Промывочный раствор и способ промывки для аффинной хроматографии


 

C07K1/22 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2564569:

НОВАРТИС АГ (CH)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения очищенных антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc или слитый с Fc белок, с использованием матрикса аффинной хроматографии, с которым связаны указанные антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc или слитый с Fc белок. Способ включает осветление смеси, содержащей антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc или слитый с Fc белок. Загружают указанную смесь на матрикс аффинной хроматографии, содержащий связывающий иммуноглобулины белок. Промывают указанный матрикс аффинной хроматографии промывочным раствором, содержащим аргинин в диапазоне концентраций 0,05-0,85 М и галогеновую соль в диапазоне концентраций 0,1-2,0 М, где указанный промывочный раствор имеет рН в диапазоне 8,0-9,5. Удаляют примеси из матрикса аффинной хроматографии. Элюируют антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc или слитый с Fc белок, с матрикса аффинной хроматографии при низком рН. Предложенное изобретение позволяет получить очищенные антитела или фрагмент антитела, содержащий область Fc, или слитый с Fc белок, с высоким выходом. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 20 табл., 6 пр.

 

Уровень техники

Аффинная хроматография позволяет осуществить выделение интересующего белка из смеси молекул, например, клеточного сбора, основываясь на предпочтительном связывании интересующего белка с мишенью в твердой фазе, например, гелевом матриксе. Данный твердофазный компонент, как правило, загружается в колонку, через которую пропускают смесь, содержащую интересующий белок. На этом начальном этапе, называемом этапом захвата, интересующий белок специфически связывается с целью в твердой фазе, в то время как иные компоненты смеси проходят через колонку. Однако определенные компоненты смеси, включая высокомолекулярные соединения (ВМС), низкомолекулярные соединения (НМС) и белки клетки-хозяина (БКХ), могут остаться в колонке в виде примесей к интересующему белку. Таким образом, обычно проводят один или более этапов отмывки, заключающихся в промывании колонки одним или более промывочными растворами, чтобы удалить данные примеси, но не нарушить связывание интересующего белка с твердой фазой. Наконец, после удаления примесей во время этапа(ов) отмывки, интересующий белок извлекают из колонки на этапе элюирования, во время которого через колонку пропускают элюирующий раствор, который разрушает связь интересующего белка с мишенью твердой фазы; в итоге интересующий белок оказывается в элюате. Соответственно, эффективность очистки интересующего белка способом аффинной хроматографии зависит, в основном, от определения условий отмывки, при которых достигается эффективное удаление примесей (например, ВМС, НМС, БКХ) и отсутствуют нарушение связывания интересующего белка с мишенью твердой фазы или иные нежелательные эффекты.

Особенно привлекательным типом аффинной хроматографии является хроматография с протеином A, используемая для очистки белков, содержащих иммуноглобулиновый Fc-фрагмент, например антитела и Fc-слитые белки. Для удаления примесей из колонок с протеином A были предложены различные промывочные растворы, включая отмывочные растворы, содержащие одно из следующих веществ: гидрофобные электролиты (например, тетраметиламмония хлорид, тетраэтиламмония хлорид, тетрапропиламмония хлорид или тетрабутиламмония хлорид при pH 5,0-7,0), растворители (например, 5-20% изопропанола или пропиленгликоля/гексиленгликоля), мочевину (например, в концентрации 1-4 М), ПАВ (например, 0.1-1% Твин 20 или Твин 80), полимеры {например, 5-15% полиэтиленгликоля, такого как ПЭГ400 или ПЭГ8000) или высококонцентрированные буферные растворы типа Трис, HCl, ацетатных, сульфатных, фосфатных или цитратных буферов в концентрациях 0,8-2,0 М при pH от 5,0 до 7,0 (см., например, Shukla А.А. и Hinckley Р. (2005) Biotechnol. Prog. 24:1115-1121; патентные заявки США №№6 127 526 и 6 333 398, поданные Blank; патентную заявку США №6870034, поданную Breece et al.). Многие из этих реактивов, тем не менее, обладают одним недостатком или более, включая, но не ограничиваясь перечисленным, токсичность, коррозионность, горючесть, нестабильность, дорогостоящую утилизацию опасных отходов и/или неэффективное удаление загрязнителей на этапе отмывки.

В литературе также описаны промывочные буферы для хроматографии с протеином A, содержащие соль (например, хлорид натрия), отдельно или в комбинации с ПАВ (например, Твин 20) или растворителем (например, гексиленгликолем), или полимером (например, полиэтиленгликолем) (Патентная заявка США №. 6 870 034, поданная Breece et al.).

Barron et al. описали интермедиатный промывочный раствор для хроматографии с протеином A, содержащий 0.5-2.0 М аргинина в фосфатном/ацетатном буфере при pH 5.0-7.5 (оптимально, 1М аргинина, 0.1М фосфатного/ацетатного буфера при pH 5.0). Этап промывки аргининовым раствором, как сообщалось, предназначен для удаления загрязнителей БКХ. Авторами также был проверен интермедиатный промывочный раствор, содержащий 0.5-2.0 М хлорида натрия при pH 5.0-7.5, но было выявлено, что при использовании этого раствора уровень БКХ не понижался (Barron et al., "Improving Purity on Protein A Affinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step", http://www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319).

Sun et al. также описал промывку аффинных хроматографических колонок, в том числе колонок с протеином А, при помощи промывочного буфера, содержащего аргинин или производное аргинина в концентрации 0.1-2.0 М при pH 4.5-8.0 (Патентные публикации США №№.20080064860 и 20080064861; публикация РСТ №WO 2008/031020).

Аргинин также использовался для элюирования белков из колонок для аффинной хроматографии и очистительных колонок других типов. К примеру, Arakawa et al. описали способы элюирования антител из колонки с протеином A с использованием элюирующего буфера, содержащего 0.5-2.0 М аргинина при pH 4.1-5.0 (Arakawa et al. (2004) Protein Expression and Purification 36:244-248: Tsumoto, K. et al. (2004) Biotechnol. Prog. 20:1301-1308; патентная публикация США №20050176109). Также в патентной заявке США №7 501 495, поданной Ejima et al., описаны способы элюирования белков из гель-фильтрационной колонки с использованием проявляющего раствора, содержащего аргинина гидрохлорид. Ghose et al. описали способы элюирования интересующих белков из незамещенного кремнезема с использованием аргининового градиента в качестве элюанта (Ghose, S. et al. (2004,) Biotech. Bioeng. 87:413-423). В патентной публикации США №20030050450, поданной Coffman et al., описаны способы высвобождения Fc-содержащих молекул из комплексов Fc-содержащих молекул и протеина A, где комплексы Fc/протеин A вводят в колонку для хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ) и колонку промывают буфером, содержащим аргинин.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении представлены эффективный и устойчивый промывочный раствор для аффинной хроматографии, а также способы промывки, использующие данный раствор. Данный промывочный раствор применяется на этапе промывки до этапа элюирования, при его использовании обеспечиваются высокие выходы и высокие концентрации интересующего белка, элюированного из аффинного матрикса и, в то же время, эффективное удаление высокомолекулярных соединений (ВМС) и белков клетки-хозяина (БКХ), происходящих из исходных материалов, загруженных в матрикс. Этот промывочный раствор характеризуется наличием как аргинина (или производного аргинина), так и небуферной соли, например галогеновой соли. Предпочтительно, чтобы промывочный раствор имел высокий уровень рН, выше 8.0. Данная комбинация аргинина (или производного аргинина) и небуферной соли удаляет значительно большее количество примесей, чем промывочные растворы, содержащие либо аргинин, либо соль по отдельности, и обеспечивает более острый пик элюирования, что коррелирует с высокой концентрацией извлеченного интересующего белка.

Дополнительно, в одном аспекте, в изобретении представлен способ получения очищенного интересующего белка с использованием матрикса аффинной хроматографии (АХ), с которым связывается целевой белок; способ, содержащий промывку АХ-матрикса одним или более промывочными растворами, содержащими (i) аргинин или производное аргинина и (ii) небуферную соль, до элюирования интересующего белка из АХ-матрикса. Предпочтительно, чтобы интересующий белок загружался на АХ-матрикс до промывания одним или более промывочными растворами и интересующий белок элюировался из АХ-матрикса после промывания одним или более промывочными растворами, в частности, с целью удаления примесей из АХ-матрикса.

В предпочтительном воплощении, АХ-матрикс является колонкой с протеином A. В различных иных воплощениях, АХ-матрикс может быть выбран, к примеру, из группы, состоящей из колонки с протеином G, колонки с протеином A/G, колонки с протеином L, колонки для аффинной хроматографии с иммобилизированными ионами металлов (IMAC), колонки со смолой, содержащей кальмодулин, колонки МЕР HyperCel, колонки, связывающей белок, соединяющийся с мальтозой (МВР), колонки, связывающей глутатион-S-трансферазу (GST), и колонки, связывающей Strep-Tag II. В предпочтительном воплощении, интересующий белок является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с АХ-матриксом, например, с колонкой с протеином A, хотя иные белки, связывающиеся с аффинными матриксами, описанными в данном документе, также пригодны для очистки согласно способам изобретения.

