Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей



Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей
Смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащая пробиотики для младенцев и маленьких детей

 


Владельцы патента RU 2564139:

НЕСТЕК С.А. (CH)

Настоящее изобретение относится к области питания младенцев и маленьких детей. В частности, настоящее изобретение относится к смесям для питания младенцев и маленьких детей, содержащим пробиотические микроорганизмы в количестве, соответствующем 106-1012 КОЕ, предназначенные для введения младенцам и маленьким детям старше 6 месяцев. Эти пробиотические микроорганизмы могут быть нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами, такими как, например, биоактивные пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при температуре 120-140°С в течение 5-15 с. 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области питания младенцев и маленьких детей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к смесям для питания младенцев и маленьких детей, содержащим пробиотические микроорганизмы, предназначенные для введения младенцам и маленьким детям старше 6 месяцев. Эти пробиотические микроорганизмы могут быть нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами, такими как, например, биоактивные пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке.

Грудное молоко представляет собой идеальный пищевой продукт для здорового роста и развития младенцев. В 2001 г. Всемирная организация здравоохранения (WHO) изменила свои рекомендации по продолжительности исключительного грудного вскармливания с периода от 4 до 6 месяцев, поэтому грудное вскармливание должно соответствующим образом поощряться и поддерживаться.

Начиная с 6-го месяца и далее, поведение младенцев меняется. Они впервые садятся или хватают игрушку только одной рукой. Пищевые потребности младенца по мере его развития также изменяются. Все более важное значение начинают приобретать такие питательные вещества, как железо и кальций.

Для сопровождения такого быстрого развития подходящим питанием были разработаны смеси для вскармливания младенцев, способные обеспечивать оптимальное питание во время переходной фазы от грудного вскармливания к потреблению твердой пищи.

Такие смеси для питания младенцев и маленьких детей являются, например, смесями для прикорма. Смесь для прикорма подразумевает пищевой продукт, предназначенный для применения в виде жидкой части диеты отлучаемых от грудного вскармливания младенцев с 6-го месяца жизни и маленьких детей.

Типичные смеси для питания младенцев и маленьких детей являются питательно полноценными, содержат нативный белок и базируются на коровьем молоке. Они предназначаются в качестве дополнения к изменяющейся диете подрастающих младенцев.

Одна важная функция раннего питания младенцев состоит в создании полезной для здоровья кишечной флоры и развитии сильной иммунной системы.

Полезная для здоровья кишечная флора способствует функционированию желудочно-кишечного тракта (ЖК-тракта), что, в свою очередь, помогает должным образом усваивать принимаемую внутрь пищу и ослабляет боли в желудке у младенцев и маленьких детей.

Младенцы и маленькие дети обычно переносят приблизительно по 10 случаев простудных заболеваний в год. Так как младенцы при кормлении из бутылочки дышат через нос, простуда может вызвать проблемы.

Поэтому было бы желательным дополнительно улучшить укрепляющее иммунную систему действие смеси для питания младенцев и маленьких детей.

Также было бы желательно улучшить, помимо этого, противовоспалительное действие смеси для питания младенцев и маленьких детей.

Следовательно, в данной области имеется потребность в смеси для питания младенцев и маленьких детей, способной предоставлять младенцам питание, настолько близкое к материнскому молоку, насколько это возможно. Такая смесь для вскармливания младенцев должна иметь улучшенную способность к укреплению иммунной системы, противовоспалительное действие и/или должна облегчать переваривание. Было бы предпочтительным достичь этого посредством применения натуральных ингредиентов, которые являются безопасными для употребления, не имея побочных эффектов, и которые легко вводятся в смеси для вскармливания младенцев, с использованием промышленных технологий существующего уровня техники.

Настоящее изобретение обращается именно к этой потребности. То есть задача настоящего изобретения состояла в улучшении существующего уровня техники и обеспечении смеси для питания младенцев и маленьких детей, которая отвечала бы обозначенной выше потребности.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что они могут достигнуть этого с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения. Основную идею настоящего изобретения развивают дополнительные пункты формулы изобретения.

Соответственно, авторы настоящего изобретения предлагают смесь для питания младенцев и маленьких детей, содержащую пробиотики.

Предписания FDA (Federal Drag Administration, Комиссия по контролю за лекарствами и питательными веществами) определяют младенцев как людей не старше 12 месяцев (раздел 21 Свода федеральных установлений 21 CFR 105.3 (е)).

Было обнаружено, что пробиотики способны проявлять свои полезные для здоровья свойства в рамках смесей для питания младенцев и маленьких детей. Более того, например, бифидобактерии присутствуют в грудном молоке и являются частью того, что придает грудному молоку его естественные защитные свойства.

Следовательно, добавление пробиотических микроорганизмов к смесям для питания младенцев и маленьких детей позволило бы им стать более сходными с грудным молоком.

Однако поскольку, в частности, предназначенные для восстановления водой порошкообразные питательные смеси обычно имеют продолжительность хранения, которая превышает продолжительность хранения, например, содержащих пробиотики йогуртных напитков, пробиотики к таким питательным смесям, как правило, не добавляются из-за отсутствия, например, уверенности в возможности обеспечения жизнеспособности пробиотиков в течение такого увеличенного срока хранения.

Авторы настоящего изобретения смогли показать, что нереплицирующиеся пробиотики также могут приносить здоровью ту пользу, которую обеспечивают пробиотики, и, возможно, даже в еще большей степени.

Поэтому одним воплощением настоящего изобретения является питательная смесь для младенцев или маленьких детей, предназначенная для введения младенцам или маленьким детям, начиная с возраста в 6 месяцев, обеспечивающая младенцу или ребенку полноценное питание и содержащая пробиотические микроорганизмы.

Питательная смесь настоящего изобретения может предназначаться для введения младенцам или маленьким детям в возрасте 6-36 месяцев, например 6-18 месяцев.

Термин «младенец» обозначает человека в возрасте не более 12 месяцев.

Термин «маленькие дети» обозначает людей в возрасте старше 12 месяцев и вплоть до 36 месяцев.

Питательная смесь может обеспечиваться в виде жидкой, готовой для введения композиции, или как сухая композиция, предназначенная для восстановления водой перед применением.

В случае предоставления в виде сухой композиции предпочтительно, чтобы композиция имела активность воды ниже 0,2, предпочтительно ниже 0,15, с тем, чтобы дополнительно повысить ее стабильность при хранении. Большинство бактерий, например, не способны к росту при активности воды ниже 0,91, а большинство плесневых грибков прекращают рост при активности воды ниже 0,80.

