Антитела, связывающиеся преимущественно с внеклеточным доменом 4 человеческого csf-1r, и их применение

Авторы патента:

ЗЕБЕР Штефан (DE)

РИС Карола (DE)

ФЕРТИГ Георг (DE)

КАЛУЦА Клаус (DE)

ПИКЛЬ Марлене (DE)

ЛАНЦЕНДЁРФЕР Мартин (DE)

ДИМОУДИС Николаос (DE)

ФИДЛЕР Александер (DE)

C07K16/28 - против рецепторов, клеточных поверхностных антигенов или клеточных поверхностных детерминантов

A61P37/00 - Лекарственные средства против иммунологических или аллергических заболеваний

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

Владельцы патента RU 2565541:

Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам к человеческому CSF-1R, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и вариантам их применения. Заявлены варианты антитела, связывающегося с CSF-1R, а также фармацевтическая композиция для лечения опосредуемых CSF-1R заболеваний. Также заявлены варианты применения указанного антитела и способ его получения с необходимыми для этого нуклеиновой кислотой, экспрессионным вектором и клеткой-хозяином. Изобретение позволяет эффективно ингибировать рост клеток, экспрессирующих CSF-1R. 12 н. и 10 з.п. ф-лы, 13 ил., 11 табл., 12 пр.

Настоящее изобретение относится к антителам в человеческому CSF-1R (антитела к CSF-1R), способам их получения, фармацевтическим композициям, которые содержат указанные антитела, и вариантам их применения.

Предпосылки создания изобретения

Рецептор человеческого CSF-1 (CSF-1R; рецептор колониестимулирующего фактора 1; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, протоонкоген Fms, c-fms, SEQ ID NO:62) известен с 1986 г. (Coussens L. и др., Nature 320, 1986, сс.277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth P. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181, 1992, сс.141-67).

CSF-1R представляет собой рецептор CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1) и опосредует биологические действия указанного цитокина (Sherr C.J. и др., Cell 41, 1985, сс.665-676). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1R) (который обозначают также как c-fms) впервые описано у Roussel M.F. и др., Nature 325, 1987, сс.549-552. В этой публикации описано, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-концевом «хвосте» белка, включая утрату способности ингибировать фосфорилирование тирозина 969, который связывается с каннабиоидным рецептором Cbl, и тем самым регулирует понижающую регуляцию рецептора (Lee P.S. и др., Embo J. 18, 1999, сс.3616-3628). В последние годы идентифицирован второй лиганд для CSF-1R, обозначенный как интерлейкин-34 (IL-34) (Lin Н. и др., Science, 320, 2008, сс.807-811).

Цитокин CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1) присутствует вне клетки в виде связанного дисульфидным мостиком гомодимера (Stanley E.R. и др., Journal of Cellular Biochemistry 21, 1983, сс.151-159; Stanley E.R. и др., Stem Cells 12, приложение 1, 1995, сс.15-24).

Основными биологическими действиями, связанными с передачей сигналов CSF-1R, являются дифференцировка, пролиферация, миграция и выживание гематопоэтических клеток-предшественников линии дифференцировки макрофагов (включая остеокласты). Активация CSF-1R опосредуется его лигандами, т.е. CSF-1 (M-CSF) и IL-34. Связывание CSF-1 (M-CSF) с CSF-1R индуцирует образование гомодимеров и активацию киназы путем фосфорилирования тирозина (Li W. и др., EMBO Journal. 10, 1991, сс.277-288; Stanley E.R. и др., Mol. Reprod. Dev. 46, 1997, сс.4-10).

Биологически активный гомодимер CSF-1 связывается с CSF-1R в субдоменах D1-D3 внеклеточного домена рецептора CSF-1 (CSF-1R-ECD). CSF-1R-ECD содержит пять иммуноглобулинподобных субдоменов (обозначены как D1-D5). Субдомены D4-D5 внеклеточного домена (CSF-1R-ECD) не участвуют в связывании CSF-1 (Wang Z. и др., Molecular and Cellular Biology 13, 1993, сс.5348-5359). Субдомен D4 участвует в димеризации (Yeung Y-G. и др., Molecular & Cellular Proteomics 2, 2003, сс.1143-1155; Pixley F.J. и др., Trends Cell Biol 14, 2004, cc.628-638).

Кроме того передача сигналов опосредуется р85-субъединицей PI3K и Grb2, связанными с путями PI3K/AKT и Ras/MAPK соответственно. Указанные два важных пути передачи сигналов могут регулировать пролиферацию, выживание и апоптоз. Другими сигнальными молекулами, которые связываются с фосфорилированным внутриклеточным доменом CSF-1R, представляют собой STAT1, STAT3, PLCy и СЫ (Bourette R.P. и Rohrschneider L.R., Growth Factors 17, 2000, сс.155-166).

Передача сигналов CSF-1R имеет физиологическое значение для иммунных ответов, для ремоделирования кости и для репродуктивной системы. Установлено, что животные, у которых «выключен» либо CSF-1 (Pollard J.W., Mol. Reprod. Dev. 46, 1997, сс.54-61), либо CSF-1R (Dai X.M. и др., Blood, 99, 2002, сс.111-120), имеют такие остеопетрозные, гематопоэтические фенотипы, фенотипы тканевых макрофагов и репродуктивной системы, которые свидетельствуют о роли CSF-1R в соответствующих типах клеток.

Sherr C.J. с соавторами в: Blood, 73, 1989, сс.1786-1793 описали некоторые антитела к CSF-1R, которые ингибируют активность CSF-1 (см. Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793). Ashmun R.A. и др., Blood, 73, 1989, сс.827-837 описали антитела к CSF-1R. Lenda,D. и др., Journal of Immunology, 170, 2003, сс.3254-3262 описали снижение рекрутмента, пролиферации и активации макрофагов у мышей с дефицитом CSF-1, что приводило к пониженному апоптозу в трубочках при воспалении почек. Kitaura H. и др., Journal of Dental Research, 87, 2008, сс.396-400 описали антитело к CSF-1, которое ингибирует ортодонтическое перемещение зубов. В WO 2001/030381 упомянуты ингибиторы активности CSF-1, включающие антисмысловые нуклеотиды и антитела, но описаны только антисмысловые нуклеотиды CSF-1. В WO 2004/045532 описано предупреждение метастазов и потери костной ткани и лечение метастического рака с помощью антагониста CSF-1, при этом описаны только антагонистические антитела к CSF-1. В WO 2005/046657 описано лечение воспалительного заболевания кишечника в помощью антител к CSF-1. В US 2002/0141994 описаны ингибиторы колониестимулирующих факторов. В WO 2006/096489 описано лечение ревматоидного артрита с помощью антител к CSF-1. В WO 2009/026303 и WO 2009/112245 описаны конкретные антитела к CSF-1R, связывающиеся с CSF-1R, в первых трех субдоменах (D1-D3) внеклеточного домена (CSF-1R-ECD).

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO:64) в соотношении 1:50 или менее.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

а) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:8,

б) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:16,

в) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:75, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:76,

г) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:83, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:84, или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

или к его гуманизированной версии.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

а) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:24, или

б) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, или

в) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:40, или

г) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:47, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:48, или

д) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:55, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:56.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

а) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:1, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6, или

б) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:9, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:10, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:11, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:12, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:13, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:14, или

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

г) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:25, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:26, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:27, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:28, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:29, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:30, или

д) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:33, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:34, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:35, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:36, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:37, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:38, или

е) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42 и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46, или

ж) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:49, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:50, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:51, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:52, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:53, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:54, или

з) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:69, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:70, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:71, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:72, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:73, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:74, или

и) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:77, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:78, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:79, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:80, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:81, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:82.

