Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов



Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов
Способ получения пэгилированных олигонуклеотидов

 


Владельцы патента RU 2564855:

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НОВАМЕДИКА" (RU)

Настоящее изобретение относится к способу получения пэгилированного олигонуклеотида, который может быть использован для получения биологически активных веществ. Способ включает: (a) синтез непэгилированного олигонуклеотида на твердом носителе, (b) отщепление непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятие защитных групп с олигонуклеотида, (c) обессоливание непэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрации, (d) пэгилирование непэгилированного олигонуклеотида для получения пэгилированного олигонуклеотида, (e) очистку пэгилированного олигонуклеотида с использованием анионообменной ВЭЖХ, (f) обессоливание и дополнительную очистку пэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрующей мембраны, которая имеет порог молекулярной массы от 10 кДа до 30 кДа, где ионообменную очистку непэгилированного олигонуклеотида не осуществляют между стадиями (b) и (с). Предложенный способ отличается улучшенной эффективностью. 9 з.п. ф-лы, 10 ил., 11 табл., 2 пр.

 

[0001] По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с серийным № 61/479226, поданной 26 апреля 2011 года, которая, таким образом, включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки создания изобретения

[0002] Нуклеиновые кислоты традиционно рассматривают, прежде всего, в качестве играющих информационную роль в биологических процессах. В последние десятилетия стало ясно, что трехмерная структура нуклеиновых кислот может давать им способность взаимодействовать и регулировать белки. Такие лиганды из нуклеиновых кислот или «аптамеры» представляют собой короткие ДНК или РНК олигомеры, которые могут связываться с заданным лигандом с высокой аффинностью и специфичностью. Как класс трехмерные структуры аптамеров достаточно вариабельны для того, чтобы позволить аптамерам связываться и действовать в качестве лигандов практически для любого химического соединения, мономерного или полимерного. Аптамеры возникли в качестве многообещающих новых диагностических и терапевтических соединений, в частности, при лечении рака и регуляции свертывания крови.

[0003] Множество сторонних производителей подало и получило патенты, покрывающие идентификацию, производство и применение аптамеров. Gold'y и Tuerk'y в основном приписывают первую разработку способа SELEX для выделения аптамеров, и их способ описан во многих патентах США, включая патенты США 5670637, 5696249, 5843653, 6110900 и 5270163. Thomas Bruice et al. сообщали о способе получения аптамеров в патенте США 5686242, который отличается от исходного способа SELEX, о котором сообщали Tuerk и Gold, поскольку в нем используют строго случайные олигонуклеотиды во время скрининга последовательности. Олигонуклеотиды, скрининг которых проводили в патенте '242, не содержат олигонуклеотидные праймеры, которые присутствуют в олигонуклеотидах, скрининг которых проводили в способе SELEX.

[0004] Sullenger, Rusconi, Kontos и White в WO 02/26932 описывают РНК аптамеры, которые связываются с факторами свертывания, семейством факторов транскрипции E2F, Ang1, Ang2 и их фрагментами или пептидами, факторами транскрипции, аутоиммунными антителами и рецепторами клеточной поверхности, которые можно использовать при модуляции гемостаза и других биологических событиях. См. также Rusconi et al, Thrombosis and Haemostasis 83:841-848 (2000), White et al, J. Clin Invest 106:929-34 (2000), Ishizaki et al, Nat Med 2:1386-1389 (1996), и Lee et al, Nat. Biotechnol. 15:41-45 (1997)).

[0005] Для того, чтобы аптамер был пригоден для использования в качестве терапевтического средства, предпочтительно его синтез должен быть не дорогостоящим, безопасным и стабильным in vivo. РНК и ДНК аптамеры, состоящие из всех рибозных или дезоксирибозных нуклеотидов без модификаций фосфодиэфирного остова, как правило, не стабильны in vivo поскольку они подвержены расщеплению нуклеазами. Устойчивость к расщеплению нуклеазами можно значительно увеличить посредством встраивания модифицирующих групп в положении 2'.

[0006] В дополнение к выведению нуклеазами, олигонуклеотидные терапевтические средства подлежат выделению через почечную фильтрацию. По существу, устойчивый к нуклеазе олигонуклеотид, введенный внутривенно, обычно проявляет время полужизни in vivo <10 мин, если фильтрация не может быть блокирована. Это можно выполнять или посредством облегчения быстрого распределения из кровотока в ткани или посредством повышения кажущейся молекулярной массы олигонуклеотида выше порога эффективного размера для клубочка. Конъюгация низкомолекулярных терапевтических средств с полиалкиленоксидным полимером (например, пэгилирование) может кардинально увеличивать время удерживания аптамеров в циркуляции, тем самым, снижая частоту дозирования и повышая эффективность относительно сосудистых мишеней.

[0007] Крупномасштабное производство пэгилированных олигонуклеотидов, которое отвечает стандартам, установленным Food and Drug Administration (FDA) и другими международными регулирующими органами, включает множество стадий синтеза, очистки и определения характеристик конечного продукта, вводимого пациенту. Каждая стадия требует значительного количества как времени, так и денег. Соответственно, существует необходимость в оптимизации эффективных и практически осуществимых способов производства этого класса терапевтических средств.

Краткое изложение сущности изобретения

[0008] В одном из аспектов предоставлен способ получения конъюгированного с полиалкиленоксидом (PAO) олигонуклеотида. В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид представляет собой РНК аптамер, где аптамер имеет определенную вторичную структуру. В еще одном другом варианте осуществления олигонуклеотид представляет собой нейтрализующее средство или активное средство управления аптамером.

[0009] В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид синтезируют с применением твердофазного синтеза. В другом варианте осуществления олигонуклеотид синтезируют с использованием по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида.

[0010] В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотида включает: синтез непэгилированного олигонуклеотида на твердом носителе, отщепление непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятие защитных групп с непэгилированного олигонуклеотида, обессоливание непэгилированного олигонуклеотида, пэгилирование непэгилированного олигонуклеотида для получения пэгилированного олигонуклеотида, очистку пэгилированного олигонуклеотида и обессоливание пэгилированного олигонуклеотида. В одном из вариантов осуществления обессоливание непэгилированного олигонуклеотида включает ультрафильтрацию.

[0011] В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотид включает: синтез непэгилированного олигонуклеотида на твердом носителе, отщепление непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятие защитных групп с непэгилированного олигонуклеотида, солевой обмен непэгилированного олигонуклеотида, пэгилирование непэгилированного олигонуклеотида для получения пэгилированного олигонуклеотида, очистку пэгилированного олигонуклеотида и обессоливание пэгилированного олигонуклеотида. В одном из вариантов осуществления солевой обмен непэгилированного олигонуклеотида включает ультрафильтрацию.

[0012] В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотида включает: синтез непэгилированного олигонуклеотида на твердом носителе, отщепление непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятие защитных групп с непэгилированного олигонуклеотида, обессоливание и солевой обмен непэгилированного олигонуклеотида, пэгилирование непэгилированного олигонуклеотида для получения пэгилированного олигонуклеотида, очистку пэгилированного олигонуклеотида и обессоливание пэгилированного олигонуклеотида. В одном из вариантов осуществления обессоливание и солевой обмен непэгилированного олигонуклеотида включают ультрафильтрацию.

[0013] В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает лиофилизацию пэгилированного олигонуклеотида. В другом варианте осуществления стадию лиофилизации осуществляют после стадии обессоливания и дополнительной очистки пэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрации.

[0014] В другом варианте осуществления очистка пэгилированного олигонуклеотида содержит использование ультрафильтрации на ультрафильтрующей мембране с порогом молекулярной массы меньше молекулярной массы пэгилированного олигонуклеотида. В еще одном другом варианте осуществления ультрафильтрующая мембрана имеет порог молекулярной массы приблизительно 10 кДа, 20 кДа или 30 кДа. В другом варианте осуществления ультрафильтрующая мембрана имеет порог молекулярной массы приблизительно от 10 кДа приблизительно до 20 кДа или приблизительно от 20 кДа приблизительно до 30 кДа.

[0015] В одном из вариантов осуществления способ не включает ионообменную очистку непэгилированного олигонуклеотида после отщепления непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятия защитных групп с непэгилированного олигонуклеотида. В другом варианте осуществления способ не включает ионообменную очистку непэгилированного олигонуклеотида перед обессоливанием и/или солевым обменом непэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрации.

[0016] В одном из вариантов осуществления очистка пэгилированного олигонуклеотида включает использование анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

[0017] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один фрагмент модифицированного основания.

