Композиция палочковидных бактерий, устойчивых к желчи и секретирующих высокие уровни незаменимых аминокислот

Группа изобретений относится к способу скрининга и выделения клеток Bacillus subtilis, к композиции кормовой добавки к кормовому продукту для животного, содержащей указанные клетки, и способу кормления животного. Способ предусматривает отбор и выделение споровых клеток Bacillus subtilis, характеризующихся быстрым прорастанием и ростом в присутствии среды с 4 мМ или 6 мМ солей желчных кислот, получение вегетативных клеток из споровых клеток, УФ-мутирование указанных вегетативных клеток, отбор и выделение клеток вегетативных клеток Bacillus subtilis, характеризующихся высоким уровнем продукции по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты, анализ полученных вегетативных клеток Bacillus subtilis для подтверждения сохранения прорастания и роста в присутствии среды с солями желчных кислот и выделение отобранных клеток Bacillus subtilis. Полученные клетки в количестве 10⁵ до 10¹² КОЕ/г входят в состав композиции кормовой добавки. Способ кормления животного включает введение указанной композиции кормовой добавки животному вместе с другими ингредиентами корма. Группа изобретений оказывает пробиотическое воздействие на организм и усиливает пищеварение и доступность нутриентов из кормовых продуктов для животных. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции палочковидных бактерий (бацилл), характеризующихся быстрым прорастанием и ростом в солях желчных кислот (моделированной кишечной среде) и высоким уровнем секреции незаменимых аминокислот. Композиция палочковидных бактерий может быть использована в качестве пищевой добавки в кормовой продукт для животного, где она оказывает пробиотическое воздействие (поддержание здоровья и стимуляция роста) и усиливает пищеварение и доступность нутриентов из кормовых для животных.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Пробиотические бактерии, такие как Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используют в области кормовых продуктов для животных в качестве кормовой добавки к рациону. Их применение связано со способностью палочковидных бактерий заменять или снижать применение антибиотиков, которые используют в качестве стимуляторов роста в производстве кормовых продуктов для животных.

Christian Hansen A/S, Denmark, представляет на рынке пример такого пробиотического продукта, стимулирующего рост, под торговой маркой GalliPro^® (депонированный как DSM 17231). GalliPro^® представляет собой композицию споровых клеток Bacillus subtilis.

Кроме того, предположительный механизм действия (например, иммуномодуляция, модификатор кишечной флоры) пробиотических палочковидных бактерий приводит к продуцированию множества оказывающих положительное воздействие компонентов, таких как ферменты, которые выделяются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) при использовании в качестве кормовой добавки к кормовому продукту для животных. Выделяющиеся ферменты, такие как фитаза, улучшают переваривание и усвоение кормового продукта для животных (более высокая перевариваемость). Рацион (корм, кормовой продукт), главным образом, включает компоненты растительного происхождения, такие как злаковые, кукуруза, соевые бобы, соевое масло и аминокислоты. В целом все это позволяет получить рентабельные кормовые продукты для животных.

Пробиотические палочковидные бактерии также способны продуцировать другие оказывающие положительное воздействие компоненты, такие как незаменимые аминокислоты.

Споры палочковидных бактерий могут проходить через кислотный желудочный барьер, прорастать и расти в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животных. Это является огромным преимуществом, поскольку при потреблении внутрь они могут выделять различные типы оказывающих положительное воздействие компонентов, например бактериоцины, и также выделяют полезные незаменимые аминокислоты. Дополнительно, споры палочковидных бактерий термостабильны в процессе пеллетизации кормового продукта и, следовательно, они являются превосходной системой доставки для доставки бактериоцинов, например незаменимых аминокислот, в ЖКТ. В процессе выживания и пролиферации палочковидных бактерий в ЖКТ очень важна роль желчи. Желчь продуцируется в печени и хранится в желчном пузыре. Желчь содержит воду, лецитин, билирубин, биливердин и соли желчных кислот.

Из литературы известно, что желчь оказывает негативное воздействие на выживание, прорастание и рост споровых клеток палочковидных бактерий в вегетативные клетки в ЖКТ животных. Следовательно, в настоящее время проводятся исследования по обнаружению пробиотических штаммов Bacillus, устойчивых к желчи.

В статье (Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4) описывается выделение образцов Bacillus/клеток непосредственно из кишечника кур. Выделенные клетки палочковидных бактерий тестируют на пробиотическую активность. Шесть палочковидных бактерий с наивысшей пробиотической активностью тестируют на устойчивость к солям желчных кислот, и было обнаружено, что специфические высоко пробиотические палочковидные бактерии имеют относительно высокий уровень устойчивости к солям желчных кислот.

В этой статье не уделяется особого внимания каким-либо временным периодам тестирования на устойчивость к желчи. В экспериментальной части споровые клетки просто тестируют на устойчивость после 5 дней присутствия в солях желчных кислот (см. абзац «Simulated small intestinal fluid tolerance test» на странице 141).

В US 2003/0124104 A описывается, что эндоспоры традиционных пробиотических палочковидных бактерий чувствительны к низким концентрациям солей желчных кислот, то есть прорастание спор и/или регидратация ингибируются присутствием даже низких концентраций солей желчных кислот. Это отличает их от других бактерий, таких как кишечные патогенны, такие как E. coli или S. aureus (см. абзацы [0014]-[0015]). Ввиду этого предлагается проводить скрининг/отбор спор палочковидных бактерий, устойчивых к ингибированию активности солями желчных кислот и прорастающих в результате в вегетативные клетки, которые затем колонизируют толстую кишку (см. [0019]).

В описании приведены рабочие примеры и отсутствуют реальные экспериментальные данные фактически полученных скринингом клеток специфических Bacillus.

Дополнительно приведены относительно общие условия скрининга на устойчивость к солям желчных кислот. В частности, нет указаний на временные периоды для отбора на устойчивость к солям. Говоря другими словами, основываясь только на широком/общем описании этого документа, могут быть выбраны клетки Bacillus, которые могут расти (прорастать) только медленно, то есть способны прорастать из спор в вегетативные клетки через, например, 20 часов в присутствии значимого количества соли желчных кислот.

В этом документе нет описания или предложения по выбору клеток палочковидных бактерий, которые могут расти (прорастать) быстро, то есть способны прорастать или расти из спор в вегетативные клетки, достигая определенной точки роста за определенный интервал времени в присутствии значимого количества солей желчных кислот.

Таким образом, в ссылках из предшествующего уровня техники, относящихся к отбору/скринингу устойчивых клеток палочковидных бактерий, не уделяется внимание быстрому росту/прорастанию палочковидных бактерий из споровых клеток в вегетативные клетки.

