Способ регистрации внутриклеточного ph опухолевых клеток

Авторы патента:

Лукьянов Сергей Анатольевич (RU)

Лукина Мария Максимовна (RU)

Дружкова Ирина Николаевна (RU)

Матдашов Михаил Егорович (RU)

Ширманова Марина Вадимовна (RU)

Белоусов Всеволод Вадимович (RU)

Снопова Людмила Борисовна (RU)

Загайнова Елена Вадимовна (RU)

A61B5/05 - измерение с помощью электрического тока или магнитных полей для диагностических целей (A61B 5/02,A61B 5/04,A61B 5/11 имеют преимущество)

Владельцы патента RU 2565377:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток. Для этого осуществляют введение сенсора на внутриклеточный рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчёт сигнала. В качестве сенсора на внутриклеточный pH используют генетически-кодируемый белок SypHer2. При этом обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путём встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток. Результирующий сигнал - рациометрический. Регистрацию сигнала сенсора на внутриклеточный pH осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня. Флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм. Приём сигнала осуществляют на длине волны 540 нм с экспозицией 5 секунд. Способ обеспечивает повышение точности измерений и возможность динамического наблюдения в течение естественного роста опухоли и при различных воздействиях на неё, в том числе за счёт избирательной локализации используемого рН-сенсора в опухоли, и отсутствие зависимости измерений от концентрации рН-сенсора. 1 з.п. ф-лы, 20 ил., 4 пр.

Предлагаемое изобретение относится к исследованиям физических и химических свойств биологических тканей и может быть использовано в экспериментальной медицине для регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток в ходе естественного роста опухоли и при различных воздействиях.

Известно, что метаболизм опухолевых клеток отличается от метаболизма нормальных клеток, что приводит к различиям многих важных физиологических показателей. Одним из таких показателей является уровень внутриклеточного рН (водородный показатель). Важность этого физиологического параметра подтверждается тем фактом, что практически все патологические процессы сопровождаются изменением рН.

Установлено, что внутриклеточный рН опухолевых клеток является более щелочным по сравнению с нормальными клетками организма (7,12-7,65 при норме: 6,99-7,2), а внеклеточный рН опухоли более кислый (6,2-6,9 при норме: 7,3-7,4), т.е. в опухолевых тканях формируется обратный градиент вне- и внутриклеточного рН: защелачивание внутриклеточного рН и закисление среды вне клетки [1, 2, 3]. Отличия внеклеточного рН в опухолях и нормальных тканях уже используются в противоопухолевой терапии для направленной доставки препаратов за счет активации лекарства или его высвобождения из носителя (мицеллы, липосомы) в кислой среде опухоли [4]. В то же время большой интерес представляет разработка препаратов, направленных на восстановление градиента рН в опухолевых клетках за счет воздействия на внутриклеточные системы его регуляции (например, путем ингибирования вакуолярной Н+-АТФазы).

Более того, увеличение пролиферативной активности, уклонение от апоптоза и эффект множественной лекарственной устойчивости ассоциирован с нарушением градиента рН в опухолевых тканях [5, 6]. Кислый внеклеточный рН может значительно затруднять прохождение препаратов через плазматическую мембрану, что приводит к уменьшению накопления цитостатика в клетке. Поскольку многие из препаратов представляют собой слабые основания, существует вероятность их прямого протонирования и нейтрализации еще вне клетки в кислой межклеточной среде. Другой механизм хеморезистентности заключается в нарушении градиента рН на мембранах клеточных органелл (лизосом, эндосом, аппарата Гольджи, секреторных везикул), где также может происходить нейтрализация лекарства.

Однако несмотря на важность изучения внутриклеточного рН, адекватные методы его измерения in vivo отсутствуют. Существующие методы прижизненного измерения рН либо инвазивны (например, использование микроэлектродов), либо крайне сложны и дорогостоящи (ПЭТ, МРТ) [7]. В настоящее время активно развиваются подходы к анализу рН оптическими методами. Их существенным недостатком является необходимость экзогенного введения в клетку или ткань флуоресцентного зонда, чувствительного к рН. Флуоресцентный зонд, как правило, представляет собой синтетически синтезированное вещество, оптические характеристики которого сильно меняются при связывании с белками или иными компонентами клетки, а внутриклеточное распределение непостоянно. Зонды высокочувствительны к изменению рН, однако для их оптимального накопления в определенной ткани требуется порядка нескольких часов. Кроме того, основным недостатком этих сенсоров является их собственное влияние на значения рН в тканях [8, 9]. Использование таких зондов ограничено исследованиями in vitro, поскольку их доставка в клетки солидной опухоли проблематична.