Предпо4 тительно антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой 4елове4еское антитело подкласса IgG1 или человеческое антитело подкласса IgG4.

Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая антитело, предлагаемое в изобретении.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения опосредуемого CSF-1R заболевания.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для

лечения рака.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения потери костной ткани.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения метастазов.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных заболеваний.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения опосредуемого CSF-1R заболевания.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения рака.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения потери костной ткани.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения метастазов.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения воспалительных заболеваний.

Следующим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, предлагаемое в изобретении, которое отличается тем, что

а) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:1, СОР2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6, или

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

г) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:83, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:84, или его гуманизированную версию.

Изобретение относится также к экспрессионным векторам, которые сдержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которые обладают способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и к клеткам-хозяевам, которые содержат указанные векторы, предназначенные для получения методом рекомбинации антитела, предлагаемого в изобретении.

Изобретение относится также к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, которая содержит вектор, предлагаемый в изобретении.

Изобретение относится также к способу получения рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют антитело из клетки или супернатанта клеточной культуры. Изобретение относится также к антителу, полученному методом рекомбинации.

Антитела, предлагаемые в изобретении, оказывают благоприятное действие на пациентов, которые нуждаются в направленной на CSF-1R терапии. Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают также высокой антипролиферативной активностью в отношении независящей от лиганда и зависящей от лиганда пролиферации и поэтому их особенно предпочтительно применять для лечения рака и метастазов.

Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, заключающемуся в том, что пациенту, у которого диагностировано наличие указанного заболевания (и который поэтому нуждается в такой терапии), вводят в эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении. Антитело вводят предпочтительно в составе фармацевтической композиции.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, страдающего раком, отличающийся тем, что вводят пациенту антитело, предлагаемое в изобретении.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что, используя фрагмент человеческого CSF-1R delD4, в котором D4-субдомен человеческого CSF-1R-ECD удален в результате делеции (SEQ ID NO:65), можно отбирать новые антитела к CSF-1R. Эти антитела обладают ценными свойствами, такими как очень высокое зависящее от лиганда ингибирование клеточного роста и в то же время независящее от лиганда ингибирование роста клеток линии NIH 3Т3, инфицированных ретровирусным экспрессионным вектором, несущим либо полноразмерный CSF-1R дикого типа (SEQ ID NO:62), либо мутант CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID NO:63), при этом несущие мутантный CSF-1R рекомбинантные клетки обладают способностью формировать сфероиды вне зависимости от лиганда CSF-1. Кроме того, антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют дифференцировку макрофагов как у человека, так и у яванского макака-крабоеда (циномолгус) (у обоих видов), поскольку они ингибируют выживаемость моноцитов человека и обезьяны циномолгус.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO:65) и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO:64) в соотношении 1:50 или менее.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, отличающемуся тем, что содержит в качестве CDR3-участка вариабельной области тяжелой цепи CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:55.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, отличающемуся тем, что

или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, отличающемуся тем, что

в) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO; 75, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:76,

или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, отличающемуся тем, что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, или к его гуманизированной версии.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:24.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:32.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:40.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:47, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:48.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:75, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:76, или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:83, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:84, или к его гуманизированной версии.

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, которое отличается тем, что

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

ж) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:49, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:50, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:51, и вариабельная область содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:52, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:53, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:54, или

а) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:69, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:70, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 71, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:72, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:73, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:74, или

б) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:77, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:78, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:79, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:80, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:81, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:82.

а) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

б) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:25, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:26, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:27, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:28, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:29, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:30, или

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:33, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:34, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:35, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:36, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:37, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:38, или

г) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42 и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46, или

д) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:49, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:50, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:51, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:52, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:53, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:54.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отли4ается тем, что

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22.

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:25, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:26, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:27, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:28, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:29, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:30.

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:33, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:34, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:35, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:36, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:37, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:38.

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличается тем, что антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) и с человеческим CSF-1R-ECD (SEQ ID NO:64) в соотношении 1:50 или менее, и отличается также тем, что не связывается с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3(SEQ ID NO:66).

Понятие «антитело» относится к различным формам антител, включая (но не ограничиваясь ими) полные антитела, фрагменты антител, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с истощенными Т-клеточными эпитопами и, кроме того, созданные с помощью генной инженерии антитела, если они сохраняют отличительные признаки, предлагаемые в изобретении. Понятие «фрагменты антитела» относится к части полноразмерного антитела, предпочтительно к его вариабельной области или по меньшей мере к его антигенсвязывающему центру. Примерами фрагментов антител являются димерные антитела (диабоди), молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела формата scFv описаны, например, у Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, сс.46-88. Кроме того, к фрагментам антитела относятся одноцепочечные полипептиды, которые имеют характеристики V_H-области, связывающейся с CSF-1R, а именно, обладают способностью объединяться с V_L-областью, или V_H-области, связывающейся с CSF-1R, а именно, обладают способностью объединяться с V_L-областью с образованием функционального антигенсвязывающего центра и, следовательно, обладающие требуемым свойством.

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату молекул антитела, которые имеют одинаковый состав аминокислот.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему мышиную вариабельную область, т.е. связывающую область, и по меньшей мере одну часть константной области из другого источника или других видов, как правило, полученному с помощью методов рекомбинантной ДНК. Химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область, являются наиболее предпочтительными. Такие крысиные/человеческие химерные антитела представляют собой продукт экспрессированных генов иммуноглобулина, которые содержат ДНК-сегменты, кодирующие вариабельные области крысиного иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, кодирующие константные области человеческого иммуноглобулина. Другие формы «химерных антител», подпадающие под объем настоящего изобретения, представляют собой такие формы, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен относительно исходного антитела. Такие «химерные» антитела обозначают также как «антитела переключенного класса». Методы получения химерных антител включают общепринятые методы, основанные на применении рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые в настоящее время хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Ргос.Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, сс.6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина из других видов по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, получая «гуманизированное антитело» (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс.268-270). Необязательно каркасный участок можно модифицировать с помощью дополнительных мутаций. CDR также можно модифицировать с помощью одной или нескольких мутаций с получением антител, предлагаемых в изобретении, например, с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании, который описан у Riechmann L. и др., Nature, 332, 1988, сс.323-327 и Queen С. и др., Ргос.Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс.10029-10033, или у других авторов. Наиболее предпочтительные CDR соответствуют CDR, которые имеют репрезентативные последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных антител. «Гуманизированная версия антитела, предлагаемого в изобретении» (которое, например, происходит из организма мышей), относится к антителу, основой которого являются последовательности мышиного антитела, в которых V_H и V_L гуманизированы стандартными методами (включая трансплантацию CDR и необязательно последующий мутагенез определенных аминокислот в каркасном участке и CDR). Предпочтительно указанная гуманизированная версия является химеризованной с помощью человеческой константной области (см., например, последовательности SEQ ID NO:57-61).

Другими формами «гуманизированных антител», подпадающим под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых константная область дополнительно модифицирована или изменена относительно исходного антитела с получением свойств, указанных в изобретении, прежде всего касательно C1q-связывания и/или связывания с Fc-рецептором (FcR).