Международная патентная публикация PCT/EP2008/057296 подана 11/06/2008, Заявитель Chr. Hansen A/S и не опубликована на момент подачи настоящей патентной заявки.

В PCT/EP2008/057296 описываются споры новых палочковидных бактерий, характеризующихся повышенной/более быстрой скоростью прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солями желчных кислот. Споры палочковидных бактерий, описанные здесь, имеют такую же повышенную/более быструю скорость прорастания и роста из спор в вегетативные клетки, как описано в PCT/EP2008/057296.

В PCT/EP2008/057296 описываются только вегетативные клетки палочковидных бактерий, продуцирующих повышенное количество фитазы по сравнению с контрольными клетками палочковидной бактерии DSM 19467. Не описывается и не предлагается скрининг вегетативных клеток палочковидных бактерий, продуцирующих незаменимые аминокислоты в повышенных количествах по сравнению с контрольными клетками палочковидных бактерий DSM 19467.

Следует понимать, что приведенные ниже ссылки на предшествующий уровень техники относятся к общедоступным материалам (например, опубликованные статьи, патенты) на момент подачи настоящей патентной заявки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема в настоящем изобретении решается за счет обеспечения композиции палочковидных бактерий, выделяющих (продуцирующих) высокие уровни незаменимых аминокислот в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) животного.

Решение основывается на том, что авторы настоящего изобретения разработали новый способ отбора для идентификации композиций новых улучшенных палочковидных бактерий.

Новой важной стадией описанного здесь нового способа отбора является специфический скрининг/отбор споровых клеток палочковидных бактерий с повышенной/большей скоростью прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии солей желчных кислот. Как указано выше, в предшествующем уровне техники описаны способы отбора клеток палочковидных бактерий, способных расти в присутствии солей желчной кислоты, но способы скрининга/отбора по предшествующему уровню техники не фокусируются на скорости прорастания и роста в присутствии соли желчной кислоты.

Следовательно, выбранные в предшествующем уровне техники устойчивые к соли желчных кислот клетки палочковидных бактерий не прорастают и не растут достаточно быстро для того, чтобы соответствовать критериям скорости прорастания и роста, описанным здесь. Например, клетки палочковидной бактерии, выделенные непосредственно из кишечника, например, кур (как, например, описано выше в статье Antonie Van Leeuwenhoek) не выбирают в кишечной среде (при атмосферном давлении) для быстрого прорастания и роста в кишечнике.

Как показано в рабочих примерах в настоящем описании, это также справедливо для коммерчески доступной композиции Bacillus GalliPro®, содержащей бациллы, которые просто прорастают или растут слишком медленно и не достигают заданной точки роста в первые 20 часов в присутствии физиологических уровней солей желчных кислот для того, чтобы соответствовать критериям скорости прорастания и роста, описанным здесь. GalliPro® представляет композицию Bacillus subtilis, которая является коммерчески доступной.

Описанный здесь новый DSM 19467 отобран с использованием в качестве исходного штамма GalliPro® и при использовании способа селективного давления с последующим выделением для быстрого прорастания и роста из спор в вегетативные клетки в присутствии соли желчных кислот, как описано в настоящем изобретении.

Дополнительные детали смотрите, например, в Таблице 1 (GalliPro®, который также может быть указан здесь как DSM).

Это показано схематически на Фигуре 1.

Кроме того, считается, что в предшествующем уровне техники не описана выделенная композиция Bacillus, включающая в пределах от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г клеток палочковидных бактерий, где клетки композиции палочковидных бактерий отвечают условиям быстрого прорастания и роста в присутствии соли желчных кислот, как описано в настоящем изобретении.

Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения определили, что быстрое прорастание и рост являются очень важным аспектом настоящего изобретения, поскольку споры палочковидной бактерии, которые устойчивы к желчи, но не достаточно быстро прорастают и растут, будут экскремированы до того как проявятся любые положительные характеристики, такие как продуцирование незаменимой аминокислоты вегетативными клетками палочковидных бактерий. Споры Bacillus, прорастая слишком медленно, просто проходят через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) до того как бактерии начнут продуцировать какое-либо значительное количество, например, незаменимых аминокислот.

После множества детальных тестов и анализов авторы настоящего изобретения, таким образом, выбрали для работы временные пределы вплоть до 20 часов и отобрали в этом временном пределе самые быстро прорастающие и растущие споры в присутствии высоких физиологических концентраций солей желчной кислоты. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией и основываясь на описанной здесь тщательной экспериментальной работе, авторы настоящего изобретения определили, что важно иметь высокие скорость прорастания и рост в первые 18-19 часов в присутствии в пределах от 4 до 6 мМ соли желчных кислот соответственно.

Затем авторы настоящего изобретения установили, что если отобраны клетки палочковидных бактерий с быстрыми прорастанием и ростом в среде с солями желчных кислот, эти клетки становятся весьма полезными в качестве исходных клеток для мутагенеза для получения новых клеток усиленным продуцированием незаменимой аминокислоты.

Как схематически показано на Фиг. 1 и в Примере 4, быстро прорастающий устойчивый к соли желчных кислот отобранный штамм DSM 19467 используют в качестве исходного штамма для классической мутации и выбирают штамм, продуцирующий незаменимую аминокислоту. Как видно из Примера 4, некоторые из отобранных штаммов продуцируют по меньшей мере в 5 раз больше незаменимой аминокислоты лейцина, чем DSM 19467 и GalliPro®.

Новые пробиотические клетки палочковидных бактерий по настоящему изобретению, следовательно, являются устойчивыми к соли желчных кислот, быстро прорастают, растут и выделяют большие количества незаменимой аминокислоты. Полученные штаммы в высшей степени подходят для использования в качестве композиций пробиотических палочковидных бактерий для добавления в кормовой продукт для животных. Они объединяют все оказывающие положительное воздействие способности пробиотических бактерий выживать и размножаться в кишечнике животных (в присутствии высоких уровней соли желчных кислот), ингибировать патогенные бактерии (продуцирование бактериоцинов), и, кроме того, выделяют большие количества оказывающих положительное воздействие незаменимых аминокислот.

Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции палочковидных бактерий, включающей от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, где композиция палочковидных бактерий характеризуется тем, что:

(i): споры палочковидных бактерий быстро прорастают и растут из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солями желчных кислот, включающей от 4 до 6 мМ солей желчных кислот, причем споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток 0,4 OD₆₃₀ за менее чем 18-19 часов, соответственно, где точка роста вегетативных клеток является точкой на кривой роста, где показатель OD начинает повышаться (ввиду роста вегетативных клеток) непрерывно и достигает OD₆₃₀, равное 0,4;

(I): причем среда с солями желчных кислот является стандартной известной неселективной средой телячьего мясного бульона (VIB) из примера 1, в которую добавлена смесь солей желчных кислот, включающая конъюгированные соли желчной кислоты тауродеоксихолата и гликодеоксихолата и деконъюгированные соли желчной кислоты тауродеоксихолата в пропорциях 60% тауродеоксихолата, 30% гликодеоксихолата и 10% деоксихолата;

где OD анализ проводят, осуществляя следующие стадии:

(a): заполнение лунок пластины микротитратора 0,150 мл среды с солями желчных кислот с 10⁸ спор палочковидных бактерий на мл среды (то есть это время ноль);

(b): инкубирование пластины при температуре 37°C при атмосферном давлении и измерение показателей OD₆₃₀, используя спектрофотометр с перемешиванием перед каждым снятием данных для получения репрезентативной кривой роста во времени; и где

(ii) вегетативные клетки палочковидных бактерий продуцируют по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве, большем, чем клетки контрольных палочковидных бактерий DSM 19467, причем количество продуцированной незаменимой аминокислоты измеряют при использовании стандартного ГХ-МС метода (газовой хроматографии-массовой спектрометрии) на основе анализа аминокислоты по примеру 2 через два дня роста при температуре 37°C в известной стандартной с минимальным содержанием солей ростовой среде по примеру 2.

Как указанно выше, клетки контрольных палочковидных бактерий DSM 19467 отбирают для быстрого прорастания и роста в присутствии соли желчной кислоты, используя GalliPro^® в качестве исходного штамма. DSM 19467 не является отобранным для повышенного продуцирования незаменимой аминокислоты. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что продуцирование релевантного количества незаменимой аминокислоты DSM 19467 соответствует GalliPro^®.

Что касается точки (i), то точка роста вегетативных клеток GalliPro^® наступает по меньшей мере через 20 часов инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ, а для нового штамма DSM 19467, как описано в настоящем изобретении, через 14-15 часов инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ соответственно (см. Фиг. 2 и рабочий пример 3 настоящего описания).

Следует отметить, что авторы настоящего изобретения также протестировали коммерчески доступный продукт CALSPORIN® (Calpis Co., Ltd., Japan) для определения точки роста вегетативных клеток в условиях точки (i) первого аспекта. Как и GalliPro®, коммерческий продукт CALSPORIN® является композицией Bacillus subtilis, используемой в качестве пробиотической кормовой добавки. Точка роста вегетативных клеток при условиях точки (i) первого аспекта для CALSPORIN® составляет более 20 часов при инкубации с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ соответственно. Это значительно больше, чем 18-19 часов, требуемые в точке (i), и это показывает, что коммерчески доступные продукты до сих пор не отбирали для быстрого прорастания и роста. Используемый здесь термин «натуральные» клетки палочковидных бактерий относится к таковым, не подвергшимся какому-либо селективному давлению для достижения быстрых прорастания и роста. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что «натуральные» клетки палочковидных бактерий не отвечают условиям точки (i) первого аспекта.

Оба, как анализ на устойчивость к желчи [точка (i)], так и анализ на незаменимую аминокислоту [точка (ii)], основаны на использовании известных коммерчески доступных стандартных элементов (таких как, например, стандартная среда, соли желчных кислот; стандартные измерения OD и стандартные тесты). Контрольные клетки палочковидных бактерий депонированы как DSM 19467 и, следовательно, общедоступны. Клетки Bacillus subtilis GalliPro^® депонированы как DSM 17231 (названный «GalliPro^®») и, следовательно, общедоступны.

Следовательно, основываясь на детальном описании анализа на устойчивость к желчи, см., например, пример 1, и анализа на незаменимую аминокислоту - пример 2, специалист в данной области техники способен рутинно повторить эти анализы для объективного определения, отвечают ли клетки интересующих специфических палочковидных бактерий условиям устойчивости к желчи [точка (i)] и условиям по незаменимой аминокислоте [точка (ii)] уровням первого аспекта настоящего изобретения.

Композиция новых палочковидных бактерий по настоящему изобретению может быть использована в качестве пробиотической кормовой добавки к кормовому продукту для животного. Дозировка и введение могут выбираться согласно предшествующему уровню техники, как, например, выбрано из предшествующего уровня техники для композиций палочковидных бактерий GalliPro^®.

Следовательно, во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу кормления животного, включающему введение композиции палочковидных бактерий по первому аспекту, и здесь описаны соответствующие варианты воплощения настоящего изобретения для животного совместно с другими ингредиентами кормового продукта для животного.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга и выделения новых клеток палочковидной бактерии, включающему следующие стадии:

(a): отбор и выделение из пула отдельных споровых клеток палочковидных бактерий новых споровых клеток палочковидных бактерий, способных прорастать и расти так быстро, чтобы достичь точки роста вегетативных клеток за менее чем 18-19 часов при условиях точки (i) первого аспекта;

(b): получение вегетативных клеток палочковидных бактерий из выделенных споровых клеток стадии (a) и мутирование новых отобранных и выделенных клеток с получением пула новых отдельных вегетативных клеток палочковидных бактерий;

(c): отбор и выделение из пула новых отдельных вегетативных клеток палочковидных бактерий стадии (b) новых вегетативных клеток палочковидных бактерий, способных продуцировать по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве, большем, чем у контрольных клеток палочковидных бактерий DSM 19467 при условиях точки (ii) первого аспекта; и

(d): анализ высокой степени продуцирования вегетативных клеток палочковидных бактерий стадии (c) для подтверждения того, что сохраняется быстрое прорастание и рост, как на стадии (a), и выделение отобранных клеток палочковидных бактерий.

Для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, очевидно, что поскольку авторы настоящего изобретения описали здесь релевантные тестовые анализы (в частности, анализ для тестирования быстрого прорастания и роста по примеру 1) плюс контрольный штамм DSM 19467, то для специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, является рутинной работа по отбору других новых клеток палочковидных бактерий, отвечающих условиям первого аспекта настоящего изобретения.

Как описано здесь, при использовании нового способа скрининга/отбора по настоящему изобретению авторы настоящего изобретения отобрали и выделили новые улучшенные клетки палочковидных бактерий.