[0018] В другом варианте осуществления по меньшей мере один фрагмент модифицированного основания выбирают из группы, состоящей из 5-фторурацила, 5-фторцитозина, 5-бромурацила, 5-бромцитозина, 5-хлорурацила, 5-хлорцитозина, 5-йодурацила, 5-йодцитозина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, гипоксантина, ксантина, 4-ацетилцитозина, 5-(карбоксигидроксиметил)урацила, 5-карбоксиметиламин-O-метилтиоуридина, 5-карбоксиметиламин-O-метилурацила, дигидроурацила, β-D-галактозилквеуозина, инозина, N6-изопентиладенина, 1-метилгуанина, 1-метилинозина, 2,2-диметилгуанина, 2-метиладенина, 2-метилгуанина, 3-метилцитозина, 6-метилцитозина, N6-аденина, 7-метилгуанина, 5-метиламин-O-метилурацила, 5-метоксиамин-O-метил-2-тиоурацила, β-D-маннозилквеуозина, 5'-метоксикарбоксиметилурацила, 5-метоксиурацила, 5-метоксицитозина, 2-метилтио-N6-изопентиладенина, урацилоксиуксусной кислоты (v), бутоксозина, псевдоурацила, квеуозина, 2-тиоцитозина, 5-метилтиоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-метилурацила, метилового эфира урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацилоксиуксусной кислоты (v), 5-метилтиоурацила, 3-(3-амино-3-N-карбоксипропил)урацила, (acp3)w и 2,6-диаминопурина.

[0019] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит один или более 2'-O-метилмодифицированных нуклеотидов. В другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит одну или более модификаций 2'-O-метилом и одну или более 2'-фтором.

[0020] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид имеет определенную вторичную структуру. В другом варианте осуществления вторичная структура содержит по меньшей мере один стебель и по меньшей мере одну петлю. В другом варианте осуществления вторичная структура содержит два стебля и три петли.

[0021] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит одну или более модификаций 2'-O-метилом и/или одно или более модификаций 2'-фтором. В другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит одну или более модификаций 2'-O-метилом и/или одну или более модификаций 2'-фтором по меньшей мере в одном стебле и/или по меньшей мере одной петле.

[0022] В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один гуанин по меньшей мере в одном стебле непэгилированного олигонуклеотида содержит гидроксисахар (2'-OH). В другом варианте осуществления по меньшей мере один уридин по меньшей мере в одном стебле непэгилированного олигонуклеотида модифицируют или 2'-фтором, или 2'-O-метилом. В другом варианте осуществления по меньшей мере один цитидин по меньшей мере в одном стебле непэгилированного олигонуклеотида модифицирован 2'-фтором.

[0023] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит спейсер. В другом варианте осуществления спейсер представляет собой гликолевый спейсер.

[0024] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит одну из SEQ ID NO:1-20. В другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид состоит из одной из SEQ ID NO:1-20. В другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит один из модифицированных олигонуклеотидов, как описано в таблицах 1 и 2 данного описания. В еще одном другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид состоит из одного из модифицированных олигонуклеотидов, как описано в таблицах 1 и 2 данного описания.

[0025] В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид подвергают сочетанию с линкером перед конъюгацией с PAO для получения конъюгированного с линкером непэгилированного олигонуклеотида. В одном из вариантов осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит линкер, который имеет реакционноспособную аминогруппу, и полиалкиленоксид функционализируют с использованием активированной сложноэфирной группы. В другом варианте осуществления непэгилированный олигонуклеотид содержит линкер, который имеет реакционноспособную тиогруппу, и полиалкиленоксид функционализируют с использованием малеимидной группы. В одном из вариантов осуществления активированная сложноэфирная группа представляет собой NHS.

[0026] В одном из вариантов осуществления полиалкиленоксид не активируют. В другом варианте осуществления полиалкиленоксид дополнительно содержит фрагмент карбоновой кислоты. В другом варианте осуществления конъюгацию PAO с конъюгированным с линкером непэгилированным олигонуклеотидом осуществляют in situ путем включения водорастворимого агента сочетания в реакцию конъюгации. В одном из вариантов осуществления водорастворимый агент сочетания представляет собой дициклогексилкарбодиимид (DCC). В другом варианте осуществления водорастворимый агент сочетания представляет собой гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDAC).

[0027] В одном из вариантов осуществления содержащий линкер непэгилированный олигонуклеотид получают конъюгацией или иным прикреплением предшественника линкера к олигонуклеотиду. В другом варианте осуществления предшественник линкера выбирают из группы, состоящей из: 6-(трифторацетамидо)гексанол(2-цианоэтил-N,N-диизопропил)фосфорамидита, TFA-амино C4 CED фосфорамидита, 5'-аминомодификатора C3 TFA, 5'-аминомодификатора 5, 5'-аминомодификатора C12 и 5' тиольного модификатора C6 (линкеры проиллюстрированы ниже).

[0028] В одном из вариантов осуществления линкер представляет собой гексиламинный линкер.

[0029] В одном из вариантов осуществления полиалкиленоксид представляет собой полиэтиленгликоль (PEG). В другом варианте осуществления PEG имеет молекулярную массу приблизительно от 20 кДа приблизительно до 60 кДа, приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа, приблизительно 50 кДа или приблизительно 60 кДа.

[0030] В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает ультрафильтрацию содержащего линкер олигонуклеотида. В другом варианте осуществления ультрафильтрация непэгилированного олигонуклеотида представляет собой диафильтрацию против раствора соли. В еще одном другом варианте осуществления соль представляет собой соль натрия или калия.

[0031] В одном из вариантов осуществления ультрафильтрацию осуществляют в присутствии очищенной воды. В другом варианте осуществления ультрафильтрацию осуществляют в присутствии очищенной воды после ультрафильтрации в присутствии раствора соли. В одном из вариантов осуществления соль представляет собой одновалентную соль. В другом варианте осуществления соль представляет собой соль натрия, калия или лития. В другом варианте осуществления соль представляет собой соль натрия, калия или лития и одного из следующих анионов: Cl-, HSO3-, BrO3-, Br-, NO3-, ClO3-, HSO4-, HCO3-, IO3-, HPO42-, формиата, ацетата или пропионата. В еще одном другом варианте осуществления соль представляет собой хлорид натрия.

[0032] В одном из вариантов осуществления конечный фильтрат имеет проводимость больше 0 мкСм/см и меньше приблизительно 75 мкСм/см, меньше приблизительно 50 мкСм/см или меньше приблизительно 40 мкСм/см, или в диапазоне от приблизительно 20 мкСм/см приблизительно до 70 мкСм/см, приблизительно от 20 мкСм/см приблизительно до 50 мкСм/см или приблизительно от 20 мкСм/см приблизительно до 40 мкСм/см.

[0033] В одном из вариантов осуществления осмоляльность конечного фильтрата составляет больше 0 мосмоль и меньше или равна приблизительно 4 мосмоль, меньше или равна приблизительно 2 мосмоль, меньше или равна приблизительно 1 мосмоль. В другом варианте осуществления осмоляльность конечного фильтрата варьирует приблизительно от 0,001 мосмоль приблизительно до 1,0 мосмоль, приблизительно от 0,5 мосмоль приблизительно до 2,0 мосмоль или приблизительно от 0,5 мосмоль приблизительно до 4,0 мосмоль.

[0034] В одном из вариантов осуществления ультрафильтрацию осуществляют при температуре от 0°C приблизительно до 50°C или при температуре окружающей среды, такой как приблизительно от 15°C приблизительно до 30°C.

[0035] В одном из вариантов осуществления ультрафильтрацию содержащего линкер олигонуклеотида осуществляют с использованием мембраны, которая имеет порог молекулярной массы (ПММ) приблизительно от 1 кДа приблизительно до 10 кДа. В еще одном другом варианте осуществления ультрафильтрацию осуществляют с использованием 1 кДа мембраны, 2 кДа мембраны, 3 кДа мембраны, 5 кДа мембраны, 8 кДа мембраны или 10 кДа мембраны. В другом варианте осуществления ультрафильтрацию осуществляют с использованием мембраны с порогом молекулярной массы приблизительно от 1 кДа приблизительно до 5 кДа или приблизительно от 3 кДа приблизительно до 5 кДа. В другом варианте осуществления ультрафильтрующая мембрана будет иметь порог молекулярной массы, который ниже молекулярной массы содержащего линкер олигонуклеотида.

[0036] В одном из вариантов осуществления конечная проводимость конечного фильтрата меньше или равна приблизительно 50 мкСм/см. В другом варианте осуществления конечная осмоляльность конечного фильтрата меньше или равна приблизительно 1,0 мосмоль.

[0037] В одном из вариантов осуществления концентрирование непэгилированного олигонуклеотида осуществляют ультрафильтрацией содержащего линкер непэгилированного олигонуклеотида. В дополнительном варианте осуществления концентрирование непэгилированного олигонуклеотида осуществляют дистилляцией.

[0038] В одном из вариантов осуществления способ получения PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает конъюгирование фрагмента полиалкиленгликолевого предшественника с линкером конъюгированного с линкером непэгилированного олигонуклеотида. В другом варианте осуществления полиалкиленгликолевый предшественник представляет собой полиэтиленгликоль.

[0039] В одном из вариантов осуществления способ получения PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает очистку PAO-конъюгированного олигонуклеотида ионообменной хроматографией. В одном из вариантов осуществления ионообменная хроматография представляет собой анионообменную ВЭЖХ.

[0040] В одном из вариантов осуществления способ получения PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает очистку ультрафильтрацией элюента из ионообменной хроматографии. В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает концентрирование ультрафильтрацией. В одном из вариантов осуществления способ производства PAO-конъюгированного олигонуклеотида включает очистку ультрафильтрацией пэгилированной смеси без анионообменной очистки перед очисткой ультрафильтрацией.

[0041] В одном из вариантов осуществления PAO-конъюгированный олигонуклеотид концентрируют путем дистилляции.