В предпочтительном воплощении, один или более промывочных растворов содержат аргинин-HCl, предпочтительно, с концентрацией в диапазоне 0,05-2,0 М, более предпочтительно, в диапазоне 0,05-0,85 М, наиболее предпочтительно, в диапазоне 0,1-0,5 М. В отдельных воплощениях, аргинин-HCl присутствует в концентрации 0,1 М, или около 0,1 М, 0,25 М, или около 0,25 М, 0,5 М, или около 0,5 М. В иных воплощениях, один или более промывочных растворов содержат производное аргинина, например производное, выбранное из группы, состоящей из ацетиларгинина, N-альфа-бутироил-аргинина, агматина, аргининовой кислоты и N-альфа-пивалоил-аргинина. В предпочтительном случае, аргинин или производное аргинина включает L-аргинин, хотя D-аргинин также охватывается изобретением.

В предпочтительном воплощении, небуферная соль в одном или более промывочных растворах является натрия хлоридом (NaCl), предпочтительно, в концентрации в диапазоне 0,1-2,0 М. В отдельных воплощениях, NaCl присутствует в концентрации 0.75 М, или около 0.75 М, 1.0 М, или около 1.0 М, или 1.25 М, или около 1.25 М. В иных воплощениях, небуферная соль в одном или более промывочных растворах выбрана из группы, состоящей из калия хлорида, кальция хлорида и магния хлорида.

В конкретном воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов выше 8,0, предпочтительно, по меньшей мере, 8,1, более предпочтительно, по меньшей мере, 8,5 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 8,9. В одном воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов лежит в диапазоне 8,1-9,5. В ином воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов лежит в диапазоне 8,5-9,5. В другом воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов равен, примерно, 9,0. В другом воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов равен 9,0.

Промывочная комбинация аргинина и небуферной соли, описанная в данном документе, предпочтительно, вводится в виде единого промывочного раствора, содержащего оба компонента (т.е. АХ-матрикс промывается одним промывочным раствором, содержащим как (i) аргинин или производное аргинина; так и (ii) небуферную соль). Альтернативно, два промывочных раствора могут использоваться для последовательных промывок: один раствор, содержащий аргинин или производное аргинина (предпочтительно, с уровнем pH выше 8.0), и другой раствор, содержащий небуферную соль. Соответственно, в ином воплощении способа промывки, АХ-матрикс промывают двумя промывочными растворами: первым промывочным раствором и вторым промывочным раствором. В одном воплощении, первый промывочный раствор содержит аргинин или производное аргинина, а второй промывочный раствор содержит небуферную соль. В ином воплощении, первый промывочный раствор содержит небуферную соль, а второй промывочный раствор содержит аргинин или производное аргинина.

Способ промывки согласно изобретению эффективен для удаления ряда примесей, включая высокомолекулярные соединения (ВМС) и белки клетки-хозяина (БКХ).

В другом аспекте, изобретение предоставляет способ получения очищенного антитела или фрагмента антитела с использованием колонки с протеином A, а именно способ, включающий (a) загрузку в колонку с протеином A смеси, содержащей антитело или фрагмент антитела; (b) промывку колонки с протеином А промывочным раствором, содержащим (i) аргинин-HCl в концентрации, лежащей в пределах 0,05-2,0 М (более предпочтительно 0,05-0,85 М, наиболее предпочтительно 0,1-0,5 М), и натрия хлорид в концентрации, лежащей в пределах 0,1-2,0 М, причем промывочный раствор удаляет примеси из колонки с протеином A; и (c) элюирование антитела или фрагмента антитела из колонки с протеином А. В конкретных воплощениях, аргинин-HCl присутствует в концентрации 0,1 М, или около 0,1 М, 0,25 М, или около 0,25 М, 0,5 М, или около 0,5 М. В отдельных воплощениях, NaCl присутствует в концентрации 0,75 М, или около 0,75 М, 1,0 М, или около 1,0 М, 1,25 М, или около 1,25 М. В различных воплощениях, уровень pH промывочного раствора выше 8,0, предпочтительно, по меньшей мере, 8,1, более предпочтительно, по меньшей мере, 8,5, более предпочтительно, 9,0, лежит в диапазоне 8,1-9,5, либо в диапазоне 8,5-9,5.

Подробное описание изобретения

В изобретении представлен новый промывочный раствор для аффинной хроматографии, например, хроматографии с протеином А, который вводится в колонку до элюирования интересующего белка с целью удаления примесей. Новый промывочный раствор содержит аргинин (или производное аргинина) и небуферную соль. Как правило, промывочный раствор является водным.

При использовании в данном документе, термин «небуферная соль» относится к соли, которая присутствует в промывочном растворе, принадлежащей к такому типу и находящейся в такой концентрации, чтобы не влиять существенно на поддержание pH промывочного(ых) раствора(ов) в применяемых условиях (например, высокий рН) при добавлении кислоты или основания. Как правило, небуферная соль является ионной солью. К небуферным солям относят галогеновые соли, включая соли, содержащие O или Br (более предпочтительно, Cl), в частности, галогеновые соли, содержащие щелочные или щелочноземельные металлы, включая Na, K, Ca и Mg (более предпочтительно, Na или K). Термин «небуферная соль» не включает буферные соли, например натрия ацетат, натрия фосфат и Трис, которые действительно существенно влияют на поддержание уровня pH промывочного(ых) раствора(ов) в применяемых условиях. В предпочтительном воплощении, небуферная соль является галогеновой солью (например, содержащей Cl или Br). В ином воплощении, небуферная соль является галогеновой солью, содержащей натрий (Na), калий (K), кальций (Са) или магний (Mg), более предпочтительно, натрий (Na) или калий (K). В еще одном воплощении, небуферная соль выбрана из группы, состоящей из NaCl, КС1, CaCl2 и MgCl2. В особенно предпочтительном воплощении, небуферная соль является натрия хлоридом (NaCl). Как правило, небуферная соль используется в «высокой» концентрации, по меньшей мере, 1 М. Иные подходящие концентрации и интервалы концентраций также описаны ниже.

Данная новая комбинация промывочных компонентов позволяет удалить значительно большее количество примесей, нежели обычные процедуры, не влияя на выход. Помимо этого, при промывке в данных условиях достигается более острый пик элюирования, что коррелирует с высокой концентрацией интересующего белка в элюате, что является преимуществом для повышения производительности при проведении дополнительного последующего процесса очистки.

Эффективное удаление примесей, включая белки клетки-хозяина (БКХ) и продукт-связанные примеси, например высокомолекулярные соединения (ВМС) и низкомолекулярные соединения (НМС), является ключевым фактором при последующей обработке интересующего белка. Аффинная хроматография часто используется в качестве первого этапа многоэтапного процесса очитки интересующего белка {например, антитела), поэтому чистота интересующего белка после аффинной хроматографии значительно влияет на типы и количество последующих этапов очистки. Иная важная роль аффинной хроматографии заключается в концентрировании продукта, что позволяет использование пропорционально меньших и менее дорогих колонок на последующих этапах очистки. Таким образом, особенно важно оптимизировать удаление примесей на этапе аффинной хроматографии.

Низкий уровень рН, как правило, в пределах pH 3-4, необходим для элюирования связанного интересующего белка из аффинного матрикса, однако имеет недостаток, заключающийся в возможном индуцировании агрегации. Исторически, для вымывания неспецифически связанных примесей из колонки, но для сохранения взаимодействия интересующего белка и аффинного матрикса, использовались менее жесткие условия, например, pH 5-5,5. Выход интересующего белка, однако, часто уменьшается из-за частичного элюирования интересующего белка в данных условиях, особенно при работе с высокой плотностью загрузки. Соответственно, в предпочтительном воплощении, промывочный раствор, представленный в настоящем изобретении, имеет преимущественно высокий рН, выше 8,0, что сохраняет связывание интересующего белка с аффинным матриксом, но позволяет удаление примесей.

Новый промывной раствор для аффинной хроматографии, представленный в настоящем изобретении, основан на смеси аргинина (или производного аргинина) и небуферной соли, предпочтительно, имеющей высокий рН. Значительный биофизический разброс примесей, присутствующих в обычных сборах или клеточных экстрактах, приводит к весьма разнообразным типам взаимодействия твердой фазы хроматографического носителя и/или связывания интересующего белка. Более или менее выраженное связывание примесей может быть следствием нековалентных межмолекулярных взаимодействий между двумя молекулами, например, водородной связи, электростатических взаимодействий, гидрофобных взаимодействий и сил Ван-дер-Ваальса или комбинации данных типов взаимодействий. Следовательно, использование комбинации нескольких различных механизмов для удаления примесей, вероятно, более эффективно, нежели подход, основанный на единственном механизме удаления примесей.

Влияние небуферной соли в промывочном растворе, основываясь на аналитических данных, представленных в настоящем документе, заключается в том, что заряженные примеси, связанные неспецифически с заряженными остатками иммобилизированного лиганда или связанного интересующего белка, эффективно извлекаются, в то время, как на высокоаффинные взаимодействия между интересующим белком и лигандом аффинного матрикса промывка раствором с высоким содержанием небуферной соли не влияет. Соответственно, один из механизмов может заключаться в том, что небуферная соль, используемая в промывочном растворе, обладает способностью разрывать ионные взаимодействия между заряженными загрязнителями (примесями), связанными неспецифически с заряженными остатками одного или более компонентов аффинного хроматографического матрикса (например, химической основой матрикса, такой как смола, аффинный лиганд, иммобилизированный на матриксе и/или интересующая мишень, связанная с лигандом, иммобилизированным на матриксе), не нарушая специфического взаимодействия связанной мишени и иммобилизированного лиганда.