В приведенных ниже примерах понятия «МАт» и «тиМАт» относятся к мышиным моноклональным антителам, таким как МАт 2F11 или МАт 2Е10, а понятие «hМАт» относится к гуманизированным моноклональным версиям указанных мышиных антител, таким как hМАт 2F11-c11, hМАт 2F11-d8, hМАт 2F11-е7, hМАт 2F11-f12 и т.д.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, сс.368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые обладают способностью после иммунизации вырабатывать полный спектр или определенный набор человеческих антител в отсутствии производства эндогенных иммуноглобулинов. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии в указанных мышей мутантной зародышевой линией может приводить к образованию человеческих антител после антигенной стимуляции (см., например, Jakobovits А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс.2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature, 362, 1993, сс.255-258; Brueggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, сс.33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter G.J. Mol. Biol., 227, 1992, сс.381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс.581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно применять также методы, разработанные Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole S.P.C. и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, с.77; и Boerner Р. и др., J. Immunol. 147, 1991, сс.86-95). Как уже отмечалось для химерных и гуманизированных антител, согласно настоящему изобретению в контексте настоящего описания понятие «человеческое антитело» относится также к таким антителам, которые модифицированы в константной области для придания им свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно C1q-связывания и/или FcR-связывания, например, посредством «переключения класса», т.е. изменения или мутации Fc-областей (например, посредством замены IgG1 на IgG4 и/или IgG1/IgG4-мутации).

Подразумевается, что понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, из мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектируют клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергали in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные последовательности V_H- и V_L-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей V_H- и V_L-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, но могут не встречаться в существующем в естественных условиях in vivo спектре зародышевых линий человеческого антитела.

Антитела, предлагаемые в изобретении, включают также указанные антитела, несущие «консервативные модификации последовательностей», т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не влияют или не изменяют указанные выше характеристики антител, предлагаемых в изобретении. Модификации можно интродуцировать с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайнаправленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых один аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическим боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, определенный остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе к CSF-1R можно предпочтительно заменять на другой аминокислотный остаток с боковой цепью из того же семейства боковых цепей.

Аминокислотные замены можно осуществлять с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании, который описан у Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс.323-327 и Queen С.и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, сс.10029-10033.

Человеческий CSF-1R (рецептор CSF-1; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, протоонкоген Fms, c-fms, SEQ ID NO:22) известен с 1986 г.(Coussens L. и др., Nature 320, 1986, сс.277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth P. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181, 1992, сс.141-167).

CSF-1R представляет собой рецептор CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF) и IL-34, и он опосредует биологические действия указанных цитокинов (Sherr C.J. и др., Cell 41, 1985, сс.665-676; Lin H. и др., Science, 320, 2008, сс.807-811). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1R) (который обозначают также как с-fms) впервые описано у Roussel M.F. и др., Nature 325, 1987, сс.549-552. В этой публикации было продемонстрировано, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-концевом «хвосте» белка, включая утрату способности ингибировать фосфорилирование тирозина 969, который связывается с Cb1, и тем самым регулирует понижающую регуляцию рецептора (Lee P.S. и др., Embo J. 18, 1999, сс.3616-3628).

CSF-1R представляет собой одноцепочечный трансмембранный тирозинкиназный рецептор (RTK) и является представителем семейства содержащих иммуноглобулиновый (Ig) мотив RTK, отличающихся присутствием 5 повторяющихся Ig-подобных субдоменов D1-D5 во внеклеточном домене (ECD) рецептора (Wang Z. и др., Molecular and Cellular Biology 13, 1993, сс.5348-5359). Внеклеточный домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO:64) содержит все пять внеклеточных Ig-подобных субдоменов D1-D5. Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) содержит внеклеточные Ig-подобные субдомены D1-D3 и D5, но в нем отсутствует субдомен D4. Фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO:66) содержит соответствующие субдомены D1-D3. Представленные последовательности не содержат сигнальный пептид MGSGPGVLLL LLVATAWHGQ G (SEQ ID NO:67).

Внутриклеточный протеинтирозинкиназный домен прерывается уникальным доменом-вставкой, который присутствует также в других представителях родственных RTK класса III, к которым относятся рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (c-Kit) и fins-подобный цитокиновый рецептор (FLT3). Несмотря на структурную гомологию, характерную для этого семейства рецепторов факторов роста, они обладают различными тканеспецифическими функциями.

CSF-1R экспрессируется главным образом на клетках линии дифференцировки моноцитов и в женских половых путях и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса, присутствующих в коже, подгруппе клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, сс.5693-5699), в В-клетках (Baker A.H. и др., Oncogene 8, 1993, с.371-378) и в микроглии (Sawada М. и др., Brain Res. 509, 1990, сс.119-124). Для клеток с мутантным человеческим CSF-1R (SEQ ID NO:23) известна способность к пролиферации, независящей от стимуляции лигандами.

В контексте настоящего описания понятия «связывается с человеческим CSF-1R» или «специфически связывает с человеческим CSF-1R» относятся к антителу, специфически связывающемуся с человеческим антигеном CSF-1R, при этом аффинность связывания при 35°С характеризуется величиной KD, составляющей 1,0×10^-8 моль/л или ниже, в одном из вариантов осуществления изобретения величина KD при 35°С составляет 1,0×10^-9 моль/л или ниже. Аффинность связывания определяют при 35°С с помощью стандартного анализа связывания, такого как поверхностный плазменный резонанс (SPR) (Biacore®, фирма GE-Healthcare Уппсала, Швеция). Метод определения величин KD, характеризующих аффинность связывания, описан в примере 9. Таким образом, в контексте настоящего описания понятие «антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R» относится к антителу, которое специфически связывается с человеческим антигеном CSF-1R, аффинность связывания которого характеризуется величиной KD, составляющей при 35°С 1,0×10^-8 моль/л или ниже (предпочтительно 1,0×10^-8 моль/л - 1,0×10^-12 моль/л), предпочтительно величиной KD, составляющей при 35°С 1,0×10^-9 моль/л или ниже (предпочтительно 1,0×10^-9 моль/л - 1,0×10^-12 моль/л).

Согласно настоящему изобретению «связывание с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO:64)» оценивают с помощью метода поверхностного плазменного резонанса (Biacore-анализ), который описан в примере 4. Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) или внеклеточный домен человеческого CSF-1R (SEQ ID NO:64) соответственно иммобилизуют на поверхности (каждый на различной поверхности) и добавляют тестируемые антитела (осуществляя для каждого различные измерения) и определяют соответствующие сигналы связывания (единицы ответа (RU)). Вычитают референс-сигналы («пустая» поверхность). Если сигналы для несвязывающихся тестируемых антител несколько ниже 0, то их величины принимают за 0. Затем определяют соотношение соответствующих сигналов связывания (сигнал связывания (RU) с фрагментом человеческого CSF-1R delD4/сигнал связывания (RU) с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)). Для антител, предлагаемых в изобретении, характерно соотношение сигналов связывания (RU(delD4)/RU(CSF-1R-ECD), составляющее 1:50 или ниже, предпочтительно 1:100 или ниже (наиболее низкое значение включает конечное значение, равное 0 (например, если величина RU равна 0, то соотношение составляет 0:50 или 0:100)).

Это означает, что указанные антитела к CSF-1R, предлагаемые в изобретении, не связываются с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (типа антитела к CCR5, обозначенного как m<CCR5>Pz03.1C5 (депонировано под регистрационным номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г. в DSMZ), и их сигналы связывания, характеризующие связывание с фрагментом человеческого CSF-1R delD4, соответствуют сигналам антитела к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5, которые составляют менее 20 RU (единицы ответа), предпочтительно менее 10 RU при анализе методом поверхностного плазменного резонанса (BIAcore-анализ), изложенного в примере 4.