Перспективным инструментом для анализа внутриклеточного рН в опухолях in vivo могут стать генетически кодируемые сенсоры на основе GFP-подобных белков [10, 11, 12].

Однако известные работы проводят только на клеточных культурах in vitro [13].

Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и техническому результату, выбранному в качестве прототипа, является способ регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток, включающий использование сенсора на рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет рациометрического сигнала, отражающего значение внутриклеточного рН (см. Tseng J.C. In Vivo Fluorescent Labling of Tumor Cells with the HaloTag®Technology // Cur. Chem. Gen., 2012, Vol. 6, p. 48-54).

Известный способ заключается в том, что предварительно путем трансфекции клеточной линии рака кишечника человека НСТ116 получают клетки, стабильно экспрессирующие протеин HaloTag в цитозоле, НСТ116-НТ. Затем клетки подкожно прививают иммунодифицитным мышам для получения подкожной опухоли. После формирования опухоли мышам внутривенно вводят раствор SNARF-1-лиганд (1 мг, растворенный в 100 мкл 20% ДМСО и 80% PBS). На следующий день после инъекции с помощью программного обеспечения Living Image разделяли автофлуоресценцию и флуоресценцию SNARF.

Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков:

- для накопления сенсора в опухолевых клетках требуется продолжительное время (~24 часа);

- накопление красителя SNARF не достаточно селективно, в день регистрации флуоресценции существенные помехи при регистрации сигнала возникают из-за неселективного накопления красителя в желудочно-кишечном тракте;

- спектр автофлуоресценции тканей и спектр флуоресценции SNARF перекрываются, что требует сложной математической обработки для их разделения;

- проводимые измерения не являются рациометрическими, проводят регистрацию интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении на одной длине волны, данный параметр зависит от концентрации флуорофора, которую невозможно контролировать известными способами;

- экзогенное введение красителя делает измерение однократным, т.е. не позволяет наблюдать одну и ту же опухоль в динамике в ходе естественного роста или какого-либо воздействия.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка рациометрического способа регистрации рН опухолевых клеток in vivo с использованием генетически-кодируемого сенсора с известной локализацией и с возможностью наблюдения клеток и тканей в динамике.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток, включающем использование сенсора на внутриклеточный рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет сигнала, отражающего значение внутриклеточного рН, в качестве сенсора на внутриклеточный рН используют генетически-кодируемый белок SypHer2, для чего обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путем встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток, результирующий сигнал является рациометрическим, регистрацию сигнала сенсора осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня, флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала на длине волны 540 нм, время экспозиции 5 сек, причем регистрацию сигнала сенсора осуществляют на криосрезах ткани ex vivo. Локализация белка SypHer2 является цитоплазматической.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности измерений за счет отсутствия необходимости экзогенного введения рН-сенсора, избирательной локализации рН-сенсора в опухолевых клетках, отсутствия перераспределения рН-сенсора в опухоли, отсутствия зависимости измерений от концентрации сенсора и возможность наблюдения клеток и тканей в динамике.

Данный технический результат достигается тем, что рН-сенсором в опухолевых клетках является генетически-кодируемый белок SypHer2, для этого обеспечивают его экспрессию в опухоли путем встраивания соответствующего гена в опухолевые клетки, измерение проводят рациометрическим способом при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 430 нм и 500 нм.

Белок SypHer2 - это желтый флуоресцентный белок, мономер [15]. Мономер белковой молекулы состоит из двух доменов и имеет структуру, типичную для белков семейства YFP (yellow fluorescent protein). Белок имеет два пика возбуждения на длине волны 420 нм и 500 нм и пик эмиссии на длине волны 516 нм. Экспрессия белка SypHer2 в опухолевых клетках обеспечивается путем встраивания соответствующего гена в геном клетки. Белок SypHer2 может быть локализован в заданном клеточном компартменте в результате слияния его с другим белком-мишенью.

Динамический диапазон отношения интенсивности флуоресцении на длине волны 500 нм к интенсивности флуоресценции на длине волны 420 нм равен 6. Сенсор эффективно работает в физиологическом диапазоне рН, что показано авторами заявки.

Данный технический результат обусловлен тем, что генетически-кодируемый рН-сенсор представляет собой белок SypHer2, ген которого встроен в опухолевые клетки. Опухоль вырабатывает данный белок SypHer2 - рН-сенсор - путем экспрессии в цитоплазме опухолевых клетках.