Описанный ниже вариант воплощения настоящего изобретения приведен только для целей иллюстрации.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Все определения соответствующих терминов имеют общепринятое значение и толкование в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Используемый здесь термин «клетки палочковидных бактерий» относится как к спорам палочковидных бактерий (бацилл), так и к вегетативным клеткам палочковидных бактерий.

Используемый здесь термин «споры палочковидных бактерий» относится к споровым клеткам, которые согласно предшествующему уровню техники могут характеризоваться как спящие, труднообрабатываемые, без репродуктивной структуры, продуцированные палочковидными бактериями. Первичной функцией спор, как правило, является гарантия выживания бактерий во время стресса, вызываемого окружающей средой. Следовательно, они устойчивы к ультрафиолету, гамма-излучению, дегидратации, лизоциму, температуре, истощению и химическим дезинфицирующим средствам. Споры, как правило, находятся в почве и в воде, где они могут выживать в течение длительного периода времени. Покрытие споры непроницаемо для большинства токсических молекул и также может содержать ферменты, способствующие прорастанию. Ядро имеет нормальные клеточные структуры, такие как ДНК и рибосомы, но метаболически не активно. Когда бактерия определяет, что условия среды становятся неблагоприятными, она может начать процесс споруляции, который занимает около восьми часов.

Используемый здесь термин «вегетативные клетки палочковидных бактерий» относится к функциональным вегетативным клеткам палочковидных бактерий, которые могут делиться с получением большего количества вегетативных клеток.

Используемый здесь термин «прорастание и рост» относится к прорастанию спор палочковидных бактерий и к росту вегетативных клеток палочковидных бактерий. Как известно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, реактивация спор происходит, когда условия благоприятны и включается прорастание и рост. Прорастание включается, спящие споры начинают метаболическую активность и, следовательно, прерывается спящий режим. Оно обычно характеризуется разрушением или абсорбцией покрытия спор, разбуханием спор, повышением метаболической активности и потерей устойчивости к стрессовым условиям окружающей среды. За прорастанием следует рост, и ядро споры производит новые химические компоненты, и отмирает старое покрытие спор для развития в функциональные вегетативные клетки палочковидных бактерий, которые могут делиться с продуцированием множества клеток. Кривые роста (OD по времени) клеток палочковидных бактерий демонстрируют различные фазы роста. Поскольку споры помещают в среду, богатую ингредиентами, то после временного снижения OD (фаза I) начинается прорастание, которое происходит благодаря высвобождению дипиколиновой кислоты и, следовательно, гидратации покрытия спор. Вторая фаза (фаза II = фаза роста) - это период с относительно незначительными изменениями OD до тех пор, пока споры развиваются в функциональные вегетативные клетки бактерий, которые могут делиться с продуцированием множества клеток и, следовательно, дают непрерывное повышение показателя OD. Точку, когда она начинает давать непрерывное повышение показателей OD, достигая OD 0,4, определяют как «точку роста вегетативных клеток».

Используемый здесь термин «оптическая плотность» относится к измерению коэффициента оптического поглощения при использовании спектрофотометра. Оптическая плотность (OD) представляет собой коэффициент поглощения оптически заданной длины волны λ на единицу расстояния. Если показатель OD, например, измерен при длине волны 630 нм, он может быть указан, как OD₆₃₀.

ЧЕРТЕЖИ

Фиг. 1: на этой Фигуре приведены стадии получения новых улучшенных штаммов. Рабочие примеры начинаются с DSM 17231 (GalliPro®), который классически мутируют и проводят скрининг/отбор на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот с получением нового отобранного штамма DSM 19467. DSM 19467 используют в качестве исходного штамма для классической мутации и отбора штаммов, продуцирующих высокие уровни незаменимой аминокислоты.

Фиг. 2A и 2B: на этих Фигурах ясно видно, что споры палочковидных бактерий DSM 19467 имеют улучшенное быстрое прорастание и рост по сравнению с DSM 17231 в присутствии от 4 до 6 мМ солей желчных кислот.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиция палочковидных бактерий

Используемый здесь термин «композиция палочковидных бактерий» следует понимать и толковать в значении, известном из предшествующего уровня техники. Следует понимать, что композиция палочковидных бактерий включает множество споровых клеток палочковидных бактерий с интересующими характеристиками.

Композиция палочковидных бактерий может включать различные типы клеток палочковидных бактерий (например, B. subtilis и Bacillus licheniformis). По существу композиция должна просто включать споровые клетки палочковидных бактерий по первому аспекту настоящего изобретения, где клетки палочковидных бактерий отвечают условиям первого аспекта.

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, коммерчески релевантные композиции споровых клеток палочковидных бактерий, как правило, получают культивированием. Полученные споровые клетки, как правило, концентрируют, сушат, смешивают с носителем и расфасовывают в подходящий контейнер.

Релевантное количество, например, в пределах от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г клеток палочковидных бактерий композиции может присутствовать в коммерчески релевантной форме, известной специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Следовательно, в одном варианте воплощения настоящего изобретения присутствует от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий композиции в форме высушенных (например, распылительная сушка) клеток или замороженных споровых клеток.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения композиция палочковидных бактерий включает от 10⁶ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, более предпочтительно в пределах от 10⁷ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий.

Используемый здесь термин «КОЕ/г» относится к массе в граммах композиции как таковой, включая подходящие релевантные добавки, присутствующие в композиции. Он не включает массу подходящего контейнера, используемого для расфасовки композиции палочковидных бактерий.

Вариант воплощения настоящего изобретения относится к таковому, где композиция палочковидных бактерий расфасована в подходящий контейнер.

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, коммерчески релевантная бактериальная композиция, как правило, также включает другие релевантные добавки, такие как, например, один носитель/ингредиент из группы, принадлежащей к сыворотке, пермеату сыворотки, карбонату кальция/кальциевому известняку и агентам против слеживания, таким как силикаты алюминия и кизельгур (диатомовая земля). Помимо этого в настоящем изобретении релевантные клетки палочковидных бактерий композиции также могут включать другие релевантные интересующие микроорганизмы, такие как, например, интересующие молочнокислые бактерии.

Клетки палочковидных бактерий

Клетки палочковидных бактерий могут представлять собой любые интересующие релевантные клетки палочковидных бактерий.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения клетки палочковидных бактерий представляют по меньшей мере клетки палочковидных бактерий, отобранных из видов палочковидных бактерий, выбранных из группы, состоящей из:

Bacillus subtilis, Bacillus uniflagellates, Bacillus lateropsorus, Bacillus laterosporus BOD, Bacillus megaterium, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, и Bacillus sterothermophilus, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus mycoides, Bacillus cereus, и Bacillus circulans.