По поводу эффектов, оказываемых содержащимся в промывочном растворе аргинином, в литературе сообщалось о том, что аргинин способен растворять некоторые осажденные протеины (Umetsu М. et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 328:189-197; Tsumoto, K. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 312:1383-1386), уменьшать образование агрегатов (Arakawa, Т. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:148-152), уменьшать неспецифическую адсорбцию протеинов на поверхностях (Ejima, D. et al. (2005) J. Chromatogr. A. 1094:49-55). He ограничиваясь по механизму, уменьшение агрегации белков может являться следствием маскирования гидрофобных участков протеинов, взаимодействующих с аргинином. Это взаимодействие может происходить между гуанидиновой группой аргинина и белковыми группами триптофана, либо посредством образования гидрофобных участков при кластеризации аргинина, либо может являться следствием комбинации таких эффектов.

По поводу использования промывочных растворов с pH выше 8.0, основный pH может способствовать частичной денатурации БКХ и ВМС, в то время, как на стабильные белки, включая мономерные антитела, это не влияет. Не ограничиваясь по механизму, денатурирование загрязняющих белков может выражаться в небольшом изменении структуры, что может быть достаточно для ослабления неспецифического связывания. Таким образом, высокий pH промывочного раствора увеличивает степень извлечения примесей путем дестабилизации их взаимодействия со связанным интересующим белком или твердой основой аффинного матрикса, что является преимуществом.

Соответственно, в одном аспекте, в изобретении представлен способ получения очищенного белка с использованием матрикса аффинной хроматографии (АХ), с которым связывается интересующий белок; способ, содержащий промывку АХ-матрикса одним или более промывочными растворами, содержащими (i) аргинин или производное аргинина и (и) небуферную соль, до элюирования интересующего белка из АХ-матрикса.

При использовании в данном документе, термин «аффинный хроматографический матрикс» или «АХ-матрикс», относится к твердофазной среде, как правило, гелю или смоле, позволяющей разделение биохимических смесей на основании высокоспецифичного связывающего взаимодействия между интересующим белком и АХ-матриксом, например, между рецептором и лигандом, ферментом и субстратом или антигеном и антителом. Таким образом, твердофазная среда содержит мишень, к которой интересующий белок может обратимо присоединяться, в зависимости от буферных условий. Нелимитирующими примерами иммобилизированной или твердофазной среды, которая может содержать АХ-матрикс, являются гелевый матрикс, например агарозные гранулы (например, доступные в продаже матриксы Sepharose), а также стеклянный матрикс, например пористые стеклянные гранулы (например, доступные в продаже матриксы ProSep).

Связывание интересующего белка с АХ-матриксом, как правило, обеспечивается при колонной хроматографии. Этот способ заключается в том, что АХ-матрикс загружается в колонку, через нее пропускается биохимическая смесь, содержащая интересующий белок, далее колонка промывается одним или более промывочными растворами, затем элюируют интересующий белок из колонки, пропуская через колонку элюирующий буфер.

Альтернативно, связывание интересующего белка с АХ-матриксом может быть достигнуто путем дозированной обработки, при которой биохимические смеси, содержащие интересующий белок, инкубируют с АХ-матриксом в сосуде, чтобы связать интересующий белок с АХ-матриксом, далее твердофазную среду удаляют из сосуда (например, путем центрифугирования), твердофазную среду промывают, чтобы удалить примеси, и вновь выделяют (например, путем центрифугирования), потом интересующий белок элюируют из твердофазной среды.

В еще одном воплощении, может использоваться комбинация дозированной обработки и колонной хроматографии. К примеру, первичное связывание интересующего белка с АХ-матриксом может быть достигнуто путем дозированной обработки, затем твердофазная среда может быть загружена в колонку, затем колонку промывают и элюируют интересующий белок из колонки.

Природа конкретного твердофазного матрикса, в частности, связывающие свойства мишени, присоединенной к твердой фазе, определяет тип(ы) белка(ов), которые могут быть очищены с использованием данного твердофазного матрикса. К примеру, в предпочтительном воплощении изобретения, АХ-матрикс является колонкой с протеином A, которая содержит в качестве мишени, прикрепленной к твердой фазе, белок бактериальной клеточной стенки - протеин A, специфически связывающийся с доменами СН2 и СН3 Fc-области определенных иммуноглобулинов. Связывающие свойства протеина A хорошо известны в отрасли. Соответственно, в предпочтительном воплощении изобретения, интересующий белок (очищаемый) является антителом или фрагментом антитела, содержащим Fc-область. Кроме того, при помощи хроматографии с протеином A могут быть очищены дополнительные белки, включая Fc-слитые белки. Таким образом, любой белок, который может специфически связываться с матриксом протеина A, может быть очищен по способам изобретения.

Различные смолы с протеином А, известные в отрасли, могут использоваться в рамках изобретения. Нелимитирующими примерами доступных в продаже смол с протеином А являются MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, rProtein A Sepharose FF, rmpProtein A Sepharose FF, Protein A Sepharose CL-4B и nProtein A Sepharose 4 FF (все доступны в продаже у GE Healthcare); ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra и ProSep-Va Ultra Plus (все доступны в продаже у Millipore); Poros А и Mabcapture А (обе доступны в продаже у Poros); IPA-300, IPA-400 и IPA-500 (все доступны в продаже у RepliGen Corp.); Affigel protein А и Affiprep protein А (обе доступны в продаже у Bio-Rad); MABsorbent А1Р и MABsorbent A2P (обе доступны в продаже у Affinity Chromatography Ltd.); Protein A Ceramic Hyper D F (доступна в продаже у Pall Corporation); Ultralink Immobilized protein А и Agarose protein А (обе доступны в продаже у PIERCE); и Protein A Cellthru 300 и Protein A Ultraflow (обе доступны в продаже у Sterogen Bioseparations).

Помимо хроматографии с протеином A, способ промывки по настоящему изобретению может использоваться и с иными системами для аффинной хроматографии. К примеру, в ином воплощении, АХ-матрикс может являться колонкой с протеином G, колонкой с протеином A/G или колонкой с протеином L, каждый из которых является также иммуноглобулин-связывающим бактериальным протеином со связывающими свойствами, известными в отрасли. Таким образом, для очистки антител и фрагментов антител, содержащих Fc-область или Fc-слитые белки, может использоваться АХ-матрикс, являющийся матриксом с протеином G, матриксом с протеином A/G или матриксом с протеином L.

Иными нелимитирующими примерами АХ-матриксов и типами протеинов, которые они могут эффективно очищать, являются: колонка для аффинной хроматографии с иммобилизированными ионами металлов (IMAC) (для очистки протеинов с аффинностью к ионам металлов, например, протеинов, помеченных гистидином), колонка со смолой с кальмодулином (для очистки протеинов, помеченных кальмодулин-связывающим пептидом (СВР)), колонка МЕР HyperCel™ (целлюлозный матрикс, селективно связывающий иммуноглобулины), колонка, связывающая протеин, соединяющийся с мальтозой (МВР) (например, смолу Dextrin Sepharose™, которая селективно связывает протеины, помеченные МВР), колонка, связывающая глутатион-S-трансферазу (GST) (например, смолу Glutathione Sepharose™, которая селективно связывает протеины, помеченные GST) и колонка, связывающая Strep-Tag II (например, смолу Strep-Tactin Sepharose, которая селективно связывает протеины, помеченные Strep-Tag И). Далее, иммуноаффинные матриксы, которые содержат антитело в качестве мишени, прикрепленной к твердой фазе, могут использоваться для очистки интересующего антигена, который специфически связывается с антителом, прикрепленным к твердой фазе.

Хотя интересующее изобретение описано в настоящем документе в связи с очисткой антител с использованием хроматографии с протеином А, промывочные способы, описанные в нем, могут использоваться для очистки с любыми белками, которые могут селективно связываться с конкретным АХ-матриксом.

Промывочные растворы согласно изобретению содержат аргинин или производное аргинина. В качестве аргинина по настоящему изобретению может использоваться природная аминокислота аргинин (например, L-аргинин), D-аргинин или производное аргинина. Неограничивающими примерами аргининовых производных являются ацилированный аргинин, например, ацетиларгинин и N-альфа-бутироил-аргинин, агматин, аргининовая кислота и N-альфа-пивалоил-аргинин. Аргинин или аргининовое производное может использоваться в виде кислотно-аддитивной соли. Примером кислоты, которая может образовывать кислотно-аддитивную соль, является соляная кислота и ей подобные.