Активность воды (аw) является показателем энергетического статуса воды в системе. Она определяется как величина давления паров воды, деленная на давление паров над чистой водой. Соответственно, дистиллированная вода имеет давление воды, равное 1.

Обычные смеси для прикорма обеспечивают не менее 60 ккал (или 250 кДж) и не более 85 ккал (или 355 кДж) в 100 мл. Смеси для прикорма также содержат не менее 3 г и не более 6 г жира на 100 калорий.

Питательная смесь в соответствии с настоящим изобретением может иметь калорийность в диапазоне 62-68 ккал/100 мл и может содержать источник белка в количестве 1,9-3,5 г/100 ккал, источник углеводов в количестве 12-13 г/100 ккал и источник липидов в количестве 4-5 г/100 ккал.

Источник белка может состоять из сывороточных белков и казеина. Например, может применяться соотношение сыворотки к казеину в диапазоне от около 35:65 до 55:45. В случае увеличенных потребностей в белке содержание казеинового компонента увеличивается. Например, для 2 г белка/100 ккал может использоваться массовое соотношение сыворотка/казеин 1:1. Для 2,5 г белка/100 ккал может использоваться массовое соотношение сыворотка/казеин 2:3.

Источник углеводов может состоять, по существу, из лактозы. При этом также могут использоваться соотношения лактозы и мальтодекстрина в диапазоне, например, от 3:1 до 1:1.

Питательная смесь настоящего изобретения может содержать 0,2-0,3 г LC-PUFA/100 г (длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты). LC-PUFA могут быть выбраны из ARA (арахидоновая кислота), DHA (докозагексаеновая кислота) или их комбинаций. Например, LC-PUFA могут содержать комбинацию ARA и DHA. Показано, что смеси, содержащие DHA и ARA, обеспечивают развитие зрительных и умственных способностей подобно достигаемым у младенцев, получающих грудное вскармливание.

Питательная смесь настоящего изобретения может также содержать 1,5-2,5 мг нуклеотидов в 100 мл смеси. Нуклеотиды и их основания не считаются «незаменимыми», поскольку они могут синтезироваться организмом младенца из более простых соединений. В некоторые периоды времени, однако, процессы синтеза могут оказаться не в состоянии удовлетворить потребности в них, например в периоды высоких темпов обновления клеточной популяции, как, например, при нормальном росте или при кишечном заболевании. В такие периоды времени организм в большей степени полагается на нуклеотиды из пищевых источников.

Питательная смесь может содержать частично или только нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что, например, в отношении укрепления иммунной системы и/или с точки зрения противовоспалительного действия нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть даже более эффективными, чем реплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.

Это является удивительным, так как пробиотики часто определяются как «живые микроорганизмы, которые при введении в надлежащих количествах приносят пользу здоровью организма» (Руководящие принципы FAO/WHO). Огромное большинство литературных публикаций касается живых пробиотиков. При этом в нескольких исследованиях изучалась полезность для здоровья снабжения нереплицирующимися бактериями, и большинство из них показало, что инактивация пробиотиков, например, тепловой обработкой приводит к потере их подразумеваемой пользы для здоровья (Rachmilewitz, D. и др., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo и др., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204; Gill, H.S. и К.J. Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr. 86:285-289; Kaila, M. и др., 1995, Arcli.Dis.Cmld 72:51-53.). Некоторые исследования показали, что мертвые пробиотики могут сохранять некоторую способность действовать на состояние здоровья (Rachmilewitz, D., и др., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gill, H.S. и К.J. Rutherrurd, 2001, Br.J.Nutr. 86:285-289), но, очевидно, живые пробиотики с этой точки зрения были оценены как намного более эффективные.

Питательная смесь согласно настоящему изобретению может содержать пробиотические микроорганизмы в любом эффективном количестве, например в количестве, соответствующем на сухую массу около 106-1012 КОЕ/г.

Пробиотические микроорганизмы могут быть нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами.

«Нереплицирующиеся» пробиотические микроорганизмы включают пробиотические бактерии, подвергнутые тепловой обработке. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствующими в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения или материалы клеточной оболочки.

«Нереплицирующиеся» означает, что никаких жизнеспособных клеток и/или колониеобразующих единиц классическими методами культивирования обнаружено быть не может. Такие классические методы культивирования сведены вместе в книге по микробиологии James Monroe Jay, Martin J.Loessner, David A.Golden. 2005. Modem food microbiology («Современная микробиология пищевых продуктов»). 7 издание, Springer Science, Нью-Йорк, N.Y. 790 стр. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть показано следующим образом: отсутствие каких-либо видимых колоний на чашках с агаровой средой или отсутствие увеличивающегося помутнения в жидкой среде для выращивания после засева бактериальными препаратами в различных концентрациях («нереплицирующиеся» образцы) и выдерживания в подходящих условиях (аэробная и/или анаэробная атмосфера на протяжении по меньшей мере 24 час).

Пробиотики для целей настоящего изобретения определяются как «препараты микробиологических клеток или компоненты микробиологических клеток, обладающие благотворным воздействием на состояние здоровья или самочувствие организма» (С. Salminen, Ouwehand A., Benno Y. и др. “Probiotics: how should they be defined” («Пробиотики: каких следует определять») Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).

Возможность применения нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов предлагает несколько преимуществ. У младенцев с серьезными иммунными нарушениями применение живых пробиотиков может быть ограничено исключительными случаями вследствие наличия потенциального риска развития бактериемии. Нереплицирующиеся пробиотики могут применяться безо всяких проблем.

Помимо этого, снабжение нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами делает возможным восстановление в горячей воде при сохранении полезных для здоровья качеств.

Питательные смеси настоящего изобретения содержат пробиотические микроорганизмы и/или нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в количестве, достаточном для по меньшей мере частичного обеспечения благотворного воздействия на здоровье. Подходящее для обеспечения такого действия количество определяется как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от многих известных специалистам в данной области факторов, таких как масса тела и общее состояние здоровья младенца, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.

При профилактических применениях питательные смеси согласно изобретению назначаются восприимчивым или иным образом подверженным риску развития определенного заболевания потребителям в количестве, которое является достаточным для по меньшей мере частичного снижения риска развития такого заболевания. Такое количество определяется как представляющее собой «профилактически эффективную дозу». Аналогично, точные количества зависят от ряда таких факторов, как состояние здоровья и масса младенца, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.