Данный белок SypHer2 не оказывает влияния на метаболизм клеток. Наличие у данного белка двух пиков возбуждения флуоресценции позволяет регистрировать не просто интенсивность флуоресценции, а рассчитывать отношение интенсивностей флуоресценции, возбуждаемых на двух разных длинах волн, что делает измерение независимым от концентрации в клетке рН-сенсора. Заданная экспрессия рН-сенсора в цитоплазме опухолевых клеток позволяет избежать трудностей, связанных с неселективным накоплением красителя при экзогенном введении, а постоянная выработка сенсора самой опухолевой клеткой позволяет проводить динамическое наблюдение в течение естественного роста опухоли и при различных воздействиях. Это означает, что при регистрации флуоресценции при заданных условиях исследователь получает данные о водородном показателе именно внутри опухолевых клеток.

При этом опухолевые клетки стабильно экспрессируют рН-сенсор в заданной локализации в процессе роста новообразования, и локализация белка не изменяется со временем, поэтому нет необходимости постоянного введения сенсора и подтверждения его локализации для проведения наблюдений.

Предлагаемый способ поясняется графическим материалом

На фиг. 1 и фиг. 2 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью к примерам 1 и 2 соответственно. На фиг. З представлены флуоресцентные изображения опухоли к примеру 3 (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2.

На фиг. 4 представлены флуоресцентные изображения криосрезов опухоли к примеру 4 (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующие гистологические изображения, окрашенные гематоксилином и эозином.

На фиг. 1 изображено:

1 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм,

2 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм,

3 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром,

4 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.

На фиг. 2 изображено:

5 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм,

6 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм,

7 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром,

8 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.

На фиг. 3 изображено:

9 - сигнал сенсора, день 7,

10 - сигнал сенсора, день 10,

11 - сигнал сенсора, день 14,

12 - сигнал сенсора, день 18,

13 - фотография опухоли, день 7,

14 - фотография опухоли, день 10,

15 - фотография опухоли, день 14,

16 - фотография опухоли, день 18.

На фиг. 4 изображено:

17 - сигнал сенсора на криосрезе толщиной 30 мкм, увеличение 200,

18 - криосрез толщиной 30 кмк, окрашенный гематоксилином и эозином,

19 - укрупненный участок зоны некроза (увеличение 400),

20 - укрупненный участок типичной опухолевой ткани (увеличение 400).

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом

Предварительно получают линию клеточной культуры Hela Kyoto, стабильно трансфецированную геном белка SypHer2 и экспрессирующую данный белок в цитоплазме.

Для регистрации внутриклеточного рН in vivo у животного с опухолью, привитой ему путем подкожной трансплантации суспензии опухолевых клеток, в которые предварительно встроен соответствующий ген белка SypHer2 и которые экспрессируют белок SypHer2 в цитоплазме, оценивают интенсивность флуоресценции белка-сенсора с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек. Авторами апробированы два режима регистрации сигнала сенсора: через кожу и путем препарирования кожного лоскута над опухолью.

Предлагаемым способом осуществлено наблюдение сигнала сенсора in vivo и ex vivo у 8 животных с привитой опухолью (рак шейки матки человека), экспрессирующей белок SypHer2 в цитоплазме клеток, в процессе естественного роста.

Результатами наблюдений стали данные о неоднородности отношения I₅₀₀/I₄₃₀ сигнала сенсора SypHer2 в пределах одного опухолевого узла и, следовательно, значения внутриклеточного рН как в трехмерных моделях опухоли, так и у экспериментальных животных. Сопоставление данных о сигнале сенсора, зарегистрированном на гистологических срезах, с данными патоморфологического анализа позволили сделать выводы о том, что в зонах некроза опухоли отношение I₅₀₀/I₄₃₀ выше, следовательно, внутриклеточный рН опухолевых клеток, находящихся в зоне некроза, является более щелочным.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1

Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.5 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. Регистрацию флуоресценции проводили через кожу на 16 день роста опухоли с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек.

Полученные изображения обрабатывали в программе EMBL_ImageJ путем вычитания фона (сигнал в зоне свободной от клеток) на каждом изображении и деления изображения, полученного при возбуждении светом с длиной волны 500 нм (I₅₀₀), на изображение, полученное при возбуждении светом с длиной волны 430 нм (I₄₃₀). Получали результирующее изображение, на котором уровень сигнала в относительных единицах отражает уровень рН. На фиг. 1 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью, где 1 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм, 2 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм, 3 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром, 4 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.

Пример 2

Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 18,3 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. На 18 день роста опухоли путем препарирования кожного лоскута непосредственно над опухолью опухоль открывали и регистрировали флуоресценцию с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек.

Полученные изображения обрабатывали аналогично примеру 1. Получали результирующее изображение, на котором уровень сигнала в относительных единицах отражает уровень рН. На фиг. 2 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью, где 5 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм, 6 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм, 7 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром, 8 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.