[0042] В одном из вариантов осуществления способ получения PAO-конъюгированного олигонуклеотида дополнительно включает лиофилизацию PAO-конъюгированного олигонуклеотида.

Фигуры

[0043] На фиг.1 проиллюстрирован способ синтеза и очистки олигонуклеотидной композиции.

[0044] На фиг.2A и 2B проиллюстрирована конъюгация олигонуклеотида с фрагментом PEG через линкерный фрагмент.

[0045] На фиг.3A-3C проиллюстрирована структура RB006 и RB007, и комплекса, образованного ими.

[0046] На фиг.4A-4B проиллюстрированы некоторые варианты осуществления способа 1 и способа 2 синтеза и очистки олигонуклеотидной композиции.

[0047] На фиг.5 проиллюстрированы структуры некоторых примесей, наблюдаемых в способах, описанных в настоящем описании.

[0048] На фиг.6 проиллюстрированы некоторые варианты осуществления способа 1 и способа 2 синтеза и очистки олигонуклеотидной композиции.

[0049] На фиг.7 представлен спектр анионообменной ВЭЖХ, осуществляемой для анализа реакционной смеси для пэгилирования.

[0050] На фиг.8 представлен спектр анионообменной ВЭЖХ, осуществляемой для анализа ретентата после ультрафильтрации реакционной смеси для пэгилирования.

[0051] На фиг.9 представлен спектр анионообменной ВЭЖХ, осуществляемой для анализа фильтрата после ультрафильтрации реакционной смеси для пэгилирования.

[0052] На фиг.10 представлен спектр ион-парной ВЭЖХ, осуществляемой для анализа ретентата после ультрафильтрации реакционной смеси для пэгилирования.

Подробное описание изобретения

[0053] Для того, чтобы получить достаточное количество лекарственного средства, необходимое для проведения последней стадии клинических исследований и последующего выхода на коммерческий рынок, предприняты обширные усилия для повышения надежности выхода производственного способа при сохранении качества продукта. Кроме того, необходим строгий контроль ключевого сырья для обеспечения улучшенного контроля всего процесса и качества.

[0054] На всем протяжении производственного процесса на различных стадиях детально определяют характеристики продуктов, чтобы обеспечить необходимое качество и количество на всем протяжении процесса. В результате такой характеризации становится возможным идентифицировать стадии способа, которые могут иметь пользу от дополнительного улучшения и оптимизации.

[0055] В настоящем описании описана разработка улучшенного и более эффективного способа получения пэгилированных олигонуклеотидных аптамеров. К удивлению, обнаружено, что пропуск анионообменной хроматографии для удаления олигонуклеотидных примесей перед осуществлением реакции пэгилирования давал конечное вещество, неотличимое от полученного, когда перед реакцией пэгилирования осуществляли анионообменную очистку. Также неожиданным было то, что эффективность пэгилирования содержащего линкер олигонуклеотида сохранялась в способе, когда в способе пропускали стадию анионообменной очистки перед реакцией пэгилирования, и реакцию пэгилирования проводили с использованием неочищенной смеси содержащих линкер и не содержащих линкер олигонуклеотидов. Кроме того, к удивлению обнаружено, что ультрафильтрация может эффективно удалять непэгилированные олигонуклеотидные частицы, которые совместно элюируются при анионообменной очистке с пэгилированным олигонуклеотидным продуктом.

[0056] Получение терапевтического олигонуклеотида представляет собой многостадийный способ, включающий твердофазный химический синтез олигонуклеотидной цепи, отщепление и снятие защитных групп с неочищенного олигонуклеотида, очистку препаративной анионообменной хроматографией, обессоливание, с последующим пэгилированием, очисткой пэгилированного олигонуклеотида препаративной анионообменной хроматографией для удаления непэгилированных олигонуклеотидных примесей и не прореагировавшего PAO, ультрафильтрацией для обессоливания и концентрированием и лиофилизацией конечного продукта. Весь способ схематически показан в диаграмме последовательности операций на фиг.1.

[0057] Химический синтез олигонуклеотида можно осуществлять, например, взаимодействием с фосфорамидитом или фосфоротиоатом, как хорошо известно в данной области. Синтез включает последовательное образование связей активированных мономеров с растущим полимером, один конец которого ковалентно связан с матрицей твердого носителя. Твердофазный подход делает возможной легкую очистку продукта реакции на каждой стадии в синтезе простым промыванием твердой фазы растворителем. Олигонуклеотиды последовательно собирают от 3'-конца в направлении 5'-конца посредством снятия защитных групп с 5'-конца связанной с подложкой молекулы, что позволяет связанной с подложкой молекуле взаимодействовать с поступающим активированным тетразолом фосфорамидитным мономером, окисляя полученный фосфитный триэфир до фосфатного триэфира и блокируя любые не прореагировавшие гидроксильные группы путем ацетилирования (образования защитных групп), чтобы предотвратить непоследовательное образование связей со следующим поступающим мономером, для формирования «последовательности с делецией». Эту последовательность стадий повторяют для последующих реакций связывания до тех пор, пока не будут синтезированы полноразмерные олигонуклеотиды.

[0058] Для получения терапевтических олигонуклеотидов, которые обладают повышенной стабильностью in vivo, олигонуклеотиды синтезируют с использованием различных модификаций, известных специалистам в данной области. Например, в патентах США 5670633 и 6005087, выданных на имя Cook et al., описаны термостабильные 2'-фторолигонуклеотиды, которые комплементарны последовательности оснований РНК или ДНК. В патентах США 6222025 и 5760202, выданных на имя Cook et al., описан синтез 2'-O-замещенных пиримидинов и олигомеров, содержащих модифицированные пиримидины. Дополнительное описание можно найти в патенте США 7531524, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

[0059] Для того, чтобы сделать возможным последующую конъюгацию с фрагментом носителя, таким как молекула полиалкиленоксида, синтез олигонуклеотида можно осуществлять с добавлением подходящего линкерного фрагмента. Например, аминолинкер, такой как C 6 гексиламинолинкер, показанный на фиг.2, можно добавлять на 5'-конец синтезируемого олигонуклеотида. Другие линкеры, которые можно использовать, описаны ниже и включают, но без ограничения:

6-(трифторацетамидо)гексанол(2-цианоэтил-N,N-диизопропил)фосфорамидит структуры:

[0060] TFA-амино C4 CED фосфорамидит структуры:

[0061] 5'-аминомодификатор C3 TFA структуры:

[0062] 5'-аминомодификатор 5 структуры:

[0063] 5'-аминомодификатор C12 структуры:

MMT: 4-монометиокситритил

5'-аминомодификатор С12

[0064] 5'-тиольный модификатор C6 структуры:

[0065] Полиэтиленгликоли (PEG) могут быть конъюгированы с биологически активными соединениями, чтобы они выполняли функцию «инертных» носителей, для потенциально (1) увеличения периода полувыведения соединения из циркуляции, (2) изменения паттерна распределения соединения и/или (3) маскировки соединения, тем самым снижая его иммуногенный потенциал и защищая его от ферментативного расщепления. Размер PEG может находиться в диапазоне от 5 до 200 кДа, при этом конкретные PEG, используемые в фармацевтических составах, находятся в диапазоне 10-60 кДа. Можно получать PEG с линейной цепью приблизительно до 30 кДа. Для PEG больше 30 кДа, множество PEG можно прикреплять вместе («разветвленные» PEG) для получения PEG желаемого размера. Общий синтез соединений с присоединением разветвленных «mPEG2» (два mPEG, соединенных через аминокислоту), описан Monfardini et al. (1995) в Bioconjugate Chem. 6:62-69. Для «разветвленных» PEG, т.е. соединений, которые содержат больше одного PEG или mPEG, связанные с общей реакционноспособной группой, PEG или mPEG можно соединять вместе через аминокислоту, такую как лизин, или их можно соединять, например, через глицерин. Для разветвленных PEG, в которых каждый mPEG составляет приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа, общая масса составляет приблизительно 20, приблизительно 40 или приблизительно 60 кДа, и соединение называют по его общей массе (т.е. 40 кДа mPEG2 представляет собой два связанных mPEG по 20 кДа). PEG с общей молекулярной массой 40 кДа, которые можно использовать в качестве реагентов в получении пэгилированного соединения, включают, но без ограничения, например, N-гидроксисукцинимид [N2-(монометокси 20K полиэтиленгликолькарбамоил)-N6-(монометокси 20K полиэтиленгликолькарбамоил)]лизина структур:

и

[0066] Дополнительные PEG реагенты, которые можно использовать для получения стабилизированных соединений, включают другой разветвленный PEG N-гидроксисукцинимид (mPEG-NHS) общей формулы:

с общей молекулярной массой 40 кДа или 60 кДа (где каждый mPEG составляет приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа).

[0067] PEG реагенты для описанных соединений могут содержать неразветвленный mPEG-сукцинимидилпропионат (mPEG-SPA) общей формулы:

где mPEG составляет приблизительно 20 кДа или приблизительно 30 кДа. В конкретном варианте осуществления реакционноспособный сложный эфир представляет собой -O-CH2CH2-CO2-NHS.

