтрации, скорости клиренса креатинина, уровням белка в моче, уровням креатинина в сыворотке, уровням креатинина в моче, уровням азота мочевины в крови (BUN), мечению продуктов метаболизма радиоактивными изотопами, томографии мягких тканей, включая сонографию, магнитно-резонансной томографии и/или компьютерной томографии.

1.13. Любой из указанных выше способов, в котором расстройство почек представляет собой расстройство, характеризуемое аномальной утратой функции почек, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом.

1.14. Любой из указанных выше способов, в котором расстройство почек представляет собой гломерулонефрит.

1.15. Любой из предшествующих способов, в котором расстройство почек показано с использованием значимого различия в экспрессии одного или нескольких из следующих показателей по сравнению с контрольными значениями экспрессии (например, когда «значимым различием» в случае повышенной экспрессии является повышение, по меньшей мере, в два раза, и в случае пониженной экспрессии является понижение, по меньшей мере, на 50%):

повышенной экспрессии люмикана;

повышенной экспрессии цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12;

повышенной экспрессии декорина;

повышенной экспрессии секретируемого родственного frizzled белка 2;

пониженной экспрессии ретинол-связывающего белка 5;

повышенной экспрессии MMP-2;

повышенной экспрессии MMP-7; и/или

повышенной экспрессии MMP-19.

В следующем варианте изобретение относится к способу (способу 2) лечения, ослабления или замедления прогрессирования расстройства почек у кошки, нуждающейся в таком лечении, включающему в себя диагностику наличия расстройства почек, например, с применением способа 1, и т.д., и лечение состояния, например, с помощью определенного рациона питания и/или лекарственного средства. Например, изобретение относится к указанному далее способу.

2.1. Способ 2, включающий в себя предоставление защищающего почки рациона питания, по существу, в качестве единственного рациона питания для кошки, имеющей расстройство почек, которое диагностировано или может быть диагностировано любым из способов 1 и т.д.

2.2. Способ 2 или 2.1, в котором кошка имеет по существу нормальную функцию почек, например, измеряемую по одному или нескольким из следующих показателей: нормальной скорости клубочковой фильтрации, скорости клиренса креатинина, уровням белка в моче, уровням креатинина в сыворотке, уровням креатинина в моче, уровням азота мочевины в крови (BUN), мечению продуктов метаболизма радиоактивными изотопами, томографии мягких тканей, включая сонографию, магнитно-резонансную томографию и/или компьютерную томографию.

2.3. Любой из указанных выше способов, в котором кошка имеет возраст, по меньшей мере, пять лет.

2.4. Любой из указанных выше способов, в котором расстройство представляет собой расстройство, характеризуемое аномальной утратой функции почек, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации или гломерулонефритом.

2.5. Любой из указанных выше способов, в котором расстройством почек является гломерулонефрит.

2.6. Любой из указанных выше способов, в котором кошка была идентифицирована как имеющая заболевание почек.

2.7. Любой из указанных выше способов, в котором кошку содержат на защищающем почки рационе в течение периода времени, составляющего, по меньшей мере, примерно 6 месяцев.

2.8. Любой из указанных выше способов, в котором кошку содержат на защищающем почки рационе в течение периода времени, начинающегося после появления или начального диагноза заболевания почек и продолжающегося, по существу, в течение всей оставшейся жизни кошки.

2.9. Любой из указанных выше способов, в котором защищающий почки рацион питания включает в себя одну или несколько из следующих модификаций по сравнению со стандартным рационом для кошек:

пониженное содержание фосфора,

пониженные уровни белка,

пониженное содержание натрия,

повышенные уровни омега-3 жирных кислот,

повышенные уровни витаминов B-комплекса,

повышенное содержание антиоксидантов.

2.10. Любой из указанных выше способов, в котором защищающий почки рацион включает в себя примерно от 18% до примерно 40% белка, примерно от 0,2% до примерно 0,85% фосфора и примерно от 0,04% до примерно 0,35% натрия на основе сухой массы.

2.11. Любой из указанных выше способов, в котором защищающий почки рацион обеспечивает примерно от 3,6 до примерно 7,9 г/100 ккал ME белка, примерно от 0,04 до примерно 0,17 г/100 ккал ME фосфора и примерно от 0,008 до примерно 0,07 г/100 ккал ME натрия.

2.12. Любой из указанных выше способов, в котором защищающий почки рацион включает в себя сухой корм, содержащий белок в количестве примерно от 5% до примерно 40%, фосфор в количестве примерно от 0,01% до примерно 2% и натрий в количестве примерно от 0,01% до примерно 2% из расчета «на готовый корм».

2.13. Любой из указанных выше способов, в котором защищающий почки рацион включает в себя влажный корм, содержащий белок в количестве примерно от 4% до примерно 12%, фосфор в количестве примерно от 0,03% до примерно 0,2% и натрий в количестве примерно от 0,03% до примерно 0,2% из расчета «на готовый корм».

В следующем варианте изобретение относится к реагентам, необязательно меченым, применимым для выявления уровня экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7; и MMP-19, у кошки, например, к указанным ниже реагентам.

a. Антитела, например, моноклональные антитела, одноцепочечные антитела и функциональные фрагменты антител, распознающие белки кошек, выбранные из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19.

b. Аптамеры, например, нуклеиновая кислота или пептидные аптамеры, распознающие белки кошек, выбранные из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19.

c. Изолированный и очищенный рекомбинантный белок кошек, выбранный из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19.

d. Олигонуклеотидные зонды, способные к гибридизации с геном кошек, выбранным из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, например, способные к гибридизации с одной или несколькими последовательностями SEQ ID NO: 9-16, например, выбранные из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 1-8.

В следующем варианте, изобретение относится к набору (набору 1) для диагностики, прогнозирования или мониторинга расстройства почек у кошек, содержащему

a) средства для измерения экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, в биологическом образце, полученном от кошки, и

b) инструкции по применению таких средств для измерения экспрессии одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от кошки, и оценке наличия процесса, приводящего к расстройству почек у кошки. Например:

1.1. Набор 1, в котором средства для измерения одного или нескольких биомаркеров представляет собой один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров.

1.2. Набор 1.1, в котором один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с одной или несколькими последовательностями SEQ ID NO: 9-16, например, в жестких условиях.

1.3. Набор 1.2, в котором один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот содержат последовательность или последовательности, выбранные из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 1-8.

1.4. Любой из предшествующих наборов, содержащий ДНК-микроматрицу, которая содержит один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров.

1.5. Набор 1, в котором средства для измерения одного или нескольких биомаркеров представляют собой одно или несколько антител, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров благодаря узнаванию экспрессированного белка.

1.6. Набор 1.5 в форме ELISA, содержащий антитело, способное выявлять один или несколько биомаркеров; выделенный очищенный или рекомбинантный белок, соответствующий экспрессированному белку; и буфер.

1.7. Набор 1, в котором средства для измерения одного или нескольких биомаркеров представляют собой один или несколько аптамеров, например, описанных в настоящей публикации выше, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров благодаря узнаванию экспрессированного белка.

1.8. Любой из указанных выше наборов, в котором один или нескольких биомаркеров включают секретируемый родственный frizzle белок-2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающий белок 5 (rbp5).

1.9. Любой из указанных выше наборов, адаптированный для применения в любом из указанных выше способов: способе 1 и т.д. или способе 2 и т.д.

Кроме того, изобретение относится к применению

нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной гену кошачьего люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, например, нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-16, или

антитела к белку, выбранному из кошачьего люмикана; цепи коллагена альфа 1(III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, или

аптамера к белку, выбранному из кошачьего люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19, или

изолированного, очищенного или рекомбинантного кошачьего люмикана; цепи коллаген альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; MMP-2; MMP-7 и MMP-19,

в способе, соответствующем способу 1 и т.д. или способу 2 и т.д., или в производстве набора, соответствующего набору 1, и т.д.

Дополнительные области применимости настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания, приведенного далее. Следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и показывают предпочтительный вариант осуществления изобретения, предназначены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1a является графиком зависимости кратного изменения геометрического среднего от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, подобного мРНК предшественника люмикана (кератансульфатный протеогликан люмикан) Canis familiaris.

Фигура 1b является графиком зависимости геометрической средней интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, подобного мРНК предшественника люмикана (кератансульфатный протеогликан люмикан) Canis familiaris.

Фигура 2a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, подобного мРНК коллагена альфа 1 (III) Equus caballus.

Фигура 2b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, подобного мРНК коллагена альфа 1 (III) Equus caballus.

Фигура 3a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии кошачьего гена, сходного с полной мРНК декорина Canis lupus familiaris.

Фигура 3b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии кошачьего гена, сходного с полной мРНК декорина Canis lupus familiaris.

Фигура 4a представляет собой график кратного изменения геометрической средней интенсивности от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена секретируемого родственного frizzled белка 2 Canis lupus familiaris.

Фигура 4b представляет собой график зависимости географической средней RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена секретируемого родственного frizzled белка 2 Canis lupus familiaris.

Фигура 5a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, сходного с мРНК матриксной металлопротеиназы 2 Canis familiaris.

Фигура 5b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, сходного с мРНК матриксной металлопротеиназы 2 Canis familiaris.

Фигура 6a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена PUMP-1 Felis domesticus.

Фигура 6b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена PUMP-1 Felis domesticus.

Фигура 7a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена Mucaca mulatta.

Фигура 7b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии мРНК гена Mucaca mulatta.

Фигура 8a представляет собой график зависимости кратного изменения геометрической средней от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии кошачьего гена, сходного с геном ретинол-связывающего клеточного белка 5 Canis familiaris.

Фигура 8b представляет собой график зависимости средней геометрической интенсивности RMA от стадии гломерулонефрита у кошки в случае экспрессии гена, сходного с геном ретинол-связывающего клеточного белка 5 Canis familiaris.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее описание предпочтительных вариантов является только иллюстративным по своему характеру и никоим образом не предназначено для ограничения изобретения, его применимости или применений.

Некоторые определения

В используемом в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают указание и формы множественного числа, если контекст ясно не диктует иное, например, указание «вариант» включает множество вариантов. Кроме того, определяемые термины включают варианты терминов, используемые в правильном грамматическом контексте, например, термин «специфично связывает» включает «специфичное связывание» и другие формы термина. Подобным образом, слова «содержат», «содержит» и «содержащий» необходимо интерпретировать включительно, а не исключительно.

Термин «антитело» означает любой иммуноглобулин, который связывается с конкретным антигеном, включая антитела IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Термин включает поликлональные, моноклональные, моновалентные, гуманизированные, гетероконъюгированные антитела, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, химерные, биспецифичные антитела, диантитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или другие антигенсвязывающие фрагменты.

Термин «матрица» означает упорядоченное расположение, по меньшей мере, двух зондов на подложке. По меньшей мере, один из зондов является контрольным или стандартным, и по меньшей мере, один из зондов является диагностическим зондом. Размещение примерно от двух до примерно 40000 зондов на подложке гарантирует, что размер и интенсивность сигнала каждого меченого комплекса, образованного между зондом и полинуклеотидом или полипептидом в образце будут индивидуально отличаться. Совокупность молекул, осажденных на матрице, может быть получена либо синтетически, либо биосинтетически. Матрица может иметь множество форм, включая библиотеки растворимых молекул, библиотеки соединенных, связанных с шариками из смолы, чипы из дикосида кремния или другие твердые подложки. Матрица нуклеиновых кислот может включать в себя библиотеки нуклеиновых кислот, которые могут быть получены нанесением в виде пятен нуклеиновых кислот по существу любой длины (например, от 1 до примерно 1000 нуклеотидов в длину) на подложку. Матрица зондов нуклеиновых кислот предпочтительно содержит нуклеиновые кислоты, связанные с подложкой в известных положениях. В других вариантах система может включать в себя твердый носитель или подложку, такую как мембрана, фильтр, предметное стекло для микроскопии, микролунка, пробирка, шарик, матрица на шариках или тому подобное. Твердая положка может быть сделана из различных материалов, включая бумагу, целлюлозу, нейлон, полистирол, поликарбонат, пластики, стекло, керамику, нержавеющую сталь или тому подобное. Твердая подложка предпочтительно может иметь жесткую или полужесткую поверхность, и предпочтительно может быть сферической (например, шарик) или по существу плоской (например, плоская поверхность) с подходящими лунками, возвышенными участками, вытравленными впадинами или тому подобным. Твердая подложка также может включать гель или матрикс, в которые могут быть залиты нуклеиновые кислоты.