Концентрация аргинина или его производного в промывочном растворе, как правило, лежит в диапазоне 0,05-2,0 М (например, 0,05 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М, 0,95 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,15 М, 1,20 М, 1,25 М, 1,30 М, 1,35 М, 1,40 М, 1,45 М, 1,5 М, 1,55 М, 1,6 М, 1,65 М, 1,7 М, 1,75 М, 1,8 М, 1,85 М, 1,9 М, 1,95 М, либо 2,0 М), более предпочтительно, в диапазоне 0.05-0.85 М (что равно верхнему пределу растворимости аргинина в воде при 20°C) (например, 0,05 М, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М или 0,85 М), наиболее предпочтительно, в диапазоне 0,1-0,5 М (например, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М или 0,5 М). В различных воплощениях, концентрация аргинина или его производного может быть равна, к примеру, 0,05 М, 0,1 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,4 М, 0,5 М, 0,6 М, 0,7 М или 0,8 М, либо находиться между 0,1 М и 0,5 М. В некоторых воплощениях, концентрация аргинина или его производного в промывочном растворе равна 0,25 М или выше. В отдельных воплощениях, аргинин присутствует в концентрации 0,1 М, или около 0,1 М, 0,25 М, или около 0,25 М, 0,5 М, или около 0,5 М.

Промывочные растворы согласно изобретению также содержат небуферную соль, как описано выше, которая принадлежит к такому типу и находится в концентрации, достаточной для разрыва ионных взаимодействий между примесями и одним и более компонентами аффинного матрикса. В предпочтительном воплощении, небуферная соль является галогеновой солью. В особенно предпочтительном воплощении, небуферная соль является натрия хлоридом (NaCl). В иных воплощениях, небуферная соль может являться, к примеру, калия хлоридом (KCl), кальция хлоридом (CaCl2) или магния хлоридом (MgCl2). Концентрация небуферной соли в промывочном растворе, как правило, лежит в диапазоне 0,1-2,0 М (например, 0,1 М, 0,15 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М, 0,35 М, 0,4 М, 0,45 М, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М, 0,95 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,15 М, 1,20 М, 1,25 М, 1,30 М, 1,35 М, 1,40 М, 1,45 М, 1,5 М, 1,55 М, 1,6 М, 1,65 М, 1,7 М, 1,75 М, 1,8 М, 1,85 М, 1,9 М, 1,95 М, либо 2,0 М) или в диапазоне 0,5 М-1,5 М (например, 0,5 М, 0,55 М, 0,6 М, 0,65 М, 0,7 М, 0,75 М, 0,8 М, 0,85 М, 0,9 М/0,95 М, 1,0 М, 1,1 М, 1,15 М, 1,2 М, 1,25 М, 1,3 М, 1,35 М, 1,4 М, 1,45 М, либо 1,5 М) или в диапазоне 1-2 М (например, 1 М, 1,1 М, 1,15 М, 1,2 М, 1,25 М, 1,3 М, 1,35 М, 1,4 М, 1,45 М, 1,5 М, 1,55 М, 1,6 М, 1,65 М, 1,7 М, 1,75 М, 1,8 М, 1,85 М, 1,9 М 1,95 М, либо 2 М). В определенных воплощениях, концентрация небуферной соли в промывочном растворе равна 1 М и выше. В отдельных воплощениях, небуферная соль в промывочном растворе присутствует в концентрации 0,75 М, или около 0,75 М, 1,0 М, или около 1,0 М, 1,25 М, или около 1,25 М.

Уровень pH промывочных растворов согласно изобретению, как правило, выше 8,0, хотя согласно изобретению могут использоваться и более низкие pH промывочных растворов. В конкретном воплощении, уровень pH выше 8,0, предпочтительно, по меньшей мере, 8,1, более предпочтительно, по меньшей мере, 8,5 или 8,9. В одном воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов лежит в диапазоне 8,1-9,5. В ином воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов лежит в диапазоне 8,5-9,5. В другом воплощении, уровень pH одного или более промывочных растворов равен, примерно, 9.0. В другом воплощении, уровень pH одного и более промывочных растворов равен 9.0. Альтернативно, в зависимости от того, какой интересующий белок подвергается очистке, может использоваться более низкий уровень рН, к примеру, в диапазоне pH 5,0-8,0, или pH 7,5, или 7,0, или 6,5, или 5,0. В зависимости от свойств очищаемого протеина, специалист в отрасли может выбрать подходящую величину pH промывочного раствора. Соответственно, промывочный(е) раствор(ы) может(гут) содержать один или более буферов для корректировки и/или поддержания рН. Нелимитирующими примерами типичных буферов, которые могут вводиться в промывочный(е) раствор(ы), являются трис (трис(гидроксиметил)метиламин), бис-трис, бис-триспропан, гистидин, триэтаноламин, диэтаноламин, формиаты, ацетаты, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), фосфаты, HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), цитраты, MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (N-трис(гидроксиметил)метилглицин), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновая кислота), какодилат (диметиларсиновая кислота) и SSC (солевой натрий-цитратный буфер).

Промывочная комбинация аргинина и небуферной соли, описанная в данном документе, предпочтительно вводится в виде единого промывочного раствора, содержащего оба компонента. Альтернативно, два промывочных раствора могут использоваться для последовательных промывок: один раствор, содержащий аргинин или производное аргинина (предпочтительно, с высоким уровнем рН), и другой раствор, содержащий небуферную соль. Соответственно, в ином воплощении способа промывки, АХ-матрикс до элюирования интересующего белка промывают двумя промывочными растворами: первым промывочным раствором и вторым промывочным раствором. В одном воплощении, первый промывочный раствор содержит аргинин или производное аргинина (предпочтительно, с pH выше 8,0), а второй промывочный раствор содержит небуферную соль. В ином воплощении, первый промывочный раствор содержит небуферную соль, а второй промывочный раствор содержит аргинин или производное аргинина (предпочтительно, с pH выше 8,0). Примеры пригодных аргининовых производных и небуферных солей, а также предпочтительные концентрации, интервалы концентраций и условия pH промывочных растворов являются такими, как представлены выше.

Способ промывки согласно изобретению эффективен для удаления ряда примесей, включая высокомолекулярные соединения (ВМС) и белки клетки-хозяина (БКХ). Как детально описано в Примерах, промывочные растворы согласно изобретению эффективны для уменьшения содержания в элюате как ВМС, так и БКХ, при их использовании достигается высокий процентный выход интересующего белка в элюате и высокая концентрация интересующего белка в элюате. К примеру, в различных воплощениях, при использовании промывочного способа, описанного в настоящем документе, достигается процентный выход интересующего белка, превышающий 95%, более предпочтительно, превышающий 96%, еще более предпочтительно, превышающий 97%. По поводу уменьшения уровня ВМС в элюате, который может быть выражен как % ВМС в элюате, в различных воплощениях, при использовании способа промывки, описанного в данном документе, обеспечивалось % ВМС в элюате ниже 10%, либо ниже 5%, либо ниже 2,0%, либо ниже 1%, либо ниже 0,5%. По поводу уменьшения БКХ в элюате, которое может быть выражено в виде логарифмической величины уменьшения (ЛВУ), в различных воплощениях, при использовании способа промывки, описанного в данном документе, достигалась ЛВУ для БКХ в элюате, равная, по меньшей мере, 1,1, по меньшей мере, 1,3, по меньшей мере, 1,5, по меньшей мере, 2,0, по меньшей мере, 2,3, по меньшей мере, 2,5, или, по меньшей мере, 2,7.

Хотя изобретение описано в данном документе в применении к промывочному этапу при аффинной хроматографии, обыкновенным специалистам в отрасли сразу станет понятно, что и до, и после промывочного этапа производятся дополнительные действия, чтобы достичь очистки интересующего белка на матриксе аффинной хроматографии. К примеру, до этапа промывки, способы изобретения могут включать этап уравновешивания, при котором матрикс аффинной хроматографии уравновешивается с загрузочным буфером, а также этап загрузки или захвата, при котором биохимическую смесь (например, клеточный сбор), содержащую интересующий белок, загружают в АХ-матрикс. Подходящие условия для уравновешивающего и загрузочного буферов будут изменяться в зависимости от природы АХ-матрикса и очищаемого интересующего белка, и обыкновенный специалист в отрасли может легко определить эти условия по способам и информации, установленным в отрасли. Нелимитирующие примеры уравновешивающих и загрузочных буферов для очистки антител в колонках с протеином А приведены в Примерах 1 и 2. Дополнительно, после промывочного(ых) этапа(ов), описанного(ых) выше, способы по изобретению могут включать один или более дополнительных промывочных этапов с использованием обычных промывочных растворов и/или этап элюирования, при котором элюирующий буфер воздействует на АХ-матрикс, чтобы элюировать интересующий белок из матрикса. Подходящие условия для элюирующего буфера будут изменяться в зависимости от природы АХ-матрикса и очищаемого интересующего белка, и обыкновенный специалист в отрасли может легко определить эти условия по способам и информации, установленным в отрасли. Как правило, элюирование целевого белка из АХ-матрикса производят при кислом рН. Нелимитирующие примеры элюирующих буферов для очистки антител в колонках с протеином A приведены в Примерах 1 и 2.