[0068] Дополнительные PEG реагенты включают разветвленные PEG, соединенные через глицерин:

(Sunbright GL2-400GS2);

(Sunbright GL2-400HS) и

(Sunbright GL2-400TS);

[0069] неразветвленный сукцинимидил-α-метилбутаноат (mPEG-SMB) общей формулы:

.

[0070] Связанные с нитрофенилкарбонатом PEG, например, следующей структуры:

[0071] PEG с тиольными реакционноспособными группами, которые можно использовать с модифицированным тиолом линкером, включают соединения общей структуры:

где mPEG составляет приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа. Дополнительно, структура может быть разветвленной, такой как

где каждый mPEG составляет приблизительно 10, приблизительно 20 или приблизительно 30 кДа, и общая масса составляет приблизительно 20, приблизительно 40 или приблизительно 60 кДа.

[0072] Разветвленные PEG также могут включать соединения общей структуры:

[0073] Ниже в качестве примера улучшенного способа получения пэгилированного олигонуклеотида приведено описание альтернативных способов получения пэгилированного аптамерного продукта, известного как RB006. RB006 относится к олигонуклеотидному аптамеру: P-L-guggaCUaUaCCgCgUaaUgCuGcCUccacT, где P представляет собой сложный эфир mPEG2-NHS молекулярной массы 40 кДа; L представляет собой C6 NH2 линкер; G представляет собой 2-OH G; g представляет собой 2'-O-Me G; C представляет собой 2-F C; c представляет собой 2'-O-Me C; U представляет собой 2-F U; u представляет собой 2'-O-Me U; a представляет собой 2-O-Me A; и T представляет собой инвертированный 2'-H T (см. фиг.3A, SEQ ID NO:1). RB006 представляет собой компонент лекарственного средства REG1, и является непосредственным ингибитором FIXa, который связывает фактор свертывания IXa с высокой аффинностью и специфичностью (см. патент США 7304041 и Dyke et al., Circulation, 114:2490-97 (2006)). RB006 вызывает противосвертывающий эффект блокированием катализируемого FVIIIa/FIXa превращения FX в FXa. RB006 представляет собой модифицированный РНК аптамер, длиной 31 нуклеотид, который устойчив к расщеплению эндонуклеазами за счет присутствия остатков, содержащих 2'-фтор- и 2'-O-метилсахаров, и устойчив к расщеплению экзонуклеазами за счет 3' инвертированного дезокситимидинового кэпа. Нуклеиновая часть аптамера конъюгирована с полиэтиленгликолевым (PEG) носителем 40 кДА, увеличивая его период полувыведения из крови.

[0074] Преимущественным признаком RB006 является обратимость его эффектов in vivo, которую вызывают введением активного средства управления, которое может быть комплементарно по меньшей мере части аптамера. Для целей настоящего раскрытия, активным средством управления для RB006 может быть RB007, который показан на фиг.3B и имеет (5'-3') последовательность: cgcgguauaguccac (SEQ ID NO:2). Другими возможными активными средствами управления могут быть олигонуклеотидные (5'-3') последовательности, которые содержат: cgcgguauaguccccau (SEQ ID NO:3); cgcgguauaguccc (SEQ ID NO:4), cgcgguauaguccauc (SEQ ID NO:5), cgcgguauagucag (SEQ ID NO:6), cgcgguauagucagg (SEQ ID NO:7), cgcgguauagucagag (SEQ ID NO:8), или cgcgguauaguccucac (SEQ ID NO:9), или любые их модификации или производные. В определенных вариантах осуществления активное средство управления по существу состоит из одной из приведенных выше последовательностей или полностью состоит из одной из приведенных выше последовательностей.

[0075] RB007 может эффективно связываться с RB006, тем самым нейтрализуя его активность против FIXa. В одном из вариантов осуществления модификация RB007 2'-O-метилом придает молекуле умеренную нуклеазную устойчивость, которая обеспечивает достаточную стабильность in vivo, чтобы позволить ей находить и связывать RB006, но не поддерживает длительную персистенцию in vivo.

[0076] Следует понимать, что описанные в настоящее время способы получения можно применять к любому олигонуклеотиду или аптамеру. Примеры дополнительных аптамеров и олигонуклеотидов, которые в пэгилированной форме можно получать с применением способов, описанных в настоящем описании, описаны ниже в таблицах 1 и 2.

Таблица 2
Модуляторы олигонуклеотидов
Название RB ID Модифицированная последовательность SEO ID NO
EF-3 CA3 RB422 12
EF-3 CA4 RB423 13
RB490 CA 1 RB513 14
RB490 CA 2 RB514 15
RB490 CA 3 RB515 16
RB490 CA 4 RB516 17
RB538/571 Контрольный агент 5 (14mer) RB543 18
RB538/571 Контрольный агент 6 (15-мер) RB544 19
RB538/571 Контрольный агент 7 (16-мер) RB545 20
SEQ ID NO: 12-20 соответствуют немодифицированным версиям модуляторов, приведенных в колонке под названием «Модифицированная последовательность».

[0077] Дополнительные положения, связанные с RB006, RB007, аптамерами, которые связывают и модулируют GPVI, и другими терапевтическими аптамерами, можно найти в патентах США 7300922; 7304041, 7312325 и 7531524 и публикации патента США 2010/0311820, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

[0078] В настоящем описании с иллюстративными целями описаны два способа получения RB006, которые не предназначены для ограничения объема, как будет очевидно специалистам в данной области, поскольку различные изменения и модификации можно осуществлять, не отступая от существа изобретения. Кроме того, способы, описанные ниже, можно использовать для других терапевтических аптамеров, а также олигонуклеотидов, которые связывают аптамеры, как описано выше. Эти два способа получения обозначают как способ 1 и способ 2, и они подробно описаны ниже.

[0079] В таблице 3 перечислено сырье, используемое при получении RB006, при использовании способа 1 и способа 2. Любые замены считают незначительными, поскольку химическая реакционная способность реагентов эквивалентна, и не ожидают влияния на качество API, полученного как следствие изменения.

Таблица 3
Сырье, используемое в способе получения RB006
Способ 1 Способ 2
mA(2'-O-метил-ABz) Мономер Мономер
mC(2'-O-метил-CAc) Мономер Мономер
mG(2'-O-метил-GiBu) Мономер Мономер
mU(2'-O-метил-U) Мономер Мономер
fC(2'-F-CAc) Мономер Мономер
fU(2'-F-U) Мономер Мономер
rG(2'-O-TBDMS-GiBu) Мономер Мономер
C6L (гексиламинолинкер) Мономер Мономер
Сложный эфир PEG-NHS (PEG 40 кДа) Мономер Мономер
Инвертированное Т стекло с контролируемым размером пор (CPG) Твердая подложка Твердая подложка

Способ 1

[0080] Один способ получения пэгилированного олигонуклеотида включает две стадии анионообменной очистки. Этот способ, называемый в настоящем описании как способ 1 и схематически показанный на фиг.4A, описан в пяти стадиях. Стадия 1 представляет собой синтез на твердом носителе и снятие защитных групп. Стадия 2 охватывает способ получения олигонуклеотида для пэгилирования и включает очистку анионообменной ВЭЖХ. Поскольку очистку осуществляют с использованием катиона натрия, стадия очистки также ведет к солевому обмену солей аммония и алкиламмония с натрием. Конечной стадией на данной стадии является обессоливание олигонуклеотида перед реакцией пэгилирования. Стадия 3 включает пэгилирование и формирование пэгилированного олигонуклеотида. Стадия 4 включает очистку анионообменной ВЭЖХ и стадию обессоливания перед лиофилизацией на стадии 5.

Способ 1, стадия 1

[0081] Стадия 1 включает твердофазный синтез RB005, с последующим отщеплением и снятием защитных групп. Во время сборки олигонуклеотида из 31 основания посредством твердофазного синтеза, последней стадией реакции сочетания является добавление гексиламинолинкера, который обеспечивает сайт-специфическое присоединение для пэгилирования (см. фиг.2A). Получаемый полноразмерный продукт с гексиламинолинкером до пэгилирования обозначают как непэгилированный аптамер (RB005). Определение характеристик неочищенного олигонуклеотида выявило два класса примесей. Первый является не поддающимся пэгилированию в связи с отсутствием гексиламинолинкера. Второй является поддающимся пэгилированию и содержит гексиламинолинкер. Определение характеристик поддающихся пэгилированию примесей выявило последовательности, которые короче (N-1) и длиннее (N+1), и те и другие содержат гексиламинолинкер. Кроме того, также были обнаружены поддающиеся пэгилированию примеси с молекулярными массами, близкими к непэгилированному аптамеру. Эти примеси обозначали как M-x и M+x, где M представляет собой молекулярную массу RB005, и x представляет собой снижение или прирост молекулярной массы. Две группы экспериментов осуществляли для того, чтобы определить характеристики примесей в качестве не поддающихся пэгилированию или поддающихся пэгилированию.