Понятие «связывание с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3» относится к определению аффинности связывания с помощью поверхностного плазменного резонанса (BIAcore-анализ). Тестируемое антитело иммобилизуют на поверхности и добавляют фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66), определяют соответствующие аффинности связывания. Понятие «отсутствие связывания с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3» означает, что при применении указанного анализа обнаруженный сигнал находился в области, не превышающей больше чем в 1,2 раза фоновый сигнал, и поэтому нельзя определить ни наличие значимой аффинности связывания, ни отсутствие связывания (см. пример 10).

Одним из вариантов осуществления изобретения является способ скрининга, который предназначен для селекции антител, предлагаемых в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:

а) определяют сигнал связывания (в единицах ответа (RU)) антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO:65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO:64) методом поверхностного плазменного резонанса (Biacore-анализ),

б) отбирают антитела, для которых обнаружено соотношение сигналов связывания (фрагмент человеческого CSF-1R t delD4/внеклеточный домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)), составляющее 50:1 или ниже.

В одном из вариантов осуществления изобретения определение осуществляют при 25°С.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ скрининга заключается также в том, что осуществляют дополнительные стадии, на которых измеряют связывание антитела к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO:66) (D1-D3) и отбирают антитела, которые не связываются с указанным фрагментом.

Понятие «эпитоп» относится к белковой детерминанте человеческого CSF-1R, которая обладает способностью специфически связываться с антителом. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, как правило, эпитопы имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первыми, в отличие от связывания с последними, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, связывается специфически с нативным и с денатурированным CSF-1R.

Понятие «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (V_L), вариабельная область тяжелой цепи (V_H)) в контексте настоящего описания в каждом случае обозначает каждую из пары областей легких и тяжелых цепей, которые непосредственно принимают участие в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельных областей легких и тяжелых цепей имеют некоторую общую структуру, и каждый домен содержит 4 каркасных участка (FR), последовательности которых являются высококонсервативными, связанных тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность областями, CDR). Каркасные участки адоптированы к β-складчатой конформации, а CDR-участки могут формировать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживаются в виде трехмерной структуры с помощью каркасных участков и формируют с CDR-участками другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют очень важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и вследствие этого являются дополнительным объектом изобретения.

Понятие «антигенсвязывающий участок (центр) антитела» в контексте настоящего описания относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Антигенсвязывающий участок антитела содержит аминокислотные остатки из «гипервариабельных участков» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельной области, остатки которых отличны от остатков гипервариабельного участка, как они определены в настоящем описании. Таким образом, вариабельные области легких и тяжелых цепей антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой основной участок, который обеспечивает главным образом связывание с антигеном и определяет свойства антитела. К CDR- и FR-участкам относятся участки, которые определяют согласно стандартному принципу Кэбота и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) и/или остатки из «гипервариабельной петли».

Понятия «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

Понятие «аминокислота» в контексте настоящего описания обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-α-аминокислот, таких как аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют связывание CSF-1 с CSF-1R. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 200 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 50 нг/мл или ниже. Значение IC₅₀, характеризующее ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R, можно определять согласно методу, описанному в примере 2.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют индуцируемое CSF-1 фосфорилирование CSF-1R (в рекомбинантных клетках линии NIH3T3-CSF-1R).

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение 1С5о составляет 800 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 600 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение 1Сзо составляет 250 нг/мл или ниже. Значение IC₅₀, характеризующее ингибирование индуцируемого CSF-1 фосфорилирования CSF-1R, можно определять согласно методу, описанному в примере 3.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют рост рекомбинантных NIH3T3-клеток, которые экспрессируют человеческий CSF-1R (SEQ ID NO:62). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 2 мкг/мл или ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 2 мкг/мл или ниже. Значения IC₅₀, значения IC₅₀ или % ингибирования роста определяют согласно методам, описанным в примере 5.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют рост рекомбинантных NIH3T3-клеток, которые экспрессируют человеческий мутантный CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID NO:63). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 15 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 10 мкг/мл или ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значение IC₅₀ составляет 2 мкг/мл или ниже. Значения IC₅₀, значения IC₅₀ или % ингибирования роста определяют

согласно методам, описанным в примере 5.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют рост опухолевых клеток линии BeWo (АТСС CCL-98) на 65% или более (при применении антитела в концентрации 10 мкг/мл и в сравнении с вариантом без антитела). Ингибирование роста (в %) определяют согласно методу, описанному в примере 8. Например, установлено, что МАт 2F11 ингибирует рост опухолевых клеток линии BeWo на 70%.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют дифференцировку макрофагов как человека, так и обезьяны циномолгус (т.е. обоих видов) (что определяют по ингибированию выживания моноцитов человека и обезьяны циномолгус согласно методу, описанному в примерах 7 и 8). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют выживание человеческих моноцитов, что характеризуется значением IC₅₀, составляющим 0,15 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения значением IC₅₀, составляющим 0,10 мкг/мл или ниже. Ингибирование выживания человеческих моноцитов определяют согласно методу, описанному в примере 7. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют выживание моноцитов обезьяны циномолгус на 80% или более, согласно одному из вариантов осуществления на 90% или более (при применении антитела в концентрации 5 мкг/мл и в сравнении с вариантом без антитела). Ингибирование выживания моноцитов обезьяны циномолгус определяют согласно методу, описанному в примере 8.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к CSF-1R, заключающийся в том, что встраивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела класса IgG1, которое связывается с человеческим CSF-1R, предлагаемой в изобретении (указанной модифицированной нуклеиновой кислоты), и нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь указанного антитела, в один или два экспрессионный(ых) вектор(а), указанный(ые) векторы(ы) встраивают в эукариотическую клетку-хозяина, экспрессируют кодируемый белок и выделяют из клетки-хозяина или супернатанта.

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. При этом антитело предпочтительно представляет собой выделенное моноклональное антитело. Такие методы рекомбинации широко известны в данной области и они заключаются в том, что осуществляют экспрессию белков в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы стандартными методами. Экспрессию осуществляют в пригодных прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, NS0-клеток, SP2/0-клеток, НЕК293-клеток, COS-клеток, клеток дрожжей или клеток E.coli, и антитело выделяют из клеток (супернатант или клетки после лизиса).

Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, сс.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, сс.271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, сс.151-161; Werner R.G. и др., Drug Res., 48, 1998, сс.870-880.

Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или полностью очищенной форме. Очистку осуществляют для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).

Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс.4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, сс.77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (HEK 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen К. в Cytotechnology 30, 1999, сс.71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc.191-199.

Контролирующие последовательности, пригодные для прокариотических организмов, представляют собой, например, промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что для эукариотических клеток применяют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие «функционально связаны» означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной секреторной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако для энхансеров не является необходимым, чтобы они были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

Моноклональные антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как, хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые кодируют моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которым затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки HEK 293, СНО-клетки или клетки миеломы, которые иначе не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.

В контексте настоящего описания понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие определения включают потомство. Так, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» относятся к первичной рассматриваемой клетке и полученным из нее культурам безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, имеющий такую же функцию или биологическую активность, которая обнаружена у исходной трансформированной клетки.