В другом аспекте, в изобретении приведены предпочтительные способы удаления примесей из смесей, содержащих антитела, во время очистки антител при помощи протеина A. Соответственно, изобретение представляет способ получения очищенного антитела или фрагмента антитела при помощи колонки с протеином A, который включает

a) загрузку смеси, содержащей антитело или фрагмент антитела в колонку с протеином A;

b) промывку колонки с протеином A при помощи промывочного раствора, содержащего (i) аргинин-HCl с концентрацией в диапазоне 0.05-2.0 М (более предпочтительно, в диапазоне 0,05-0,85 М, наиболее предпочтительно, в диапазоне 0,1-0,5 М) и (ii) натрия хлорид в концентрации, лежащей в диапазоне 0,1-2,0 М, причем промывочный раствор удаляет примеси из колонки с протеином A; и

c) элюирование антитела или фрагмента антитела из колонки с протеином A.

Предпочтительно, чтобы промывочный раствор имел высокий уровень рН, выше 8.0. Предпочтительные концентрации и интервалы концентраций для аргинина-HCl представлены выше. К примеру, в предпочтительном воплощении, аргинин-HCl находится в концентрации около 0,25 М или в концентрации равной 0,25 М. Предпочтительные концентрации и интервалы концентраций для натрия хлорида представлены выше. К примеру, в предпочтительном воплощении, натрия хлорид находится в концентрации около 1 М или в концентрации равной 1 М. Предпочтительные значения pH и интервалы pH также являются такими, как описаны выше. К примеру, в одном воплощении, уровень pH промывочного раствора лежит в диапазоне 8,1-9,5. В другом воплощении, уровень pH промывочного раствора равен 8,5 или выше. В еще одном воплощении, уровень pH промывочного раствора равен 9,0.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует толковать ограничивающими. Содержимое всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных в настоящей заявке, прямо включены в нее во всей полноте по ссылке.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Сравнение промывочного раствора с аргинином/небуферной солью с иными промывочными растворами

В настоящем примере сравнивается эффективность различных промывочных растворов для удаления примесей из раствора, содержащего антитела, во время аффинной хроматографии. Более конкретно, производилось сравнение трех промывочных растворов: одного, не содержащего аргинина и небуферной соли с pH 5,0, второго, содержащего небуферную соль, но не содержащего аргинина с pH 7,0, и третьего, содержащего и небуферную соль, и аргинин с pH 9,0.

Осветленные супернатанты культур клеток млекопитающих, содержащие от 1,5 до 2,5 г/л антител, собирали способом глубокой фильтрации и очищали на АЖХ колонке, в частности, колонке с протеином A (GE Healthcare), согласно условиям, приведенным ниже в Таблице 1.

Таблица 1
Операционные условия для колонок с протеином A
Этап Буфер ОК** Bp.уд.*(мин)
Уравновешивание 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 6 4
Загрузка Бесклеточный сбор сколько необходимо 4
Промывка 1 Различные (см. Таблицу 2) 3 4
Промывка 2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 3 4
Элюирование ОПМ (очистка по месту) 20 мМ уксусной кислоты 0,1 MNaOH 4 4
3 4
Хранение 20 мМ уксусной кислоты/натрия ацетата, 2% бензилового спирта, рН 5,1 4 4
* Bp.уд.=время удерживания; ** : ОК, объем колонки

Уравновешенную колонку загружали осветленным сбором и вначале промывали промывочным раствором 1, описанным в Таблице 2 ниже, затем промывали второй раз промывочным раствором 2 (20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0), после чего элюировали при низком рН. Элюат анализировали на концентрацию антител способом аналитической АЖХ, на ВМС/НМС способом аналитической эксклюзионной хроматографии (ЭХ), на содержание БКХ-способом иммуноферментного анализа, разработанного для той же клеточной линии. Различные промывные растворы, сравнивавшиеся на первом промывании, определены ниже в Таблице 2.

Таблица 2
Варианты промывочных растворов для первой промывки
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 20 мМ натрия ацетата, 6 мМ уксусной кислоты pH 5,0 W1-A5
2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, pH 7.0 W2-N7
3 50 мМ трис, 250 мМ аргинин-HCl, 1 М NaCl, NaOH * pH 9,0 W3-Arg/N9
* pH корректировали 32% раствором NaOH

Процентные выходы при очистке с протеином A четырех различных моноклональных антител (mAb) с использованием трех различных промывочных растворов согласно Таблице 2, показаны ниже в Таблице 3.

Таблица 3
Процентные выходы различных антител с использованием различных промывочных растворов
Промывочный раствор
Антитело W1-A5 W2-N7 W3-Are/N9
mAb-Qg 81,2 101,3 97,8
mAb-By 86,6 96,5 97,6
mAb-Bp 95,7 92,5 95,8
mAb-Va 96,5 97,9 98,6

В Таблице 3 продемонстрировано, что промывка как с W1-A5 (не содержащим ни небуферной соли, ни аргинина, с pH 5,0), так и с W2-N7 (содержащим небуферную соль, но не содержащим аргинин, с pH 7,0) приводит к флуктуациям в количестве восстановленных антител, в зависимости от очищаемого антитела. Более специфически, промывание с W1-A5 приводит к выходам, флуктуирующим между 81 и 96%, промывание с W2-N7 приводит к выходам, флуктуирующим между 92 и 101%. И наоборот, промывание с W3-Arg/N9, содержащим как небуферную соль, так и аргинин, с pH 9,0, приводит к постоянно высоким выходам, превышающим 96%, для всех четырех антител, подвергнутых очистке.

Концентрации в элюате (в г/л) после очистки с протеином A четырех различных моноклональных антител (mAb) с использованием трех различных промывочных растворов согласно Таблице 2, приведены ниже в Таблице 4.

Таблица 4
Концентрации различных антител в элюатах при использовании различных промывочных растворов
Промывочный раствор
Антитело W1-A5 W2-N7 W3-Are/N9
mAb-Qg 17,3 17,7 28,4
mAb-By 12,6 19,8 21,0
mAb-Bp 23,5 17,2 21,2
mAb-Va 15,1 14,3 16,4

В Таблице 4 продемонстрировано, что концентрация в элюате также зависит от промывочного буфера, используемого при АЖХ. Для трех из четырех моноклональных антител (моноклональные антитела Qg, By и Va), при промывании с W3-Arg/N9 достигались более высокие элюатные концентрации, нежели при промывании с W1-A5 или W2-N7. Средняя элюатная концентрация для четырех антител была самой низкой после промывания с W1-A5 (17,1 г/л), затем - после промывания с W2-N7 (17,3 г/л), самой высокой - после промывания с W3-Arg/N9 (21,7 г/л).

Данные об уменьшении содержания белков клетки-хозяина (БКХ) в элюатах после очистки с протеином A четырех различных моноклональных антител (mAb) с использованием трех различных промывочных растворов согласно Таблице 2, приведены ниже в Таблице 5. Уменьшение содержания БКХ выражалось в виде логарифмической величины уменьшения (ЛВУ) относительно величин в клеточном сборе.

Таблица 5
Уменьшение содержания БКХ в элюате для различных антител при использовании различных промывочных растворов
Промывочный раствор
Антитело W1-A5 W2-N7 W3-Are/N9
mAb-Qg 1,50 1,64 2,75
mAb-By 1,40 1,68 2,15
mAb-Bp 1,77 1,88 2,53
mAb-Va 0,94 0,99 1,33

На основании данных, приведенных в Таблице 5, можно установить четкий порядок эффективности трех промывочных буферов для удаления примесей. Самое низкое уменьшение уровня БКХ наблюдалось при промывке раствором W1-A5 с низким рН, следующим по эффективности промывки оказался солевой раствор W2-N7; наиболее высокий показатель удаления наблюдался для комбинированного буфера аргинин-NaCl с pH 9,0 (W3-Arg/N9). При выражении степени извлечения в логарифмическом виде, при промывке с W1-A5 этот показатель достигал в среднем 1.4 log, при промывке с W2-N7 - 1,55 log, а наибольшая степень извлечения в 2,2 log достигалась с W3-Arg/N9.

Данные об уменьшении содержания высокомолекулярных соединений (ВМС) в элюатах после очистки с протеином А четырех различных моноклональных антител (mAb) с использованием трех различных промывочных растворов согласно Таблице 2, приведены ниже в Таблице 6. Уровень ВМС в элюатах выражался в процентном соотношении (%) от общего уровня белка в элюатах.

Таблица 6
Уровень ВМС в элюате для различных антител при использовании различных промывочных растворов
Промывочный раствор
Антитело W1-A5 W2-N7 W3-Are/N9
mAb-Qg 4,7 3,8 0,8
mAb-By 2,1 0,7 0,4
mAb-Bp 10,4 10 9,8
mAb-Va 4,1 2,9 1,6

В Таблице 6 показано, что уровень ВМС для 4 различных моноклональных антител очень гетерогенен и что очистка от ВМС зависит от моноклонального антитела. По совокупности данных, промывочный раствор W1-А5 был наименее эффективен. Более хорошие результаты были получены с промывочным раствором W2-N7, самые низкие уровни ВМС в АЖХ элюате постоянно определялись для промывочного раствора W3-Arg/N9. Для трех моноклональных антител (моноклональные антитела Qg, By и Va) было отмечено 2,6-5,9-кратное уменьшение уровня ВМС при сравнении промывки с W1-A5 и промывки с W3-Arg/N9, в то время как для mAb-Bp наблюдалось лишь незначительное уменьшение.

Сводные экспериментальные данные из Таблиц 3-6 выше представлены ниже в Таблице 7. Заштрихованные строки относятся к составу сбора.