[0082] Для подтверждения того, что не содержащие линкер олигонуклеотиды являются не поддающимися пэгилированию, эксперименты осуществляли с использованием версии непэгилированного аптамера, синтезированного без гексиламинолинкера. Этот не содержащий линкер непэгилированный аптамер комбинировали со сложным эфиром mPEG2 NHS в стандартных условиях реакции и было показано, что он не подвергался пэгилированию. Для того чтобы оценить, какие примеси в синтезе из сырья являются поддающимися пэгилированию, проводили модельное исследование, в котором проводили взаимодействие продукта синтеза из сырья и суррогата сложного эфира mPEG2 NHS в стандартных условиях пэгилирования и определяли молекулярную массу продуктов высокоэффективной жидкостной хроматографией с масс-спектрометрией (ЖХ-МС). Суррогат сложного эфира NHS имеет такую же структуру ядра, как mPEG2, и предположительно обладает такой же реакционной способностью. Такое же определение характеристик нельзя осуществлять при mPEG2, присоединенном к RB005 (RB006), в связи с полидисперсностью PEG и состоянием зарядов олигонуклеотида. В результате, определение характеристик идентифицировало N-1, M-x, M+x и N+1 в качестве поддающихся пэгилированию частиц. Следовательно, впоследствии определение характеристик способа было сфокусировано на оценке уровней частиц N-1, M-x, M+x и N+1 на различных стадиях получения.

[0083] Определение характеристик олигонуклеотида указывало на то, что дополнительная оптимизация параметров цикла синтеза может привести к боле низкому уровню поддающихся пэгилированию примесей N-1 и N+1.

Способ 1, стадия 2

[0084] Ожидали, что стадия анионообменной очистки, используемая перед пэгилированием в способе 1, удалит не поддающиеся пэгилированию и поддающиеся пэгилированию олигонуклеотидные примеси и удалит реагенты из стадии снятия защитных групп. Однако обширный анализ образцов до и после очистки к удивлению показал, что данная стадия очистки была только частично эффективна при удалении олигонуклеотидных примесей, влияющих на конечное качество лекарственного вещества. В анализе применяли как ЖХ-МС, так и хроматографические методы.

[0085] Использованный метод ЖХ-МС предоставляет полуколичественные данные, основанные на относительном подсчете ионов в %. Анализ посредством данного метода ЖХ-МС подтверждал, что отсутствовала значимая разница в чистоте непэгилированного аптамера в результате анионного обмена. Данные, представленные в таблице 4, показывают, что имеют место небольшие сдвиги в распределении примесей до и после анионообменной очистки, но общая чистота является сравнимой. Имеет место повышение примесей M-x, связанных со способом, после анионообменной очистки и соответствующее снижение примесей M+98, N-1 и N+1. Более подробное обсуждение примесей M-x представлено ниже.

Таблица 4
ЖХМС сравнение чистоты и примесей в RB005 до очистки и очищенном RB005 (ионный ток %)
Партия RB006 Изменение после очистки
Серия 2
Изменение после очистки
Серия 3
Использование I фаза клинических исследований
Другие исследования
I фаза клинических исследований
Сумма N-1 -1,7 -1,3
Сумма M-x 1,9 4,2
Чистота RB005 3,3 1,3
M+98 -2,7 -2,9
Сумма N+1 -0,7 -1,2
1) Положительное число представляет собой повышение чистоты или уровня примесей после очистки. Отрицательное число означает, что уровень примесей снижался после очистки.

[0086] Кратко, похоже, что анионообменная ВЭЖХ после синтеза непэгилированного аптамера, но перед пэгилированием обеспечивала минимальное улучшение качества непэгилированного аптамера. Кроме того, любое значимое улучшение качества непэгилированного аптамера, взятое перед стадией пэгилирования, наиболее вероятно, может быть достигнуто посредством непрерывного улучшения качества синтеза, а не посредством очистки.

Способ 1, стадия 3

[0087] В способе 1, на каждый эквивалент непэгилированного аптамера использовали два эквивалента сложного эфира mPEG2 NHS и осуществляли реакцию пэгилирования в водной смеси ацетонитрила и бората натрия. Несмотря на то, что реакция, по-видимому, отвечала требованиям, усилия по улучшению были направлены на снижение числа эквивалентов данного реагента, которое требуется для получения пэгилированного аптамера (RB006), и, тем самым, минимизацию уровня непрореагировавшего mPEG2, подлежащего удалению во время последующей обработки. На уровень пэгилирования влияет pH, растворимость сложного эфира mPEG2 NHS, растворимость непэгилированного аптамера и количество воды, присутствующей в реакции. Слишком большое количество воды ведет к гидролизу реакционноспособного сложного эфира NHS, слишком малое может вести к осаждению олигонуклеотида. Ни одно из этих условий не влияет на качество лекарственного вещества, но происходит снижение эффективности реакции пэгилирования.

Способ 1, стадия 4

[0088] Анионообменную очистку пэгилированного аптамера, используемую в способе 1, оценивали по ее способности удалять избыток mPEG2 и не поддающиеся пэгилированию примеси. Неанионная природа mPEG2 позволяет анионообменной колонке эффективно удалять нереакционноспособный mPEG2. Короткие не поддающиеся пэгилированию олигонуклеотидные примеси удаляли во время стадии анионного обмена стадии 2. Не поддающиеся пэгилированию олигонуклеотидные примеси, близко родственные непэгилированному аптамеру, которые не были удалены на стадии 2, эффективно удаляли на стадии 4 препаративной анионообменной очисткой, поскольку фрагмент PEG пэгилированного аптамера приводил к элюированию пэгилированного аптамера значительно раньше не поддающихся пэгилированию олигонуклеотидных примесей, близко родственных непэгилированному аптамеру.

[0089] Дополнительного концентрирования пэгилированного аптамера достигали дистилляцией воды, чтобы соответствовать требованиям к упаковке лиофилизированного RB006 в сосуды.

Способ 1, стадия 5

[0090] Физико-химические характеристики пэгилированного аптамера оценивали как часть масштабирования способа лиофилизации, чтобы определить подходящие внутренние температуры для заморозки и первичной сушки.

Способ 2

[0091] На основе определения характеристик на различных стадиях способа 1, осуществляли изменения для повышения эффективности производства пэгилированного аптамера, как рассмотрено ниже. Параллельное сравнение способа 1 и способа 2 предоставлено на фиг.4B.

[0092] Способ получения в способе 2 также описан в пяти стадиях. Стадия 1 представляет собой синтез на твердом носителе и снятие защитных групп. Стадия 2 охватывает способ получения непэгилированного аптамера для пэгилирования и включает обессоливание продукта перед реакцией пэгилирования путем ультрафильтрации. Стадия 3 включает пэгилирование и формирование пэгилированного аптамера. Стадия 4 включает очистку анионообменной ВЭЖХ и очистку, и обессоливание с использованием ультрафильтрации перед лиофилизацией на стадии 5.

Способ 2, стадия 1

[0093] В способе 1 синтез непэгилированного аптамера осуществляли в масштабе 3 ммоль. Требования к материалам для клинических исследований и коммерческая осуществимость требовали увеличения масштаба в способе 2. Синтез в способе 2 осуществляли в масштабе 10 и 20 ммоль и 250 ммоль и дополнительное масштабирование возможно в ходе разработки, например, в масштабе 300 ммоль, 350 ммоль или 400 ммоль. Крупномасштабный синтезатор использовали для способа 2. Путь химического синтеза оставался неизменным наряду с исходными мономерами. Чистота на стадии синтеза была повышена по сравнению с достигнутой при использовании способа 1. В таблице 5 кратко изложен масштаб синтеза, чистота после анионной ВЭЖХ и выход полноразмерного продукта (FLP) приведены в OD/ммоль. Также показаны предполагаемое использование и способ производства. Материал из масштабированной процедуры сравним с материалом, полученном в меньшем масштабе. Качество сырья было на 6% выше для серии № 5 по сравнению с предыдущими клиническими сериями.

Таблица 5
Сравнение синтеза RB005 в способе с исходной токсикологической серией
Способ 1 Способ 2
Токсикология Клиника Клиника Токсикология Клиника
Серия 1 Серия 2 Серия 3 Серия 4 Серия 5
Масштаб синтеза (ммоль) 3 3 3 20 10
Изменение чистоты после АО ВЭЖХ NA 12%** 12%** 13% 18%
Изменение выхода (OD/ммоль) NA Нет изменений 15% 29% 28%
**Среднее четырех независимо определяемых синтезов в масштабе 3 ммоль
*** Среднее семи независимо определяемых синтезов в масштабе 3 ммоль
NA: не применимо

Способ 2, стадия 2

[0094] В способе 1 анионообменную хроматографию использовали для удаления не поддающихся пэгилированию примесей и обменять соли аминов из реакции снятия защитных групп на соли натрия. В способе 2 не поддающиеся пэгилированию примеси удаляли на стадии 4 посредством комбинации анионного обмена и ультрафильтрации. В таблице 6 сравнивают два способа по удалению не поддающихся пэгилированию примесей.