«Fc-фрагмент» антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но обладает различными эффекторными функциями. Понятие «Fc-фрагмент антитела» хорошо известно специалисту в данной области и его определяют на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины разделяют на следующие классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. На основе строение константных областей тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов обозначают как α, δ, ε, γ и µ соответственно. Fc-фрагмент антител непосредственно участвует в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность) в результате активации комплемента, связывания C1q и связывания Fc-рецептора. Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора системы комплемента C1q с Fc-фрагментом большинства антител подклассов IgG. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-фрагменте. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Boakle R.J. и др., Nature 282, 1979, сс.742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс.2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс.907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, сс.338-344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, сс.995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, сс.4178-4184; Hezareh M. И др., J. Virology 75, 2001, сс.12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, сс.319-324; ЕР 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-нумерации по Кэботу, см. ниже). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3, как правило, обусловливают активацию комплемента и связывание C1q и С3, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывается с C1q и С3.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит Fc-фрагмент человеческого происхождения и предпочтительно все остальные участки человеческих константных областей. В контексте настоящего описания понятие «Fc-фрагмент человеческого происхождения» относится к Fc-фрагменту, котором представляет собой либо Fc-фрагмент человеческого антитела подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно Fc-фрагмент человеческого подкласса IgG1, либо мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgG1 (предпочтительно с мутацией L234A+L235A), либо Fc-фрагмен человеческого подкласса IgG4, либо мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgG4 (предпочтительно с мутацией S228P). Наиболее предпочтительными являются константные области человеческой тяжелой цепи, последовательности которых представлены в SEQ ID NO:58 (человеческий подкласс IgG1). SEQ ID NO:59 (человеческий подкласс IgG1 с мутациями L234A и L235A), SEQ ID NO:60 человеческий подкласс IgG4) или SEQ ID NO:61 (человеческий подкласс IgG4 с мутацией S228P).

Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgG1 или человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4. В одном из вариантов осуществления изобретения оно представляет собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgG1. В одном из вариантов осуществления изобретения оно представляет собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что содержит человеческие константные цепи. Указанные константные цепи хорошо известны в данной области и описаны, например, у Kabat Е.А. (см., например, Johnson G. и Wu, Т.Т., Nucleic Acids Res., 28, 2000, сс.214-218). Например, приемлемая человеческая константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:58. Например, приемлемая человеческая константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи SEQ ID NO:57.

Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что

или его гуманизированная версия.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, или его гуманизированная версия.

Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающееся тем что

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, или его гуманизированная версия.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:75, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:76, или его гуманизированная версия.

вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:83, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:84, или его гуманизированная версия.

в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:19, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:22, или

Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с 4еловеческим CSF-1R, отличающееся тем, что

г) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46, или

г) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46.

вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:41, СОК2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:42, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:46.

Изобретение относится также к способу лечения пациента, который нуждается в такой терапии, отличающемуся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для указанной терапии.

Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, которые применяют для лечения «опосредуемых CSF-1R заболеваний», или антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, которые применяют для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения «опосредуемых CSF-1R заболеваний», которые можно описать с помощью представленных ниже характеристик:

Известно три различных механизма, посредством которых передача сигналов CSF-1R, вероятно, участвует в росте и метастазах опухолей. Первый из них связан с тем, что экспрессия CSF-лиганда и рецептора обнаружена в опухолевых клетках женской половой системы (молочная железа, яичник, эндометрий, шейка матки) (Scholl S.M. и др., J. Natl. Cancer Inst, 86, 1994, сс.120-126; Kacinski B.M., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, сс.71-74; Ngan H.Y. и др., Eur. J. Cancer 35, 1999, сс.1546-1550; Kirma N. и др., Cancer Res, 67, 2007, сс.1918-1926), и экспрессия ассоциирована с ростом ксенотрансплантата рака молочной железы, а также с плохим прогнозом для страдающих раком молочной железы пациентов. В одном из исследований две точковые мутации обнаружены в CSF-1R примерно у 10-20% пациентов, страдающих острым миелолейкозом, хроническим миелолейкозом и миелодисплазией, и одна из этих мутаций, как установлено, приводила к нарушению обновления рецептора (Ridge S.A. и др., Ргос.Natl. Acad. Sci USA, 87, 1990, сс.1377-1380). Однако частота встречаемости мутаций не была подтверждена в более поздних исследования (Abu-Duhier F.M. и др.,, Br. J. Haematol., 120, 2003, сс.464-470). Мутации обнаружены также в ряде случаев печеночноклеточного рака (Yang D.H. и др., Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 3, 2004, сс.86-89) и идиопатического миелофиброза (Abu-Duhier F.M. и др., Br. J. HaematoL, 120, 2003, сс.464-470). В настоящее время в клеточной линии GDM-1, полученной из организма пациента, страдающего миеломонобластным лейкозом, идентифицирована мутация Y571D в CSF-1R (Chase А. и др., Leukemia, 23, 2009, сс.358-364).

Пигментированный виллонодулярный синовиит (PVNS) и теносиновиальные гигантоклеточные опухоли (TGCT) могут возникать в результате транслокации, приводящей к слиянию гена M-CSF с геном коллагена COL6A3 и последующей сверхэкспрессии M-CSF (West R.B. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, сс.690-695). Предполагается, что условия окружающей среды оказывают влияние на массу образовавшейся опухоли, которая состоит из моноцитов, привлеченных клетками, которые экспрессируют M-CSF. TGCT представляют собой опухоли меньшего размера, которые относительно легко можно удалять из пальцев, где они наиболее часто встречаются. PVNS представляет собой более агрессивное заболевание, поскольку может затрагивать крупные суставы и его сложно контролировать хирургическим путем.

Второй механизм основан на блокаде передачи сигналов через M-CSF/CSF-1R в областях метастазов в кости, которые вызывают остеокластогенез, резорбцию кости и остеолитические повреждения кости. Рак молочной железы, множественная миелома и рак легкого являются примерами типов рака, при которых могут образовываться метастазы в кость и которые могут вызывать остеолитическую болезнь кости, осложнениями которой являются нарушения скелета. M-CSF, высвобождающийся из опухолевых клеток и стромы, индуцирует дифференцировку предшественников гематопоэтических миелоидных моноцитов в зрелые остеокласты в сочетании с лигандом рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В (RANKL). В указанном процессе М-CSF действует в качестве «разрешающего» фактора, передавая сигнал выживания остеокластам (Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 91, 1993, сс.257-263). Ингибирование активности CSF-1R в процессе дифференцировки остеокластов и созревание в присутствии антитела к CSF-1R, вероятно, предупреждает несбалансированную активность остеокластов, которая вызывает остеолитическую болезнь и ассоциированные с ней родственные нарушения скелета при метастатическом заболевании. В то время как рак молочной железы, легкого и множественная миелома, как правило, приводят к остеолитическим повреждениям, метастазы в костную ткань при раке предстательной железы первоначально имеют остеобластное проявление, при котором повышенная активность в отношении образования кости приводит к «переплетенной кости», отличающейся от типичной пластинчатой структуры здоровой кости. По мере развития болезни повреждения кости приобретают выраженный остеолитический компонент, а также высокие уровни в сыворотке маркеров резорбции кости, и предполагается, что при этом может оказаться полезной антирезорбтивная терапия. Установлено, что бисфофонаты ингибируют образование остеолитических повреждений и снижают количество связанных с повреждением скелета случаев только у мужчин с устойчивым к гормонам метастатическом раке предстательной железы, однако при этом их воздействие на остеобластные повреждения является дискуссионным, и согласно полученным к настоящему времени данным бисфосфонаты не оказывают полезного воздействия в отношении предупреждения костных метастазов или чувствительного к гормонам рака предстательной железы. В настоящее время в клинических условиях проводится изучение воздействия антирезорбтивных средств при смешанном остеолитическом/остеобластном раке предстательной железы (Choueiri М.В. и др., Cancer Metastasis Rev., 25, 2006, сс.601-609; Vessella R.L. и Corey E., Clin. Cancer Res., 12 (20 Pt 2), 2006, сс.6285-6290).