Термин «биомаркеры» относится к генам и генным продуктам, кодируемым геном согласно изобретению, или их гомологу, особенно к их кошачьему гомологу, при этом определено, что ген по-другому экспрессировался в результате заболевания, состояния, расстройства или введения вещества, лекарственного средства, питательного вещества или компонента рациона или их сочетания, и при этом такие гены и генные продукты согласно изобретению указаны в виде SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 и 16, или к гомологичному гену, включая без ограничения ген кошек. Биомаркер может представлять собой полинуклеотид, полипептид, белок, РНК, включая РНК-транскрипт или продукт его трансляции, ДНК, кДНК, метаболит одного или нескольких из указанных выше молекул или применимый вариант любой из указанных выше молекул, дифференциальная экспрессия которых ассоциирована с расстройством почек, включая без ограничения гломерулонефрит, и при этом сравнение такой дифференциальной экспрессии в образце, взятом от тестируемого животного, с образцом, взятым от контрольного животного, можно применять в диагностике, прогнозировании, мониторинге или лечении состояния, заболевания или расстройства у нуждающегося в этом животного. Кроме того, биомаркер, в общем, можно использовать по отношению к любой части или участку такого гена или белка, который можно идентифицировать или сравнивать с полноразмерным геном или белком, например, в анализе или другом способе согласно изобретению. Экспрессию биомаркера также можно идентифицировать, выявляя трансляцию биомаркера (т.е., выявление белка биомаркера в образце). Способы, подходящие для выявления белка биомаркера, включают любой подходящий способ выявления и/или измерения белков из клеток или клеточного экстракта. Такие способы включают без ограничения, иммуноблот (например, Вестерн-блот), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (РИА), иммунопреципитацию, иммуногистохимию и иммунофлуоресценцию. Особенно предпочтительные способы выявления белков включают любой анализ на отдельных клетках, включая иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализы. Такие способы хорошо известны в данной области. Кроме того, антитела против некоторых биомаркеров, описанных в настоящей публикации, известны в данной области и описаны в опубликованной литературе, и способы их получения хорошо известны специалисту.

Термин «сравнима», который используют для сравнения экспрессии в тестируемом образце и в контрольном образце, должен означать признаки сходного характера и количества и должен включать без ограничения значения в пределах одного стандартного отклонения вокруг среднего значения, по отношению к которому делают указанное сравнение, и значения, охватывающие дифференциальную экспрессию, наблюдаемую в тестируемом образце и контрольном образце.

Термины «дифференциально экспрессируемый ген», «дифференциальная экспрессия генов», «дифференциальная экспрессия» или «дифференциально экспрессируемый» и их синонимы, которые использованы взаимозаменяемо, относятся к гену, экспрессия которого активируется до более высокого или более низкого уровня у субъекта, страдающего от заболевания, состояния или расстройства, или в результате введения вещества, лекарственного средства, питательного вещества или компонента рациона или их сочетания, по сравнению с его экспрессией у здорового или контрольного субъекта. Термины также включают гены, экспрессия которых активируется до более высокого или более низкого уровня на разных стадиях одного и того же заболевания. Также следует понимать, что дифференциально экспрессируемый ген может быть либо активирован, либо ингибирован на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка, или может быть подвергнут альтернативному сплайсингу, приводящему к образованию другого полипептидного продукта. Такие различия можно выявить, например, по изменению уровней мРНК, поверхностной экспрессии, секреции или другому распределению полипептида. Выявление дифференциальной экспрессии генов может включать в себя сравнение экспрессии двух или более генов или их генных продуктов, или сравнение соотношений экспрессии двух или более генов или их генных продуктов, или даже сравнение двух дифференциально процессируемых продуктов одного и того же гена, которые отличаются у здоровых субъектов и субъектов, страдающих от заболевания, состояния или расстройства, или отличаются в результате введения вещества, лекарственного средства, питательного вещества или компонента рациона или их сочетания, или отличаются на разных стадиях одного и того же заболевания, состояния или расстройства или в результате введения разных количеств вещества, лекарственного средства, питательного вещества или компонента рациона, или их сочетания. Дифференциальная экспрессия включает как количественные, так и качественные различия во временной или клеточной картине экспрессии гена или экспрессии его продукта, например, нормальных и пораженных заболеванием клеток или среди клеток, которые были подвергнуты разным патологическим явлениям или на разных стадиях заболевания. В целях настоящего изобретения считают, что имеет место «дифференциальная экспрессия генов», когда имеется, по меньшей мере, примерно 2,0-, 1,9-, 1,8-, 1,7-, 1,6-, 1,5-, 1,4-, 1,3-, 1,2-, 1,1- или 1,0-кратное, предпочтительно, по меньшей мере, примерно двукратное или большее, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 2,5-, 3- или 4-кратное, или большее изменение количества транскрибированных полинуклеотидов или транслированных белков в образце.

Термин «кратное» при использовании в качестве меры дифференциальной экспрессии генов означает количество экспрессии генов у кошки, которое представляет собой многократное количество или долю от экспрессии генов в случае сравнения с количеством экспрессии генов у кошки, используемой для сравнения, например, у кошки, имеющей утрату почечной функции, почечную недостаточность, пониженную скорость клубочковой фильтрации или гломерулонефрит, по сравнению с животным, у которого не наблюдают такого состояния. Например, ген, который экспрессируется в 2 раза больше у данного животного по сравнению с животным, используемым для сравнения, имеет 2-кратную дифференциальную генную экспрессию, и ген, экспрессия которого у данного животного составляет половину от экспрессии у животного, используемого для сравнения, также имеет 2-кратную дифференциальную генную экспрессию.

Термин «фрагмент» означает (1) олигонуклеотидную или полинуклеотидную последовательность, которая составляет часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью в случае конкретного применения, как и полная полинуклеотидная последовательность, или (2) пептидную или полипептидную последовательность, которая составляет часть полной последовательности и которая обладает такой же или сходной активностью в случае конкретного применения, как и полная полипептидная последовательность. Такие фрагменты могут содержать любое количество нуклеотидов или аминокислот, которые, как полагают, подходят для конкретного применения. Обычно фрагменты олигонуклеотидов или полинуклеотидов содержат, по меньшей мере, примерно 10, 50, 100 или 1000 нуклеотидов, и фрагменты полипептидов содержат, по меньшей мере, примерно 4, 10, 20 или 50 следующих друг за другом аминокислот из полной последовательности. Термин охватывает варианты фрагментов полинуклеотидов и полипептидов. Полинуклеотид, например, может быть разрушен или фрагментирован на множество участков.

Различные способы фрагментации нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области. Такие способы могут быть, например, либо химическими, либо физическими по своей природе. Химическая фрагментация может включать частичное разложение ДНКазой; частичную депуринизацию кислотой; использование ферментов рестрикции; участие кодируемых интроном эндонуклеаз; способы расщепления на основе ДНК, такие как способы образования триплексов и гибридов, которые основаны на специфичной гибридизации участка нуклеиновой кислоты для локализации расщепляющего агента в конкретном положении молекулы нуклеиновой кислоты; или использование других ферментов или соединений, которые расщепляют ДНК в известных или неизвестных положениях. Физические способы фрагментации могут включать в себя процесс, в котором ДНК подвергают действию высокой скорости сдвига. Высокие скорости сдвига могут быть получены, например, при движении ДНК через камеру или канал с выемками и выступами, или пропускание образца ДНК под давлением через проходное сечение ограниченного размера, например, через отверстие, имеющее размер поперечного сечения, измеряемый микронной или субмикронной шкалой. Другие физические способы включают обработку ультразвуком и распыление. Также можно использовать сочетания физических и химических способов фрагментации, например, фрагментацию с использованием нагревания и опосредованного ионами гидролиза. См., например, публикацию Sambrook с соавторами, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) («Sambrook с соавторами»), которая включена в настоящее описание в виде ссылки для всех целей. Такие способы могут быть оптимизированы для расщепления нуклеиновой кислоты на фрагменты в выбранном диапазоне размеров. Подходящие диапазоны размеров могут быть от 100, 200, 400, 700 или 1000 до 500, 800, 1500, 2000, 4000 или 10000 пар оснований. Однако также применимы диапазоны больших размеров, такие как от 4000, 10000 или 20000 до 10000, 20000 или 500000 пар оснований.

Термин «ген» или «гены» означает полный или частичный участок ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептида, включая области, предшествующие и следующие за кодирующей областью (лидер и концевой участок) и вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими участками (экзонами). Термин охватывает любую последовательность ДНК, которая гибридизуется с комплементом кодирующих последовательностей гена.

Термин «гомолог» означает (1) полинуклеотид, включая полинуклеотиды того же или другого вида животного, имеющий сходство последовательностей, составляющее более 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с определенным полинуклеотидом и обладающий такими же или по существу такими же свойствами и осуществляющий такую же или по существу такую же функцию, как и полный полинуклеотид, или обладающий способностью специфично гибридизоваться с полинуклеотидом в жестких условиях; или (2) полипептид, включая полипептиды того же или другого вида животного, имеющий сходство последовательностей, составляющее более 30%, 50%, 70%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов, и обладающий такими же или по существу такими же свойствами и осуществляющий такую же или по существу такую же функцию, как и полный полипептид, или обладающий способностью специфично связываться с полипептидом, идентифицированным по экспрессии полинуклеотидов. Сходство последовательностей двух полипептидных последовательностей или двух полинуклеотидных последовательностей определяют, используя способы, известные специалистам, например, алгоритм Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990)). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (Altschul с соавторами, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Gapped Blast, как описано в публикации Altschul с соавторами (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют параметры соответствующих программ по умолчанию (например, XBLAST и NBLAST). См. http://ww.ncbi.nlm.nih.gov.

Термин «гибридизация» относится к процессу, в котором два однонитевых полинуклеотида связываются нековалентно с образованием двунитевого полинуклеотида. Термин «гибридизация» также может относиться к гибридизации трех нитей. Получаемый в результате (обычно) двунитевой полинуклеотид является «гибридом». Долю популяции полинуклеотидов, которые образуют стабильные гибриды, в настоящем описании называют «степенью гибридизации».

Реакции гибридизации можно осуществлять в форме абсолютной или дифференциальной гибридизации. В форме абсолютной гибридизации полинуклеотиды, полученные из одного образца, гибридизуются с зондами на матрице нуклеиновых кислот. Сигналы, регистрируемые после образования гибридизационных комплексов, коррелируют с уровнями полинуклеотидов в образце. В форме дифференциальной гибридизации полинуклеотиды, полученные из двух образцов, метят разными метящими остатками. Смесь таких по-разному меченых полинуклеотидов добавляют к матрице нуклеиновых кислот. Затем матрицу нуклеиновых кислот исследуют в условиях, в которых эмиссию от двух разных меток можно регистрировать по отдельности. В одном варианте используют флуорофоры Cy3 и Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.) в качестве метящих остатков для формы дифференциальной гибридизации.

Сигналы, полученные от матриц нуклеиновых кислот, можно анализировать, используя коммерчески доступную компьютерную программу, такую как программы, предоставляемые Affymetrix или Agilent Technologies. Контроли, такие как контроли чувствительности сканирования, мечения зондов и дискретизации кДНК или кРНК, предпочтительно включают в эксперименты по гибридизации. Сигналы гибридизации можно масштабировать или нормализовать перед тем, как подвергнуть субъекта следующему анализу. Например, сигналы гибридизации для каждого отдельного зонда можно нормализовать, чтобы учесть вариации интенсивности гибридизации в случае использования более чем одной матрицы в сходных условиях тестирования. Сигналы гибридизации также могут быть нормализованы с использованием интенсивностей, полученных от внутренних контролей для нормализации, находящихся на каждой матрице. Кроме того, гены с относительно постоянными уровнями экспрессии среди образцов можно использовать для нормализации уровней экспрессии других генов. В одном варианте зонды некоторых обслуживающих генов включены в матрицу нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Такие гены выбраны потому, что они имеют стабильные уровни экспрессии в группе разнообразных тканей. Сигналы гибридизации могут быть нормализованы и/или масштабированы на основе уровней экспрессии таких обслуживающих генов.

Термин «гибридизационный комплекс» означает комплекс, который образуется между полинуклеотидами в образце, когда пурины одного полинуклеотида связываются водородной связью с пиримидинами комплементарного полинуклеотида, например, 5'-A-G-T-C-3' образует пары оснований с 3'-T-C-A-G-5'. Степень комплементарности и использование аналогов нуклеотидов влияет на эффективность и жесткость реакций гибридизации.

Термин «зонд для гибридизации» охватывает нуклеиновые кислоты (такие как олигонуклеотиды), способные связываться специфичным для оснований образом с комлементарной нитью нуклеиновой кислоты. Такие зонды включают пептидонуклеиновые кислоты, которые описаны в публикации Nielsen с соавторами, Science 254: 1497-1500 (1991), Nielsen, Curr. Opin. Biotechnol., 10: 71-75 (1999), и другие аналоги нуклеиновых кислот и миметики нуклеиновых кислот. См. патент США № 6156501, поданный 3 апреля 1996 г.