В более предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения клетки палочковидных бактерий представляют клетки B. subtilis или Bacillus licheniformis.

Наиболее предпочтительно, когда клетки палочковидных бактерий представляют клетки B. subtilis.

Анализ для отбора на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот

Как указанно, анализ на устойчивость к желчи точки (i) по первому аспекту основывается на использовании известных коммерчески доступных стандартных элементов (таких как, например, стандартная среда, соли желчных кислот, измерения стандарта OD).

Следовательно, основываясь на детальном описании анализа в описании настоящего изобретения (см., например, пример 1), специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен рутинно повторить этот анализ для объективного подтверждения, отвечают ли интересующие споровые клетки специфических палочковидных бактерий условиям быстрого прорастания и роста из споровых в вегетативные клети, как указано в точке (i).

В точке (i) это объясняется тем, что точка роста вегетативных клеток является точкой на кривой роста, начинающейся с 10⁸ спор/мл соответствующих OD в пределах около 0,2-0,3 до того момента времени, когда показатель OD возрастает (ввиду роста вегетативных клеток) непрерывно до достижения OD 0,4. Это находится в соответствии с тем, как специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, понимает такую точку роста вегетативных клеток, основанную на кривой роста, специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, рутинно определяет это с ограниченной варьируемостью около ±30 минут, как указанно здесь. Рабочий пример 1 по настоящему изобретению обеспечивает детальное описание анализа на устойчивость к желчи, подходящего для отбора на быстрое прорастание и рост в присутствии солей желчных кислот. Детально описанные условия Примера 1 по настоящему изобретению являются предпочтительным анализом для определения, отвечают ли интересующие споровые клетки палочковидных бактерий условиям точки (i) первого аспекта.

Используемый здесь термин «соли желчных кислот» относится к солям желчных кислот. Желчные кислоты являются стероидными кислотами, которые встречаются преимущественно в желчи млекопитающих. Они продуцируются в печени окислением холестерина, хранятся в желчном пузыре и выделяются в кишечник в форме солей. Они действуют как поверхностно-активные вещества, эмульгирующие липиды и помогающие их абсорбции и перевариванию. Соли желчных солей, используемые в примере 1, получают, имитируя физиологические концентрации и композиции солей желчных кислот у свиней. Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, композиции солей желчных кислот у свиней могут рассматриваться как относительно «жесткие» условия по сравнению с композициями солей желчных кислот у птиц.

Используемый здесь термин «среда с солями желчных кислот» относится к среде, включающей релевантные ингредиенты роста палочковидных бактерий, такие как релевантные нутриенты и соли желчных кислот.

Точка роста вегетативных клеток в анализе на устойчивость к солям желчных кислот - точка (i) первого аспекта

Как указано выше, в отношении точки (i) первого аспекта споровые клетки палочковидных бактерий по настоящему изобретению имеют прорастание из спор в вегетативные клетки и рост, который происходит так быстро, что они достигают точки роста вегетативных клеток 0,4 OD за менее чем 18-19 часов при 4-6 мл солей желчных кислот соответственно. Как указано выше, новый штамм DSM 19467 достигает точки роста вегетативных клеток через 14-15 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ соответственно.

Следовательно, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток через 17-18 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта, более предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток через 15-16 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта.

Как указано и схематически показано выше на Фиг. 1, новый штамм DSM 19467 по настоящему изобретению отбирают при использовании коммерчески доступного GalliPro^® в качестве исходного штамма для мутагенеза и отбора для быстрого роста в присутствии солей желчных кислот, как указано выше.

GalliPro^® является композицией, включающей клетки Bacillus subtilis и Bacillus subtilis, депонированных как DSM 17231. Следовательно, GalliPro® может быть использован в настоящем изобретении в качестве контрольного штамма. Как указано выше, точка начала роста вегетативных клеток GalliPro® через 20 часов инкубации с солями желчных кислот в пределах от 4 до 6 мМ при условиях точки (i) первого аспекта. Следовательно, в одном варианте воплощения настоящего изобретения споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток по меньшей мере на 3 часа раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®») при условиях точки (i) первого аспекта, более предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки роста вегетативных клеток по меньшей мере на 4 часа раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®»), при условиях точки (i) первого аспекта, и наиболее предпочтительно споры палочковидных бактерий достигают точки начала роста вегетативных клеток по меньшей мере на 5 часов раньше, чем споровые клетки контрольной Bacillus subtilis, депонированной как DSM 17231 («GalliPro^®»), при условиях точки (i) первого аспекта.

Незаменимые аминокислоты

Как известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, незаменимая аминокислота может представлять незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, валина, треонина, триптофана, изолейцина, метионина, лейцина, лизина, цистеина, тирозина, гистидина и аргинина.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения незаменимая аминокислота представляет по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из фенилаланина, валина, треонина, триптофана, изолейцина, метионина, лейцина и лизина.

В более предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения незаменимая аминокислота представляет по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из валина, изолейцина и лейцина.

Наиболее релевантной незаменимой аминокислотой является лейцин.

Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что вегетативные клетки палочковидных бактерий могут продуцировать более высокие количества более чем одной незаменимой аминокислоты, такое как, например, более высокое количество двух, или трех, или более различных незаменимых аминокислот.

Анализ на аминокислоту

Как указанно выше, анализ на аминокислоту точки (ii) по первому аспекту основывается на использовании стандартных, известных коммерчески доступных элементов (таких как, например, стандартная среда, стандартный тест). Следовательно, основываясь на детально описанном анализе (см., например, пример 2 настоящего описания), специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен рутинно повторить этот анализ для объективного подтверждения, отвечают ли вегетативные клетки специфических интересующих палочковидных бактерий по количеству продуцированной незаменимой аминокислоты, как указанно в точке (ii).

Рабочий пример 2 по настоящему изобретению обеспечивает детальное описание анализа на незаменимую аминокислоту.

Детально описанные условия этого примера 2 являются предпочтительным анализом на незаменимую аминокислоту для определения, отвечают ли вегетативные клетки интересующих палочковидных бактерий условиям точки (ii) первого аспекта.

Продуцированное количество незаменимой аминокислоты - точка (ii) первого аспекта

В соответствии с точкой (ii) первого аспекта, вегетативные клетки Bacillus предпочтительно продуцируют по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве по меньшей мере в 2 раза большем, чем контрольные клетки DSM 19467, при условиях точки (ii) первого аспекта.