Третий механизм основан на современных данных о том, что уровень ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ), обнаруженных в плотных опухолях при раке молочной железы, предстательной железы, яичника и шейки матки, коррелировал с плохим прогнозом (Bingle L. и др., J. Pathol., 196 2002 сс.254-265; Pollard J.W., Nat. Rev. Cancer, 4, 2004, сс.71-78). Рекрутмент макрофагов в опухоль происходит с помощью M-CSF и других хемокинов.

Макрофаги могут принимать участие в развитие опухолей посредством секреции ангиогенных факторов, протеаз и других факторов роста и цитокинов и могут блокироваться путем ингибирования передачи сигналов CSF-1R. В настоящее время Zins с соавторами (Zins K. и др., Cancer Res., 67, 2007, сс.1038-1045) установили, что экспрессия siPHK фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), M-CSF или их комбинации может снижать рост опухолей на мышиной модели с использованием ксенотрансплантата на 34-50% после внутриопухолевой инъекции соответствующей siPHK. SiPHK, мишенью которой является TNF-альфа, секретируемый человеческими клетками линии SW620, снижала уровни мышиного M-CSF и приводила к снижению уровня макрофагов в опухоли. Кроме того, обработка ксенотранслантатов опухоли MCF7 антигенсвязывающим фрагментом, мишенью которого является M-CSF, приводила к 40%-ному ингибированию роста опухолей, устранению устойчивости к химиотерапевтическим средствам и улучшенной выживаемости мышей при применении в сочетании с химиотерапевтическим средствами (Paulus P. и др., Cancer Res., 66, 2006, сс.4349-4356).

ТАМ являются только одним примером проявления связи между хроническим воспалением и раком. Известны другие доказательства связи между воспалением и раком, поскольку многие хронически заболевания ассоциированы с повышенным риском возникновения рака, рак возникает в местах хронического воспаления, химические медиаторы воспаления обнаружены при многих видах рака; устранение клеточных или химических медиаторов воспаления ингибирует развитие некоторых созданных экспериментальным путем типов рака и пролонгированное применение противовоспалительных средств снижает риск возникновения некоторых видов рака. Связь с раком известна для ряда воспалительных состояний, среди которых индуцированный Н. pylori гастрит в случае рака желудка, шистозомиас в случае рака мочевого пузыря, HHVX в случае саркомы Капоши, эндометриоз в случае рака яичника и простатит в случае рака предстательной железы (Balkwill F. и др., Cancer Cell, 7 2005, сс.211-217). Макрофаги представляют собой основные клетки при хроническом воспалении, и они реагируют по разному на их микроокружение. Известно два типа макрофагов, которые рассматриваются в качестве имеющих решающее значение для целого ряда функциональных состояний: M1-макрофаги принимают участие в реакциях типа 1. Эти реакции включают активацию продуктами микробного происхождения и последующее уничтожение патогенных микроорганизмов, что приводит к образованию в качестве промежуточных продуктов реактивных форм кислорода. С другой стороны, к имеющим решающее значение относятся М2-макрофаги, которые принимают участие в реакциях типа 2, которые усиливают клеточную пролиферацию, регулируют воспаления и адаптивный иммунитет и усиливают ремоделирование, ангиогенез и репарацию тканей (Mantovani А. и др., Trends Immunol., 25, 2004, сс.677-686). Хроническое воспаление, приводящее к развитию неоплазм, как правило, ассоциируется с М2-макрофагами. Основным цитокином, опосредующим воспалительные реакции, является TNF-альфа, который в соответствии со своим названием может стимулировать противоопухолевый иммунитет и геморрагический некроз при применении в высоких дозах, но также, как установлено в последние годы, может экспрессироваться опухолевыми клетками и действовать в качестве промотора опухоли (Zins K. и др., Cancer Res., 67, 2007, сс.1038-1045; Balkwill F., Cancer Metastasis Rev., 25, 2006, сс.409-416). Специфическая роль макрофагов в отношении опухолей еще нуждается в дальнейшем изучении, включая исследование потенциальной пространственной и временной зависимости их функции и связи с конкретными типами опухолей.

Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, предназначенные для применения при лечении рака. Понятие «рак» в контексте настоящего описания может обозначать, например, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечноклеточную карциному, карциному почечной лоханки, мезотелиому, печеночноклеточный рак, рак желчных протоков, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли спинных позвонков, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шваномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, лимфому, лимфоцитарный лейкоз, включая устойчивые варианты любого из указанных выше видов рака, или комбинацию любых из указанных выше видов рака. Предпочтительно рак представляет собой рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак легкого или рак предстательной железы. Предпочтительно указанные виды рака отличаются также экспрессией или сверхэкспрессией CSF-1 или CSF-1R. Еще одним вариантом осуществления изобретения являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, предназначенные для применения для одновременного лечения первичных опухолей и новых метастазов.

Таким образом, еще одним вариантом осуществления изобретения являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, предназначенные для применения для лечения периодонтита, гистоцитоза X, остеопороза, болезнь кости Пэджета (PDB), потери костной ткани из-за противораковой терапии, перипростетического остеолиза, индуцированного глюкокортикоидами остеопороза, ревматоидного артрита, псориатического артрита, остеоартрита, воспалительных артридитов и воспаления.

В статье Rabello D. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347, 2006, сс.791-796 продемонстрировано, что SNP в гене CSF-1 позитивно ассоциированы с агрессивностью периодонтита: воспалительного заболевания тканей периодонта, которое вызывает потерю зубов из-за резорбции альвеолярной кости.

Гистоцитоз Х (который называют также гистозитозом из клеток Лангерганса, LCH) представляет собой пролиферативное заболевание дендритных клеток Лангерганса, которое проявляется в дифференцировке в остеокласты кости и увеличении связанных с LCH костных повреждений. Клетки Лангерганса имеют происхождение из находящихся в кровотоке моноцитов. Установлено, что повышенные уровни M-CSF, обнаруженные в сыворотке, и повреждения коррелируют с серьезностью заболевания (da Costa С.Е. и др., J. Exp.Med., 201, 2005, сс.687-693). Болезнь возникает в основном в детском возрасте и ее лечат химиотерапевтическими средствами, когда болезнь становится системной или является рецидивирующей.

Патофизиология остеопороза опосредована потерей формирующих кость остеобластов и повышением уровня зависящей от остеокластов резорбции кости. Подтверждающие это данные получены Cenci с соавторами, которые продемонстрировали что инъекция антитела к M-CSF сохраняет плотность костной ткани и ингибирует резорбцию кости у мышей после овариэктомии (Cenci S. и др., J. Clin. Invest, 105, 2000, сс.1279-1287). В последние годы выявлена потенциальная связь между потерей костной ткани в постменопаузальном периоде из-за дефицита эстрогена и установлено присутствие продуцирующих TNF-альфа Т-клеток, оказывающих воздействие на метаболизм костной ткани (Roggia С.и др., Minerva Med., 95, 2004, сс.125-132). Возможный механизм может включать индукцию in vivo M-CSF с помощью TNF-альфа. Важная роль M-CSF в индуцируемом TNF-альфа остеокластогенезе подтверждена воздействием антитела к M-CSF, которое блокировало индуцируемый TNF-альфа остеолиз у мышей, и по этой причине ингибиторы пути передачи сигналов CSF-1R являются потенциальными мишенями при воспалительном артрите (Kitaura Н. и др., J. Clin. Invest., 115, 2005, сс.3418-3427).