Таблица 6
Сравнение способов очистки
Способ 1 Способ 2
Стадия 2 Удаление непэгилированных примесей и солевой обмен с использованием анионообменной ВЭЖХ
Обессоливание и диафильтрация
Солевой обмен с использованием диафильтрации
Обессоливание и диафильтрация
Стадия 3 Пэгилирование Пэгилирование
Стадия 4 Удаление нереакционноспособных mPEG2, не поддающихся пэгилированию примесей и очистка RB006 с использованием анионообменной ВЭЖХ Удаление нереакционноспособных mPEG2, не поддающихся пэгилированию примесей и очистка RB006 с использованием анионообменной ВЭЖХ и ультрафильтрации

[0095] Ультрафильтрацию осуществляют путем пропускания раствора олигонуклеотида через ультрафильтрующую мембрану, посредством чего примеси с более низкой молекулярной массой, такие как соли аммония и алкиламмония, и растворители, которые могут присутствовать в виде остатков от синтеза и отщепления и снятия защитных групп, проходят через мембрану, при этом происходит удерживание олигонуклеотида без прохождения через мембрану. Ультрафильтрация служит для снижения отношения примесей с низкой молекулярной массой к олигонуклеотиду. Ультрафильтрацию можно осуществлять таким образом, чтобы повысить концентрацию олигонуклеотида в растворе, не добавляя свежего растворителя (обыкновенно воды), чтобы заместить объем, проходящий через ультрафильтрующую мембрану, или добавляя меньшее количество воды, чем объем, который прошел. Альтернативно, можно добавлять эквивалентный или больший объем растворителя, чем тот, что прошел через мембрану. Раствор обычно с усилием проталкивается через ультрафильтрующую мембрану с применением повышенного давления.

[0096] Стадию ультрафильтрации можно осуществлять в присутствии водного раствора соли натрия, такого как раствор хлорида натрия, для образования олигонуклеотида в форме желаемой соли натрия и замены любых остаточных ионов аммония, включая алкиламмоний.

[0097] При желании, можно осуществлять множество стадий ультрафильтрации. В некоторых вариантах осуществления ультрафильтрацию осуществляют в присутствии очищенной воды, в частности, после стадии ультрафильтрации в присутствии солей натрия. Ультрафильтрацию с использованием очищенной воды обыкновенно осуществляют до тех пор, пока олигонуклеотид по существу не будет содержать аммония и остаточных неорганических солей натрия.

[0098] Мониторинг концентрирования остаточных ионов часто осуществляют посредством измерения проводимости, при значениях меньше 75 мкСм/см, меньше 50 мкСм/см или меньше 40 мкСм/см, или в диапазоне приблизительно от 20 мкСм/см приблизительно до 50 мкСм/см в конечном фильтрате. В другом варианте осуществления конечная осмоляльность конечного фильтрата меньше или равна приблизительно 4 мосмоль, меньше или равна приблизительно 2 мосмоль, меньше или равна приблизительно 1 мосмоль, находится в диапазоне приблизительно от 0,001 приблизительно до 1,0 мосмоль, приблизительно от 0,5 мосмоль приблизительно до 2,0 мосмоль или приблизительно от 0,5 мосмоль приблизительно до 4,0 мосмоль.

[0099] Ультрафильтрующие мембраны, используемые в описанных выше способах, могут иметь порог молекулярной массы, выбранный так, чтобы он был ниже молекулярной массы олигонуклеотида. В вариантах осуществления, где желательно удалить ионы алкиламмония из раствора, можно использовать порог молекулярной массы выше молекулярной массы ионов алкиламмония. Во многих вариантах осуществления, например, при использовании обычно 15-40-членного олигонуклеотида, имеющего молекулярную массу приблизительно от 4,5 до 12 кДа, используют порог молекулярной массы в диапазоне от 1 кДа до 3 кДа.

[0100] Способ согласно настоящему изобретению часто осуществляют при температуре в диапазоне от 0°C приблизительно до 50°C или при температуре окружающей среды, такой как приблизительно от 15°C приблизительно до 30°C.

[0101] Основная причина для осуществления анионообменной очистки не поддающихся пэгилированию примесей на стадии 4 способа 2 заключается в специфичности взаимодействия сложного эфира mPEG2 NHS с гексиламинолинкером. Улучшения начального качества синтеза и снижение примеси M-x подтверждали ЖХ-МС анализом. Способ 2 сохраняет общее качество непэгилированного аптамера по сравнению со способом 1.

[0102] Данные, полученные для обработанного непэгилированного аптамера сведены в таблицу 7. Молекулярная масса непэгилированного согласуется с теоретической молекулярной массой, и наблюдаемое значение согласуется для обоих способов. Данные секвенирования указывают на то, что способ 2 не оказывает влияния на ожидаемую последовательность. Чистоту материалов, полученных в способе 1 и способе 2, нельзя сравнивать непосредственно на данной стадии, поскольку примеси, удаляемые на стадии анионного обмена способа 1, присутствуют в способе 2. В способе 2 примеси удаляют на конечной стадии 4.

Таблица 7
История изменения в партиях непэгилированного аптамера (обрабатываемого) относительно серии 1
История партий RB005 (обрабатываемого)
Серия 1 Серия 2 Серия 3 Серия 4 Серия 5
Способ Способ 1 Способ 1 Способ 1 Способ 2 Способ 2
Изменение в чистоте сырья относительно серии 1 по АО ВЭЖХ NA 11% 11% 12% 18%
Изменение в чистоте после очистки относительно серии 1 по АО ВЭЖХ NA -1% -2% NA* NA*
*NA: Не применимо: Непосредственное сравнение не может быть выполнено на этой стадии, поскольку материал не очищен

[0103] Как рассмотрено выше, только примеси, содержащие гексиламинолинкер, поддаются пэгилированию, и стадия анионообменной очистки в способе 1 имела минимальное влияние на удаление этих примесей. ЖХ-МС анализ использовали для того, чтобы идентифицировать и сравнить поддающиеся пэгилированию примеси, присутствующие в материале, полученном способом 1 и способом 2 на данной стадии. Используемый метод ЖХ-МС предоставляет полуколичественные данные на основе относительного подсчета ионов в %. Данные ЖХ-МС показали, что одни и те же типы примесей прогнозируются в пэгилированном продукте способа 1 и способа 2. В таблице 8 вычисленные массы и предварительная идентичность для поддающихся пэгилированию примесей представлены наряду с относительными уровнями примесей как для способа 1, так и для способа 2. В таблице 8 сведены относительные частицы N-1, M-x, непэгилированный аптамер, M+x и N+1 из способа 1 и способа 2. Номенклатура M-x и M+x относится к примесям, которые близки по массе к непэгилированному аптамеру, где M представляет собой массу непэгилированного аптамера, и x представляет собой снижение или увеличение массы. Номенклатура N+1 и N-1 представляет собой такие частицы, которые имеют или один дополнительный присутствующий нуклеотид или недостающий нуклеотид. Поскольку продемонстрировано, что не поддающиеся пэгилированию примеси не вступают в реакцию, их не включали в анализ и данные нормализовали по отношению к непэгилированному аптамеру.

Таблица 8
Изменение в суммарных данных ЖХ-МС для обработанного непэгилированного аптамера из способа 2 относительно способа 1 (ионный ток %)
Изменение относительно способа 1*
Партия RB006 Серия 4 Серия 5
Сумма N-1 -0,5 0,3
Сумма M-x -2,6 -3
Чистота RB005 2,2 2,5
М+98 0 0
Сумма N+1 0,9 0,3
*Положительное число представляет собой повышение чистоты или примеси относительно средних значений, наблюдаемых в способе 1. Отрицательное значение представляет снижение уровня примесей в способе 2 по сравнению со средними значениями, наблюдаемыми в способе 1.

Примеси

[0104] В обоих способах наблюдали примеси N+1 и N-1, содержащие гексиламинолинкер. Семейство примесей N+1 является результатом двойного связывания, и семейство N-1 возникает из-за внутренних делеций. Частицы M-94, M-52 и M-20 согласуются с модификацией 2'-дезокси-2'-фторуридина, возникающей во время способа получения. Показано, что нагревание и растворы с основным pH повышают уровень этих примесей. Молекулярные массы примесей, связанных со способом, (M-x) согласуются со следующими структурами:

[0105] Частицы соответствуют разрушению 2'-дезокси-2'-фторуридина.

[0106] В способе 1 примесь M+98 соответствует примеси, связанной с исходным материалом линкера. Предварительно идентифицировали, что примесь исходного материала представляет собой бифункциональный фосфорамидит гексиламинолинкера. В способе 1 эту примесь удаляли препаративной анионообменной очисткой перед пэгилированием. В способе 2 уже реализовали способ газовой хроматографии/FID QC, чтобы контролировать эту примесь в исходном материале. Эта примесь хорошо поддается контролю на стадии сырья и не присутствует в любой из партий, полученных способом 2.

Таблица 9
Сводка по поддающимся пэгилированию примесям и чистоте по АО-ВЭЖХ (площадь %) относительно серии 2
Способ 1 Способ 2
Партия RB006 Очищенная серия 2 Очищенная серия 3 Серия 4 Серия 5
Предварительная идентификация
Разница в потенциальных поддающихся пэгилированию примесях RRT 0,91-0,99 и 1,01-1,15 Не применимо -0,6% +1,1% -0,8%
Изменение чистоты по АО ВЭЖХ Не применимо +0,6% -0,9% +0,8%
Таблица 10
Сводка по поддающимся пэгилированию примесям и чистоте по ИП-ВЭЖХ (площадь %) относительно серии 2
Способ 1 Способ 2
Партия RB006 Очищенная серия 2 Очищенная серия 3 Серия 4 Серия 5
Предварительная идентификация
Разница в потенциальных поддающихся пэгилированию примесях Сумма RRT 0,91-0,99 и 1,01-1,15 Не применимо -2,9% -2,6% -3,3%
Изменение чистоты по АО ВЭЖХ +3,1% +2,7% +3,3%

[0107] Кратко, взятые вместе данные ЖХ-МС и хроматографии показывают снижение поддающихся пэгилированию примесей M-x, полученных способами очистки, и минимальное повышение N-1 и N+1, когда удаляют первую стадию анионообменной очистки. Анализ партий ЖХ-МС представлен в таблице 8. Аналогичным образом, все примеси, присутствующие в клинической партии, полученной способом 2, присутствуют на эквивалентных или более низких уровнях, чем в более ранних партиях. Общая чистота по ЖХ-МС для материала, полученного способом 2, лучше, чем способом 1.