Подразумевается, что термины «заболевание почек» или «расстройство почек» или аналогичные термины «почечное заболевание» или «почечное расстройство» охватывают острую или хроническую аномальную утрату функции почек, такую как почечная недостаточность, пониженная скорость клубочковой фильтрации и гломерулонефрит. Гломерулонефрит может иметь форму мембранозного гломерулонефрита, в который вовлечено утолщение базальной мембраны клубочков. Альтернативно, гломерулонефрит может иметь форму пролиферативного или мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, который характеризуется пролиферацией клеток в мезангиальном матриксе. Кроме того, гломерулонефрит может иметь форму мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита, в который вовлечено сочетание указанных выше изменений. Гломерулосклероз является тяжелой формой гломерулонефрита. Заболевания почек или расстройства почек также включают нефрит, нефропатию, гиперфильтрацию, умеренную микроальбуминурию, клиническую альбуминурию, прогрессирующую клиническую нефропатию, хроническую почечную недостаточность, повреждения почечных сосочков, тубулярный некроз и диабетическую нефропатию, которые по-разному диагностируются специалистами в области ветеринарии. Термин не предназначен для обозначения поликистоза почек генетической природы.

Кошка с нормальной функцией почек представляет собой кошку, у которой нет симптомов расстройства почек, и не наблюдаются клинические признаки или симптомы расстройства почек и нет изменений в клинических лабораторных измерениях функции почек. Нормальная функция почек может быть определена с использованием одного или нескольких измерений, включая без ограничения, скорость клубочковой фильтрации, уровень белка в моче, уровень креатинина в крови, уровень креатинина в моче, клиренс креатинина и азот мочевины в крови.

«Последовательность нуклеиновой кислоты» означает олигонуклеотид, нуклеотид или полинуклеотид и их фрагменты или части, и термин относится к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одно- или двунитевыми, и представляют собой смысловую или антисмысловую нить.

Термин «полинуклеотид» или «олигонуклеотид» означает полимер из нуклеотидов. Термин охватывает молекулы ДНК и РНК (включая кДНК и мРНК), либо однонитевые, либо двунитевые, и если они являются однонитевыми, то их комплементарная последовательность находится в линейной или кольцевой форме. Термин также охватывает фрагменты, варианты, гомологи и аллели, которые соответствуют последовательностям, которые обладают такими же или по существу такими же свойствами и выполняют такую же или по существу такую же функцию, что и исходная последовательность. Последовательности могут быть полностью комплементарными (без ошибочных спариваний) при выравнивании или могут иметь до 30% несовпадений последовательностей. Предпочтительно в случае полинуклеотидов цепь содержит примерно от 20 до 10000 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 150 до 3500 нуклеотидов. Предпочтительно в случае олигонуклеотидов цепь содержит примерно от 2 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 6 до 30 нуклеотидов. Точный размер полинуклеотида или олигонуклеотида будет зависеть от разных факторов и от конкретного применения и использования полинуклеотида или олигонуклеотида. Термин включает нуклеотидные полимеры, которые синтезируют и которые выделяют и очищают из природных источников. Термин «полинуклеотид» включает и «олигонуклеотид».

Термин «полипептид», «пептид» или «белок» означает полимер, состоящий из аминокислот. Термин охватывает встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе (синтетические) полимеры и полимеры, в которых одна или несколько аминокислот заменены искусственными химическими миметиками. Термин также охватывает фрагменты, варианты и гомологи, которые обладают такими же или по существу такими же свойствами и выполняют такую же или по существу такую же функцию, что и исходная последовательность. Термин охватывает полимеры любой длины, предпочтительно полимеры, содержащие примерно от 2 до 1000 аминокислот, более предпочтительно примерно от 5 до 500 аминокислот. Термин включает в себя полимеры из аминокислот, которые синтезируют и которые выделяют и очищают из природных источников.

Термин «зонд» означает (1) олигонуклеотид или полинуклеотид, либо РНК, либо ДНК, либо встречающийся в природе, как в очищенном продукте расщепления ферментами рестрикции, либо полученный синтетически, который способен к отжигу или специфичной гибридизации с полинуклеотидом с последовательностями, комплементарными зонду, или (2) пептид или полипептид, способный специфично связывать конкретный белок или белковый фрагмент, по существу исключая другие белки или белковые фрагменты. Олигонуклеотидный или полинуклеотидный зонд может быть либо однонитевым, либо двунитевым. Точная длина зонда будет зависеть от многих факторов, включая температуру, источник и применение. Например, для диагностических применений в зависимости от сложности последовательности-мишени олигонуклеотидный зонд обычно содержит примерно от 10 до 100, от 15 до 50 или от 15 до 25 нуклеотидов. В случае некоторых диагностических применений полинуклеотидный зонд содержит примерно 100-1000, 300-600 нуклеотидов, предпочтительно примерно 300 нуклеотидов. Зонды в данном случае выбирают так, чтобы они были «по существу» комплементарными разным нитям конкретной последовательности-мишени. Это значит, что зонды должны быть в достаточной степени комплементарными, чтобы специфично гибридизоваться или отжигаться с соответствующими последовательностями-мишенями в предварительно определяемых условиях. Следовательно, последовательность зонда не должна точно отражать комплементарную последовательность мишени. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть связан с 5'- или 3'-концом зонда, при этом остальная часть последовательности зонда является комплементарной последовательности-мишени. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть рассеяны по зонду, при условии, что последовательность зонда имеет достаточную комплементарность с последовательностью полинуклеотида-мишени для специфичного отжига с полинуклеотидом-мишенью. Пептидный или полипептидный зонд может представлять собой любую молекулу, с которой белок или пептид специфично связывается, включая ДНК (в случае ДНК-связывающих белков), антитела, рецепторы клеточных мембран, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны, органеллы и мембраны органелл.

Термин «образец» означает любую ткань или жидкость животного, содержащую, полинуклеотиды, включая клетки и другую ткань, содержащую ДНК и РНК. Примерами являются кровь, почечная, соединительная, эпителиальная, лимфоидная, мышечная, нервная ткань, слюна и тому подобное. Образец может быть твердым или жидким и может представлять собой, например, ДНК, РНК, кДНК, жидкости организма, такие как кровь или моча, клетки, клеточные препараты или растворимые фракции или аликвоты их сред, хромосомы, органеллы и тому подобное.

Термин «специфично связываются» означает особое и точное взаимодействие между двумя молекулами, которое зависит от их структуры, в частности, от боковых групп молекулы. Например, интеркаляция регуляторного белка в главную бороздку молекулы ДНК, образование водородных связей вдоль остова между двумя однонитевыми нуклеиновыми кислотами или связывание между эпитопом белка и агонистом, антагонистом или антителом.

Термин «специфично гибридизуются» означает ассоциацию между двумя однонитевыми полинуклеотидами с достаточной комплементарностью последовательностей для того, чтобы осуществить такую гибридизацию в предварительно определяемых условиях, обычно используемых в данной области (иногда называемых «комплементарными в значительной степени»). Например, термин может относиться к гибридизации полинуклеотидного зонда с последовательностью, комплементарной ему в значительной степени, находящейся в однонитевой молекуле ДНК или РНК согласно одному аспекту настоящего изобретения, по существу, с исключением гибридизации полинуклеотидного зонда с однонитевыми полинуклеотидами с некомплементарной последовательностью.

Термин «жесткие условия» означает (1) гибридизацию в 50% (об./об.) формамиде с 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% фикола, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 6,5, содержащего 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия, при 42°C, (2) гибридизацию в растворе, содержащем 50% формамида, 5x SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5x раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфата декстрана, при 42°C; с промывками при 42°C в 0,2x SSC и 0,1% SDS или промывками в 0,015 М NaCl, 0,0015 М цитрате натрия, 0,1% Na2SO4 при 50°C, или сходные известные в данной области способы с использованием сходной низкой ионной силы и средств для промывки при высокой температуре и сходных денатурирующих агентов.

Термин «применимые варианты» означает (1) в случае полинуклеотида, комплементы полинуклеотида; гомологи полинуклеотида и их комплементы; варианты полинуклеотида, их комплементы и их гомологи; и фрагменты полинуклеотида, их комплементы, их гомологи и их варианты, и (2) в случае полипептида, гомологи полипептида; варианты полипептида и их гомологи; и фрагменты полипептида, их гомологи и их варианты.

Термин «вариант» означает (1) полинуклеотидную последовательность, содержащую любую замену, изменение, модификацию, перестановку, делецию или добавление одного или нескольких нуклеотидов в полинуклеотидной последовательности, и которая обладает такими же или по существу такими же свойствами и осуществляет такую же или по существу такую же функцию, что и исходная последовательность; и (2) полипептидную последовательность, содержащее любую замену, изменение, модификацию, перестановку, делецию или добавление одной или нескольких аминокислот в полипептидной последовательности, и которая обладает такими же или по существу такими же свойствами и осуществляет такую же или по существу такую же функцию, что и исходная последовательность. Таким образом, термин включает однонуклеотидный полиморфизм (SNP) и аллельные варианты и включает консервативные и неконсервативные аминокислотные замены в полипептидах. Термин также в соответствующих случаях охватывает химическую дериватизацию полинуклеотида или полипептида и замену нуклеотидов или аминокислот нуклеотидами или аминокислотами, которые не встречаются в природе.

Если не оговорено особо, все технические и научные термины и любые акронимы, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, которое обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение.

Зонды

Зонды, которые применимы при практическом осуществлении изобретения и которые применимы для идентификации кошачьих биомаркеров в образцах от кошек, содержат последовательности SEQ ID NO: 1-8. Последовательности зондов соответствуют указанным ниже идентификационным номерам зондов, используемых в случае запатентованного чипа кошачьих генов производства Affymetrix, называемого Asymetrix Feline GeneChip®, которые более полно описаны в настоящей спецификации.

HP04719_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 1, которая применима для гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК гена собаки Canis lupus familiaris для предполагаемого секретируемого родственного frizzled белка 2 (ген sfrp2). Последовательность кошачьего гомолога, с которым гибридизуется последовательность SEQ ID NO: 1, представлена в SEQ ID NO: 9. Идентификационный номер зонда соответствует идентификационному номеру, используемому в случае Affymetrix Feline GeneChip®. Соответствующая последовательность мРНК собаки обозначена номером доступа NM_001002987.1, GeneID: 475471.

HP12767_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 2, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК Canis familiaris, сходной с вариантом 2 транскрипта клеточного ретинол-связывающего белка 5. Последовательность кошачьего гомолога, с которым гибридизуется последовательность SEQ ID NO: 2, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 10. Идентификационный номер зонда соответствует идентификационному номеру, используемому в случае Affymetrix Feline GeneChip®. Соответствующая последовательность мРНК обозначена LOC477706 и указана в виде эталонной последовательности NCBI: XM_848184.1.

HP04078_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 3, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК гена Canis familiaris, сходной с предшественником люмикана (кератансульфатный протеогликан люмикан) (люмикан KSPG). Соответствующая последовательность собаки указана в виде LOC 482599. Соответствующая последовательность мРНК собаки указана в виде эталонной последовательности NCBI: XM_539716.2, GeneID: 482599.

HP04079_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 4, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК декорина (DCN) Canis lupus familiaris. Соответствующая последовательность мРНК собаки указана в виде эталонной последовательности NCBI: NM_001003228.1, GeneID: 403904.

HP06873_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 5, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК Equus caballus, сходной с мРНК коллагена типа III альфа 1 (синдром Элерса-Данлоса типа IV; аутосомно-доминантный). Соответствующая последовательность мРНК лошади указана в виде эталонной последовательности NCBI: XM_001917620, GeneID 100034123.

HP00944_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 6, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2) Canis familiaris. Соответствующая последовательность мРНК собаки указана в виде эталонной последовательности NCBI: XM_535300.2, GeneID: 403733.

HP09664_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 7, которая применима при гибридизации с последовательностью мРНК кошки синтетической конструкции мРНК PUMP-1 Felis domesticus. Последовательность PUMP-1 приведена с номером доступа U04444.1.

HP00012_at соответствует последовательности SEQ ID NO: 8, которая применима при гибридизации с кошачьим гомологом последовательности мРНК предполагаемого варианта транскрипта 1 матриксной металлопротеиназы 19 Macaca mulatta (MMP19). Номер эталонной последовательности NCBI XM_001111542, GeneID 7100111.

Биомаркеры

Биомаркерами, применимыми при практическом осуществлении настоящего изобретения, являются: секретируемый родственный frizzled белок 2 (sFRP2); ретинол-связывающий белок 5 (rbp5); люмикан (LUM); декорин (DCN); цепь коллагена альфа 1 (III), вариант 12 (COL3A1); и матриксная металлопротеиназа-2, -7 и -19 (MMP2, MMP7 и MMP19), которые более полно описаны ниже и в списке последовательностей, прилагаемом к настоящему описанию.