Болезнь кости Пэджета (PDB) представляет собой второе наиболее распространенное нарушение костного метаболизма после остеопороза, при котором локальные аномалии повышенного обновления костной ткани приводят к осложнениям, таким как боль, деформация, патологические переломы кости и глухота. Идентифицированы мутации в четырех генах, которые регулируют нормальную функцию остеокластов и предрасположенность индивидуумов к PDB и родственным нарушениям: инсерционные мутации в гене TNFRSF11A, который кодирует рецептор-активатора ядерного фактора (NF) каппа-В (RANK), имеющий решающее значение регулятор функции остеокластов, инактивирующие мутации в гене TNFRSF11 В, который кодирует остеопротегерин (рецептор-ловушка для лиганда RANK), мутации гена sequestosome I (SQSTM1), который кодирует важный каркасный белок в пути NFKannaB, и мутации в гене валозинсодержащеого белка (VCP). Этот ген кодирует VCP, который играет роль в направленном расщеплении ингибитора NFKannaB протеосомой (Daroszewska А. и Ralston S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 2, 2006, сс.270-277). Ингибиторы, мишенью которых является CSF-1R, косвенно противодействуют блокаде нарушения регуляции передачи сигналов RANKL, и они представляют собой дополнительный путь лечения наряду с применямыми в настоящее время бисфосфонатами.

Потеря костной ткани, вызванная противораковой терапией, прежде всего у пациентов, страдающих раком молочной железы и предстательной железы, является еще одним показанием, при котором ингибитор, мишенью которого является CSF-1R, может предупреждать потерю костной ткани (Lester J.E. и др., Br. J. Cancer, 94, 2006, сс.30-35). При улучшении прогноза в отношении ранней стадии рака молочной железы отдаленные действия вспомогательных терапий становятся более важными, поскольку некоторые из таких терапий, включая химиотерапию, облучение, применение ингибиторов ароматазы и овариэктомии, оказывают воздействие на метаболизм костный ткани, снижая минеральную плотность костной ткани, что приводит к повышенному риску развития остеопороза и связанных с ним переломов (Lester J.E. и др., Br. J. Cancer, 94, 2006, сс.30-35). Эквивалентом вспомогательной терапии, основанной на ингибировании ароматазы, при раке молочной железы является терапия, основанная на снижении уровня андрогена, при раке предстательной железы, которая приводит к снижение минеральной плотности костной ткани и значительному повышению риска связанных с остеопорозом переломов (Stoch S.A. и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 2001, сс.2787-2791).

Целенаправленное ингибирование передачи сигналов CSF-1R, вероятно, может оказаться ценным при других показаниях, а также в тех случаях, когда типы клеток, на которые оказывают направленное воздействие, представляют собой остеокласты и макрофаги, например, при лечении специфических осложнений, связанных с заменой сустава, например, по причине ревматоидного артрита. Нарушение имплантата вследствие перипростетической потери костной ткани и последующее расшатывание протеза является основным осложнением при замене сустава и требует повторного хирургического вмешательства, что сопровождается высокой социоэкономической нагрузкой на индивидуального пациента и на систему медико-санитарной помощи. К настоящему времени отсутствует удовлетворительная лекарственная терапия предупреждения или ингибирования перипростетического остеолиза (Drees P. и др., Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 3, 2007, сс.165-171).

Индуцированный глюкокортикоидами остеопороз (GIOP) представляет собой еще одно показание, при котором ингибитор CSF-1R может предупреждать потерю костной ткани после длительного применения глюкокортикоидов, которые используют при различных состояниях, в том числе при хроническом обструктивном заболевании легких, астме и ревматоидном артрите (Guzman-Clark J.R. и др., Arthritis Rheum., 57, 2007, сс.140-146; Feldstein А.С.и др., Osteoporos. Int., 16, 2005, сс.2168-2174).

Ревматоидный артрит, псориатический артрит и воспалительные артридиты сами являются потенциальными показаниями для применения ингибиторов пути передачи сигналов CSF-1R, поскольку одним из их компонентов являются макрофаги и для них характерна различная степень деструкции костной ткани (Ritchlin С.Т. и др., J. Clin. Invest., 111, 2003, сс.821-831). Остеоартрит и ревматоидный артрит представляют собой воспалительные аутоиммунные заболевания, вызываемые накоплением макрофагов в соединительной ткани и инфильтрацией макрофагов в синовиальную жидкость, что по меньшей мере частично опосредуется M-CSF. В статье Campbell I.K. и др., J. Leukoc. Biol., 68, 2000, сс.144-150 продемонстрировано, что M-CSF продуцируется клетками суставной ткани человека (хондроциты, синовиальные фибробласты) in vitro и присутствует в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом, это позволяет предположить его участие в пролиферации в синовиальной жидкости и инфильтрации макрофагов, что ассоциировано с патогенезом заболевания. Ингибирования передачи сигналов CSF-1R, вероятно, позволяет контролировать количество макрофагов в суставе и облегчает боль, связанную с деструкцией костной ткани. Одним из путей минимизации нежелательных явлений и дополнительного изучения роли передачи сигналов CSF-1R при таких показаниях является специфическое ингибирование CSF-1R без воздействия на множество других киназ, таких как Raf-киназа.

В современной литературе описана корреляция между повышенным уровнем M-CSF в кровотоке и плохим прогнозом и развитием атеросклероза при хронической ишемической болезни сердца (Saitoh Т. и др., J. Am. Coll. Cardiol., 35, 2000, сс.655-665; Ikonomidis I. и др., Eur. Heart. J., 26, 2005, сс.1618-1624); M-CSF влияет на процесс атеросклероза, способствуя образованию пенистых клеток (макрофаги с захваченным окисленным ЛПНП), которые экспрессируют CSF-1R и представляют собой начальную бляшку (Murayama Т. и др., Circulation, 99, 1999, сс.1740-1746).

Экспрессия и передача сигналов M-CSF и CSF-1R обнаружена в активированной микроглии. Микроглия, которая представляет собой местонахождение макрофагов в центральной нервной системе, может активироваться различными нарушениями, включая инфекцию и травматическое повреждение. M-CSF рассматривается в качестве имеющего решающее значение регулятора воспалительных ответов в головном мозге, и уровни M-CSF повышаются при ВИЧ-1, энцефалите, болезни Альцгеймера (AD) и опухолях головного мозга. Микроглиозы, являющиеся результатом аутокринной передачи сигналов M-CSF/CSF-1R, приводят к индукции воспалительных цитокинов и высвобождению оксидов азота, что продемонстрировано например, с помощью экспериментальной модели нейронного повреждения (Нао A.J. и др., Newoscience, 112, 2002, сс.889-900; Murphy G.M. Jr. и др., J. Biol. Chem., 273, 1998, сс.20967-20971). Микроглия, для которой характерны повышенные уровни экспрессии CSF-1R, обнаружена в окружении бляшек при AD и на созданной на трансгенных мышах, несущих белок-предшественник V717F, модели AD (Murphy G.M. Jr. и др., Am. J. PathoL, 157, 2000, сс.895-904). С другой стороны, у мышей линии ор/ор с пониженным уровнем микроглии в головном мозге имеет место отложение фибрилл А-бета и потеря нейронов по сравнению со здоровыми контрольными мышами, что позволяет предположить, что микроглия может выполнять нейрозащитную функцию, препятствуя развитию AD, которая отсутствует у мышей линии ор/ор (Kaku М. и др., Brain Res. Brain Res. Protoc., 12, 2003, cc.104-108).