Пример 3

Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.0 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. После формирования опухоли в период с 7 по 18 день естественного роста опухоли проводили наблюдение сигнала сенсора с поверхности открытой опухоли, как в примере 2. Обработку изображений проводили аналогично примеру 1. На фиг. 3 представлены флуоресцентные изображения опухоли (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующие фотографии, где 9 - сигнал сенсора, день 7, 10 - сигнал сенсора, день 10, 11 - сигнал сенсора, день 14, 12 - сигнал сенсора, день 18, 13 - фотография опухоли, день 7, 14 - фотография опухоли, день 10, 15 - фотография опухоли, день 14, 16 - фотография опухоли, день 18.

Пример 4

Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.0 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. После формирования опухоли на 18 день естественного роста опухоли мышь подвергали афтаназии, опухоль вырезали. Затем опухоль разрезали в поперечном направлении на две части и помещали в жидкий азот для сохранения флуоресценции сенсора. После замораживания с помощью криотома Leica LCS 900 (Leica, Германия) получали криосрезы толщиной 20-30 мкм. Интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа DM IL LED (Leica, Германия). Обработку изображений проводили аналогично примеру 1. Затем образцы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Сопоставляли данные о гистологической структуре опухоли с данными о сигнале сенсора и выявляли взаимосвязь гистологического строения опухоли и уровня внутриклеточного рН.

На фиг. 4 представлено флуоресцентное изображение криосреза опухоли (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующее гистологическое изображение, окрашенные гематоксилином и эозином, где 17 - сигнал сенсора на криосрезе толщиной 30 мкм, увеличение 200, 18 - криосрез толщиной 30 кмк, окрашенный гематоксилином и эозином.

Проводили сопоставление сигнала сенсора и гистологического строения опухоли. Установлено, что зоны с более высоким уровнем сигнала сенсора соответствуют зонам некроза, а зоны с более низким сигналам сенсора соответствуют зонам типичной опухолевой ткани. На рисунке 19 представлен укрупненный участок зоны некроза (увеличение 400), на рисунке 20 представлен укрупненный участок типичной опухолевой ткани (увеличение 400).

Источники информации

1. Webb В.A. Dysregulated рН: a perfect storm for cancer progression // NAT. REV., 2011, Vol. 11, p. 671-677.

2. Casey J.R., Grinstein S., Orlowski J.. Sensors and regulators of intracellular pH, Nanure reviews / Molecular cell Biology, 2010, Vol. 11, p. 50-61.

3. Song C.W., Griffin R., Park H.J.. Influence of Tumor pH on Therapeutic Response, Cancer Drug Discovery and Development, 2006.

4. Iessi E. et al. Tumor acidity and malignancy: novel aspects in the design of anti-tumor therapy // Cane. Ther, 2008, Vol. 6, p. 55-66.

5. C. Rauch et al. // Ch. 3 in: Multiple Drug Resistance

6. Calderon-Montano J.M., Burgos-Moron E., Perez-Guerrero C, Salvador J., Robles Α., Lopez-Lazaro M. Role of the Intracellular pH in the Metabolic Switch between Oxidative Phosphorylation and Aerobic Glycolysis - Relevance to Cancer, WebmedCentral, 2011.

7. Zhang X. et al. Tumor pH and its mesarument // J. Nucl. Med., 2010, Vol. 51, No. 8. p. 1167-1170.

8. Judenhofer M.S, Wehrl H.F., Newport D.F., Catana C., Siegel S.B, Becker M., Thielscher Α., Kneilling M., Lichy M.P., Eichner M., Klingel K., Reischl G., Widmaier S., Ro M., Nutt R.E., Machulla H., Uludag K., Cherry S.R., Claussen C.D., Pichler B.J. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging, Nature Publishing Group, 2008.

9. Gallagher F.A., Kettunen M.I.,. Day S.E, Hu De-En, Ardenkjasr-Larsen J.H., Zandt R., Jensen P.R., Karlsson M., Golman K., Lerche M.H., Brindle K.M. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate, Nature, June 2008, Vol 453.

10. Poburko D., Santo-Domingo J., Demaurex N. Dynamic Regulation of the Mitochondrial Proton Gradient during Cytosolic Calcium Elevations. // J. Biol. Chem. 2011. 286. 11672-11684.

11. Raimondo J.V., Irkle Α., Wefelmeyer W., Newey S.E., Akerman C.J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons, Front. Mol. Neurosci., May 2012.

12. Tantama M., Hung Y.P.,. Yellen G.. Imaging Intracellular pH in Live Cells with a Genetically Encoded Red Fluorescent Protein Sensor, J. Am. Chem, 2011, vol 133 (26), pp. 10034-10037.