SEQ ID NO: 9 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной мРНК секретируемого родственного frizzled белка 2 Canis lupus. Последовательность собаки обозначена как эталонная: NM_001002987.1 и GeneID: 475471. Полноразмерная нуклеотидная последовательность собаки имеет длину 1760 п.н. Соответствующий полипептид собаки имеет эталонную последовательность NCBI NP_001002987.1. Секретируемый родственный frizzled белок 2 (sFRP2) собаки имеет длину 294 аминокислоты. Представители семейства трансмембранных белков «frizzled» (FZ) являются рецепторами для представителей семейства Wnt, богатых цистеином гликозилированных лигандов, вовлеченных во множество клеточных процессов, включая контроль полярности клеток и злокачественную трансформацию. Секретируемые родственные frizzled белки (sFRPs), по-видимому, действуют как растворимые модуляторы передачи сигнала Wnt, конкурируя со связанными с мембраной рецепторами frizzled за связывание секретируемых лигандов Wnt.

SEQ ID NO: 10 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной мРНК, сходной с вариантом 2 транскрипта клеточного ретинол-связывающего белка 5 Canis familiaris (LOC477706). Последовательность собаки указана в виде эталонной последовательности NCBI XM_848184.1. Полноразмерная нуклеотидная последовательность собаки имеет длину 511 п.н. Соответствующий полипептид собаки имеет эталонную последовательность NCBI XP_853277.1. Белок rbp5 собаки является белком, состоящим из 135 аминокислот. Rbp5 относится к семейству липокалина и, как полагают, является внутриклеточным носителем ретинола (витамин A-спирт).

SEQ ID NO: 11 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки гомологичной предполагаемой мРНК, сходной с мРНК предшественника люмикана Canis familiaris (кератансульфатного протеогликана люмикана) (LOC 482599). Последовательность собаки указана в виде эталонной последовательности NCBI XM_539716.2. Полноразмерная нуклеотидная последовательность собаки имеет длину 2028 п.н. Соответствующий полипептид собаки имеет эталонную последовательность NCBI XP_539716.1. Предшественник люмикана собаки (кератансульфатного протеогликана люмикана) является белком, состоящим из 338 аминокислот. Люмикан (LUM) является сульфатированным протеингликаном внеклеточного матрикса, который взаимодействует с белками, которые вовлечены в сборку матрикса, такими как коллаген типа I и типа VI. LUM вовлечен в пролиферацию клеток и морфогенез тканей. Считают, что люмикан играет важную роль в регуляции сборки нитей коллагена. Белок также является связывающимся партнером TGF-бета.

SEQ ID NO: 12 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной мРНК предшественника декорина Canis lupus familiaris. Последовательность указана в виде эталонной последовательности NCBI NM_001003228.1, GeneID 403904. Полноразмерная нуклеотидная последовательность собаки имеет длину 1470 п.н. Соответствующая полипептидная последовательность собаки имеет эталонную последовательность NCBI: NM_001003228.1. Соответствующий полипептид предшественника декорина собаки имеет эталонную последовательность NCBI NP_001003228.1. Предшественник декорина собаки является белком, состоящим из 360 аминокислот. Белок представляет собой небольшой клеточный или периклеточный протеогликан матрикса, близко родственный по структуре белку бигликана, и является компонентом соединительной ткани. Декорин связывается с нитями коллагена типа I и играет роль в сборке матрикса. Он содержит одну связанную цепь гликозаминогликана. Полагают, что такой белок способен подавлять рост различных линий опухолевых клеток. В научной литературе было идентифицировано несколько альтернативно сплайсируемых вариантов транскриптов такого гена.

SEQ ID NO: 13 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной мРНК коллагена типа III альфа 1 Equus caballus (синдром Элерса-Данлоса типа IV; аутосомно-доминантный) (COL3A1). Последовательность указана в виде эталонной последовательности NCBI XM_001917620.1, GeneID 100034123. Полноразмерная нуклеотидная последовательность лошади имеет длину 5492 п.н. Соответствующая полипептидная последовательность лошади имеет эталонную последовательность NCBI: XP_001917655. Коллаген типа III, альфа 1 лошади (синдром Элерса-Данлоса типа IV; аутосомно-доминантный) (COL3A1) является белком, состоящим из 1466 аминокислот. Коллаген типа III у людей представляет собой образующий фибриллы коллаген, содержащий 3 цепи альфа-1 (III), и экспрессируется в эмбрионах на ранних стадиях и в ходе эмбриогенеза. У взрослых коллаген типа III является основным компонентом внеклеточного матрикса в различных внутренних органах и коже. Мутации в гене COL3A1, который кодирует проколлаген типа III, приводят к возникновению синдрома Элерса-Данлоса, заболевания, приводящего к разрыву аорты в молодом возрасте.

SEQ ID NO: 14 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной мРНК матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2) Canis familiaris. Последовательность указана в виде эталонной последовательности NCBI XM_535300.2, GeneID 4037333. Полноразмерная нуклеотидная последовательность собаки имеет длину 2618 п.н. Соответствующая полипептидная последовательность лошади имеет эталонную последовательность NCBI: XP_535300.2. MMP-2 собаки является белком, состоящим из 612 аминокислот. Коллагеназа типа IV является представителем группы секретируемых цинковых металлопротеиназ, которые у млекопитающих разрушают коллагены внеклеточного матрикса. MMP2 имеет три повтора доменов фибронектина типа II, в строенных в каталитический домен; см. миниобзор матриксных металлопротеиназ, представленный Nagase с соавторами, J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274(31): 21491-21494.

SEQ ID NO: 15 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки для неполной кодирующей мРНК PUMP-1 Felis domesticus. Последовательность указана в виде эталонной последовательности NCBI FDU04444, GeneBank: U04444.1. Полноразмерная нуклеотидная последовательность PUMP-1 кошки имеет длину 1001 п.н. Полноразмерная полипептидная последовательность PUMP-1 указана в виде последовательности в GeneBank: AAA 18222.1. PUMP-1 кошки представляет собой белок, состоящий из 262 аминокислот.

SEQ ID NO: 16 соответствует последовательности нуклеиновой кислоты кошки, гомологичной предполагаемому варианту 1 транскрипта мРНК матриксной металлопротеиназы 19 Macaca mulatta (MMP-19). Последовательность макак-резус указана в виде эталонной последовательности NCBI: XM_001111542.1. Полноразмерная нуклеотидная последовательность макак-резус имеет длину 2182 п.н. Полноразмерная полипептидная последовательность обозначена XP_001111542.1. MMP-19 макак-резус представляет собой белок, состоящий из 485 аминокислот.

Что касается обсуждения вариантов осуществления изобретения, то следует понимать, что настоящее изобретение дополнительно охватывает сочетания биомаркеров, включающие в себя гены и продукты их экспрессии, которые выбраны из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 15) и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 16). Варианты осуществления изобретения охватывают конструирование панелей биомаркеров из различных сочетаний двух групп генов и продуктов их экспрессии.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кошка может иметь нормальную функцию почек, определяемую с использованием известных в данной области клинических измерений, например, скорости клубочковой фильтрации, клиренса креатинина, уровней белка в моче, уровней креатинина в крови, уровней креатинина в моче и/или уровней азота мочевины в крови, и способы согласно изобретению можно использовать для прогнозирования, выявления и диагностики у такой кошки изменения от нормального состояния до аномального состояния, приводящего к расстройству почек, характеризуемому пониженной почечной функцией, почечной недостаточностью, пониженной скоростью клубочковой фильтрации и гломерулонефритом.

В другом предпочтительном варианте способ согласно изобретению может быть осуществлен на практике с применением матрицы, которая позволяет выявлять изменения экспрессии генов или уровень или активность одного или нескольких генов или продуктов их экспрессии, выбранных из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллаген альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В одном способе такая матрица представляет собой ДНК-микроматрицу. Уровень активности или экспрессии одного или нескольких генов можно определить, измеряя продукт экспрессии таких генов, который может представлять собой полинуклеотид или полипептид или белок.

В другом предпочтительном варианте способ согласно изобретению может быть осуществлен на практике с применением матрицы, которая позволяет выявлять изменения экспрессии генов или уровень или активность одного или нескольких генов или продуктов их экспрессии, выбранных из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из: люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллаген альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В одном способе такая матрица представляет собой ДНК-микроматрицу. Уровень активности или экспрессии одного или нескольких генов можно определить, измеряя продукт экспрессии таких генов, который может представлять собой полинуклеотид или полипептид или белок.

В одном аспекте изобретение относится к осуществлению контакта образца ткани или образца жидкости организма со средством, которое выявляет у кошки один или несколько генов или продукт экспрессии такого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). Средством может быть антитело или зонд, состоящий из нуклеиновой кислоты, используемые вместе с обычными средствами для анализа, такими как иммобилизация на твердой фазе, лунках для микротитрования, пробирках, тестовых полосках или других обычных средствах.

В другом аспекте изобретение относится к осуществлению контакта образца ткани или образца жидкости организма со средством, которое позволяет выявлять у кошки один или нескольких генов или продукт экспрессии такого одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). Средством может быть антитело или зонд, состоящий из нуклеиновой кислоты, используемые вместе с обычными средствами для анализа, такими как иммобилизация на твердой фазе, лунках для микротитрования, пробирках, тестовых полосках или других обычных средствах.

Другой варианта осуществления способа согласно изобретению охватывает применение обычных способов анализа с целью определения экспрессии генов у кошки либо отдельно, либо вместе с дисплеями на матрице экспрессии генов, в которых используют полипептиды и/или полинуклеотиды, при этом такие обычные способы включают один или несколько из следующих способов: ELISA, РИА, иммуноблот-анализ, гибридизацию in situ, Нозерн-блот-анализ, Вестерн-блот-анализ и анализ Luminex X-Map®.

Следующий аспект изобретения заключается в том, что изобретение относится к идентификации новых биомаркеров расстройства почек у кошек, а также к способам выявления расстройства почек у таких кошек на основании характеристической картины экспрессии генов таких биомаркеров in vivo. В частности, способы согласно изобретению включают в себя выявление дифференциальной экспрессии по сравнению с контрольным уровнем экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера в образце из организма, предпочтительно в образце крови, при этом выявление дифференциальной экспрессии такого биомаркера позволяет специфично идентифицировать кошек, которые имеют гломерулонефрит. Таким образом, такие способы основаны на выявлении, по меньшей мере, одного биомаркера, который по-другому экспрессируется у кошки, имеющей расстройство почек, по сравнению с клетками от здоровых или контрольных животных. Биомаркеры согласно изобретению представляют собой белки и/или нуклеиновые кислоты, которые дифференциально экспрессируются у кошки, имеющей аномальное расстройство почек, или у которой вероятно развивается аномальное расстройство почек, в частности, расстройство почек. В одном варианте картина экспрессии генов включает в себя, по меньшей мере, один РНК-транскрипт или продукт его трансляции, выбранный из группы, состоящей, по меньшей мере, из одного гена или продукта трансляции такого гена, выбранного из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В предпочтительном варианте дифференциальная означает, по меньшей мере, примерно одно стандартное отклонение от среднего значения. В более предпочтительном варианте дифференциальная означает, по меньшей мере, примерно 2-кратную разницу.

Следующий аспект изобретения заключается в том, что изобретение относится к идентификации новых биомаркеров расстройства почек у кошек, а также к способам выявления расстройства почек у таких кошек, основанным на характерной картине экспрессии генов таких биомаркеров in vivo. В частности, способы согласно изобретению включают в себя выявление дифференциальной экспрессии по сравнению с контрольным уровнем экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера в образце из организма, предпочтительно в образце крови, при этом выявление дифференциальной экспрессии такого биомаркера позволяет специфично идентифицировать кошек, которые имеют гломерулонефрит. Таким образом, такие способы основаны на выявлении, по меньшей мере, одного биомаркера, который по-другому экспрессируется у кошки, имеющей расстройство почек, по сравнению с клетками от здоровых или контрольных животных. Биомаркеры согласно изобретению представляют собой белки и/или нуклеиновые кислоты, которые дифференциально экспрессируются у кошки, имеющей аномальное расстройство почек, или у которой вероятно развивается аномальное расстройство почек, в частности расстройство почек. В одном варианте картина экспрессии генов включает в себя, по меньшей мере, один РНК-транскрипт или продукт его трансляции, выбранный из первой группы, состоящей, по меньшей мере, из одного гена или продукта трансляции такого гена, выбранного из группы, состоящей из: секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из: люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В предпочтительном варианте дифференциальная означает, по меньшей мере, примерно одно стандартное отклонение от среднего значения. В более предпочтительном варианте дифференциальная означает, по меньшей мере, примерно 2-кратную разницу.

В следующем аспекте изобретение относится к биомаркерам гломерулонефрита у кошек, включая, по меньшей мере, один РНК-транскрипт или продукт его трансляции, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В другом варианте биомаркер или биомаркеры применяют для выявления гломерулонефрита. В предпочтительном варианте указанный выше биомаркер или биомаркеры применяют для того, чтобы отличить стадии гломерулонефрита у кошки.