В более предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения в отношении точки (ii) первого аспекта вегетативные клетки Bacillus предпочтительно продуцируют по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве по меньшей мере в 4 раза большем, чем клетки контрольной Bacillus DSM 19467, при условиях точки (ii) первого аспекта.

Способ скармливания/введения спор палочковидных бактерий животному

Как указанно выше, во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу кормления животного, включающему введение композиции палочковидных бактерий по первому аспекту, и к описанным здесь вариантам воплощения настоящего изобретения, включающим введение животному композиции совместно с другими ингредиентами кормового продукта для животного.

Животное может быть любым интересующим животным. Предпочтительно животное представляет животное, выбранное из группы, состоящей из домашней птицы, жвачных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыбы и домашних животных.

При введении GalliPro^® по предшествующему уровню техники нормальной дозой является доза около 10⁴-10⁸ КОЕ/г кормового продукта, как правило, 10⁵-10⁶ КОЕ/г кормового продукта или в дозировке, эквивалентной нормальному потреблению корма/кг живой массы животного. В качестве альтернативы, споры палочковидных бактерий могут быть введены животному одним и следующих способов:

(1): добавление в питьевую воду для животных;

(2): распыление на животных; или

(3): применены в виде пасты, геля или болюсов.

Способ скрининга и выделения клеток новых палочковидных бактерий

Как указано выше, в третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга и выделения клеток новых палочковидных бактерий.

Способ по третьему аспекту выбран для клеток палочковидных бактерий, отвечающих условиям точки (i) и (ii) первого аспекта.

Как понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, специфический детально описанные здесь анализ на устойчивость к желчи и анализ на количество незаменимой аминокислоты (см., например, пример 1 для анализа на устойчивость к желчи и пример 2 для анализа на незаменимые аминокислоты), параметры которого могут быть изменены, для получения альтернативного способа скрининга, все еще отвечающего основным целям настоящего изобретения, то есть клетки палочковидных бактерий отвечают условиям точки (i) и (ii) первого аспекта.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения анализ на устойчивость к желчи по примеру 1 используют на стадии (a) способа скрининга по третьему аспекту, а анализ на незаменимую аминокислоту по примеру 2 используют на стадии (c) способа скрининга по третьему аспекту.

На стадии (d) способа скрининга по третьему аспекту выделяют вегетативные клетки палочковидных бактерий. Эти вегетативные клетки палочковидных бактерий могут быть использованы для получения споровой формы палочковидных бактерий.

Следовательно, в варианте воплощения способа скрининга по третьему аспекту проводят дополнительную стадию (e), где выделенные вегетативные клетки палочковидных бактерий стадии (d) культивируют с получением от 10⁵ до 10¹² вегетативных клеток палочковидных бактерий, и эти от 10⁵ до 10¹² вегетативные клетки палочковидных бактерий используют для получения от 10⁵ до 10¹² споровых клеток палочковидных бактерий, выделенных для получения композиции Bacillus, включающей от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий.

Конечным результатом стадии (e) является новая композиция Bacillus, включающая от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, где клетки палочковидных бактерий отвечают условиям точки (i) и (ii) первого аспекта. Следовательно, отдельный аспект настоящего изобретения относится к композиции Bacillus, включающей от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток палочковидных бактерий, где споровые клетки палочковидных бактерий отвечают условиям точки (i) и (ii) первого аспекта получены способом скрининга по третьему аспекту после дополнительной стадии (f), как указано выше.

На стадии (b) способа скрининга по третьему аспекту подвергают мутации ранее отобранные клетки палочковидных бактерий, устойчивых к желчи для отбора клеток стадии (c), продуцирующих высокое количество незаменимой аминокислоты. Как понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, это может быть, например, за счет классической мутации (например, за счет химической обработки или УФ), специфического изменения генов для получения так называемого генетически модифицированного организма (ГМО).

Депонированные штаммы

Образец нового штамма Bacillus subtilis депонирован как DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig) под депозитарным номером DSM 19467 27 июня 2007 года. Штамм депонирован в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Анализ на устойчивость к желчи

Среда:

Среда является стандартной известной неселективной средой телячьего мясного бульона (VIB) (Difco, 234420). На дату подачи настоящей заявки в каталоге продуктов (DifcoTM/BBLTM Manual) от поставщика BD Diagnostic Systems (www.bd.com) в отношении телячьего мясного бульона сообщается:

«Бульон из постной телятины и пептона обеспечивает азот, витамины, углерод и аминокислоты в среде телячьего бульона. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс композиций»; и

среду получают согласно инструкциям производителя, суспендируя 25 г порошка телячьего бульона в 1 л очищенной воды (раствор 2,5%), нагревают при постоянном перемешивании и кипятят в течение 1 минуты до полного растворения порошка. 2,5%-ный раствор телячьего бульона включает на литр:

Бульон из постной телятины: 10 г

Протеозопептон: 10 г

Хлорид натрия: 5 г

Среду разливают в стерильные бутылочки и автоклавируют при температуре 121°C в течение 15 минут.

Среда/растворы солей желчной кислоты:

Смеси солей желчной кислоты получают, имитируя физиологическую композицию и концентрацию солей желчной кислоты в желчи свиней, и растворяют в среде из телячьего бульона, полученной, как указанно выше, с получением конечной концентрации солей желчных кислот 8 мМ.

Конъюгированные соли желчных кислот представляют тауродеоксихолат (Sigma T-0875, US) и гликодеоксихолат (Sigma G-9910, US), а деконъюгированные соли желчной кислоты представляют деоксихолат (Sigma D-5670 US), и конечный 8 мМ смешенный раствор солей желчных кислот содержит 60% тауродеоксихолата, 30% гликодеоксихолата и 10% деоксихолата. Перед автоклавированием в течение 15 минут при температуре 121°C растворы доводят до pH 7,4, используя гидроксид натрия. Полученную 8 мМ солей желчных кислот среду разводят с получением концентраций солей желчных кислот 0, 1, 2, 4, 6 и 8 мМ.

Соли желчных кислот добавляют в среду из телячьего бульона в концентрированной форме. Следовательно, конечное количество бульона из постной телятины, протеозопептона и хлорида натрия было по существу как для 2,5% среды из телячьего бульона перед добавлением солей желчных кислот.