13 Bizzarri R. et. al. Development of a Novel GFP-based Ratiometric Excitation and Emission pH Indicator for Intracellular Studies // Biophysical J., 2006, vol. 90, p. 3300-3314.

14. Tseng J.C. In Vivo Fluorescent Labling of Tumor Cells with the HaloTag®Technology // Cur. Chem. Gen., 2012, vol. 6, p. 48-54.

15. Markvicheva K.N., Bilan D.S., Mishina N.M., et. al. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011. 19. 1079-1084.

1. Способ регистрации внутриклеточного pH опухолевых клеток, включающий использование сенсора на внутриклеточный pH, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет сигнала, отражающего значение внутриклеточного pH, отличающийся тем, что в качестве сенсора на внутриклеточный pH используют генетически-кодируемый белок SypHer2, для чего обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путем встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток, результирующий сигнал является рациометрическим, регистрацию сигнала сенсора на внутриклеточный pH осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня, флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала на длине волны 540 нм, время экспозиции 5 сек.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что регистрацию сигнала сенсора осуществляют на криосрезах ткани exvivo.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в педиатрии, неврологии, неонатологии. Способ прогнозирования риска развития неврологического дефицита у доношенных новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением головного мозга включает клиническое и нейросонографическое выявление тяжелых проявлений на 2-12 сутки жизни ребенка.

Способ диагностики поражения регионарных лимфоузлов у больных раком предстательной железы // 2564965

Изобретение относится к медицине, радионуклидным и биопсийным методам диагностики у больных раком предстательной железы (ПЖ) и может быть использовано для диагностики поражения регионарных лимфоузлов путем радионуклидной визуализации и биопсии сигнальных лимфоузлов.

Персональное устройство электроимпедансной диагностики молочной железы // 2563917

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам для электроимпедансной диагностики молочной железы. Устройство содержит матрицу измерительных электродов, отводящий электрод и размещенные в корпусе источник питания, источник зондирующего сигнала для питания активных измерительных электродов, общая шина которого соединена с отводящим электродом, многоканальный измеритель напряжения, микроконтроллер, к которому подключены модуль управления и ввода информации, модуль для вывода визуальной информации и анализатор данных, состоящий из микропроцессора, с подключенным к нему модулем памяти, в котором записаны коэффициенты линейной комбинации входных параметров, соответствующие данным репрезентативных контрольных групп пациентов.

Способ выявления несостоятельных перфорантных вен у больных варикозной болезнью нижних конечностей // 2562823

Изобретение относится к медицине, телемедицине, флебологии, физиологии. Проводят исследование напряжения путем измерения потенциалов с помощью электродов, подсоединенных к вольтметру, в участках, расположенных в области кожных покровов бедра и голени с локализацией расширенных подкожных вен.

Способ диагностики монокулярного оптического неврита в дебюте рассеянного склероза // 2562136

Изобретение относится к медицине, офтальмологии и может быть использовано для диагностики монокулярного оптического неврита в дебюте рассеянного склероза (РС). Проводят визометрию, периметрию, офтальмоскопию, оптическую когерентную томографию (ОКТ), неврологический осмотр для выявления микросимптоматики, электрофизиологические исследования (ЭФИ).

Способ оценки тяжести детского церебрального паралича (дцп) и задержек в психоречевом развитии (зпрр) // 2561290

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии и неврологии. Выявляют клинические признаки заболевания при неврологическом осмотре; регистрируют компьютерную электроэнцефалограмму, проводят эмисионно-позитронную томографию; регистрируют коротколатентные вызванные потенциалы: зрительные, слуховые, когнитивные, соматосенсорные (ССВП); проводят нейромиографию.

Формирование функциональных изображений // 2559930

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к средствам формирования функциональных изображений. Способ содержит получение первого изображения накопления первого контрастного вещества в ткани пациента, не являющейся объектом исследования, при этом первое изображение генерируется на основе первых данных от первого средства формирования изображений, получение второго изображения накопления второго контрастного вещества в исследуемой ткани пациента и ткани пациента, не являющейся объектом исследования, при этом второе изображение генерируется на основе вторых данных от другого второго средства формирования изображений, генерирование первой маски изображения на основе первого изображения, генерирование первого изображения особенности на основе второго изображения и первой маски изображения и отображение первого изображения особенности, которое не включает в себя накопление контрастного вещества в исследуемой ткани, не накапливающей контрастное вещество.

Измеритель электростатического потенциала и заряда тела человека // 2559574

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано в медицине в диагностических целях. Техническим результатом является расширение функциональных возможностей устройства за счет измерения электрического заряда тела человека.