[0108] В способе 1 анионообменную очистку использовали для осуществления солевого обмена и удаления первичных аминов из неочищенного непэгилированного аптамера во время стадии очистки. Это представляет собой важную операцию, поскольку конъюгация не будет происходить в присутствии солей аминов. Ультрафильтрацию осуществляли с использованием мембраны с порогом молекулярной массы (ПММ) 1 кДа. В способе 2, поскольку удаление не поддающихся пэгилированию примесей перемещают на стадию 4, стадию ультрафильтрации модифицировали для включения диафильтрации против хлорида натрия, чтобы добиться солевого обмена, что необходимо для эффективной конъюгации с PEG. Кроме того, мембрану 1 кДа заменяли мембраной с ПММ 5 кДа, чтобы улучшить скорость потока.

Способ 2, стадия 3

[0109] В способе 1 на каждый эквивалент непэгилированного аптамера использовали два эквивалента сложного эфира PEG-NHS и реакцию пэгилирования осуществляли в смеси ацетонитрила и бората натрия. Усилия по улучшению совершали для снижения числа эквивалентов данного реагента, необходимого для получения пэгилированного аптамера. Оценивали различные условия для пэгилирования, которые включают время реакции, температуру, pH, эквиваленты PEG-NHS и растворитель. Результаты исследования указывают на то, что хотя эффективность пэгилирования варьировала при использовании различных условий, профиль примесей полученного пэгилированного продукта оставался соответствующим. В способе 2 1,5-1,75 эквивалента сложного эфира PEG-NHS используют в смеси ACN:ДМСО и буфере из бората натрия для получения пэгилированного аптамера. Специфичность новых условий пэгилирования оценивали с использованием не содержащего линкер непэгилированного аптамера и сложного эфира mPEG2 NHS. Как обсуждалось выше, аптамер без линкера не является реакционноспособным в условиях пэгилирования. Сравнение обрабатываемого материала, полученного способом 2, со способом 1 осложнено присутствием не поддающихся пэгилированию примесей, которые присутствуют в способе 2. Не поддающиеся пэгилированию примеси удаляют на стадии 4. Следовательно, непосредственное сравнение материала, полученного с использованием двух способов, невозможно на стадии 3. Следовательно, сравнение качества материала, полученного обоими способами, выполняют посредством рассмотрения данных, представленных в истории партий, таблице 10, и дополнительного аналитического определения характеристик, как описано выше.

Способ 2, стадия 4

[0110] В способе получения 1 условия препаративной анионообменной ВЭЖХ для очистки на стадии 4 схожи с условиями, используемыми во время стадии 2. В способе получения 2 условия очистки на стадии 4 оптимизировали по сравнению с условиями, используемыми в способе 1; изменение состояло в модификации градиента для очистки и загрузки реакционной смеси, получаемой со стадии 3. Сравнение обрабатываемого материала, полученного способом 2, со способом 1 осложнено присутствием не поддающихся пэгилированию примесей и, таким образом, не проводили непосредственного сравнения для материала, полученного с использованием двух способов.

[0111] В способе получения 1 ультрафильтрацию после пэгилирования осуществляли с использованием мембраны с ПММ 5 кДа. Основная роль стадии ультрафильтрации в способе 1 заключалась в обессоливании и концентрировании RB006 перед лиофилизацией. В способе 2 ПММ мембраны меняли до 10 или 30 кДа, для гарантии того, что все непэгилированные олигонуклеотиды будут удалены перед лиофилизацией. Кроме того, повышение порога молекулярной массы обладает дополнительным эффектом улучшения скорости потока во время диафильтрации. Важный элемент при разработке способа получения 2 заключается в оценке способности способа удалять не поддающиеся пэгилированию примеси. Несмотря на то, что большинство этих примесей удаляют при анионообменной очистке пэгилированного аптамера, существует возможность того, что произойдет совместное элюирование непэгилированных олигонуклеотидов с пэгилированным продуктом и может произойти перенос в API. Для того чтобы тестировать степень, в которой мембрана с ПММ 30 кДа способна удалять не поддающиеся пэгилированию примеси в диапазоне от 2 кДа до 10 кДа, реакционную смесь для пэгилирования со стадии 3 загружали на мембрану с ПММ 30 кДа, не подвергая нормальному способу очистки. Схематическое представление способа оценки относительно способа 2 показано на фиг.6.

[0112] АО-ВЭЖХ (анионообменную ВЭЖХ) использовали для того, чтобы проанализировать реакционную смесь для пэгилирования, раствор фильтрата ультрафильтрации и раствор ретентата ультрафильтрации. Результаты представлены на фиг.7-9. Аналитическая ВЭЖХ материала после ультрафильтрации ясно демонстрирует способность способа удалять не поддающиеся пэгилированию примеси, включая такие частицы, которые совместно элюируются с пэгилированным аптамером. На фиг.7 показана неочищенная реакционная смесь для пэгилирования. Время удерживания пэгилированного аптамера составляет 14,3 минуты. Время удерживания 19-20 минут соответствует не поддающимся пэгилированию примесям, близким с полноразмерному продукту (N-1, N-2... без линкера) с приблизительной молекулярной массой 10000 кДа. На фиг.8 анализ ретентата показывает удаление большого числа частиц из реакционной смеси для пэгилирования. Примеси со временем удерживания 19-20 минут удаляли ультрафильтрацией. Дополнительно на фиг.9 представлен анализ раствора фильтрата. Фильтрат показывает, что также удаляются не поддающиеся пэгилированию частицы с временем удерживания, схожим с пэгилированным аптамером. ИП-ВЭЖХ и АО-ВЭЖХ используют в комбинации для проведения мониторинга удаления не поддающихся пэгилированию примесей во время ультрафильтрации.

[0113] Для того, чтобы оценить использование ПММ в 10 кДа в способе получения, пэгилированный олигонуклеотид очищали анионообменной ВЭЖХ (стадия 3 способа) и затем подвергали ультрафильтрации с использованием мембраны 10 кДа. Затем материал анализировали аналитической ИП-ВЭЖХ, которая избирательна к непэгилированному и пэгилированному олигонуклеотиду. Обнаружение не поддающихся пэгилированию олигонуклеотидов происходит от 2 до 6 минут. На фиг.10 показано, что не поддающиеся пэгилированию олигонуклеотиды отсутствуют, и что применение очистки ВЭЖХ и мембраны 10 кДа удаляет не поддающиеся пэгилированию олигонуклеотиды.

[0114] Чистота материала, полученного способом 2 в конце стадии 4, сравнима с чистотой материала, полученного способом 1.

Способ 2, стадия 5

[0115] В способе 1 пэгилированный аптамер лиофилизировали в отдельных сосудах. В способе 2 параметры лиофилизации оптимизировали на базе определения физических характеристик RB006, и материал лиофилизировали большими партиями с использованием лотков Lyoguard. Использование лотков Lyoguard и определение физико-химических характеристик позволяет лиофилизировать пэгилированный аптамер в более низких концентрациях, чем необходимо для обеспечения лиофилизации в сосудах. Рассмотрено рациональное обоснование для каждого измерения и возможное влияние изменения на качество продукта. Изменения осуществляли для того, чтобы вместить более надежный способ, потенциал для масштабирования, более высокую производственную гибкость и безопасность сотрудников при небольшом или нулевом влиянии на качество продукта. Материал, полученный с использованием способа 1, и материал, полученный с использованием способа 2, отвечают спецификациям качества, содержат схожие профили примесей и обладают схожей чистотой в целом. Изменения осуществляли на всех пяти стадиях способа 1 для того, чтобы разработать способ 2, предусматривающий повышенную простоту и выполнимость масштабирования при сохранении или улучшении качества продукта.