Пример 2: Сравнение различных аргининовых/солевых промывочных растворов

В данном примере сравнивается эффективность дополнительных промывочных растворов, содержащих различные количества небуферной соли и/или аргинина при различных уровнях pH при удалении примесей во время аффинной жидкостной хроматографии (АЖХ). Хроматографические условия, использованные в данном Примере, определены в Таблице 8 ниже.

Таблица 8
Операционные условия для колонки с протеином A
Этап Буфер ОК** Bp.уд.*(мин)
Уравновешивание 1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0 3 4
Уравновешивание 2 Аналогично промывочному буферу 1 3 4
Загрузка Бесклеточный сбор сколько необходимо 4
Промывка 1 Различные (см. Таблицу 9) 6 4
Промывка 2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0 3 4
Элюирование 50 мМ уксусной кислоты 5 4
ОПМ (очистка по месту) 0,1 М NaOH 3 4
Хранение 20 мМ уксусной кислоты/натрия ацетата, 2% бензилового спирта, рН 5,1 5 4
* Bp.уд.=время удерживания; **: ОК, объем колонки

Промывочные растворы, сравнивавшиеся в настоящем Примере, приведены в Таблице 9.

Таблица 9
Дополнительные варианты промывочных растворов для первой промывки
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, рН 7.0 W2-N7
2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 150 мМ NaCl, рН 7.0 W4-0.15M N7
3 250 мМ аргинин-HCl, ~18* мМ Tris-HCl, рН 8.0 W5-Arg8
4 ~18* мМ трис-HCl, 250 мМ аргинин-HCl, 1 М NaCl, pH 8,0 W6-Arg/N8
* Точная концентрация не измерялась (1 М основания трис [(гидроксиметил) аминометан] использовалось для корректировки pH)

При помощи четырех промывочных растворов, описанных в Таблице 9, можно прямым образом сравнить промывочный раствор с низким содержанием небуферной соли (W4-0,15M N7, содержащий 150 мМ NaCl) с промывочным раствором с высоким содержанием небуферной соли (W2-N7, содержащий 1М NaCl), а также сравнить промывочный раствор, содержащий только аргинин и имеющий pH 8,0 (W5-Arg8) с промывочным раствором, содержащим комбинацию небуферной соли и аргинина при основном pH (W6-Arg/N8).

Процентные выходы, процентное содержание ВМС в элюате, понижение уровня БКХ (выраженное в виде ЛВУ) при очистке моноклональных антител mAb-By с использованием четырех различных промывочных растворов согласно Таблице 9, а также комбинации однократной промывки раствором аргинина (W5-Arg8) и однократной промывки раствором соли с высоким содержанием (W2-N7), показаны ниже в Таблице 10.

Таблица 10
Показатели очистки для mAb-By при использовании различных промывочных растворов
Промывочный раствор
Показатель очистки W4-0.15M N7 W2-N7 LW* W5-Are8 W5-Arg8, W2-N7 W6-Are/N8
Выход (%) 98,4 100 99,3 97,4 97,9
ВМС (%) 1,6 0,9 0,5 0,3 0,3
БКХ (ЛВУ) 1,81 2,19 2,35 2,57 2,7
* LW=промывка осуществлялась для 12 объемов колонки вместо 6.

Из Таблицы 10 следует, что процентный выход антител превышает 97% при всех условиях промывки. Кроме того, наиболее эффективными для удаления примесей как БКХ, так и ВМС, являются промывочный раствор, содержащий и аргинин, и небуферную соль с основным pH (W6-Arg/N8) или комбинация промывочного раствора, содержащего аргинин, с основным pH (W5-Arg8) и раствора с высоким уровнем небуферной соли (W2-N7).

При промывании физиологическим промывочным раствором, W4-0.15M N7, уровень БКХ понижается в 64 раза (1.81 log) относительно исходного материала, загружаемого в колонку. Наоборот, при промывании комбинацией небуферной соли и аргинина с pH 8 (W6-Arg/N8) наблюдается уменьшение содержания в 498 раз (2.7 log).

Уменьшение уровня ВМС характеризуется аналогично. При промывании промывочным раствором, содержащим 20 мМ натрия фосфата, 150 мМ NaCl, pH 7,0 (W4-0,15M N7) в элюате отмечается 1,6% ВМС, в то время как при промывании комбинацией небуферной соли и аргинина (W6-Arg/N8) эта величина ниже более чем в 5 раз.

Пример 3: Сравнение промывочных растворов с основным pH и физиологическим рН

В данном примере проанализировано влияние pH промывочных растворов на удаление БКХ и ВМС и продемонстрировано превосходство основных условий рН. Клеточный сбор mAb-Va со слегка различными уровнями БКХ и ВМС подвергали аффинной жидкостной хроматографии (АЖХ) в условиях, определенных в Таблице 8 Примера 2.

Промывочные растворы, сравнивавшиеся в настоящем Примере, приведены в Таблице 11.

Таблица 11
Промывочные растворы с различными величинами pH для первой промывки (для mAb-Va)
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, pH 7,0 W2-N7
2 13,2 мМ Na2HPO4, 250 мМ аргинин HCl, 1 М NaCl, pH 7,0 W6-Arg/N7
3 ~289 мМ* трис, 250 мМ аргинин-HCl, 1 М NaCl, pH 8,9 W3b-Arg/N8,9
* Для корректировки pH NaOH не использовался

Процентные выходы, процентное содержание ВМС в элюате, понижение уровня БКХ (выраженное в виде ЛВУ) при очистке моноклональных антител mAb-Va с использованием трех различных промывочных растворов согласно Таблице 11, показаны ниже в Таблице 12.

Таблица 12
Сравнение воздействия растворов с физиологическим pH и с основным pH на показатели очистки для mAb-Va
Промывочный раствор
Показатель очистки W2-N7 W6-Are/N7 W3b-Are/N8,9
Выход (%) 100,5 99,4 99
ВМС (%) 2,4 1,6 1,4
БКХ (ЛВУ) 0,87 1,48 1,61

Промывочный раствор, содержащий только небуферную соль в высокой концентрации, W2-N7, служит в качестве базовой контрольной промывки для того, чтобы установить способность удалять БКХ/ВМС комбинацию растворов с аргинином/небуферной солью при, примерно, физиологическом pH 7.0 (промывочный раствор W6-Arg/N7) и основном pH 8,9 (промывочный раствор W3b-Arg/N8,9). При высоком уровне pH (рН 8.9), в сравнении с более низким уровнем pH (рН 7,0), наблюдалось небольшое, но отчетливое уменьшение уровней ВМС с 1,6 до 1,4%. Более очевидным было влияние на удаление БКХ. При промывке раствором с более низким уровнем pH (рН 7,0), содержание БКХ уменьшалось в 1,48 log, в то время как при промывании раствором с более высоким уровнем pH (рН 8,9) эта величина уменьшалась в 1,61 log, что подчеркивает преимущество промывки с высоким pH для удаления примесей.

Пример 4: Сравнение промывочного раствора с аргинином/солью с иными промывочными растворами

В этом примере сравниваются промывочные растворы с аргинином/небуферной солью и иные промывочные растворы, содержащие твин-80, аминокислоты, отличные от аргинина или содержащие трис в высокой концентрации. В данном примере проанализировано влияние pH промывочных растворов на удаление БКХ и ВМС и продемонстрировано превосходство основных условий рН. Клеточный сбор mAb-Va со слегка различными уровнями БКХ и ВМС подвергали аффинной жидкостной хроматографии (АЖХ) в условиях, определенных в Таблице 1 Примера 1.

Промывочные растворы, сравнивавшиеся в настоящем Примере, приведены ниже в Таблице 13.

Таблица 13
Промывочные растворы с различными компонентами для первого промывания
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, pH 7,0 W2-N7
2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, pH 7,0 W2-N7 LW*
3 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, 0,1% (масс,/об,) Твин-80, pH 7,0 W7-N7-T80
4 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, 0,1 М глицина, трис** W8-N7-0.1 MG
5 500 мМ трис, pH 8,9 W9-0,5 М трис 8,9 LW*
6 289 мМ трис, 250 мМ аргинина-HCl, 1 М NaCl, pH 8,9 W3b-Arg/N8,9
* LW=промывка осуществлялась для 12 объемов колонки вместо 6. ** pH корректировался 1М базовым раствором, концентрацию не определяли.

Процентные выходы, процентное содержание ВМС в элюате, понижение уровня БКХ (выраженное в виде ЛВУ) при очистке моноклональных антител mAb-Va с использованием шести различных промывочных растворов согласно Таблице 13 показаны ниже в Таблице 14.

Таблица 14
Сравнение влияния компонентов промывочных растворов на показатели очистки mAb-Va
Промывочный раствор
Показатель очистки W2-N7 W2-N7 LW* W7-N7-Т80 W8-N7-01MG W9-0,5 М трис 8,9 LW* W3b-Arg/N8.
9
Выход (%) 100,5 100,9 99 98,7 98,1 99
ВМС (%) 2,4 2,3 2,5 3,1 3 1,4
БКХ (ЛВУ) 0,87 1,42 1,34 1,24 1,07 1,61
* LW=промывка осуществлялась для 12 объемов колонки вместо 6.