Специалисты в данной области смогут отрегулировать терапевтически эффективную дозу и/или, соответственно, профилактически эффективную дозу.

В целом питательная смесь настоящего изобретения содержит пробиотические микроорганизмы и/или нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.

Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в диапазоне около 0,005-1000 мг пробиотических микроорганизмов и/или нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов в сутки.

В выражении численных количеств подвергнутые «кратковременной высокотемпературной» обработке нереплицирующиеся микроорганизмы могут присутствовать в питательной смеси в количествах, эквивалентно соответствующих 104-1012 КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, поэтому этот термин следует понимать как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получается из от 104 до 1012 КОЕ/г реплицирующихся бактерий. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержит данная питательная смесь, вне зависимости от того, являются ли они на самом деле живыми, инактивированными, мертвыми или фрагментированными, или же представляют собой смесь любых из этих состояний, выражается в терминах способности данного количества микроорганизмов образовывать колонии (КОЕ), как если бы все эти микроорганизмы являлись бы живыми.

Предпочтительно нереплицирующиеся микроорганизмы присутствует в количестве, эквивалентном величине 104-109 КОЕ/г сухой питательной смеси, еще более предпочтительно в количестве, эквивалентном величине 105-109 КОЕ/г сухой питательной смеси.

Пробиотики могут быть приведены в нереплицирующееся состояние любым известным в данной области способом.

Имеющиеся в настоящее время технологии, пригодные для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние, обычно представлены тепловой обработкой, γ-облучением, ультрафиолетовым светом или применением химических реагентов (формалин, параформальдегид).

Предпочтительной для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние была бы технология, которая является относительно простой в применении в производственных условиях пищевой промышленности.

Большинство представленных в настоящее время на рынке продуктов содержат пробиотики, подвергнутые тепловой обработке в процессе их изготовления. Поэтому было бы удобным иметь возможность обрабатывать пробиотики нагреванием либо вместе с вырабатываемым продуктом, либо по меньшей мере подобным способом, при том, чтобы пробиотики сохраняли или улучшали свои полезные качества или даже приобретали бы новые полезные для потребителя свойства.

Однако инактивация пробиотических микроорганизмов тепловой обработкой по литературным данным, как правило, связана с по меньшей мере частичной потерей активности пробиотика.

Авторы настоящего изобретения в настоящее время неожиданно обнаружили, что перевод пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние, например, тепловой обработкой не приводит к потере полезных для здоровья качеств пробиотика, но, наоборот, может усилить имеющийся благотворный эффект и даже привести к созданию новых благоприятствующих здоровью свойств.

В этой связи одним воплощением настоящего изобретения является питательная смесь, в которой нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы приводятся в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой.

Такая тепловая обработка может выполняться при по меньшей мере 71,5°С в течение по меньшей мере 1 секунды.

Может применяться как длительная тепловая обработка, так и кратковременная тепловая обработка.

В промышленных масштабах в настоящее время предпочтительными обычно являются способы краткосрочной тепловой обработки, такие как подобные UHT (ультравысокотемпературная) тепловой обработке. Этот вид тепловой обработки снижает бактериальную нагрузку и сокращает продолжительность обработки, тем самым снижая ухудшение качества питательных веществ.

Авторы настоящего изобретения впервые продемонстрировали, что пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при высоких температурах в течение непродолжительного времени, показывают противовоспалительные иммунные профили независимо от своих исходных свойств. В частности, либо вырабатывается новый противовоспалительный профиль, либо существующий противовоспалительный профиль в результате такой тепловой обработки усиливается.

Поэтому теперь оказывается возможным вырабатывать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы с противовоспалительными иммунными профилями, применяя специальные параметры тепловой обработки, которые соответствуют типичным применимым при тепловой обработке в промышленности, даже если их живые аналоги не являются штаммами, обладающими противовоспалительной активностью.

Поэтому тепловая обработка может представлять собой, например, высокотемпературную обработку при около 71,5-150°С в течение около 1-120 секунд. Высокотемпературная обработка может являться высокотемпературной/кратковременной (HTST) обработкой или ультравысокотемпературной (UHT) обработкой.

Пробиотические микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 71,5-150°С в течение короткого времени около 1-120 секунд.

Более предпочтительно микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 90-140°С, например при 90-120°С, в течение короткого времени около 1-30 секунд.

Эта высокотемпературная обработка переводит микроорганизмы, по меньшей мере частично, в нереплицирующееся состояние.

Высокотемпературная обработка может проводиться при нормальном атмосферном давлении, но также может быть выполнена под повышенным давлением. Типичные диапазоны давлений составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Очевидно, что предпочтительным будет, если пробиотики подвергаются тепловой обработке в питательной среде, которая при приложении теплоты является жидкостью или твердым веществом. Поэтому идеальная величина прикладываемого давления будет зависеть от природы композиции, которая обеспечивается микроорганизмами, и от используемой температуры.

Высокотемпературная обработка может выполняться в интервале температур около 71,5-150°С, предпочтительно около 90-120°С, еще более предпочтительно около 120-140°С.

Высокотемпературная обработка может выполняться в течение короткого времени около 1-120 секунд, предпочтительно около 1-30 секунд, еще более предпочтительно около 5-15 секунд.

Данный временной интервал относится ко времени, в течение которого пробиотические микроорганизмы подвергаются воздействию данной температуры. Следует заметить, что в зависимости от природы и количества обеспечиваемой микроорганизмами композиции, а также в зависимости от конструкции применяемого нагревательного устройства, используемая продолжительность нагревания может изменяться.

Однако, как правило, питательная смесь настоящего изобретения и/или микроорганизмы подвергаются высокотемпературной кратковременной (HTST) обработке, мгновенной пастеризации или ультравысокотемпературной обработке.

Обработка является ультравысокотемпературной обработкой или ультратепловой обработкой (обе сокращаются аббревиатурой UHT), включающей по меньшей мере частичную стерилизацию композиции при нагревании ее в течение короткого времени, приблизительно 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°С (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения в молоке спор бактерий. Например, такая обработка молока с помощью температур, превышающих 135°С, делает возможным снижение величины бактериальной нагрузки при таком обязательном времени пребывания (до 2-5 с), которое позволяет использовать режим непрерывного потока.

Есть два основных типа UHT-систем: прямые и непрямые системы. В прямой системе продукты обрабатываются впрыскиванием пара или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты подвергаются тепловой обработке с помощью пластинчатого теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. В процессе обработки продукта комбинации UHT-систем могут применяться на любом этапе или на нескольких этапах.