В еще одном аспекте изобретение относится к биомаркерам гломерулонефрита у кошек, включая, по меньшей мере, один РНК-транскрипт или продукт его трансляции, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16). В другом варианте биомаркер или биомаркеры применяют для выявления гломерулонефрита. В предпочтительном варианте указанный выше биомаркер или биомаркеры применяют для того, чтобы отличить стадии гломерулонефрита у кошки.

В следующем аспекте изобретение относится к композициям, содержащим один или нескольких зондов, состоящих из нуклеиновой кислоты, которые специфично гибридизуются с нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, кодирующим биомаркер согласно настоящему изобретению, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матричной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16).

В следующем аспекте изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько зондов, состоящих из нуклеиновой кислоты, которые специфично гибридизуются с нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, кодирующим биомаркер согласно настоящему изобретению, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16).

В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим антитела, которые специфично связываются с полипептидом, кодируемым геном, экспрессирующим биомаркер согласно настоящему изобретению, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16).

В дополнительном аспекте изобретение относится к композициям, содержащим антитела, которые специфично связываются с полипептидом, кодируемым геном, экспрессирующим биомаркер согласно настоящему изобретению, выбранный из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка 2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16).

Кроме того, в настоящем изобретении предполагается, что способы согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с традиционными диагностическими методиками, которые позволяют выявлять физические и морфологические характеристики почечных расстройств. Таким образом, например, характеристику дифференциальной экспрессии генов в случае почек в клетках, полученных из образцов тканей или образцов жидкостей организма кошки, можно сочетать с обычными способами диагностики (например, радиологическими), чтобы подтвердить диагноз расстройства почек у кошки, включая, например, гломерулонефрит.

Следующий аспект изобретения относится к способу диагностики и/или прогнозирования расстройства почек у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определения количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблицы 3, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от животного, при этом указанным биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является набор для диагностики и/или прогнозирования расстройства почек у кошки, в частности, для осуществления способа диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определение количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблицы 3, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от животного, при этом указанный биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом, и необязательно дополнительно содержит регистрируемое средство, связанное с указанным биомаркером.

В еще одном дополнительном варианте изобретение относится к реагенту для диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, в частности, для осуществления способа диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определения количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблицы 3, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от кошки, при этом указанный биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом, и необязательно дополнительно содержит регистрируемое средство, связанное с указанным биомаркером.

Следующий аспект изобретения относится к способу диагностики и/или прогнозирования расстройства почек у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определения количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблиц 3 и 4, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от животного, при этом указанный биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является набор для диагностики и/или прогнозирования расстройства почек у кошки, в частности, для осуществления способа диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определения количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблиц 3 и 4, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от животного, при этом указанный биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом, и необязательно дополнительно содержит регистрируемое средство, связанное с указанным биомаркером.

В еще одном варианте изобретение относится к регенту для диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, в частности, для осуществления способа диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита у кошки, при этом способ включает в себя стадии: получения, по меньшей мере, одного образца ткани или образца жидкости организма от животного; определения количества одного или нескольких биомаркеров, выбранных из таблиц 3 и 4, в указанном, по меньшей мере, одном образце, полученном от кошки, при этом указанный биомаркер является полипептидом, белком, РНК, ДНК, полинуклеотидом или их метаболитом, и необязательно дополнительно содержит регистрируемое средство, связанное с указанным биомаркером.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению одного или нескольких полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или их метаболитов, выбранных из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка S (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллаген альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), в качестве биомаркера для диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита, в частности, для получения набора для диагностики или прогнозирования гломерулонефрита у кошки.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению одного или нескольких полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или их метаболитов, выбранных из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), в качестве биомаркера для диагностики и/или прогнозирования гломерулонефрита, в частности, для получения набора для диагностики или прогнозирования гломерулонефрита у кошки.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению одного или нескольких полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или их метаболитов, выбранных из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9); ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металлопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), в качестве биомаркера для диагностики и/или прогнозирования расстройства почек, в частности, для получения набора для диагностики или прогнозирования расстройства почек у кошки.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению одного или нескольких полипептидов, белков, РНК, ДНК, полинуклеотидов или их метаболитов, выбранных из группы, состоящей из секретируемого родственного frizzle белка-2 (SFRP2) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 9) и ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 10); и, необязательно, второй группы, состоящей, по меньшей мере, из одного полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 11); декорина (DCN) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 12); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1) или кошачьего гомолога или его фрагмента (SEQ ID NO: 13); матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 14); матриксной металопротеиназы-7 (MMP7, PUMP-1) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 15); и матриксной металлопротеиназы-19 (MMP19) или кошачьего гомолога или ее фрагмента (SEQ ID NO: 16), в качестве биомаркера для диагностики и/или прогнозирования расстройства почек, в частности, для получения набора для диагностики или прогнозирования расстройства почек у кошки.

Еще один вариант относится к такому набору, в котором реагенты и оборудование включают материалы для анализа ДНК-микроматриц, включая микроматрицу олигонуклеотидов, микроматрицу кДНК и специализированный генный чип или их сочетание.

Другие и дополнительные цели, признаки и преимущества настоящего изобретения легко поймут специалисты в данной области.

На протяжении настоящего описания различные аспекты изобретения могут быть представлены в форме диапазона. Следует понимать, что описание в форме представлено только для удобства и краткости, и его не следует толковать как жесткое ограничение объема изобретения. Соответственно, следует считать, что описание диапазона специально раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в данном диапазоне. Например, следует считать, что описание такого диапазона как диапазон от 1 до 5, специально раскрывает поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 2 до 4, от 2 до 5, от 3 до 5 и т.д., а также отдельные числовые значения в данном диапазоне, например, 1, 2, 3, 4 и 5. Это применимо независимо от ширины диапазона.

При практическом осуществлении настоящего изобретения, если не оговорено особо, можно использовать обычные методики и описания органической химии, технологии производства полимеров, молекулярной биологии (включая методики рекомбинации), клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые относятся к данной области. Такие обычные методики включают синтез матриц полимеров, гибридизацию, лигирование и выявление гибридизации с использованием метки. Конкретные иллюстрации подходящих методик можно получить, обращаясь к приведенным ниже примерам. Однако, конечно, также можно использовать другие обычные эквивалентные способы. Такие обычные методики и описания можно найти в стандартных лабораторных руководствах, таких как: Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cells: A Laboratory Manual, (все публикации Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000); Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y; и Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y., которые все включены в настоящее описание в полном объеме в виде ссылки для всех целей.

Матрицы нуклеиновых кислот, которые применимы в настоящем изобретении, включают матрицы, которые коммерчески доступны из Affymetrix (Santa Clara, Calif.) под торговым названием GeneChip®. Примеры матриц показаны на веб-сайте affymetrix.com.

Настоящее изобретение также предполагает множество применений полимеров, связанных с твердыми подложками. Такие применения включают мониторинг и получение профилей экспрессии генов, скрининг библиотек, генотипирование и диагностику. Способы мониторинга и получение профиля экспрессии генов можно найти в патентах США № 5800992, 6013449, 6020135, 6033860, 6040138, 6177248, 6309822 и 6344316. Таким образом, генотипирование и применения показаны в публикациях заявок на выдачу патентов США с регистрационным № 60/319253, 10/013598 и патентах США № 5856092, 6300063, 5858659, 6284460, 6361947, 6368799 и 6333179. Другие применения воплощены в патентах США № 5871928, 5902723, 6045996, 5541061 и 6197506.

Специалистам в данной области будет понятно, что продукты и способы, воплощенные в настоящем изобретении, могут быть применимы в различных системах, включая коммерчески доступные системы мониторинга экспрессии генов, включающие в себя матрицы зондов нуклеиновых кислот, мембранные блоты, микролунки, шарики и пробирки с образцами, сконструированные с использованием различных материалов и различных способов, известных в данной области. Соответственно, настоящее изобретение не ограничено любым конкретным контекстом, и следующее описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения приведено только в целях иллюстрации.

Система мониторинга экспрессии генов в предпочтительном варианте может содержать матрицу зондов, состоящих из нуклеиновых кислот (включая матрицу олигонуклеотидов, матрицу кДНК, матрицу в виде пятен и тому подобные), мембранный блот (такой как блот, используемый в гибридизационных анализах, такой как Нозерн-, Саузерн-, дот-блот и тому подобные) или микролунки, пробирки с образцами, шарики или волокна (или любая твердая подложка, содержащая связанные нуклеиновые кислоты). См. патенты США № 5770722, 5744305, 5677195, 5445934 и 6040193, которые включены в настоящее описание в виде ссылки. Система мониторинга экспрессии генов также может содержать зонды, состоящие из нуклеиновых кислот, в растворе.

Настоящее изобретение также предполагает получение образца с применением амплификации. Геномный образец может быть амплифицирован с использованием множества механизмов, некоторые из которых могут включать в себя ПЦР. См., например, публикации PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (Eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford) и патенты США № 4683202, 4683195, 4800159, 4965188 и 5333675, при этом каждая из публикаций включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для всех целей. Образец может быть амплифицирован на матрице. См., например, патент США № 6300070 и заявку на выдачу патента США с регистрационным № 09/513300, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Другие подходящие способы амплификации включают лигазную цепную реакцию (LCR) (например, Wu and Wallace, Genomics 4, 560 (1989), Landegren с соавторами, Science 241, 1077 (1988) и Barringer с соавторами, Gene 89: 117 (1990)), транскрипционную амплификацию (Kwoh с соавторами, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989) и WO 88/10315), самоподдерживаемую репликацию последовательностей (Guatelli с соавторами, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990) и WO 90/06995), избирательную амплификацию полинуклеотидных последовательностей-мишеней (патент США № 6410276), праймируемую консенсусной последовательностью полимеразную цепную реакцию (CP-PCR) (патент США № 4437975), случайно праймируемую полимеразную цепную реакцию (AP-PCR) (патенты США № 5413909, 5861245) и основанную на нуклеиновой кислоте амплификацию последовательности (NABSA) (см. патенты США № 5409818, 5554517 и 6063603, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки). Другие способы амплификации, которые можно использовать, описаны в патентах США № 5242794, 5494810, 4988617, 6344316 и в заявках на выдачу патента США с регистрационным № 09/854317, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.

Дополнительные способы получения образцов и методики описаны в публикации Dong с соавторами, Genome Research 11, 1418 (2001), в патентах США № 6361947, 6391592 и в заявках на выдачу патента США с регистрационным № 09/916135, 09/920491, 09/910292 и 10/013598.

Систему мониторинга экспрессии генов согласно настоящему изобретению можно применять для облегчения сравнительного анализа экспрессии в разных клетках или тканях, разных субпопуляциях одних и тех же клеток или тканей, разных физиологических состояний одних и тех же клеток или тканей, разных стадий развития одних и тех же клеток или тканей или разных популяциях клеток одной и той же ткани. В предпочтительном варианте способы пропорциональной амплификации согласно настоящему изобретению могут давать воспроизводимые результаты (т.е., в статистически значимых пределах ошибки или степени достоверности), достаточные для того, чтобы получить измерение количественных, а также качественных различий тестируемых образцов.

Анализы на основе гибридизации полинуклеотидов хорошо известны в данной области. Способы и условия гибридизационных анализов будут варьировать в зависимости от применения и могут быть выбраны в соответствии с обычными известными способами связывания, включая способы, описанные в публикациях: Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N.Y, 1989); Berger and Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987); Young and Davis, P.N.A.S, 80: 1194 (1983). Способы и устройство для осуществления многократных и контролируемых реакций гибридизации описаны в патентах США № 5871928, 587421, 6045996, 6386749 и 6391623, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществляют детекцию сигнала гибридизации между лигандами. См. патенты США № 5143854, 5578832, 5631734, 5834758, 5936324, 5981956, 6025601, 6141096, 6185030, 6201639, 6218803 и 6225625, в заявке на выдачу патента США 60/364731 и в заявке PCT PCT/US99/06097 (опубликованной с номером WO 99/47964), которые также включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для всех целей. Способы и устройство для детекции сигнала и обработки данных об интенсивности раскрыты, например, в патентах США № 5143854, 5547839, 5578832, 5631734, 5800992, 5834758, 5856092, 5902723, 5936324, 5981956, 6025601, 6090555, 6141096, 6185030, 6201639, 6218803 и 6225625, в заявке на выдачу патента США 60/364731 и в заявке PCT PCT/US99/06097 (опубликованной с номером WO 99/47964), которые также включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме для всех целей.

Изобретение не ограничено конкретной методикой, протоколами и реагентами, описанными в настоящей публикации, так как они могут варьировать. Кроме того, терминология, используемая в настоящей публикации, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения.