Система и способ интегрированной биопсии и лечения // 2558521

Группа изобретений относится к способам и системам для объединения диагностики и лечения внутренних органов. Способ включает в себя этапы, на которых визуализируют часть внутреннего органа субъекта с использованием первой технологии, способной различать типы тканей, задают в качестве цели участки биопсии и обеспечивают доступ к участкам биопсии для инструмента с использованием изображений, полученных первой технологией, скомбинированных с изображениями, полученными второй технологией, способной обновлять изображения в реальном масштабе времени, планируют лечение одного из участков биопсии с использованием изображений, полученных первой технологией, и комбинируют изображения, полученные первой технологией, с изображениями, полученными второй технологией, и направляют инструменты к по меньшей мере одному участку биопсии с использованием комбинированных изображений.

Аппаратно-программный комплекс оценки функциональных резервов организма и рисков развития распространенных неинфекционных заболеваний // 2558453

Изобретение относится к медицине, диагностике, может быть использовано для комплексной скрининг-оценки состояния здоровья пациентов. Аппаратно-программный комплекс оценки функциональных резервов организма включает хотя бы одно терминальное устройство (ТУ) пациента - компьютер с загруженным программным приложением для психологического тестирования, хранилищем данных с базами данных (БД) пациентов, их антропометрических показателей, результатов выполненных тестов, БД тестов, БД текстовых, графических и звуковых объектов, используемых в тестах.

Обработка набора данных изображения // 2565521

Изобретение относится к формированию обработанного набора данных изображения. Техническим результатом является повышение точности обработки набора данных изображения пациента. Система содержит: множество наборов данных параметров, причем набор данных параметров соответствует клинически классифицированной популяции пациентов и представляет передаточную функцию, при этом набор данных параметров включает в себя статистическое распределение измеренных характеристик клинически классифицированной популяции пациентов; блок выбора, реализованный в виде узла обработки аппаратного обеспечения компьютера, для выбора набора данных параметров из множества наборов данных параметров; и подсистему обработки изображений, реализованную в виде указанного узла обработки аппаратного обеспечения компьютера, для применения передаточной функции, представленной выбранным набором данных параметров, для по меньшей мере части набора данных изображения, характерного для пациента, для получения обработанного набора данных изображения. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил.

Способ снятия аналоговых сигналов для определения функционального состояния слушающего при помощи наушников // 2565652

Изобретение относится к медицине, диагностике, способам измерения кожно-гальванической реакции в наружных слуховых проходах. Способ может быть использован для контроля состояния бодрствования и сна слушающего и управления воспроизведением в зависимости от уровня восприятия слушающего. Используют не менее чем два контактных электрода, выполненные в форме электропроводящих участков корпуса наушников. Электроды размещают в наружных слуховых проходах, при этом электропроводящими участками могут быть выполнены полностью или частично амбушюры наушников или поверхность тех частей наушников, которые контактируют с ухом человека. Производят измерение кожно-гальванической реакции кожи на ушах слушающего, исходя из того, что не менее чем один электрод контактирует с кожей одного уха и не менее чем один электрод контактирует с кожей другого уха. Техническим результатом изобретения является портативность, удобство прослушивания аудиоматериалов в состоянии утомления и в процессе засыпания облегчение (стимулирование) засыпания при бессоннице, упрощение анализа состояний бодрствования и сна без необходимости наложения дополнительных электродов на другие части тела. 4 ил.

Способ диагностики распространения неопластического процесса пищевода // 2566185

Изобретение относится к медицине, лучевой диагностике и может быть использовано для диагностики распространения неопластического процесса пищевода путем магнитно-резонансной томографии (МРТ). Комплексное МРТ-исследование проводят до лечения и в процессе контроля результатов химио- и/или лучевой терапии. Исследование включает три этапа. На первом получают Т2 взвешенные изображения высокого разрешения в аксиальной и сагиттальной плоскостях, используя импульсную последовательность быстрого спин-эхо со следующими параметрами: поле обзора (FOV) 32, толщина среза (slice thickness) 4,0, период повторения последовательности (TR) 675, время появления эхо-сигнала (ТЕ) 100, матрица частоты (frequency) и фазы (phase) соответственно 384 и 256, длина эхо-трейна (etl) 23, количество возбуждений выбранного слоя (NEX) 4. По полученным изображениям судят о протяженности неопластического процесса, дифференцировке слоев пищевода, отношении его к окружающим органам и тканям, а также о наличии метастатических изменений и спорных участков поражения неопластическим процессом, визуализацию которых уточняют с помощью МРТ-исследования второго этапа. Для этого на втором этапе получают диффузионно-взвешенные изображения (ДВИ) в аксиальной плоскости со следующими параметрами импульсной последовательности: значение B-value 800, поле обзора (FOV) 36, толщина среза (slice thickness) 5,0, период повторения последовательности (TR) 8000, время появления эхо-сигнала (ТЕ) минимальное (min), матрица частоты (frequency) и фазы (phase) соответственно 128 и 192, количество возбуждений выбранного слоя (NEX) 16. Визуализируют спорные и метастатические участки поражения на Т2 взвешенных изображениях с помощью картирования полученных данных ДВИ на Т2 взвешенные изображения. На третьем этапе получают Т1 взвешенные изображения в режиме подавления сигнала от жировой ткани до и после введения гадолиний-содержащего контрастного вещества, используя последовательность быстрого очищенного вызванного градиентами эхо со следующими параметрами: поле обзора (FOV) 32, толщина среза (slice thickness) 4,0, период повторения последовательности (TR) 370, время появления эхо-сигнала (ТЕ) минимальное (min), угол отклонения (Flip angle) 80, матрица частоты (frequency) и фазы (phase) соответственно 384 и 384, длина эхо-трейна (etl) 23, количество возбуждений выбранного слоя (NEX) 2. По степени накопления контрастного вещества уточняют степень поражения тканей неопластическим процессом. Способ обеспечивает повышение информативности диагностики данной патологии за счет комплексного подхода к исследованию, улучшения визуализации при МРТ, оптимизации параметров исследования. 2 пр.