Обработка HTST определяется следующим образом (высокая температура/короткое время): способ пастеризации, предназначенный для пятикратного по логарифмической шкале снижения количества жизнеспособных микроорганизмов в молоке с уничтожением 99,9999% их общего содержания. Это считается подходящим для истребления почти всех дрожжей, плесневых грибков и обычных вызывающих порчу бактерий, а также для обеспечения надлежащего уничтожения обычных патогенных теплоустойчивых организмов. При способе HTST молоко на 15-20 секунд нагревается до 71,7°С (161°F).

Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Это выполняется перед расфасовкой в контейнеры для уничтожения вызывающих порчу микроорганизмов, придания продуктам большей безопасности и увеличения продолжительности их хранения. Жидкость двигается в контролируемом непрерывном потоке и при этом в течение около 15-30 секунд подвергается воздействию температур от 71,5°С (160°F) до 74°С (165°F).

Для целей настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» включает, например, кратковременную обработку при высокой температуре (HTST), UНТ-обработку и мгновенную пастеризацию.

Так как такая тепловая обработка придает нереплицирующимся пробиотикам улучшенный противовоспалительный профиль, питательная смесь настоящего изобретения может быть применена в профилактике или лечении воспалительных нарушений.

Воспалительные нарушения, которые могут быть вылечены или предупреждены с помощью питательной смеси настоящего изобретения, специальным образом не ограничиваются. Например, они могут быть выбраны из группы, состоящей из острых воспалений, таких как сепсис; ожогов; хронических воспалений, таких как воспалительные заболевания кишечника, например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, паучит; некротизирующего энтероколита; кожных воспалений, таких как УФ- или химически индуцированное воспаление кожи, экзема, реактивная кожа; синдрома раздраженного кишечника; воспалений глаз; аллергии, астмы и их комбинаций.

Если для приведения пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние применяется длительная тепловая обработка, такая тепловая обработка может осуществляться в интервале температур около 70-150°С в течение около 3 минут - 2 часов, предпочтительно в диапазоне 80-140°С от 5 минут до 40 минут.

В то время как существующий уровень техники в основном указывает, что бактерии, приведенные в нереплицирующееся состояние с помощью длительной тепловой обработки, обычно менее эффективны, чем живые клетки в отношении проявления их пробиотических качеств, авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что подвергнутые тепловой обработке пробиотики превосходят свои живые аналоги в способности стимулировать иммунную систему.

Настоящее изобретение также относится к питательной смеси, содержащей пробиотические микроорганизмы, приведенные в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой в течение по меньшей мере около 3 минут при по меньшей мере около 70°С.

Усиливающее иммунную систему действие нереплицирующихся пробиотиков было подтверждено in vitro иммунным профилем. В применяемой in vitro модели используется цитокиновый профиль человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и хорошо принимается в данной области в качестве стандартной модели для исследования иммуномодулирующих соединений (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203).

Испытания РВМС in vitro применялись несколькими авторами/исследовательскими группами, например, для классификации пробиотиков согласно их иммунным профилям, то есть по их анти- или провоспалительным показателям (Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Было показано, например, что такие испытания позволяют прогнозировать противовоспалительное действие исследуемых пробиотиков в отношении кишечного колита в моделях на мышах (Foligne В. и др., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243). Более того, это испытание регулярно применяется в качестве показательного в клинических исследованиях и была продемонстрирована его способность представлять результаты, согласующиеся с клиническими данными (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).

За последние десятилетия непрерывно увеличивается распространенность аллергических заболеваний и в настоящее время они рассматриваются WHO в качестве эпидемических. В общих чертах, аллергия, как полагают, является следствием дисбаланса между иммунными ответами Тh1 и Th2, приводящего к сильному сдвигу в сторону продуцирования медиаторов Th2. Поэтому аллергия может быть смягчена, подавлена или предотвращена посредством восстановления надлежащего соответствия между Th1 и Th2 компонентами иммунной системы. Это подразумевает необходимость в снижении Th2-ответов или усилении, по меньшей мере временном, ответа Th1. Последнее было бы показателем укрепления иммунной системы, часто сопровождаемого высокими уровнями, например, IFN-γ, TNF-α и IL-12 (World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Viljanen M. и др., 2005, Allergy, 60, 494-500).

Питательная смесь настоящего изобретения позволяет поэтому вылечивать или предупреждать нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты.

Соответственно, нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты, которые могут быть вылечены или предупреждены с помощью питательной смеси настоящего изобретения, специальным образом не ограничиваются.

Например, они могут выбираться из группы, состоящей из инфекций, в частности бактериальных, вирусных, грибковых и/или паразитарных инфекций; фагоцитарного дефицита; угнетения иммунитета слабой или тяжелой степени, вызванного стрессом или действием иммунодепрессивных лекарственных препаратов, химиотерапии или лучевой терапии; натуральных состояний сниженной иммунокомпетентности иммунной системы, например, у новорожденных; аллергий и их комбинаций.

Описанная в настоящем изобретении питательная смесь позволяет также усиливать реакцию младенца на вакцины, в частности на пероральные вакцины.

Эффективными могут быть любые количества нереплицирующихся микроорганизмов. Однако предпочтительно, чтобы в целом по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являлись бы нереплицирующимися.

В одном воплощении настоящего изобретения все микроорганизмы являются нереплицирующимися.

Соответственно, в питательной смеси настоящего изобретения по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики могут быть нереплицирующимися.

Для целей настоящего изобретения могут применяться любые пробиотические микроорганизмы.

Например, пробиотические микроорганизмы могут выбираться из группы, состоящей из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий или их комбинаций, например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и/или их смесей.

Питательная смесь в соответствии с настоящим изобретением может, например, содержать пробиотические микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM17938, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 или их комбинаций.

Все эти штаммы были или депонированы согласно Будапештскому договору, и/или являются предлагаемыми в продаже.

Депонированными согласно Будапештскому договору являются следующие штаммы:

Bifidobacterium longum NCC 3001: АТСС ВАА-999
Bifidobacterium longum NCC 2705: CNCM 1-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950 CNCM 1-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818: CNCM 1-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461: CNCM 1-2116
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007: CGMCC 1.3724
Streptococcus themophilus NCC 2019: CNCM 1-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059: CNCM 1-4153
Lactococcus lactis NCC 2287: CNCM 1-4154
Lactobacillus casei NCC 4006: CNCM 1-1518
Lactobacillus casei NCC 1825: ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009: АТСС 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15: CNCM 1-1198
Lactobacillus johnsonii La1 CNCM 1-1225
Lactobacillus reuteri DSM17938 DSM17938
Lactobacillus reuteri ATCC55730 ATCC55730
Escherichia coli Nissle 1917: DSM 6601.