Суспензии спор

Для разделения вегетативных клеток и спор и гарантии чистоты споровых продуктов для инокуляции определение количества спор в продукте палочковидных бактерий проводят используя +/- тепловую обработку при температуре 80°C в течение 10 минут. После тепловой обработки и последующего охлаждения до комнатной температуры проводят серию 10-кратных разведений в соленом пептоновом бульоне. Дубликаты пластин триптоза-кровяной агар (Difco 0232-01) инокулируют 0,1 мл подходящими десятикратными разведениями. Пластины инкубируют при температуре 37°C до наступления следующего дня. На основе предыдущего определения количества спор в продуктах, суспензии спор получают в стерильной дистиллированной воде до достижения конечной рассчитанной концентрации спор 10⁸ КОЕ/мл. Определение количества вегетативных клеток и спор в конечном инокуляте проводят с использованием указанного выше способа. Конечная концентрация 108 КОЕ/мл соответствует начальному OD₆₃₀ при 0,2-0,3.

Измерение роста: измерение оптической плотности

Используют стерильные с плоским дном 96-луночные пластины для микротитратора (Greiner Bio-one GmbH, Germany). Каждую лунку заполняют 0,150 мл VIB, инокулированного спорами (~1×10⁸ спор на мл эквивалента/соответствуя начальному OD630 ~0,2-0,3), и инкубируют пластинки в течение 20 часов при температуре 37°C с 1-минутным циклом встряхивания с интенсивностью 4 (высокая) перед каждым считыванием данных.

Во избежание конденсации на внутренней части крышки пластины крышки промывают раствором Triton X-100.

Кинетику прорастания и роста штаммов Bacillus измеряют при использовании спектрофотометра при длине волны 630 нм (OD₆₃₀) (Bio-tek Instruments, Inc. VE). Считывание данных проводят с 10-минутным интервалом, и анализ данных проводят, используя программное обеспечение KC4(TM) (Bio-tek Instruments, Inc., USA). Через 20 часов данные переводят в Excel® развернутые таблицы для дополнительного анализа, переводят в SAS version 9.0 и проводят статистический анализ.

ПРИМЕР 2: Анализ на аминокислоту

Используемый в исследовании способ измерения и количественного определения аминокислот, продуцированных клетками палочковидных бактерий, является стандартным ГХ-МС способом для водных образцов при использовании метилхлорформиата в качестве дериватизирующего агента.

Рост клеток Bacillus

Клетки Bacillus инокулируют и выращивают в ростовой среде с минимальным содержанием солей при температуре 37°C, 150 оборотах в минуту и выращивают в течение 2 дней, затем измеряют количество аминокислоты в супернатанте, как указано ниже.

Клетки палочковидных бактерий размножаются в среде с минимальным содержанием солей по Chapman (1972) со следующими композициями:

(NH₄)2SO₄ (Merck 1.01217.1000) 1 г/л

K₂HPO₄ (Merck 1.05101.1000) 7 г/л

KH₂PO₄ (Merck 1.04873.1000) 3 г/л

MgSO₄-7H₂O (Merck 1.05886.1000) 0,1 г/л

Автоклавируют в течение 15 минут при температуре 121°C и добавляют автоклавированную глюкозу до конечной концентрации 0,5%.

Инкубацию проводят в пробирках с 10 мл среды в течение 2 дней при температуре 37°C и 150 оборотах в минуту.

Анализ на аминокислоту

Анализ на аминокислоту проводят на супернатантах клеток, поскольку аминокислоты выделяются в среду. Образцы подвергают стерильной фильтрации и хранят при температуре -20°С до момента проведения анализа.

Реагенты:

Реагент 1: раствор внутреннего стандарта. Норвалин 1 мМ: 0,0172 г Норвалин + 100 мл MQW

Реагент 2: метанол/пиридин 32/8 (объем/объем) (катализатор)

Реагент 3: метилхлорформиат ч.д.а. (МХФ) (дериватизирующий агент)

Реагент 4: 1 % МХФ/CHCl3 (объем/объем) (Экстракция): 1 мл метилхлорформиата ч.д.а. + хлороформ до 1000 мл.

Получение образца:

- Добавление из пипетки 150 мкл (25 мкл + 125 мк MQW) образца в 2-мл ампулу для инъекций.

- Добавление 150 мкл IS

- Добавление 200 мкл 1-метанола/пиридина 32/8% (объем/объем). Тщательно смешивают.

- Добавление 25 мкл МХФ (метилхлорформиата). Тщательно перемешивают до появления газа.

- Добавление 500 мкл 1% МХФ/CHCI3 (объем/объем), укупоривание и интенсивное перемешивание. Фазовое разделение происходит в течение нескольких минут. Если фазовое разделение проходит слишком медленно, ампулу центрифугируют (500 оборотов/10 минут).

Если в качестве антиметаболита используют норвалин, то должен использоваться внешний стандарт или другой подходящий внутренний стандарт, и 150 мкл IS заменяют или MQW, или образцом.

Образцы подвергают ГХ-МС со стандартной аминокислотной колонкой и протоколом.

ПРИМЕР 3: Отбор клеток Bacillus subtilis DSM 19467, устойчивых к желчи

Исходными клетками палочковидных бактерий являются клетки Bacillus subtilis GalliPro^®.

GalliPro^® мутируют с получением пула новых индивидуальных клеток палочковидных бактерий. Получают споры и проводят отбор на быстрое прорастание и рост из спор в вегетативные клетки в присутствии среды с солями желчной кислоты в пределах от 4 до 6 мМ по примеру 1 выше. Проводят отбор клеток Bacillus subtilis DSM 19467.

В Таблице ниже приведены данные прорастания и роста.

Время (часы) от 10⁸ КОЕ/мл соответствует OD 0,2-0,3 до достижения OD 0,4 (среднее 3 повтора).

B. subtilis	4 мМ желчи	6 мМ желчи
Существующий продукт GalliPro® (DSM 17231)	>20	>20
Толерантность к желчи (DSM 19467)	14 часов 40 минут	15 часов
Коммерческий продукт Calsporin	>20	>20

Некоторые данные этого примера получены при проведении тестирования сверхэкспрессии фитазы DSM 19489. Но для технического результата этот пример относительно не релевантен, поскольку DSM 19467 имеет прорастание и рост примерно, как у DSM 19489. См., PCT/EP2008/057296 для дополнительных деталей.

Заключение

DSM 19467 является штаммом, устойчивым к желчи, и явно прорастает и растет быстрее, чем GalliPro®.

ПРИМЕР 4: Отбор клеток Bacillus DSM 19467, продуцирующих высокие уровни аминокислоты

Исходные клетки палочковидных бактерий представляют клетки Bacillus subtilis DSM 19467, отобранные в примере 3.