Система и способ компьютеризированной диагностики с множественными модальностями // 2566462

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к средствам обработки изображений множественных модальностей для скрининга на рак молочной железы. Система содержит загрузчик изображений, включающий процессор, при этом изображения множественных модальностей содержат изображение маммограммы, ультразвуковое изображение и MRI изображение, устройство просмотра изображений, одновременно отображающее инструментальную панель, включающую в себя меню и пиктограммы, с помощью которых пользователь выбирает функции, которые должны быть выполнены процессором для генерирования диагностической информации из изображений, изображения множественных модальностей и диагностическую информацию, причем диагностическая информация отображается на участке устройства просмотра изображений, который является отдельным от отображения изображений множественных модальностей и инструментальной панели. Процессор включает в себя инструмент анализа с функциями, выбранными на отображенной инструментальной панели для оценки и генерирования отчета. Способ обработки заключается в работе системы. Второй вариант выполнения системы состоит в том, что имеется средство для одновременного отображения изображений множественных модальностей, упомянутой инструментальной панели и отчета с диагностической информацией на устройстве просмотра изображений, причем отчет с диагностической информацией отображается на участке устройства просмотра изображений, который является отдельным от отображения изображений множественных модальностей. Использование изобретения позволяет повысить точность постановки диагноза. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 ил.

Способ диагностики гиперактивного мочевого пузыря у пациентов с аденомой предстательной железы // 2567607

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, андрологии, онкологии, и может быть использовано для выявления гиперактивного мочевого пузыря у пациентов с аденомой предстательной железы. Проводят компьютерную или магнитно-резонансную томографию предстательной железы и мочевого пузыря. Исследование проводят в сагиттальной проекции, выполненной на уровне уретры. При выявлении дивертикула мочевого пузыря, направляющегося от шейки мочевого пузыря прямо вниз, дорсально и каудально, симптома "зубьев пилы" в области шейки мочевого пузыря и дна дивертикула, скопления в мочевом пузыре конкрементов, имеющих форму "медальона", диагностируют гиперактивный мочевой пузырь. Способ позволяет неинвазивно и безопасно, с высокой точностью и просто провести диагностику за счет использования компьютерной или магнитно-резонансной томографии и выявления комплекса значимых объективных данных. 4 ил., 3 пр.

Способ определения наклона суставной поверхности головки первой плюсневой кости стопы // 2567825

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для определения угла наклона суставной поверхности головки первой плюсневой кости стопы. Выполняют магниторезонансную томографию (МРТ) стопы. Ориентируют направление срезов в коронарной плоскости по оси первой плюсневой кости. Визуализируют первую плюсневую кость и хондральный слой головки первой плюсневой кости. Выделяют границу хондрального слоя головки первой плюсневой кости. На снимке МРТ отмечают латеральную и медиальную крайние точки на суставной поверхности головки первой плюсневой кости, расположенные на границе соединения хряща с костью. Проводят линию продольной оси диафиза первой плюсневой кости и перпендикуляр к линии, соединяющей крайние точки на суставной поверхности головки первой плюсневой кости. Измеряют угол между линией продольной оси диафиза и перпендикуляром. Способ обеспечивает повышение точности определения угла наклона суставной поверхности головки первой плюсневой кости до оперативного лечения, выбор оптимальной тактики хирургического вмешательства, снижение рецидивов заболевания, сокращение сроков лечения за счет выполнения МРТ стопы, визуализации и точного определения границ хондрального слоя головки плюсневой кости. 15 ил., 2 пр.