Специалистам в данной области ясно, что они могут свободно объединять все описанные здесь признаки настоящего изобретения без отступления от его раскрываемого здесь объема.

Дальнейшие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующих далее Фигур и Примеров.

Фигуры 1А и В показывают усиление противовоспалительных иммунных профилей пробиотиков, подвергнутых «кратковременной высокотемпературной обработке».

Фигура 2 показывает штаммы пробиотика, не обладающего противовоспалительными качествами, которые становились противовоспалительными, то есть демонстрирующего выраженный противовоспалительный профиль in vitro после кратковременной обработки высокими температурами.

Фигуры 3А и 3В показывают штаммы пробиотиков, применяемых в коммерчески доступных продуктах, которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после кратковременной обработки высокими температурами.

Фигуры 4А и 4В показывают штаммы молочной закваски (то есть заквасочные штаммы Lc1), которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после кратковременной обработки высокими температурами.

Фигура 5 показывает штамм пробиотика, не обладающего противовоспалительными качествами, который демонстрирует противовоспалительный иммунный профиль in vitro после HTST-обработки.

Фигура 6. Метод главных компонент на данных РВМС (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10), обеспечиваемых пробиотическими и молочными заквасочными штаммами в их живом и подвергнутом тепловой обработке (140°С в течение 15 секунд) состоянии. Каждая точка представляет один штамм, живой либо подвергнутый тепловой обработке и идентифицированный его NCC-номером или названием.

Фигура 7 показывает отношения IL-12p40/IL-10 живых и подвергнутых тепловой обработке (85°С, 20 мин) штаммов. В целом тепловая обработка в течение 20 минут при 85°С приводит к увеличению величин отношения IL-12p40/IL-10 по сравнению с кратковременной высокотемпературной обработкой настоящего изобретения (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5).

Фигура 8 показывает повышение in vitro секреции цитокина из человеческих РВМС, стимулируемой подвергнутыми тепловой обработке бактериями.

Фигура 9 показывает процентную интенсивность диареи, наблюдаемой у OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации солевым раствором (отрицательный контроль), OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA (положительный контроль) и OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA и терапии подвергнутыми тепловой обработке или живыми Bifidobacterium breve NCC2950. Результаты отображены в виде процента от интенсивности диареи (среднее ±SEM, рассчитанное по 4 независимым экспериментам) со 100% интенсивностью диареи, соответствующей симптомам, развившимся в группе с положительным контролем (сенсибилизация и провокация аллергеном).

Пример 1

Методика

Бактериальные препараты.

Польза, обеспечиваемая живыми пробиотиками иммунной системе организма, как правило, рассматривается как штаммспецифичная. Было показано, что пробиотики, приводящие к высоким уровням IL-10 и/или вызывающие снижение уровней провоспалительных цитокинов in vitro (испытание РВМС) являются действенными противовоспалительными штаммами in vivo (Foligne В. и др., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243).

Для исследования противовоспалительных свойств подвергнутых тепловой обработке пробиотиков было применено несколько пробиотических штаммов. Это были Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825) и Escherichia coli Nissle. Были также исследованы несколько штаммов заквасочных культур, включая некоторые штаммы, применяемые промышленно для получения ферментированных Lc1 продуктов Nestlé: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 и Lactococcus lactis NCC 2287.

Бактериальные клетки культивировались в условиях, оптимизированных для каждого штамма, в 5-15-л биореакторах. Пригодными являются любые стандартные среды для выращивания бактериальных культур. Такие среды известны специалистам в данной области. После доведения рН до 5,5 в непрерывном режиме был добавлен 30% основной раствор (либо NaOH, либо Ca(OH)2). Когда это было необходимо, создавались анаэробные условия заполнением свободного пространства газообразным СО2. Е.coli выращивалась при стандартных аэробных условиях.

Бактериальные клетки собирались центрифугированием (5000 g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере (PBS) в объемах, подходящих для достижения конечной концентрации около 109-1010 КОЕ/мл. Часть препарата была заморожена при -80°С с 15% глицерином. Другая часть клеток была подвергнута тепловой обработке с помощью:

- ультравысокой температуры: 140°С в течение 15 с; с введением непрямого пара;

- высокой температуры в течение короткого времени (HTST): 74°С, 90°С и 120°С в течение 15 с впрыскиванием непрямого пара;

- низкой температуры в течение длительного времени (85°С, 20 минут) на водяной бане;

При тепловой обработке образцы перед применением сохранялись в замороженном при -80°С состоянии.

Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов.

Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способности индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенипиллина/стептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). PBMCs (7×105 клеток на лунку) были затем инкубированы с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×106 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 ч. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на PBMCs, полученных от 8 различных доноров, разделенных на два отдельных эксперимента. После 36 ч инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°С. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и той же серии PBMCs) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.

После 36 ч инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл)+/-SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом. Для каждого штамма было вычислено отношение IL-12p40/IL-10 в качестве прогностического показателя in vivo противовоспалительного эффекта (Foligne В. и др., 2007, World J.Gastroenterol. 13:236-243).

Численные характеристики цитокинов (пг/мл), определенные по данным ELISA (см. выше) для каждого штамма, были введены в программу BioNumerics v5.10 ((Applied Maths, Smt-Martens-Latem, Бельгия). К этому набору данных был применен метод главных компонент (РСА, методика задания размерности). В этот анализ было включено определение разницы средних величин по признакам и деление полученного показателя на величину дисперсии по этим признакам.

Результаты

Противовоспалительные профили, обеспечиваемые видами обработки, сходными с ультравысокотемпературной (UНТ)/кратковременной высокотемпературной (HTST) обработкой.