Все патенты, заявки на выдачу патентов, публикации и другие ссылки, цитированные или указанные в описании, включены в настоящее описание в рамках, определяемых законодательством. Обсуждение таких публикаций предназначено только для суммирования приведенных в них данных. Не допускается, что любые такие патенты, заявки на выдачу патентов, публикации или ссылки или любая их часть, относятся к прототипу настоящего изобретения и в частности сохраняется право на сомнение в отношении правильности и значимости таких патентов, заявок на выдачу патентов, публикаций и других ссылок.

На протяжении всего описании диапазоны используют для краткости описании любого значения, которое входит в данный диапазон. Любое значение в диапазоне может быть выбрано в качестве конечного значения диапазона. Кроме того, все публикации, цитированные в настоящем описании, включены тем самым в виде ссылки в полном объеме. В случае противоречий в определении в настоящем описании и определении в цитированной публикации, настоящее описание будет подвергнуто проверке.

Примеры

Пример 1: Классификация кошек с хроническим заболеванием почек согласно руководству международного общества исследования почек

В следующих далее примерах, кошек, у которых наблюдаются клинические признаки хронического заболевания почек, тестировали по сравнению с животными, у которых не наблюдаются признаки или симптомы хронического заболевания почек. Диагнозы патологий, связанных с хроническим заболеванием почек, осуществляли на основе критериев, приведенных в таблицах 1 и 2 ниже, и в соответствии с руководством международного общества исследования почек (IRIS).

Определение стадии хронического заболевания почек (CKD) осуществляли после установления диагноза CKD, чтобы обеспечить подходящее лечение и наблюдение за животным. Определение стадий первично основано на уровне креатинина в плазме натощак, оцениваемого, по меньшей мере, в двух случаях у животного в стационарном состоянии. Кошек, у которых наблюдают нормальную почечную функцию и не наблюдают клинических признаков или симптомов CKD, относят к группе не пораженных заболеванием кошек. Стадия 1 у кошек соответствует ранее предложенной классификации от раннего заболевания почек без биохимического доказательства CKD до почечной недостаточности, когда не выявляют азотемии, но когда скорость клубочковой фильтрации (GFR) может быть снижена и может иметь место плохая концентрирующая способность почек. Стадия 2 соответствует предложенной ранее классификации ранней почечной недостаточности. На стадии 2 отмечают слабую азотемию. Стадия 3 соответствует предложенной ранее классификации уремической почечной недостаточности, при этом наблюдают умеренную азотемию. Могут присутствовать системные признаки уремической почечной недостаточности, такие как боль в костях, уремический гастрит, анемия и метаболический ацитоз. Стадия 4 соответствует конечной стадии почечной недостаточности, которая характеризуется тяжелой азотемией и усиленными системными клиническими признаками уремического кризиса.

В таблице 1 описаны пять категорий исследуемых кошек, соответственно. Всего исследовали 42 кошки, которые были диагностированы как не имеющие CKD. Всего у 14 кошек в случае стадии 1 наблюдали минимальный гломерулонефрит (GN). Количества исследуемых кошек, у которых наблюдали развитые стадии CKD, составляли: слабый GN на стадии 2=24; умеренный GN на стадии 3=8 и выраженный GN на стадии 4=13. Уровни креатинина в плазме для каждой группы кошек показаны в таблице 2 в виде средних и медианных уровней в плазме для каждой группы кошек.

Таблица 1
Определение стадий у кошек
Определение стадий CKD согласно IRIS Диапазон креатинина в плазме, мг/дл
Нет заболевания <1,6 без достоверных доказательств заболевания.
Стадия 1 <1,6 (<140 мкмоль/л) с доказательствами заболевания.
Азотемия отсутствует. Присутствуют некоторые другие почечные аномалии (например, неадекватная концентрирующая способность в отсутствие идентифицируемой не связанной с почками причины; аномальные результаты пальпации почек и/или данные томографии почек; протеинурия почечной природы; аномальная биопсия почек).
Стадия 2 От 1,6 до 2,8 (140-249 мкмоль/л).
Слабая почечная азотемия. Клинические признаки обычно слабые или отсутствуют.
Стадия 3 От 2,9 до 5,0 (250-439 мкмоль/л).
Умеренная почечная азотемия. Могут присутствовать многие клинические признаки.
Стадия 4 5,0 (> 440 мкмоль/л).
Тяжелая почечная азотемия. При дополнительные клинические почечные признаки.

Пример 2: Критерии для выбора кандидатов

В примерах, которые следуют далее, в которых сообщается о кошках, для которых данные об экспрессии генов получали с использованием анализа на ДНК-микроматрице, устанавливали критерии для идентификации некоторых генов и экспрессированных белков как подходящих биологических маркеров хронического заболевания почек и, соответственно, гломерулонефрита. Чтобы идентифицировать в качестве биологически значимого маркера CKD при определении профиля экспрессии генов, требуется, чтобы: (1) ген давал экскретируемый белок; (2) должны иметь место разные уровни экспрессии у здоровых животных, для которых не получено доказательств клинических признаков или симптомов гломерулонефрита, и у животных, с доказанными минимальными, слабыми, умеренными или выраженными (стадии 1-4, соответственно) признаками CKD, отличающимися, по меньшей мере, в 2 раза (повышающая или понижающая регуляция); (3) уровни экспрессии генов должны коррелировать с прогрессированием заболевания от минимального до слабого, умеренного и выраженного (стадии 1-4); и (4) существует, по меньшей мере, одно стандартное отклонение от среднего при сравнении не пораженных заболеванием животных и животных с умеренным заболеванием. Последний критерий отбора основан на том факте, что чипы на основе микроматриц генов являются полуколичественными устройствами и что для нормализации данных используют грубый анализ множества матриц (RMA) с применением логарифмической шкалы.

Специалист может выбрать алгоритм из ряда алгоритмов для анализа данных, полученных с использованием генного чипа. Такие алгоритмы включают статистический алгоритм MASS, оценку ошибки логарифма интенсивности зонда (PLIER) и грубый анализ множества чипов (RMA). Алгоритмы обработки подробно обсуждаются в следующих публикациях: Li, C. Mo, 2001, Model-based analysis of oligonucleotide arrays: expression index computation and outlier detection, Proc. Acad. Sci., Vol. 98:31-36; Irizarry R.A. et al., Exploration, normalization and summaries of high density oligonucleotide array probe level data, Biostatistics, 2003, Vol. 4:249-264; Irizarry et al., Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data, Nucleic Acid Res., 2003, Vol. 31(4): e15; и Fan, W., A et al., A class f models for analyzing GeneChip gene expression analysis array data, BMC Genomics, 2005, Vol. 16: 6-16; Zhou, L et al., An expression index for Affymetrix GeneChips based on the generalized logarithm, Bioinformatics, 2005, Vol. 21(21): 3983-3989 и Hein A.K. et al., BGX: a fully Bayesian integrated approach to the analysis of Affymetrix GeneChip data, Biostatistics, 2005, Vol. 6: 349-373.

Исходные данные, полученные в следующих примерах, анализировали, используя компьютерную программу GeneSpring, версию 7,0 (GS) (Agilent Corporation) и подтверждали, используя свободно распространяемую программу R-Bioconductor (RB). Оба пакета компьютерных программ использовали для вычисления интенсивностей зондов на основании файлов CEL, созданных прибором Affymetrix. Наличие/отсутствие/пограничные сигналы на зонд и P-значения оценивали, используя компьютерные программы R-Bioconductor и GeneSpring по отдельности.

Данные об экспрессии генов определяли либо как подвергаемую «повышающей», либо «понижающей» регуляции экспрессию в случае любого данного анализа. Решение о том, подвергается ли ген «повышающей» или «понижающей» регуляции основано на кратном изменении, которое вычисляют в виде отношения «интенсивность при обработке/интенсивность в контроле» для каждого отдельного зонда. Кратное изменение считают обусловленным понижающей регуляцией, если значение <1/2, и считают обусловленным повышающей регуляцией, если оно >2,0. Также, зонд считают имеющим значение для дальнейшей проверки, если зарегистрирован сигнал как присутствующий только в одном из сравниваемых состояний (обработка или контроль) и сигнал «отсутствует» или «является пограничным» в другом состоянии, и кратное изменение является значимым в соответствии с используемой компьютерной программой.

Пример 3: Способы выделения РНК

Материалы и способы. Описанные далее общие способы можно использовать для выделения РНК из образцов тканей кошек для определения профиля экспрессии генов с использованием генных чипов, как дополнительно описано в примерах в настоящей публикации. Специалисту в данной области будет понятно, что такие способы или их модификации, которые известны в данной области, можно применять для выделения РНК из образцов тканей или жидкостей организма для дальнейшего анализа экспрессии генов с использованием множества аналитических способов, доступных специалисту в данной области, в частности, с использованием методики микроматриц.

Выделение рибонуклеиновой кислоты (РНК) из ткани. Образцы ткани могут быть собраны, заморожены в жидком азоте, разморожены и затем измельчены в ступке пестиком, гомогенизированы и перенесены в коническую колбу объемом 50 мл. Гомогенизированный образец ткани затем обрабатывают способом экстракции РНК с использованием TRIzol® согласно инструкциям производителя (Invitrogen), получая РНК хорошего качества, которую затем подвергают дальнейшему геномному анализу.

Материалы: лед, жидкий азот, замороженная ткань кошки, реагент для лизиса TRIzol®, хлороформ минимум 99%, изопропиловый спирт, 70% этанол (приготовленный с использованием абсолютного этанола и деионизованной не содержащей РНК-азы воды), РНК-аза Zap®, деионизованная вода, раствор для хранения РНК из Ambion.

Оборудование: Гомогенизатор Ultra-Turrax T25 Power, центрифуга Beckman Coulter Allegra 25R, центрифуга Eppendorf, пинцет, скальпель, твердая поверхность для резки, т.е. доска для резки, не содержащие ДНК-азы и РНК-азы стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, не содержащие ДНК-азы и РНК-азы одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 50 мл, пипетки P1000, P200, P20, P10 и P2 Rainin Pipetman, наконечники с фильтром для пипеток P1000, P200, P20, P10 и P2, не содержащие ДНК-азы и РНК-азы/стерильные и не имеющие ворса салфетки.

Подготовка: Готовят полипропиленовые пробирки объемом 50 мл с 4 мл TRIzol® (одна пробирка для каждой ткани, выбранной для выделения РНК).

Гомогенизация ткани: заполняют емкость, способную удерживать жидкий азот, 3-4 ковшами жидкого азота. Моментально помещают кусочек замороженной ткани в указанную выше емкость (ткань должна иметь размер примерно с горошину) и ткань помещают в соответствующую помеченную полипропиленовую пробирку объемом 50 мл (которая уже содержит 4 мл TRIzol®). Сразу же начинают гомогенизацию, используя гомогенизатор Ultra-Turrax T25 Power. Гомогенизируют при установке гомогенизатора на самый высокий режим (6) в течение 10-15 секунд. Охлаждают образец на льду еще в течение 10-15 секунд и затем повторяют гомогенизацию. Продолжают до тех пор, пока ткань не будет полностью гомогенизирована и раствор не станет мутным. После полной гомогенизации пробирку объемом 50 мл закрывают крышкой и возвращают на лед. Перед тем, как приступить к процедуре выделения, гомогенизированные ткани инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут.

Пример 4: Способы получения РНК

Выделение РНК: Обычно применяют способы, приведенные в инструкциях Invitrogen, с использованием реагента TRIzol®. Разделяют гомогенизированный образец на четыре аликвоты по 1 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. К каждой аликвоте по 1 мл добавляют 200 мл хлороформа. Пробирки закрывают крышкой, встряхивают круговыми движениями в течение 15 секунд и затем встряхивают вверх и вниз. В результате должна получиться розово-молочная жидкость. Пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут. Пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 14000 об/мин и 4°C. Жидкую фазу (верхний слой) переносят в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Обычный объем водной фазы, который следует переносить в новую пробирку, составляет примерно 500 мкл. Следуют быть осторожными, чтобы не перенести промежуточную или нижнюю фазы. Преципитируют РНК в растворе, добавляя 500 мкл изопропилового спирта в каждую микроцентрифужную пробирку, содержащую водный слой. Встряхивают пробирки движениями вверх и вниз в течение, по меньшей мере, 20 секунд. Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугируют образцы в течение 10 минут при 14000 об/мин при 4°C. Надосадок осторожно удаляют аспирацией жидкости, при этом убеждаясь, что осадок не потерян. Добавляют 1 мл 70% этанола, чтобы промыть осадок. Осадок смещают, слегка ударяя по пробирке (или постукивая пробиркой по поверхности стола) и встряхивают для перемешивания. Центрифугируют в течение 5 минут при 8200 об/мин при 4°C. Осторожно удаляют надосадок аспирацией жидкости, при этом убеждаясь, что осадок не потерян. Используют не имеющую ворса салфетку, чтобы осторожно впитать излишек этанола, чтобы сделать осадок сухим. Ресуспендируют каждый осадок в 30 мкл раствора для хранения РНК. Осторожно перемешивают пипетированием вплоть до тех пор, пока РНК снова не перейдет в раствор, и затем хранят при -80°C. Может потребоваться круговое встряхивание образца в течение нескольких секунд при низкой скорости, чтобы облегчить ресуспендирование РНК. При необходимости перед замораживанием образцы центрифугируют, используя микроцентрифугу.