DSM 19467 или дикий тип, или мутанты, полученные, например, УФ-мутагенезом, выращивают на агаровой среде с минимальным содержанием солей, как описано в примере 2B выше, и добавляют 1,5% агара, содержащего аналоги аминокислоты в подходящих ингибирующих количествах. В зависимости от сверхэкспрессируемой аминокислоты могут быть использованы различные аналоги аминокислоты, например, норвалин или 4-аза-DL-лейцин для сверхпродуцирования лейцина (Bardos, 1974, Topics in Current Chemistry 52, 63-98). Собирают и выращивают на среде с минимальным содержанием солей колонии, устойчивые к аналогу аминокислоты, и проводят анализ на продуцирование аминокислоты. Вегетативные клетки отбирают для продуцирования большого количества аминокислоты при использовании способа ГХ-МС, как описано в примере 2B выше.

Отбирают продуцирующие высокие уровни аминокислоты клетки Bacillus subtilis.

Результаты измерения аминокислоты

Отбирают штаммы, продуцирующие незаменимую аминокислоту - лейцин, в количестве, значительно более высоком, чем контрольные клетки палочковидных бактерий DSM 19467.

Отобранные штаммы продуцируют по меньшей мере в 5 раз больше лейцина, чем DSM 19467.

Заключение:

Этот пример демонстрирует, что можно рутинно, основываясь на приведенных в настоящем описании инструкциях, провести скрининг и определить штамм, продуцирующий по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту (в качестве примера здесь приведен лейцин) в количестве, значительно более высоком, чем клетки контрольных палочковидных бактерий DSM 19467.

DSM 19467 происходит из GalliPro^® и не выбирается по высокому продуцированию незаменимой аминокислоты. Следовательно, считается, что GalliPro® продуцирует примерно такое же количество незаменимой аминокислоты, как и DSM 19467.

ПРИМЕР 5: «Проверка» на устойчивость к желчи клеток палочковидных бактерий, продуцирующих большое количество незаменимой аминокислоты

Предпочтительные высокие уровни незаменимой аминокислоты, продуцируемой клетками палочковидных бактерий, отобранных в примере 4, повторно проверяют на способность быстро прорастать и расти из спор в вегетативные клетки, как указанно в примере 1.

Результаты, как и ожидалось, показали, что они сохранили примерно такое же хорошее и быстрое прорастание и рост, как и исходные клетки DSM 19467, используемые для их получения.

ССЫЛКИ

1. Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 JuI 4.

2. US 2003/0124104 A.

3. US6255098.

4. PCT/EP2008/057296.

1. Способ скрининга и выделения клеток Bacillus subtilis, включающий следующие стадии:
(a): отбор и выделение из пула отдельных споровых клеток Bacillus subtilis споровых клеток, способных прорастать и расти так, чтобы достичь точки роста вегетативных клеток за менее чем 18 ч в присутствии среды с 4 мМ солей желчных кислот, и за менее чем 19 ч в присутствии среды с 6 мМ солей желчных кислот, где точка роста вегетативных клеток является точкой на кривой роста, в которой показатель OD начинает непрерывно повышаться (ввиду роста вегетативных клеток) и достигает OD₆₃₀, равного 0,4; где
(I): среда с солями желчных кислот является неселективной средой телячьего мясного бульона (VIB) дополненной смесью конъюгированных солей желчных кислот тауродеоксихолата, и гликодеоксихолата, и деконъюгированных солей деоксихолата в пропорциях 60% тауродеоксихолата, 30% гликодеоксихолата и 10% деоксихолата;
a OD анализ проводят, осуществляя следующие стадии:
(II): заполнение лунок пластины микротитратора 0,150 мл среды с солями желчных кислот, содержащей 10⁸ спор Bacillus subtilis на мл среды (время ноль); и
(III): инкубирование пластины при температуре 37°C и атмосферном давлении, измерение показателей OD₆₃₀, используя спектрофотометр с перемешиванием перед каждым снятием данных для получения репрезентативной кривой роста во времени; и
(b): получение вегетативных клеток Bacillus subtilis из выделенных споровых клеток стадии (а) и УФ-мутирование отобранных и выделенных клеток с получением пула отдельных вегетативных клеток Bacillus subtilis;
(c): отбор и выделение из пула отдельных вегетативных клеток Bacillus subtilis стадии (b) вегетативных клеток Bacillus subtilis, способных продуцировать по меньшей мере одну незаменимую аминокислоту в количестве, по меньшей мере в 2 раза большем, чем контрольные клетки Bacillus subtilis DSM 19467,
где количество продуцированной незаменимой аминокислоты измеряют в супернатанте стандартным ГХ-МС способом для водных образцов, используя метилхлорформиат в качестве дериватизирующего агента после инкубации в течение 2 дней клеток Bacillus subtilis в пробирках, при температуре 37°C и 150 оборотах в минуту, с 10 мл ростовой среды с минимальным содержанием солей следующего состава:
(NH₄)₂SO₄ (Merck 1.01217.1000) 1 г/л
K₂HPO₄ (Merck 1.05101.1000) 7 г/л
KH₂PO₄ (Merck 1.04873.1000) 3 г/л
MgSO₄-7H₂O (Merck 1.05886.1000) 0,1 г/л,
которую автоклавируют в течение 15 минут при температуре 121°C и добавляют автоклавированную глюкозу до конечной концентрации 0,5%; и
(d): анализ вегетативных клеток Bacillus subtilis стадии (с) для подтверждения того, что сохраняются прорастание и рост, как на стадии (а), и выделение отобранных клеток Bacillus subtilis.

2. Композиция кормовой добавки к кормовому продукту для животного, включающая от 10⁵ до 10¹² КОЕ/г споровых клеток Bacillus subtilis, выделенных способом по п. 1.

3. Композиция по п. 2, где споровые клетки Bacillus subtilis присутствуют в виде высушенных (например, распылительной сушкой) споровых клеток.

4. Композиция Bacillus subtilis по п. 2 или 3, где незаменимую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из фенилаланина, валина, треонина, триптофана, изолейцина, метионина, лейцина, лизина, цистеина, тирозина, гистидина и аргинина.

5. Композиция Bacillus subtilis по п. 4, где незаменимую аминокислоту выбирают из группы, состоящей из валина, изолейцина и лейцина.

6. Композиция Bacillus subtilis по п. 5, где незаменимая аминокислота представляет лейцин.

7. Способ кормления животного, включающий введение животному вместе с другими ингредиентами корма (кормового продукта для животного) композиции Bacillus subtilis по любому из пп. 2-6.

8. Способ кормления животного по п. 7, где животное выбирают из группы, состоящей из домашней птицы, жвачных, телят, свиней, кроликов, лошадей, рыб и домашних животных.