Таблица 11
Изменения в способе получения пэгилированного аптамера и влияние на качество продукта
Оборудование для синтеза и масштаб Способ 1 Способ 2 Причина для изменений Влияние на качество продукта
Очистка посредством АО или обессоливания
Масштаб 3 ммоль Удалена анионообменная очистка Очистка не эффективна при удалении примесей N+1 и N-1 Не обнаружено
Способ АО смола Не применимо Не применимо Не применимо
Обессоливание ультрафильтрацией
Кассеты для ультрафильтрации Pall Maximate 1 кДа (полиэфирсульфон) Sartorius Hydrostart 2-5 кДа (регенерированная целлюлоза) Улучшенная скорость потока, сниженное время обработки Не обнаружено
Реактивы Вода для инъекций Вода для инъекций. NaCl, вода для инъекций Удаление аминов Не обнаружено
Обессоливание ультрафильтрацией
Кассеты для ультрафильтрации 5K Pall Maximate Pall Maximate 10-30 кДа Стадия очистки для удаления не поддающихся пэгилированию примесей Не обнаружено
Реактивы Вода для инъекций Без изменений Не применимо Не применимо
Лиофилизация
Контейнер Стеклянные сосуды (100 мл) Лоток Lyoguard Масштабирование

[0116] Способы включают анализ с использованием анионообменной ВЭЖХ, ион-парной ВЭЖХ с обращенной фазой и двухколоночной GPC. В улучшенном анионообменном способе используют систему из буфера Tris/ацетонитрила/метанола/pH 8 и градиент хлорида натрия, колонку Dionex DNAPac PA-100 (4×250 мм) при 40°C с потоком 1,5 мл/мин. Обнаружение происходит при 259 нм. Было показано, что способ допускает несколько синтетически полученных пэгилированных примесей N+1 и N-1, продукты расщепления RB006 и RB006, которые пэгилированы с частицами 20 кДа и 30 кДа. Способ обладает линейными свойствами в диапазоне 50%-120% и 0,1%-10% номинальной концентрации (2,0 мг/мл). В улучшенном двухколоночном способе GPC параллельно используют колонки Waters Ultrahydrogel 1000 и 500 (7,8×300 мм) и 20 мМ аммоний ацетат pH 7,4 при температуре окружающей среды с изократическим элюированием при 0,4 мл/мин. Обнаружение осуществляют посредством испарительного рассеяния света (пролетные трубы 50°C, азот 40 фунтов/дюйм2, ESI охлаждение) и с помощью УФ при 259 нм. В способе используют серию стандартов полиэтиленоксида и полиэтиленгликоля в диапазоне от 72 кДа до 12 кДа для определения молекулярной массы. Способ обладает линейными свойствами во всем диапазоне масс, и предел обнаружения составляет 0,2%. Улучшенный ион-парный ВЭЖХ (ИП-ВЭЖХ) анализ RB006 осуществляют с использованием колонки Waters Xbridge BEH300 C4 (4,6×100 мм, 3,5 мкм) с использованием градиента подвижной фазы A: 100 мМ триэтиламмонийацетат (TEAA), pH 7,2, 5% метанол, и подвижной фазы B: 100 m TEAA, pH 7,2, 50% ацетонитрил, 30% изопропанол с pH 8,5, при температуре колонки 35°C. Скорость потока составляет 1,0 мл/мин и обнаружение происходит при УФ 259 нм.

[0117] До тех пор, пока не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как их обычно понимает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, схожие или эквивалентные описанным в данном описании, также можно использовать при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения, описаны примеры способов и материалов. Все публикации, указанные в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, чтобы раскрыть и описать способы и/или материалы, применительно к которым публикации процитированы.

1. Способ получения терапевтического пэгилированного олигонуклеотида, включающий:
(a) синтез непэгилированного олигонуклеотида на твердом носителе,
(b) отщепление непэгилированного олигонуклеотида от твердого носителя и снятие защитных групп с олигонуклеотида,
(c) обессоливание непэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрации,
(d) пэгилирование непэгилированного олигонуклеотида для получения пэгилированного олигонуклеотида,
(e) очистку пэгилированного олигонуклеотида с использованием анионообменной ВЭЖХ и
(f) обессоливание и дополнительную очистку пэгилированного олигонуклеотида с использованием ультрафильтрующей мембраны, которая имеет порог молекулярной массы приблизительно от 10 кДа приблизительно до 20 кДа или приблизительно от 20 кДа приблизительно до 30 кДа,
где ионообменную очистку непэгилированного олигонуклеотида не осуществляют между стадиями (b) и (с).

2. Способ по п. 1, который дополнительно включает стадию (g) лиофилизации конечного продукта.

3. Способ по п. 1, где непэгилированный олигонуклеотид содержит вторичную структуру.

4. Способ по п. 3, где вторичная структура содержит стебель и петлю.

5. Способ по п. 1, где непэгилированный олигонуклеотид содержит модифицированный нуклеотид.

6. Способ по п. 5, где непэгилированный олигонуклеотид содержит модифицированный 2′-O-метилом нуклеотид.

7. Способ по п. 5, где непэгилированный олигонуклеотид содержит модифицированный 2′-фтором нуклеотид.

8. Способ по п. 1, где непэгилированный олигонуклеотид подвергают сочетанию с линкером перед стадией d.

9. Способ по п. 1, где непэгилированный олигонуклеотид содержит аптамер RB005.

10. Способ по п. 1, где пэгилированный олигонуклеотид содержит аптамер RB006.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белковых каркасов, связывающихся с IgG, и может быть использовано в диагностике или лечении. Получают белковый каркас на основе консенсусной последовательности десятого повтора фибронектина типа III (FN3) человека, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК животных, входящих в группу: свинья, бык, курица, овца, индейка, мышь, крыса, собака, кошка, и ДНК человека в сухих или консервированных кормах для животных и в сырых или подвергшихся кулинарной обработке мясных продуктах.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Предложен олигодезоксирибонуклеотидный ингибитор ДНК-метилтрансферазы 1 человека (Dnmt1), характеризующийся тем, что он имеет самокомплементарную структуру, которая образует двуцепочечную шпильку, имеет неспаренную СА пару в сайте узнавания фермента ДНК-метилтрансферазы 1 человека и содержит в своем составе 5-метилцитозин (5mC) и тиофосфаты вместо фосфатов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин.

Группа изобретений касается дискриминирующего мишень зонда (TD-зонду), способа его конструирования и способов детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени с его использованием.
Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к способу очистки синтетических олигодезоксирибонуклеотидов. Основной задачей настоящего изобретения является разработка эффективного способа очистки олигодезоксирибонуклеотидов с высоким выходом и высокой степенью очистки от производных кремниевой кислоты, пригодного для крупномасштабного синтеза.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к реагенту для предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), способу предотвращения по меньшей мере одного ошибочного старта в амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР-амплификация) и наборам, которые включают данный реагент.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и набору для определения наличия или отсутствия мутации в гене PIK3CA. .

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано для детекции нуклеиновых кислот, диагностики и/или лечения заболеваний.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к полипептиду и его гомодимеру, которые обладают агонистической активностью в отношении рецептора гормона роста, молекуле нуклеиновой кислоты, их кодирующей, вектору, который включает данную нуклеиновую кислоту, клетке для экспрессии данного полипептида, фармацевтической композиции и способу с применением вышеуказанных полипептидов для лечения дефицита гормона роста.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1-клеток, направленных против коллагена типа II, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к гибридным белкам рецептора фактора роста фибробластов (FGFR), и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, связанных с избыточной экспрессией FGF.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой конъюгат для внутриклеточной доставки миРНК, содержащий миРНК, которая посредством ковалентной связи конъюгирована с одной стороны с гидрофильным соединением, например, с ПЭГ, а с другой стороны с гидрофобным соединением, например с холестерином.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Предложен олигодезоксирибонуклеотидный ингибитор ДНК-метилтрансферазы 1 человека (Dnmt1), характеризующийся тем, что он имеет самокомплементарную структуру, которая образует двуцепочечную шпильку, имеет неспаренную СА пару в сайте узнавания фермента ДНК-метилтрансферазы 1 человека и содержит в своем составе 5-метилцитозин (5mC) и тиофосфаты вместо фосфатов.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для лечения инфекционного перитонита в эксперименте. Для этого крысам внутривенно вводят суспензию аллогенных мезенхимальных стволовых клеток из расчета 1,5×106 на 100 г массы животного в 2 мл физиологического раствора.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к лентивирусной доставке апоптина в опухолевые ткани, и может быть использовано в медицине. Способ включает получение лентивирусного конструкта, экспрессирующего модифицированный апоптин, слитый с секреторным сигналом лактотрансферрина и трансдукторным сигналом (ST-CTP-апоптин), с последующим получением рекомбинантных лентивирусных частиц, дефектных по репликации и несущих модифицированный апоптин, которые затем вводятся в Т-лимфоциты (TILs), полученные при хирургическом удалении опухоли или в процессе получения биопсии, которые обладают способностью проникать в опухолевые ткани.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению олигопептидных соединений, содержащих мотив, взаимодействующий с ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA), и может быть использовано в медицине.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к предварительной оценке эффективности трансплантации аутологичного клеточного материала для стимуляции роста кровеносных сосудов, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ уменьшения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких или подавления увеличения продуцирующих внеклеточный матрикс клеток в легких, содержащий введение субъекту композиции, содержащей (i) носитель, содержащий ретиноид в качестве направляющего агента, и (ii) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из миРНК, рибозима, антисмысловой нуклеиновой кислоты и ДНК/РНК химерного полинуклеотида, который нацелен на HSP47, и векторов, экспрессирующих указанные миРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и/или ДНК/РНК химерный полинуклеотид.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к композициям для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает трансформацию штамма E.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой безводную гелеобразную композицию мупироцина или его фармацевтически приемлемой соли для местного применения для лечения бактериальных инфекций кожи, содержащую липофильную основу, выбранную из группы, состоящей из вазелина, среднецепочечных триглицеридов, изопропилмиристата и их смесей, биоадгезив, выбранный из группы, состоящей из поливинилпирролидона и полиметакрилатов, и растворитель, выбранный из группы, состоящей из этанола, пропанола и изопропанола.
Наверх