Очистка РНК: Следуют способам, приведенным в руководстве RNeasy® Mini.

Выделение РНК из клеток, культивируемых в камерах OptiCell, с использованием набора RNeasy Mini. Культивируемые клетки линий клеток млекопитающих используют для выделения РНК хорошего качества, которую затем используют для последующего геномного анализа. Всю работу, связанную с культивированием клеток, проводят в строгих асептических условиях.

Реагенты: 10X PBS, деионизованная H2O, абсолютный этанол, раствор для хранения РНК, β-меркаптоэтанол, РНК-аза Zap®, буфер RLT, буфер RW1 и буфер RPE (поставляемые в наборе RNeasy Mini).

Оборудование/материалы: Набор RNeasy Mini, центрифужные колонки QIAshredder, нож OptiCell, стерильный шприц на 20 мл, наконечники OptiCell, скребок для клеток, пипетка P1000 Pipetman, Rainin, пипетка P200 Pipetman, Rainin, наконечники для пипеток с фильтрами на 100-1000 мкл, наконечники для пипеток на 1-200 мкл, стерильные пипетки для переноса, чашка для стерильного раствора на 55 мл, стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и микроцентрифуга Eppendorf.

Растворы: Буфер RLT (маточный раствор, поставляемый в наборе RNeasy Mini): добавляют 100 мкл β-меркаптоэтанола на 10 мл буфера RLT перед началом осуществления протокола. 70% этанол: готовят 50 мл 70% этанола, добавляя 35 мл абсолютного этанола к 15 мл деионизованной не содержащей РНКазы воды. 1X PBS: не содержащая РНКазы вода. Раствор фильтруют, используя 0,22 мкм фильтр.

Способ: Клетки извлекают из камеры OptiCell (обрабатывают одну OptiCell за один раз). Проверяют клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки являются живыми перед выделением РНК. Извлекают и выбрасывают среду культивирования клеток. Используя нож OptiCell, срезают верхнюю отлитую мембрану, открывая клетки на нижней мембране. Мембрану, на которой прикреплены клетки, промывают три раза, используя 1X PBS. Пипеткой вносят 600 мкл растворы буфера RLT (содержащего β-меркаптоэтанол) в центр мембраны, к которой прикреплены клетки. Используя скребок для клеток, осторожно распределяют буфер RLT по всей поверхности мембраны и затем собирают жидкость в один угол. Пипеткой отсасывают весь объем буфера RLT и помещают в центрифужную колонку QIAshredder.

Выделение РНК: Центрифужные колонки QIAshredder центрифугируют при 14000 об/мин в течение 2 минут. Центрифужную колонку выбрасывают, но оставляют пробирку для сбора и ее содержимое. В пробирку для сбора добавляют 600 мкл 70% этанола и хорошо перемешивают пипетированием (общий объем становится = 1,2 мл). 600 мкл клеточного лизата переносят в колонку RNeasy mini и центрифугируют в течение в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Проходящий поток выбрасывают, оставляя пробирку для сбора и центрифужную колонку. Оставшийся объем клеточного лизата (~600 мкл) переносят в центрифужную колонку и повторяют центрифугирование. Проходящий поток выбрасывают, оставляя пробирку для сбора и центрифужную колонку. В колонку добавляют 700 мкл буфера RW1. Центрифугируют в течение 15 секунд при 14000 об/мин, чтобы промыть колонку. Выбрасывают проходящий поток и пробирку для сбора. Переносят центрифужную колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл и в колонку добавляют 500 мкл буфера RPE. Центрифугируют в течение 15 секунд при 14000 об/мин. Отбрасывают проходящий поток, оставляя пробирку для сбора/колонку. В колонку добавляют еще 500 мкл буфера RPE. Центрифугируют в течение 2 минут при 14000 об/мин. Центрифужную колонку переносят в пробирку для сбора объемом 1,5 мл. Добавляют 30 мкл раствора для хранения РНК непосредственно на мембрану из силикагеля и центрифугируют в течение 1 минуты при 14000 об/мин, чтобы элюировать РНК. Конечную РНК хранят при -70°C.

Анализ RNA Nano 6000. Используя биоанализатор Agilent 2100 и анализ RNA Nano 6000, анализируют РНК, выделенную из культивируемых клеток млекопитающих, лимфоцитов или тканей, в отношении качества.

Реагенты: гелевый матрикс RNA 6000 Nano, концентрат красителя RNA 6000 Nano, маркер RNA 6000 Nano (все указанные выше реагенты входят в набор для анализа RNA 6000 Nano, Agilent), лэддер RNA 6000, РНКаза Zap и не содержащая РНКазы вода из Ambion.

Оборудование/другие материалы: установка праймирования чипов Agilent, Agilent, чип RNA 6000, Agilent, очистители электродов, стерильные пипетки P2, P10, P200 и P1000 Rainin Pipetman, не содержащие ДНКазы/РНКазы наконечники для пипеток с фильтрами, стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, встряхиватель, встряхивающий миксер IKA, микроцентрифуга и нагревательный блок.

Способ: Способ описан в руководстве, прилагаемом к набору реагентов для анализа RNA 6000 Nano, изданном в ноябре 2003 г., Agilent Technologies. Все операции проводили, следуя руководству со следующими модификациями: Подготовка геля, стр. 17: вместо того, чтобы делить профильтрованный гель на аликвоты по 65 мкл, маточный профильтрованный гель хранили в исходной микроцентрифужной пробирке и при необходимости отбирали аликвоты по 65 мкл. Загрузка маркера RNA 6000 Nano, стр. 22: добавляли 1 мкл не содержащей РНКазы воды (вместо маркера RNA 6000 Nano) в каждую лунку для образца, которая не будет содержать образца. Это не экономит количество используемого маркера, но также служит в качестве негативного контроля, чтобы увидеть, что ни один из реагентов не содержит примесей, включая не содержащую РНКазу воду. Загрузка лэддера и образцов, стр. 23: образцы и лэддер RNA 6000 денатурировали нагреванием дополнительно в течение 30 секунд (всего 2,5 минуты) при 71°C. Начало разгонки чипа, стр. 26: выбирали опцию «Eukaryote Total RNA Nano» («суммарная эукариотическая РНК») в меню анализа.

Пример 5: Анализ экспрессии с использованием чипов GeneChip Affymetrix

Экспрессию генов анализируют, используя запатентованные чипы для кошек Affymetrix Feline GeneChip®. Суммарную РНК обратно транскрибируют в кДНК. кДНК используют для создания кРНК, которую фрагментируют и используют в качестве зондов для гибридизации на генном чипе. Генный чип промывают, и сигнал гибридизации измеряют, используя лазерный сканнер Affymetrix. Данные по гибридизации затем подтверждают и нормализуют для дальнейшего анализа согласно инструкциям производителя.

Оборудование: Микроцентрифуга Eppendorf, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 50 мл, пипетки P1000, P200, P20, P10 и P2 Rainin Pipetman, не содержащие ДНКазы и РНКазы/стерильные наконечники с фильтром для пипеток P1000, P200, P20, P10 и P2 и термоциклер Peltier PTC-200.

Способ: Точно выполняют все операции, которые описаны в техническом руководстве для анализа экспрессии с использованием генных чипов (Affymetrix Copyright 1999-2003). Используют 5 микрограмм суммарной РНК для синтеза первой нити кДНК. Используют либо термоциклер Peltier PTC-200, либо нагревательный блок для контроля температуры реакций и денатурации зондов. Качественный контроль осуществляют, используя чипы RNA NanoDrop и BioAnalyer 2100. Используют формат 100 (средняя матрица) для генного чипа для кошек.

Пример 6: Экспрессия генов у кошек с хроническим заболеванием почек

Исследования проводили в соответствии с описанными выше примерами 1-5, используя кошек, имеющих различные стадии хронического заболевания почек, чтобы определить лежащие в основе различия в экспрессии генов между кошками с нормальной функцией почек и кошками, имеющими минимальный, слабый, умеренный и выраженный гломерулонефрит, соответствующий стадиям 1-4, которые указаны в таблице 1. Использовали способы, которые описаны в примерах в настоящей публикации, чтобы получить образцы тканей и жидкостей организма от 15 кошек, имеющих нормальную функцию почек, 4 кошек, имеющих минимальный гломерулонефрит, 10 кошек, имеющих слабый гломерулонефрит, 20 кошек, имеющих умеренный гломерулонефрит, и 13 кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, который определяли по уровням креатинина в плазме, представленных в таблице 2 и при клиническом обследовании.

На основании сравнения данных об экспрессии генов, полученных для кошек с нормальной функцией почек и кошек, имеющих гломерулонефрит, которых определяли, как описано в предыдущих примерах, идентифицировали четыре гена, указанных в таблице 3, в качестве удовлетворяющих критериям отбора согласно примеру 2 потенциальных биомаркеров хронических расстройств почек у кошек. Такими генами являются гены люмикана (LUM), цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1), декорина (DCN) и секретируемого родственного frizzled белка 2 (SFRP2). Аналогичные синонимичные названия у человека и номера доступа для мРНК и белка перечислены в таблице 3 для каждого гена. Каждый из белков является секретируемым белком. Данные кратного изменения геометрического среднего, отложенные на графике против стадии гломерулонефрита, для каждого из пяти генов, представлены на фигурах 1-4, соответственно.

На фиг. 1a показано кратное изменение геометрического среднего в 10 раз у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена люмикана. На фиг. 1b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 2a показано кратное изменение геометрического среднего в 10 раз у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена COL3A1. На фиг. 2b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 3a показано кратное изменение геометрического среднего в 4,3 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена декорина. На фиг. 3b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 4a показано кратное изменение геометрического среднего в 3,8 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена SFRP2. На фиг. 4b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 5a показано кратное изменение геометрического среднего в 10,3 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена матриксной металлопротеиназы-2. На фиг. 5b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 6a показано кратное изменение геометрического среднего в 23 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена матриксной металлопротеиназы-7. На фиг. 6b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 7a показано кратное изменение геометрического среднего в 6,9 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии матриксной металлопротеиназы-19. На фиг. 7b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

На фиг. 8a показано кратное изменение геометрического среднего понижающей регуляции в 3,9 раза у кошек, имеющих выраженный гломерулонефрит, по сравнению со здоровыми кошками в отношении продукта экспрессии гена ретинол-связывающего белка 5. На фиг. 8b представлены средние геометрические данные интенсивности RMA, отложенные против стадии гломерулонефрита для каждого тестированного животного.

Хотя любые композиции, способы, изделия производства или другие средства или материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей публикации, можно применять при практическом осуществлении настоящего изобретения, в настоящей публикации описаны предпочтительные композиции, способы, изделия производства или другие средства или материалы.

1. Способ диагностики наличия гломерулонефрита у кошки, включающий в себя измерение уровня экспрессии одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; ММР-2; ММР-7 и ММР-19, в биологическом образце, полученном от кошки, при этом значимое различие в экспрессии одного или нескольких биомаркеров в образце по сравнению с контрольным значением для экспрессии в образце, полученном от здорового животного, свидетельствует о наличии гломерулонефрита, причем «значимым различием» в случае повышенной экспрессии является повышение, по меньшей мере, в два раза и в случае пониженной экспрессии является понижение, по меньшей мере, на 50%:
a) повышенной экспрессии люмикана;
b) повышенной экспрессии цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12;
c) повышенной экспрессии декорина;
d) повышенной экспрессии секретируемого родственного frizzled белка 2;
e) пониженной экспрессии ретинол-связывающего белка 5;
f) повышенной экспрессии ММР-2;
g) повышенной экспрессии ММР-7; и/или
h) повышенной экспрессии ММР-19.

2. Способ по п. 1, включающий в себя выявление уровней экспрессии секретируемого родственного frizzled белка 2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающего белка 5 (rbp5) и, необязательно, уровней экспрессии, по меньшей мере, одного гена, выбранного из группы, состоящей из люмикана (LUM); декорина (DCN); цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12 (COL3A1); матриксной металлопротеиназы-2 (ММР2); матриксной металлопротеиназы-7 (ММР7, PUMP-1); и матриксной металлопротеиназы-19 (ММР19).

3. Способ по п. 1 или 2, в котором уровень экспрессии одного или нескольких биомаркеров определяют, измеряя экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров с использованием либо (i) ДНК-микроматрицы, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, комплементарных мРНК или кДНК, соответствующей одному или нескольким измеряемым биомаркерам, либо (ii) количественной полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами к мРНК или кДНК, соответствующей одному или нескольким измеряемым биомаркерам.