Штаммы пробиотиков при исследовании были подвергнуты серии тепловых обработок (ультравысокотемпературная (UHT), кратковременная высокотемпературная (HTST) и 20 мин при 85°С), и их иммунные профили были сравнены с аналогичными профилями живых клеток in vitro. Живые микроорганизмы (пробиотики и/или молочные заквасочные культуры) при инкубации с человеческими РВМС индуцировали различные уровни продуцирования цитокинов (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5). Тепловая обработка этих микроорганизмов модифицировала уровни продуцируемых РВМС цитокинов температурно зависимым образом. «Кратковременная высокотемпературная» обработка (120°С или 140°С в течение 15 с) приводила к получению нереплицирующихся бактерий с противовоспалительными иммунными профилями (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Фактически, штаммы, подвергнутые обработке, подобной ультравысокотемпературной (140°С, 15 с), индуцировали меньше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40) при сохранении или стимулировании продуцирования дополнительного IL-10а (в сравнении с живыми экземплярами). Полученные величины отношения IL-12p40/IL-10a для всех штаммов, подвергнутых обработке, подобной ультравысокотемпературной, по сравнению с живыми клетками были ниже (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Это наблюдение было также действительно и для бактерий, подвергнутых HTST-подобной обработке, то есть 15 с при 120°С (Фигуры 1, 2, 3 и 4), или 15 с при 74°С и 90°С (Фигура 5). Тепловые обработки (UHT-подобные или HTST-подобные) имели сходное воздействие на in vitro иммунные профили штаммов пробиотиков (Фигуры 1, 2, 3 и 5) и молочных заквасочных культур (Фигура 4). Метод главных компонент по данным РВМС, полученным с живыми и подвергнутыми тепловой обработке (140°С, 15 с) штаммами пробиотиков и молочных заквасок, выявил, что живые штаммы распределяются по всей оси X, что показывает, что эти штаммы демонстрируют сильно различающиеся иммунные профили in vitro, от слабой (левая сторона) до сильной (правая сторона) индукции провоспалительных цитокинов. Группа подвергнутых тепловой обработке штаммов с левой стороны графика показывает, что подвергнутыми тепловой обработке штаммами провоспалительные цитокины индуцируются в значительно меньшей степени (Фигура 6). В отличие от этого, бактерии, подвергнутые тепловой обработке в течение 20 мин при 85°С, индуцировали больше провоспалительных цитокинов и меньше IL-10a, чем живые клетки, приводя к более высоким показателям отношения IL-12p40/IL-10a (Фигура 7).

Противовоспалительные профили, усиленные или полученные в результате UHT-подобной и HTST-подобной обработки.

Подвергнутые UHT- и HTST-обработке штаммы демонстрируют противовоспалительные профили независимо от их соответствующих исходных иммунных профилей (живые клетки). Было показано, что штаммы пробиотиков, известные в качестве противовоспалительных in vivo и демонстрирующие противовоспалительные профили in vitro (В.longum NCC 3001, В.longum NCC 2705, В.breve NCC 2950, В.lactis NCC 2818), демонстрируют усиленные противовоспалительные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки. Как показано на Фигуре 1, отношения IL-12p40/IL-10a подвергнутых UHT-подобной обработке штаммов Bifidobacterium были ниже, чем у живых экземпляров, тем самым показывая улучшенные противовоспалительные профили образцов, подвергнутых UHT-подобной обработке. Еще более удивительно образование противовоспалительных профилей под действием UHT-подобной и HTST-подобной обработки, подтвержденное также и у не обладавших противовоспалительной активностью живых штаммов. Оба штамма живых L.rhamnosus NCC 4007 и L.paracasei NCC 2461 показывают высокие величины отношения IL-12p40/IL-10a in vitro (Фигуры 2 и 5). Было показано, что эти два живых штамма не обладают протективным действием против TNBS-индуцированного колита у мышей. Величины индуцированного L.rhamnosus NCC 4007 и L.paracasei NCC 2461 отношения IL-12p40/IL-10a резко снижались после «кратковременной высокотемпературной» обработки (UHT или HTST), достигая столь же низких уровней, как полученные со штаммами Bifidobacterium. Такие низкие показатели отношения IL-12p40/IL-10a являются результатом низких уровней продуцирования IL-12p40 в сочетании с отсутствием изменений (L.rhamnosus NCC 4007) или сильным индуцированном секреции IL-10a (Z.paracasei NCC 2461) (Фигура 2).

Как следствие:

- противовоспалительные профили живых микроорганизмов могут быть усилены UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработкой (например, В.longum NCC 2705, В.longum NCC 3001, В.breve NCC 2950, В.lactis NCC 2818);

- противовоспалительные профили могут быть получены у не обладающих противовоспалительной активностью живых микроорганизмов (например, L.rhamnosus NCC 4007, L.paracasei NCC 2461, молочные закваски S.thermophilus NCC 2019) посредством применения UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработки;

- продемонстрировано также наличие противовоспалительных профилей у штаммов, выделенных из имеющихся в продаже продуктов (Фигуры 3 А и В), включая штамм пробиотической Е.coli.

Воздействие UHT/HTST-подобной обработки было сходным для всех проверенных пробиотиков и молочных заквасок, например молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков.

UHT/HTST-подобная обработка применялась к нескольким видам молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков, показывающим различные in vitro иммунные профили. Все штаммы после UHT/HTST-подобной обработки индуцировали меньше провоспалительных цитокинов, чем их живые экземпляры (Фигуры 1, 2, 3, 4, 5 и 6), демонстрируя, что действие UHT/HTST-подобной обработки на иммунные свойства конечных нереплицирующихся бактерий может быть обобщено на все пробиотики, в частности на молочнокислые бактерии и бифидобактерии и определенные штаммы Е.coli, а также на все молочные заквасочные культуры, в частности стрептококки, лактококки и молочнокислые бактерии.

Пример 2

Методика

Бактериальные препараты.

При исследовании усиления иммунных свойств нереплицирующихся пробиотиков было использовано пять пробиотических штаммов: 3 вида бифидобактерий (В.longum NCC3001, В.lactis NCC2818, В.breve NCC2950) и 2 молочнокислых бактерий (L.paracasei NCC2461, L.rhamnosus NCC4007).

Бактериальные клетки выращивались на среде MRS в режиме периодического культивирования в течение 16-18 ч при 37°С без контроля рН. Бактериальные клетки центрифугировались (5000 g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере перед разведением в водно-солевом растворе до достижения конечной концентрации около 1010 КОЕ/мл. В.longum NCC3001, В.lactis NCC2818, L.paracasei NCC2461, L.rhamnosus NCC4007 были подвергнуты тепловой обработке в течение 20 мин при 85°С на водяной бане. В.breve NCC2950 нагревались 30 минут на водяной бане при 90°С. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные суспензии аликвотировались и до применения сохранялись в замороженном при -80°С состоянии. Живые бактерии до применения сохранялись при -80°С в смеси PBS-глицерин (15%).

Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов

Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способности индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенициллина/стептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). PBMCs (7×105 клеток на лунку) были затем инкубированы с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×106 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 ч. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на PBMCs, полученных от 8 различных доноров, разделенных на два отдельных эксперимента. После 36 ч инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°С. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и тоже серии PBMCs) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.

После 36 ч инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл)+/-SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом.

Эффект in vivo живых и подвергнутых тепловой обработке Bifidobacterium breve NCC2950 в профилактике аллергической диареи.

Для проверки Тh1-промотирующего действия В.breve NCC2950 использовалась модель аллергической диареи на мышах (Brandt Е.В и др. JCI 2003; 112 (11): 1666-1667). После сенсибилизации (2 интраперитонеальные инъекции яичного альбумина (OVA) и алюминиевокалиевых квасцов с интервалом в 14 дней; дни 0 и 14), самцы мышей линии Balb/c были подвергнуты 6-кратной пероральной провокации OVA (дни 27, 29, 32, 34, 36, 39), приводящий к кратковременным клиническим симптомам (диарея) и изменению иммунных параметров (плазменная концентрация общего IgE, OVA-специфического IgE, протеазы-1 тучных клеток мышей, то есть ММСР-1). Bifidobacterium breve NCC2950, живые или подвергнутые 30 мин тепловой обработке при 90°С, вводились чреззондовым питанием за 4 дня до OVA-сенсибилизации (дни-3,-2,-1, 0 и дни 11, 12, 13 и 14) и во время провокационного периода (дни 23-39). Использовалась суточная доза бактерий около 10 КОЕ или эквивалентные количества в выражении КОЕ/мышь.

Результаты

Индукция секреции «провоспалительных» цитокинов после тепловой обработки.

Была оценена in vitro способность подвергнутых тепловой обработке бактериальных штаммов стимулировать секрецию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (PBMCs) человека. Иммунные профили, основанные на четырех цитокинах, продуцируемых при стимулировании PBMCs подвергнутыми тепловой обработке бактериями, сравнивались с индуцируемыми живыми бактериальными клетками в условиях одинаковых испытаний in vitro.

Подвергнутые тепловой обработке препараты высевались на чашки и оценивались на отсутствие какого-либо количества жизнеспособных микроорганизмов. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные препараты не образовывали колоний после высевания на чашки.

Живые пробиотики при инкубации с человеческими PBMCs индуцировали различные и зависящие от вида штамма уровни цитокинов (Фигура 8). Тепловая обработка пробиотиков модифицировала уровни продуцируемых PBMCs цитокинов по сравнению с их живыми аналогами. Подвергнутые тепловой обработке бактерии индуцировали больше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), чем их живые аналоги. Напротив, подвергнутые тепловой обработке бактерии в сравнении с живыми клетками индуцировали подобные или более низкие количества IL-10а (Фигура 8). Эти данные показывают, что подвергнутые тепловой обработке бактерии способны в большей степени стимулировать иммунную систему, чем их живые аналоги, и поэтому могут эффективнее укреплять ослабленную иммунную защиту. Другими словами, in vitro данные иллюстрируют улучшение эффекта укрепления иммунитета бактериальными штаммами после тепловой обработки.

Для того чтобы показать повышенную эффективность подвергнутых тепловой обработке В.breve NCC2950 (по сравнению с живыми клетками) в отношении действия на иммунную систему, и живые, и подвергнутые тепловой обработке В.breve NCC2950 (штамм А) были проверены в модели аллергической диареи на животных.

По сравнению с группой позитивного контроля интенсивность диареи после терапии с подвергнутыми тепловой обработке В.breve NCC2950 была значительно и устойчиво снижена (41,1%±4,8), тогда как интенсивность диареи после терапии с живыми В.breve NCC2950 была снижена только на 20±28,3%. Эти результаты показывают, что подвергнутые тепловой обработке В.breve NCC2950 демонстрируют более выраженное протективное действие против аллергической диареи, чем их живые аналоги (Фигура 9).

В результате показано улучшение способности пробиотиков усиливать иммунную защиту после их подвергания тепловой обработке.

Примеры 3-7.

Могут быть приготовлены следующие питательные смеси для младенцев или маленьких детей

Белок (г/100 ккал) 2,5 2,5 2 2,5 2
Сыворотка/казеин 40/60 40/60 50/50 40/60 50/50
СНО г/100 ккал 12,9 12,9 12,3 12,9 12,3
Лактоза (г/100 ккал) 9 12,9 7,7 12,9 7,7
Мальтодекстрин (г/100 ккал) 3,9 - 4,6 - 4,6
Жиры (г/100 ккал) 4,25 4,25 4,8 4,25 4,8
Пробиотики, сухая масса, г 109 КОЕ Lactobacillus johnsonii La1 109 КОЕ подвергнутых тепловой обработке (75°С, 20 мин) Bifidobacteriu m longum NCC3001 109 КОЕ подвергнутых UHT Lactobacillus johnsonii La1 109 КОЕ подвергнутых UHT Bifidobacterium breve NCC2950 109 КОЕ Lactobacillus johnsonii La1
LC-PUFA (0,20 г/100 г жирных кислот) - - - DHA ARA/DHA
Калорийность (ккал/100 мл) 64,88 64,88 65 64,88 65

1. Питательная смесь для младенцев или маленьких детей, предназначенная для введения младенцам или маленьким детям, начиная с возраста в 6 месяцев, предоставляющая младенцу или ребенку полноценное питание и содержащая пробиотические микроорганизмы в количестве, соответствующем 106-1012 КОЕ, в которой пробиотические микроорганизмы приводятся в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой при температуре 120-140°C в течение 5-15 с.

2. Питательная смесь по п. 1, имеющая калорийность в диапазоне 62-68 ккал/100 мл и содержащая источник белка в количестве 1,9-3,5 г/100 ккал, источник углеводов в количестве 12-13 г/100 ккал и источник липидов в количестве 4-5 г/100 ккал.

3. Питательная смесь по п. 2, содержащая полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью в количестве 0,15-0,25 г LC-PUFA /100 г жирных кислот, в которой LC-PUFA выбраны из арахидоновой кислоты (ARA), докозогексаеновой кислоты (DHA) или их сочетания.

4. Питательная смесь по п. 1, содержащая нуклеотиды в количестве 1,5-2,5 мг на 100 мл смеси.