В Таблице 14 продемонстрировано, что промывочный раствор аргинина/небуферной соли с высоким pH (W3b-Arg/N8,9) наиболее эффективно удаляет как ВМС, так и БКХ, в сравнении с иными промывочными растворами, содержащими только небуферную соль в высокой концентрации (W2-N7), твин-80 (W7-N7-T80), иные аминокислоты, например глицин (W8-N7-0,lMG) или высокие концентрации трис (W9-0,5 М Tris 8,9 LW).

Пример 5: Сравнение промывочного раствора с аргинином/небуферной солью, обладающего высоким рН, с растворами, содержащими только соль при низком и высоком рН

В этом примере сравнивается эффективность промывочного раствора аргинина/небуферной соли, обладающего высоким рН, с раствором небуферной соли при высоком и низком рН. Более конкретно, оценивались и сравнивались следующие условия: (1) промывочный раствор небуферной соли с низким pH (а именно 7.0), (2) промывочный раствор небуферной соли с высоким pH (а именно 9.0) и (3) промывочный раствор небуферной соли и аргинина с высоким pH (а именно 9.0). Дополнительно, было проанализировано влияние аргинина на удаление ВМС, НМС, БКХ; было показано, что использование раствора небуферной соли в комбинации с аргинином при основном pH особенно эффективно и предпочтительно. Промывочные растворы, сравнивавшиеся в настоящем Примере, приведены ниже в Таблице 15.

Таблица 15
Промывочные растворы с различными компонентами для первого промывания
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 20 мМ NaH2P04/Na2HP04, 1000 мМ NaCl, рН 7,0 W2-N7
2 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, 1000 мМ NaCl, NaOH, pH 9,0* W10-N9
3 50 мМ трис, 250 мМ аргинина-HCl, 1 М NaCl, NaOH, pH 9,0* W3-Arg/N9
* pH корректировали до 9,0 при помощи 32% раствора основания NaOH

Клеточный сбор mAb-By с различными уровнями БКХ и ВМС подвергали аффинной жидкостной хроматографии (АЖХ) в условиях, определенных в Таблице 1 Примера 1 с минимальными отклонениями, как описано ниже в Таблице 16.

Таблица 16
Операционные условия для колонки с протеином A
Этап Буфер ОК Bp.уд.** (мин) Комментарии
Уравновешивание 20 мМ NaH2-/Na2H-PO4, pH 7.0 5/6* 4
Загрузка Бесклеточный сбор 4 36 мг/мл смолы
Промывка 1 см. Таблицу 15 6 4
Промывка 2 эквивалентный 3 4
Элюирование 20 мМ уксусной кислоты, pH tq*** 5/4* 4 100-100 мAU при 280 нм
ОПМ (очистка по месту) 0.1 MNaOH 4 4
Хранение 20 мМ Na-ацетата, 2% бензиловый спирт, pH 5,1 5/4* 4
*, для прогона с промывочным раствором W3-Arg/N9, для уравновешивания использовалось 6 ОК, для элюирования и хранения - 4 ОК. **, Bp.уд.=время удерживания. ***, tq=как есть.

При очистке mAb-By с использованием трех различных промывочных растворов, указанных в Таблице 15, определялись следующие параметры: (1) концентрация антител после ЭХ (г/л), (2) процентное содержание ВМС и НМС, (3) уровень БКХ, выраженный в нг/мг моноклонального антитела и (4) процентный выход после АЖХ в АЖХ-элюате. Результаты представлены ниже в Таблице 17.

Таблица 17
Сравнение влияния компонентов промывочных растворов на показатели очистки mAb-By
Промывочный раствор Конц. (г/л) ВМС (%) НМС (%) БКХ (нг/мг MAb) Выход (%)
Исходный материал 2,32 не применимо не применимо 370962 (100)
W2-N7 20,00/19,84* 1,3/0,9* 0,4/0,4* 9315/6783* 100,8/не определено*
W10-N9 20,28/20,10* 1,2/1,0* 0,5/0,5* 8984/7884* 101,9/не определено*
W3-Arg/N9 20,55 0,8 0,1 2110 100,3/не определено*
*, вторая величина соответствует второму замеру после фильтрации через 0.2 мкм фильтр.

В Таблице 17 более точно продемонстрировано, что промывочный раствор аргинина/небуферной соли с высоким рН, равным 9,0 (W3-Arg/N9), наиболее эффективно удаляет ВМС, НМС и БКХ, в сравнении с иными промывочными растворами, содержащими только небуферную соль (W2-N7 и W10-N9), независимо от их рН. В частности, при промывании промывочным раствором с аргинином/небуферной солью с pH 9,0, отмечалось уменьшение содержания БКХ, по меньшей мере, в 3 раза, НМС - по меньшей мере, в 4 раза, в сравнении с промыванием раствором, содержащим только небуферную соль с pH 7 (W2-N7) или рН9 (W10-N9).

Пример 6: Сравнение интервалов концентраций аргинина и NaCl, а также pH у промывочных растворов с аргинином/солью

В данном примере определялась эффективность удаления примесей во время аффинной жидкостной хроматографии (АЖХ) при использовании растворов с дополнительными значениями pH и концентрациями аргинина и небуферной соли. Промывочные растворы, сравнивавшиеся в настоящем Примере, приведены ниже в Таблице 18.

Таблица 18
Промывочные растворы с различными компонентами для первого промывания
Раствор Буфер Сокращение, принятое для буфера
1 0,75 М NaCl, 250 мМ L-аргинина/трис pH 8,5* Wll-Arg/N8,5
2 1,25 М NaCl, 250 мМ L-аргинина/трис, pH 9,5* W12-Arg/N9,5
3 50 мМ трис, 500 мМ аргинина-HCl, 1 М NaCl, NaOH, pH 9,0* W13-Arg/N9
4 10 мМ трис, 100 мМ аргинина-HCl, 1 М NaCl, NaOH, pH 9,0* W14-Arg/N9**
*, pH корректировали 8 М NaOH; **, буфер был получен путем 5-кратного разбавления W13-Arg/N9 и доведения pH до 9,0 при помощи 8 М NaOH

Клеточный сбор mAb-By со слегка различными уровнями БКХ и ВМС подвергали АЖХ (в условиях, определенных в Таблице 1 Примера 1) с минимальными отклонениями, как описано ниже в Таблице 19.

Таблица 19
Операционные условия для колонки с протеином A (с вр. уд. 4 минуты)+
Этап Буфер ОК Комментарии
Уравновешивание 20 мМ NaH2-/Na2H-PO4, рН 7,0 6
Загрузка Бесклеточный сбор 38 мг/мл смолы
Промывка 1 См. Таблицу 18 4,5*/7,5**/6****
Промывка 2 эквивалентный 3
Элюирование 50 мМ уксусной кислоты, рН 3,5 */*/*** или 50 мМ уксусной кислоты, pH 3,8****/***** 4/6**** 500-500 мAU/см при 280 нм
ОПМ (очистка по месту) 0,1 М NaOH 4/3**** восходящим потоком
Хранение 20 мМ Na-ацетата, 2% бензиловый спирт, pH 5,1 4 восходящим потоком
*, для прогона с промывочным раствором W11-Arg/N8,5; **, для прогона с промывочным раствором W12-Arg/N9,5; ***, pH корректировали 1 М Tris; ****, для прогона с промывочными растворами W13-Arg/N9 и W14-Arg/N9; *****, pH корректировали 8 М NaOH. +Вр. уд.=время удерживания.

При очистке mAb-By с использованием двух различных промывочных растворов, указанных в Таблице 18, определялись следующие параметры: (1) концентрация антител после ЭХ (г/л), (2) процентное содержание ВМС и НМС (%), (3) уровень БКХ, выраженный в нг/мг моноклонального антитела и (4) процентный выход после АЖХ в АЖХ-элюате. Данные результаты представлены ниже в Таблице 20.

Таблица 20
Эффективность промывочных буферов с различными концентрациями NaCl и уровнями pH при очистке mAb-By (два разных исходных материала)
Примененный промывочный раствор Концентрация (мг/мл) (ЭХ) ВМС (%) НМС (%) БКХ (нг/мг) Выход (%) (АЖХ)
Исходный материал 2,6 не применимо не применимо 602398 (100)
W12-Arg/N9,5 27,35 2,1 0,3 4637 100,4
Wll-Arg/N8,5 22,42 2,1 0,5 9922 100,2
Исходный материал 2,91 не применимо не применимо 311761 (100)
W13-Arg/N9 16,15 1,7 0,1 1367 98,7
W14-Arg/N9 16,31 1,7 0,1 3405 95,9

Данные, представленные в Таблице 20, подчеркивают эффективность промывочного раствора с аргинином/небуферной солью, имеющего высокий рН, для использования в аффинной жидкостной хроматографии. При промывании (1) раствором аргинина и небуферной соли в низкой концентрации (0,75 М NaCl) при pH 8,5, (2) раствором аргинина и небуферной соли в более высокой концентрации (1,25 М NaCl) при pH 9,5 или (3) раствором, содержащим аргинин как в низкой (например, 100 мМ), так и в высокой (например, 500 мМ) концентрации, обеспечивается выраженное понижение уровня БКХ (в среднем, уменьшение >2 log), без влияния на выход продукта.