4. Способ по п. 3, в котором стадия измерения экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров включает в себя (i) выделение РНК из образца ткани, (ii) обратную транскрипцию РНК с получением соответствующей кДНК, (iii) выделение и фрагментацию полученной таким образом кДНК, (iv) осуществление контакта фрагментов кДНК с ДНК-микроматрицей, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, комплементарных кДНК, соответствующей одному или нескольким измеряемым биомаркерам, и (v) выявление гибридизации между фрагментами кДНК и одним или несколькими олигонуклеотидами на ДНК-микроматрице.

5. Способ по п. 4, в котором олигонуклеотиды на ДНК-микроматрице содержат один или несколько зондов, способных гибридизоваться с одной или несколькими последовательностями SEQ ID NO: 9-16.

6. Способ по п. 5, в котором олигонуклеотиды на ДНК-микроматрице содержат один или несколько зондов, содержащих последовательности, выбранные из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 1-8.

7. Способ по п. 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют с использованием антитела к экспрессированному белку.

8. Способ по п. 7, в котором биомаркер выявляют с использованием иммуноанализа, выбранного из анализа конкурентного связывания, анализа неконкурентного связывания, радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), «сэндвич»-анализа, реакции преципитации, анализа иммунодиффузии в геле, анализа агглютинации, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа, иммуноанализа иммуно-ПЦР, иммуноанализа с использованием белка А или белка G и иммуноэлектрофоретического анализа.

9. Способ по п. 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют, используя измерение количества белка в образце с помощью количественной масс-спектроскопии.

10. Способ по п. 1, в котором уровень экспрессии биомаркера выявляют с использованием узнавания аптамером экспрессированного белка.

11. Способ по п. 1, в котором биологическим образцом является кровь или образец ткани почек.

12. Способ по п. 1, включающий в себя выявление уровней экспрессии секретируемого родственного frizzled белка-2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающего белка 5 (rbp5).

13. Способ по п. 1, в котором кошка имеет по существу нормальную функцию почек, измеряемую по одному или нескольким из следующих показателей: нормальной скорости клубочковой фильтрации, скорости клиренса креатинина, уровням белка в моче, уровням креатинина в сыворотке, уровням креатинина в моче, уровням азота мочевины в крови (BUN), мечению продуктов метаболизма радиоактивными изотопами, томографии мягких тканей, включая сонографию, магнитно-резонансную томографию и/или компьютерную томографию.

14. Применение набора в способе по любому из предшествующих пунктов для диагностики наличия гломерулонефрита у кошек, при этом набор содержит средства для измерения экспрессии генов одного или нескольких биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; ММР-2; ММР-7 и ММР-19, в биологическом образце, полученном от кошки; и инструкции по применению таких средств для измерения экспрессии одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце, полученном от кошки, и диагностики наличия гломерулонефрита у кошки.

15. Применение по п. 14, в котором средства для измерения одного или нескольких биомаркеров представляет собой один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров.

16. Применение по п. 15, в котором один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с одной или несколькими последовательностями SEQ ID NO: 9-16.

17. Применение по п. 16, в котором один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот содержат последовательность или последовательности, выбранные из одной или нескольких последовательностей SEQ ID NO: 1-8.

18. Применение по любому из пп. 14-17, включающее ДНК-микроматрицу, содержащую один или несколько зондов в виде нуклеиновых кислот, способных выявлять экспрессию генов одного или нескольких биомаркеров.

19. Применение по любому из пп. 14-17, в котором средства для измерения одного или нескольких биомаркеров представляют собой одно или несколько антител или аптамеров, способных выявлять один или несколько биомаркеров.

20. Применение по п. 19 в форме ELISA, содержащей одно или несколько антител, способных выявлять один или несколько биомаркеров, выделенный белок, соответствующий биомаркеру, который служит в качестве стандарта, и буфер.

21. Применение по любому из пп. 14-17, в котором один или нескольких биомаркеров включают секретируемый родственный frizzled белок-2 (SFRP2) и/или ретинол-связывающий белок 5 (rbp5).

22. Применение нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной гену кошачьего люмикана; цепи коллагена альфа 1 (III), варианта 12; декорина; секретируемого родственного frizzled белка 2; ретинол-связывающего белка 5; ММР-2; ММР-7 и ММР-19, например, нуклеотидной последовательности, соответствующей или комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-16, в способе по любому из пп. 1-13 для диагностики наличия гломерулонефрита у кошки.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу диагностики болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного расстройства. Сущность способа состоит в том, что способ включает измерение в крови десмостерола, бета-амилоида, гельсолина.

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способу определения неизвестной концентрации клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к известной концентрации клостридиального нейротоксина во втором образце и к способу определения относительной активности клостридиального нейротоксина в первом образце по отношению к активности клостридиального нейротоксина во втором образце, где способ включает следующие этапы: (а) контактирование клеточной культуры с указанным вторым образцом, содержащим клостридиальный нейротоксин в известной концентрации; (c) измерение второго эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в известной концентрации; (d) повторение этапов (а)-(с) при различных концентрациях указанного клостридиального нейротоксина; (e) регистрацию измеренного второго эффекта этапа (d) в зависимости от концентрации клостридиального нейротоксина с регистрацией, таким образом, второго набора данных; (f) контактирование клеточной культуры с указанным первым образцом, содержащим указанный клостридиальный нейротоксин в неизвестной концентрации; (h) измерение первого эффекта, вызванного в указанной клеточной культуре указанным клостридиальным нейротоксином в неизвестной концентрации; (k) определение концентрации клостридиального нейротоксина, при которой указанный первый и указанный второй эффекты идентичны; и (l) сравнение концентрации клостридиального токсина, определенной в (k), с указанной неизвестной концентрацией клостридиального нейротоксина; где до указанного измерения в этапе (с) и этапе (h), и после контакта в этапе (а) и этапе (f), указанную клеточную культуру подвергают контакту в течение от 0,5 до 100 ч с водной средой, которая не содержит клостридиальный нейротоксин, и где этап (с) выполняют при отсутствии указанного второго образца, а этап (h) выполняют при отсутствии указанного первого образца.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и гастроэнтерологии, и описывает способ оценки риска развития язвенной болезни у хакасов на основе генетического анализа.

Изобретение касается способа выявления ионов кальция в эритроцитах периферической крови беременных. Способ включает выполнение гистохимической реакции на монослойных мазках периферической крови с помощью их последовательной обработки растворами, состоящими из 5% нитрата серебра, промывки 5% тиосульфатом натрия и дистиллированной водой с последующей докраской 1% раствором сафранина на 96% этиловом спирте, дифференцировки в 96% этиловом спирте, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, просветление в кислоте и заключение в бальзам.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии, иммунологии и медицины и предназначена для идентификации популяций аутореактивных Т-клеток у индивидуумов с аутоиммунными заболеваниями.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения иммуностимулятора из нервной ткани головоногих моллюсков, мозга морских млекопитающих и рыб.
Изобретение относится к медицине и описывает способ оценки эффективности диализно-фильтрационной очистки крови, заключающийся в том, что в сыворотке крови больного определяют суммарную концентрацию фенилуксусной (ФУК), пара-гидроксифенилуксусной (п-ГФУК), фенилмолочной (ФМК) и пара-гидроксифенилмолочной (п-ГФМК) кислот до и после очистки крови и при снижении ее в 2 и более раз очистку крови оценивают как эффективную.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования депрессии тяжелой степени у мужчин с ишемической болезнью сердца (ИБС). Сущность способа состоит в том, что у мужчин с ИБС устанавливают временную и структурную связь между ИБС и признаками депрессии, измеряют уровень личностной тревожности с помощью теста Спилбергера-Ханина.

Изобретение относится к гинекологии и представляет собой способ прогнозирования риска развития пролапса гениталий (ПГ) у женщин с родовыми травмами в анамнезе, включающий отбор биоматериала для выделения ДНК, проведение генотипирования ДНК методом тетра-праймерной аллель-специфической полимеразной цепной реакции, выявление полиморфизма гена FBLN5 по сайтам rs12586948, rs2018736, rs12589592 и rs2474028, в котором высокий риск развития пролапса гениталий прогнозируют при выявлении совокупности генотипов: rs12586948-A/*, rs2018736-C/*, rs12589592-G/G и rs2474028-T/*, а низкий риск - при совокупности генотипов: rs12586948-G/G, rs2018736-A/A, rs12589592-A/A и rs2474028-С/С.
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи. Способ включает получение биоптата исследуемого новообразования кожи, затем с исследуемым образцом проводят ПЦР в реальном времени для количественного определения относительного уровня экспрессии микроРНК по нормализующей микро-РНК - snRNA-U6, при этом маркером дифференциальной диагностики является ген hsa-miR-205.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для детекции гриба Trichophyton mentagrophytes. Осуществляют выделение тотальной нативной ДНК из образца кожи и волос, проводят полимеразную цепную реакцию и амплификацию фрагмента гена 5.8S рРНК Trichophyton mentagrophytes с использованием специфических праймеров.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены способы диагностики пациентов с рассеянным склерозом (PC).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному антителу, которое специфически связывается с TAT211, или его функциональному фрагменту. Также раскрыты конъюгат, содержащий указанное антитело и который специфически связывает TAT211, нуклеиновая кислота, кодирующая заявленное антитело, и клетка, которая продуцирует заявленное антитело.

Изобретение относится к области биоинженерии и касается генетической конструкции, предназначенной для введения в хромосому Yarrowia lipolytica гена RecA из Bacillus subtilis. Представленная конструкция характеризуется последовательностью SEQ ID NO 1.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза - микобактерий туберкулезного комплекса с одновременным установлением генотипа возбудителя и определением генетических детерминант устойчивости к широкому спектру противотуберкулезных препаратов, включая рифампицин, изониазид, фторхинолоны, канамицин, капреомицин, амикацин, этамбутол, в клиническом образце на дифференцирующем олигонуклеотидном микрочипе.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения присутствия или отсутствия локуса устойчивости к пыльной головне в растении маиса, а также к способу определения растения маиса, которое проявляет устойчивость к пыльной головне, где способ включает обнаружение в идиоплазме растения маиса, по меньшей мере, одной аллели маркерного локуса, расположенного на хромосомном участке хромосомы 2 маиса, включающем и фланкированном umc1736 и umc2184.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для диагностических исследований. Группа изобретений характеризует автоматическую систему количественной амплификации в реальном времени, способ автоматической очистки нуклеиновой кислоты и количественного определения амплификации гена с использованием указанной системы, способ автоматического измерения количества жизнеспособных клеток патогенных бактерий, анализа патогенных бактерий на чувствительность к антибиотикам и автоматического получения антигенной плотности с использованием указанной системы, а также способ очистки связывающей нуклеиновой кислоты-мишени, которой мечен антиген-мишень, содержащийся в биологическом образце, с использованием указанной автоматической системы.
Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования депрессии тяжелой степени у мужчин с ишемической болезнью сердца (ИБС). Сущность способа состоит в том, что у мужчин с ИБС устанавливают временную и структурную связь между ИБС и признаками депрессии, измеряют уровень личностной тревожности с помощью теста Спилбергера-Ханина.
Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и медицины. Предложен набор биомаркеров старения сердца, включающий множество полинуклеотидов, которые дифференциально экспрессируются в ткани сердца у старых субъектов по сравнению с молодыми субъектами, в котором полинуклеотиды выбирают из двух или более генов, вовлеченных в передачу Wnt-сигнала в ткани сердца, где гены представляют собой Dlgh1, Magi3, Akt1, Dab2, Rac1, Ctnnb1, Camk2d, Mapk1, Senp2, Smad3, Mark2, Ccnd1 и Pias4, а также соответствующая композиция и способ скрининга средства или режима на их способность замедлять старение сердца.

Изобретения относятся к области ветеринарной микробиологии и касаются олигонуклеотидных праймеров для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы D, а также способа с их использованием.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ тестирования собаки с целью определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени или к предрасположенности к накоплению меди в печени. Способ предусматривает генотипирование образца ДНК собаки на присутствие или отсутствие в геноме собаки одного или более полиморфизмов, выбранных из (a) SNP ATP7a_Reg3_F_6 (SEQ ID NO:142) и (b) одного или более полиморфизмов, находящихся в неравновесном сцеплении с указанным полиморфизмом (a). Также описано применение указанных полиморфизмов для определения вероятности наличия у собаки защиты от накопления меди в печени или к предрасположенности к накоплению меди в печени, а также способы отбора собак для получения потомства и способ предотвращения заболевания, связанного с накоплением меди в печени собак. Предложенная группа изобретений может быть использовано в ветеринарии. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 ил., 11 табл., 9 пр.
Наверх