Ультразвуковая терапия с наведением по мр-визуализации // 2568356

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к терапевтическим системам. Система содержит блок ультразвуковой терапии, выполненный с возможностью облучения ультразвуком по меньшей мере части тела пациента с использованием ультразвука высокой интенсивности, причем блок ультразвуковой терапии содержит ультразвуковой облучатель, прикрепленный к столу пациента, служащему опорой для его тела, и размещенный под отверстием в столе для проведения лечения, и блок MP-визуализации, выполненный с возможностью получения MP-сигналов от части тела и реконструкции MP изображения по MP-сигналам, причем блок МР-визуализации содержит РЧ приемную антенну, целиком встроенную в стол пациента, расположенную по периферии отверстия для проведения лечения и полностью закрытую кожухом стола пациента. Использование изобретения позволяет повысить качество изображения близко к ультразвуковому облучателю и эксплуатационную пригодность терапевтической системы. 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

Способ управления состоянием массы тела у животного // 2569698

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается управления состоянием массы домашнего животного, в частности кошек и собак. Предложенные варианты способа включают предварительное определение безжировой массы тела или телесного жира с учетом выбранных физических данных домашнего животного и расчетом показателей по определенным уравнениям. Это позволяет адекватно определить соответствующий режим снижения массы тела. Варианты способа обеспечивают объективизацию состояния животных с избыточной массой и тучных животных для успешного управления состоянием их массы. 14 н.п. ф-лы, 2 пр., 2 табл., 5 ил.

Биотехническая система контроля биоимпеданса // 2570071

Изобретение относится к медицинской технике. Биотехническая система контроля биоимпеданса состоит из ЭВМ и мобильного блока, содержащего активный и пассивный электроды и их токоподводы, электронный модуль, аккумуляторный блок питания и беспроводный интерфейс, подключенный к выходу электронного модуля и осуществляющий через радиоканал связь мобильного блока с ЭВМ. Корпус мобильного блока выполнен в виде полого цилиндра, закрытого с одной стороны конусообразным колпачком, а с другой стороны - цилиндрической крышкой. Внутри корпуса расположены электронный модуль и мембрана, закрепленная перпендикулярно продольной оси цилиндрического корпуса, в центре которой закреплен один из концов стержня активного электрода. Другой конец активного электрода установлен в осевое отверстие конусообразного колпачка. На наружной поверхности корпуса установлены пассивный электрод, выполненный в виде токопроводящего кольца, кнопка, беспроводный интерфейс и аккумуляторный блок питания, общий провод которого подключен к пассивному электроду и первому выводу кнопки. Применение изобретения позволит повысить точность и оперативность биоимпедансных исследований за счет возможности пациента самостоятельно снимать информацию с поверхности кожи и тем самым контролировать силу давления электрода, а также за счет передачи данных биоимпедансных исследований в телекоммуникационные сети в реальном времени. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

Устройство и способ генерации и перемещения магнитного поля, имеющего линию отсутствия поля // 2570288

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к средствам генерации и изменения магнитного поля в поле обзора. Устройство для генерации и изменения магнитного поля в поле обзора, имеющем первую подзону шарообразной или линейной формы, имеющую низкую напряженность магнитного поля, и вторую подзону, имеющую более высокую напряженность магнитного поля, содержит по меньшей мере три пары первых катушек, при этом катушки расположены по кольцу вокруг поля обзора на равных или неравных расстояниях от центра поля обзора, причем две катушки из каждой пары размещены напротив друг друга на противоположных сторонах поля обзора, по меньшей мере одну пару вторых катушек, размещенных напротив друг друга на противоположных сторонах поля обзора на открытых сторонах кольца, генераторное средство сигналов тока для снабжения первых и вторых катушек и средство управления для генерации сигналов тока для поля выбора для снабжения первых катушек так, чтобы по меньшей мере три пары первых катушек генерировали градиентное магнитное поле выбора, имеющее такую пространственную конфигурацию напряженности магнитного поля, что в поле обзора формируются первая подзона и вторая подзона, имеющая более высокую напряженность магнитного поля, и сигналов тока поля возбуждения для снабжения вторых катушек и двух пар первых катушек так, чтобы по меньшей мере одна пара вторых катушек и две пары первых катушек генерировали однородное магнитное поле возбуждения для изменения положения в пространстве двух подзон в поле обзора. Устройство получения изображений с помощью магнитных частиц содержит устройство для генерации и изменения магнитного поля в поле обзора. Способ генерации и изменения магнитного поля состоит в этапах работы с устройством генерации. Использование изобретения позволяет повысить эффективность сканирования и снизить потери энергии. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 10 ил.