5. Питательная смесь по любому из пп. 1-4, используемая при профилактике или при лечении воспалительных заболеваний.

6. Питательная смесь по п. 1, в которой пробиотические микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий или их сочетаний.

7. Питательная смесь по п. 6, в которой пробиотические микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и их сочетаний.

8. Питательная смесь по п. 7, в которой бактерии выбраны из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM17938, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 и их сочетаний.

9. Питательная смесь по п. 1, содержащая в расчете на суточную дозу около 0,005-1000 мг нереплицирующихся микроорганизмов.

10. Питательная смесь по п. 1, содержащая пробиотические микроорганизмы в количестве, соответствующем 109-1010 КОЕ.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологии. Описано применение теней бактерий Е.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены штаммы Lactobacillus plantarum CECT 7484, Lactobacillus plantarum CECT 7485 и Pediococcus acidilactici CECT 7483, проявляющие противовоспалительную активность, иммуномодулирующую активность, активность в отношении IBS или активность в отношении вздутия живота.

Предложена питательная композиция, содержащая штамм Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 и оболочки жировых шариков молока (MFGM), в которой MFGM усиливают биологическое действие указанного штамма.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и может быть использовано для лечения системных иерсиниозных бактериальных инфекций псевдотуберкулеза или кишечного иерсиниоза в эксперименте.

Изобретение относится к способу исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры. Способ исследования повышения антибиотикочувствительности условно-патогенной микрофлоры при использовании молочнокислой кормовой добавки, содержащей культуру микроорганизмов Bifidobacter longum Б-41 in vitro, включает добавление к мясопептонному бульону супернатанта молочнокислой кормовой добавки, содержащей культуру условно-патогенной микрофлоры, полученный раствор инкубируют, после чего проводят определение антибиотикочувствительности микроорганизмов на мясопептонном агаре с 24 видами антибактериальных препаратов дискодиффузионным методом.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой способ коррекции кишечного микробиоценоза с использованием микробных культур Е. coli М-17, В.

Изобретение относится к генной инженерии. Описаны клостридиальные токсины или гибрид клостридиальнго токсина, содержащие инактивационный сайт расщепления.

Группа изобретений относится к композиции, включающей штаммы Lactobacillus plantarum, и применению штаммов и композиции. Композиция со снижающей холестерин активностью эффективное количество по меньшей мере, одного из штаммов, выбранных из группы штамм Lactobacillus plantarum CECT 7527, штамм Lactobacillus plantarum CECT 7528 и штамм Lactobacillus plantarum CECT 7529.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение соли угольной кислоты в качестве стабилизатора цвета в бактериальной композиции, содержащей бактериальные клетки, относящиеся к роду Bifidobacterium, и аскорбат.
Представленное изобретение относится к области ветеринарии и касается средства для профилактики мастита у коров в период лактации. Охарактеризованное решение содержит в качестве пробиотических бактерий для обработки сосков после доения пробиотические штаммы Bacillus subtilis - B-5225 (1×108) 4 мас.%, Enterococcus faecium СТФ 1/56 (1×108) 4 мас.%, глицерин (2 мас.%) и стерильную воду 90%.
Изобретение относится к хлебопекарной отрасли пищевой промышленности. Способ получения обогащенных хлебных изделий предусматривает прием, хранение и подготовку сырья, приготовление теста пшеничного, или ржаного, или пшенично-ржаного, или ржано-пшеничного, разделку, расстойку теста и выпечку изделий.

Группа изобретений относится к способу получения продукта поликонденсации сахарида или его восстановленного продукта, продукту поликонденсации сахарида, его восстановленному продукту или композиции продукта поликонденсации сахарида, пищевому или питьевому продукту, способам получения алкогольного напитка со вкусом пива и корму для домашнего скота.
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способу получения соуса на основе белкового концентрата колострума, и может быть использовано при производстве функциональных продуктов, предназначенных для диетического питания.

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к производству пищевых добавок. Способ предусматривает обработку свекловичного жома водным раствором перекиси водорода, прессование обработанного жома с отделением твердой фракции, ее сушку, экстракцию высушенного материала водой, отделение экстракта, его концентрирование и сушку.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при производстве пищевых добавок. Способ включает прессование жома топинамбура, сушку жома после прессования и измельчение высушенного жома.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для получения высококачественной биологически активной добавки (БАД), применяемой для непосредственного применения в пищу в качестве профилактики или для создания обогащенных, функциональных и специализированных пищевых продуктов.
Изобретение относится к области биотехнологии и может применяться при производстве биологически активных добавок (БАД) функционального назначения из сырья животного и растительного происхождения.
Изобретение относится к детскому питанию. Предложен способ изменения состава жирных кислот в мембранах клеток мозга, выбранного из группы, состоящей из: i) увеличения текучести мембран клеток мозга, ii) увеличения содержания PUFA в мембранах клеток мозга, iii) увеличения содержания LC-PUFA в мембранах клеток мозга, iv) уменьшения соотношения n6/n3 LC-PUFA в мембранах клеток мозга, v) уменьшения соотношения n6/n3 PUFA в мембранах клеток мозга, vi) увеличения содержания n3 PUFA в мембранах клеток мозга, vii) увеличения содержания n3 LC-PUFA в мембранах клеток мозга и viii) увеличения содержания DHA в мембранах клеток мозга у субъекта-человека путем введения питательной композиции, содержащей 10-50 мас.% растительных липидов на сухую массу композиции и липидные шарики с ядром, включающим указанные растительные липиды.
Настоящее изобретение относится к смеси олигосахаридов и к продукту питания, содержащему такую смесь. Смесь олигосахаридов содержит 5-70 мас.% по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида, 5-90 мас.% по меньшей мере одного галакто-олигосахарида, 2-50 мас.% по меньшей мере одного сиалилированного олигосахарида и 2-70 мас.% по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида.
Настоящее изобретение относится к смеси олигосахаридов и к продукту питания, содержащему такую смесь. Смесь олигосахаридов содержит 5-70 мас.% по меньшей мере одного N-ацетилированного олигосахарида, 5-90 мас.% по меньшей мере одного галакто-олигосахарида, 2-50 мас.% по меньшей мере одного сиалилированного олигосахарида и 2-70 мас.% по меньшей мере одного фукозилированного олигосахарида.

Группа изобретений относится к пищевой промышленности, а именно к готовому к употреблению продукту на основе целых цельных зерен овса и способу его получения. Промывают зерна холодной водой.
Наверх