1. Способ получения очищенных антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc или слитый с Fc белок, с использованием матрикса аффинной хроматографии, с которым связаны указанные антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc или слитый с Fc белок, где способ включает:
(a) осветление смеси, содержащей антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc или слитый с Fc белок;
(b) загрузку указанной смеси на матрикс аффинной хроматографии, содержащий связывающий иммуноглобулины белок;
(c) промывку указанного матрикса аффинной хроматографии промывочным раствором, содержащим аргинин в диапазоне концентраций 0,05-0,85 М и галогеновую соль в диапазоне концентраций 0,1-2,0 М, где указанный промывочный раствор имеет рН в диапазоне 8,0-9,5 и удаляет примеси из матрикса аффинной хроматографии; и
(d) элюирование антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc или слитый с Fc белок, с матрикса аффинной хроматографии при низком рН.

2. Способ по п. 1, где указанный матрикс аффинной хроматографии включает белок А, белок G, белок A/G или белок L.

3. Способ по п. 2, где указанный матрикс аффинной хроматографии включает белок А.

4. Способ по п. 1, где указанная галогеновая соль представляет собой хлорид натрия.

5. Способ по п. 1, где указанные антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc, представляют собой слитый с Fc белок.

6. Способ по п. 1, где концентрация аргинина составляет приблизительно 0,25 М.

7. Способ по п. 1, где указанный аргинин представляет собой аргинин-HCl.

8. Способ по п. 1, где концентрация галогеновой соли составляет приблизительно 1 М.

9. Способ по п. 1, где рН указанного промывочного раствора находится в диапазоне приблизительно 8,5-9,5.

10. Способ по п. 9, где рН указанного промывочного раствора составляет 9,0.

11. Способ по п. 1, где указанные примеси включают высокомолекулярные соединения.

12. Способ по п. 1, где указанные примеси включают белки клетки-хозяина.

13. Способ по п. 1, где концентрация галогеновой соли находится в диапазоне 0,5-2,0 М.

14. Способ получения очищенных антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc, с использованием колонки на основе белка А, где способ включает:
(a) осветление смеси, содержащей антитело или фрагмент антитела, содержащие область Fc;
(b) загрузку указанной смеси на колонку на основе белка А; и
(c) промывку указанной колонки на основе белка А промывочным раствором, содержащим аргинин в диапазоне концентраций 0,05-0,85 М и хлорид натрия в диапазоне концентраций 0,1-2,0 М, где указанный промывочный раствор имеет рН в диапазоне 8,0-9,5 и удаляет примеси из колонки на основе белка А; и
(d) элюирование указанных антитела или фрагмента антитела, содержащих область Fc, с указанной колонки на основе белка А.

15. Способ по п. 14, где концентрация аргинина составляет приблизительно 0,25 М.

16. Способ по п. 14, где указанный аргинин представляет собой аргинин-HCl.

17. Способ по п. 14, где концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 1 М.

18. Способ по п. 14, где рН указанного промывочного раствора находится в диапазоне приблизительно 8,5-9,5.

19. Способ по п. 18, где рН указанного промывочного раствора составляет 9,0.

20. Способ по п. 14, где указанные примеси включают высокомолекулярные соединения.

21. Способ по п. 14, где указанные примеси включают белки клетки-хозяина.

22. Способ по п. 14, где концентрация галогеновой соли находится в диапазоне 0,5-2,0 М.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области генетической инженерии. Предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты для терапии кур или для поддержания, стимуляции или усиления у них иммунного ответа, выбранная из числа молекул, кодирующих лямбда-интерферон (IFN-λ) кур, представленных в SEQ ID NO: 1 или 3, или молекул, представляющих собой нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2 или 4, либо последовательность нуклеиновой кислоты, способной гибридизоваться с SEQ ID No: 1 или 3 в строгих условиях, а также предложены выделенный полипептид, терапевтический способ и применение для терапии кур.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложено терапевтическое антитело и терапевтический фрагмент антитела для повышения продукции тромбоцитов, включающие пептид-миметик тромбопоэтина (ТРО), содержащий последовательность IEGPTLRQWLAARA и встроенный как дополнение к С-концу константной области легкой цепи и/или в положении менее 20 аминокислот ниже С-конца шарнирной области тяжелой цепи.

Изобретение относится к области получения и выделения однодоменных молекул (SDAB). Описан способ выделения или очистки SDAB молекулы, которая представляет собой трехвалентную молекулу нанотела ATN-103, направленную на TNFα и HAS, из смеси, содержащей указанную SDAB молекулу и одно или более загрязняющих веществ.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описывается способ получения препарата антитела или его антигенсвязывающей части со сниженным содержанием белка клетки-хозяина (HCP).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым IL-17-ингибирующим полипептидам, соответствующим слитым белкам, к композициям и применению их в медицинских целях.

Настоящее изобретение относится к новой сепарационной матрице, содержащей лиганд, присоединенный к основе. Матрица может быть использована при очистке белков, где белок представляет собой антитело, фрагмент антитела или слитый белок, содержащий антитело.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлены вариантные иммуноглобулины с одной или несколькими аминокислотными модификациями в Fc-участке, которые имеют увеличенное время полужизни, и способы их применения.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ получения антител с использованием иммуноадъюванта.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой состав для получения медикамента, содержащий антитело, у которого снижена склонность к агрегации, за счет введения, по меньшей мере, одной мутации, снижающей агрегацию, выбираемой из группы, состоящей из остатков мотива агрегации - 1:181 (CH1); мотива агрегации 4:252 (CH2) и 253 (CH2); мотива агрегации 5:282 (CH2); мотива агрегации 6:291 (CH2); мотива агрегации 7:296 (CH2); мотива агрегации 8:308 (CH2) и 309 (CH2); мотива агрегации 9:328 (CH2), 329 (CH2), 330 (CH2) и 331 (CH2); мотива агрегации 10:395 (CH3), 396 (CH3), 397 (CH3), 398 (CH3) и 404 (CH3); мотива агрегации 11:443 (CH3); и мотива агрегации 14:201 (CL).

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено применение Fc области с мутацией 434S и 428L для увеличения периода полужизни in vivo полипептида, содержащего указанную область.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения рекомбинантного белка SAV-RGD, специфически узнающего клетки меланомы человека, предусматривает культивирование в питательной среде штамма Escherichia coli MG1655/pSAV-RGD, получение периплазматической фракции клеток указанного штамма, очистку рекомбинантного белка ионообменной хроматографией с последующей ультрафильтрацией и лиофилизацией.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченых антител, и может быть использовано для диагностики. Антитела конструируют с заменой одной или нескольких аминокислот исходного антитела на не являющиеся перекрестно связанными, высокореакционноспособные цистеиновые аминокислоты.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы получения биологически активного ботулинического нейротоксина с использованием хроматографии, по существу без использования продуктов животного происхождения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выявления присутствия двух или более представляющих интерес белков с известными аминокислотными последовательностями в образце растительного происхождения (варианты) и способу сохранения генотипа сорта трансгенного растения.

Изобретение относится к способу получения иммуноглобулинов подкласса IG1 и IG4 из супернатантов культивированных клеток. За счет подведения значения рН в кислую сторону и последующего инкубирования закисленного раствора нуклеиновые кислоты и белки клетки хозяина могут преципитировать, но искомый полипептид остается в растворе.

Изобретение касается применения композиции, включающей гидролизат горохового белка и/или пептид для получения композиции для лечения и/или профилактики инфекции Helicobacter pylori (варианты), а также таких композиций (варианты).

Изобретение относится к способу получения множества продуктов из биомассы видов водных растений. Получают биомассу, разрушают ее, разделяют указанную биомассу с получением сока и твердой фазы, фильтруют и осветляют сок.
Изобретение относится к биотехнологии получения гемостатических препаратов. Предложен способ выделения очищенного концентрата фибриногена, свободного от вирусов и балластных белков.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу выделения проурокиназы М5 из телец включения, содержащих данную проурокиназу. Способ включает стадии разрушения телец включения, ренатурации и очистки белка.

Изобретение относится к области получения и выделения однодоменных молекул (SDAB). Описан способ выделения или очистки SDAB молекулы, которая представляет собой трехвалентную молекулу нанотела ATN-103, направленную на TNFα и HAS, из смеси, содержащей указанную SDAB молекулу и одно или более загрязняющих веществ.
Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к способу получения препарата интерлейкина-2, препарату интерлейкина-2, полученному указанным способом, и фармацевтическому препарату, содержащему указанный препарат интерлейкина-2. Культивируют штамм Saccharomyces cerevisiae - продуцент интерлейкина-2 в питательной среде в течение от 36 до 50 часов при аэрации от 0,2 до 0,8 литра воздуха в минуту на 100 литров среды. Получают осадок дрожжевых клеток центрифугированием или фильтрованием. Механически разрушают клетки в течение от 15 минут до 40 минут. Очищают осадок от примесных дрожжевых липидов и белков промывкой н-бутанолом. Экстрагируют целевой белок и проводят его хроматографическую очистку. Изобретения позволяют получать препарат интерлейкина-2 с высокими показателями чистоты, выхода и удельной активности и применять его в фармацевтических иммуномодулирующих композициях. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 12 пр.
Наверх