Экспрессия и передача сигналов M-CSF и CSF-1R ассоциированы с воспалительным заболеванием кишечника (IBD) (WO 2005/046657). Понятие «воспалительное заболевание кишечника» относится к серьезным хроническим нарушениям кишечного тракта, отличающимся хроническим воспалением в различных областях желудочно-кишечного тракта, и в частности включает неспецифический язвенный колит (UC) и болезнь Крона.

Изобретение относится к антителу, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, которое предназначено для лечения рака.

Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения рака или в другом варианте для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения потери костной ткани или в другом варианте для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения потери костной ткани.

Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для предупреждения или лечения метастазов или в другом варианте для приготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения метастазов.

Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для лечения воспалительных заболеваний или в другом варианте для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных заболеваний.

Следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения предлагаемого в изобретении антитела к CSF-1R, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь человеческого антитела класса IgG1, связывающегося с человеческим CSF-1R, которая представляет собой модифицированную нуклеиновую кислоту, и нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь указанного антитела, встраивают в экспрессионный вектор, указанный вектор встраивают в эукариотическую клетку-хозяина, кодируемый белок экспрессируют и выделяют из клетки-хозяина или супернатанта.

Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Указанные методы хорошо известны в данной области и предусматривают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в приемлемых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, NS0-клеток, SP2/0-клеток, HEK 293-клеток, COS-клеток, PER-С6-клеток, дрожжей или клеток Е. coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).

Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif., 17, 1999, сс.183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif., 8, 1996, сс.271-282; Kaufman R.J., Mol. BiotechnoL, 16, 2000, сс.151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48, 1998, cc.870-880.

Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически очищенной форме. Очистку осуществляют для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).

Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс.109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс.261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с.Е9. Клонирование вариабельных областей описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс.3833-3837; Carter Р. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс.4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, сс.77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen К. в Cytotechnology 30, 1999, сс.71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc.191-199.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела к CSF-1R, получают различными методами, известными в данной области. Эти методы включают (но не ограничиваясь только ими) выделение из встречающегося в естественных условия источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайтнаправленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии гуманизированного антитела к CSF-1R.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепи, предлагаемые в изобретении, объединяют с последовательностями промотора, инициации трансляции, константной области, с 3'-нетранслируемой последовательностью, последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с получением конструкций экспрессионных векторов. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепи можно объединять в одном векторе, их можно применять для котрансфекции, серийной трансфекции или раздельной трансфекции клеток-хозяев, которые затем можно сливать с получением индивидуальной клетки-хозяина, которая экспрессирует обе цепи.

Следующим объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязывающих участков, предлагаемых в настоящем изобретении, приготовленная в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, антибактериальным и противогрибным агентам, регулирующим изотоничность и замедляющим абсорбцию/ресорбцию агентам и подобным веществам, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель должен быть пригоден для инъекции или инфузии.

Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить различными методами, известными в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов.

Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение указанных сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. Помимо воды носитель может представлять собой, например, изотонический забуференный физиологический раствор.

Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые можно применять в приемлемой гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, могут варьироваться так, чтобы получать количество действующего вещества, которое является эффективным для получения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, не являясь при этом токсичными для пациента (эффективное количество).

Выбранный уровень доз должен зависеть от разнообразных фармакокинетических факторов, таких как активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или их сложных эфиров, солей или амидов, путь введения, время введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в сочетании с конкретными композициями, возраст, пол, вес, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни пациента, подлежащего лечению, и подобных факторов, которые хорошо известны в медицине.

Изобретение относится также к применению антител, предлагаемых в изобретении, для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы.

Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего указанным заболеванием.

В изобретении предложен также способ приготовления фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, в эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, и применение антитела, предлагаемого в изобретении, в таком способе.

Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком.

Представленные ниже примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что можно осуществлять модификации в изложенных процедурах без отклонения от сущности изобретения.

Описание последовательностей

SEQ ID NO:1 CDR3 тяжелой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:2 CDR2 тяжелой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:3 CDR1 тяжелой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:4 CDR3 легкой цепи, МАт 2F 11

SEQ ID NO:5 CDR2 легкой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:6 CDR1 легкой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:7 вариабельная область тяжелой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:8 вариабельная область легкой цепи, МАт 2F11

SEQ ID NO:9 CDR3 тяжелой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:10 CDR2 тяжелой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:11 CDR1 тяжелой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:12 CDR3 легкой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:13 CDR2 легкой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:14 CDR1 легкой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:15 вариабельная область тяжелой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:16 вариабельная область легкой цепи, МАт 2Е10

SEQ ID NO:17 CDR3 тяжелой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:18 CDR2 тяжелой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:19 CDR1 тяжелой цепи, hМАт 2F11-c11

SBQ ID NO:20 CDR3 легкой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:21 CDR2 легкой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:22 CDR1 легкой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:23 вариабельная область тяжелой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:24 вариабельная область легкой цепи, hМАт 2F11-c11

SEQ ID NO:25 CDR3 тяжелой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:26 CDR2 тяжелой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:27 CDR1 тяжелой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:28 CDR3 легкой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:29 CDR2 легкой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:30 CDR1 легкой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:31 вариабельная область тяжелой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:32 вариабельная область легкой цепи, hМАт 2F11-d8

SEQ ID NO:33 CDR3 тяжелой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:34 CDR2 тяжелой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:35 CDR1 тяжелой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:36 CDR3 легкой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:37 CDR2 легкой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:38 CDR1 легкой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:39 вариабельная область тяжелой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:40 вариабельная область легкой цепи, hМАт 2F11-е7

SEQ ID NO:41 CDR3 тяжелой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:42 CDR2 тяжелой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:43 CDR1 тяжелой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:44 CDR3 легкой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:45 CDR2 легкой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:46 CDR1 легкой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:47 вариабельная область тяжелой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:48 вариабельная область легкой цепи, hМАт 2F11-f12

SEQ ID NO:49 CDR3 тяжелой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:50 CDR2 тяжелой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:51 CDR1 тяжелой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:52 CDR3 легкой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:53 CDR2 легкой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:54 CDR1 легкой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:55 вариабельная область тяжелой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:56 вариабельная область легкой цепи, hМАт 2F11-g1

SEQ ID NO:57 константная область человеческой легкой каппа-цепи

SEQ ID NO:58 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG1

SEQ ID NO:59 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG1, с мутациями L234A и L235A

SEQ ID NO:60 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG4

SEQ ID NO:61 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG4, с мутацией S228P

SEQ ID NO:62 человеческий CSF-1R дикого типа (wt CSF-1R)

SEQ ID NO:63 человеческий CSF-1R с мутациями L301S Y969F

SEQ ID NO:64 внеклеточный домен человеческого CSF-1R

SEQ ID NO:65 фрагмент человеческого CSF-1R delD4

SEQ ID NO:66 фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3

SEQ ID NO:67 сигнальный пептид

SEQ ID NO:68 праймер

SEQ ID NO:69 CDR3 тяжелой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:70 CDR2 тяжелой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:71 CDR1 тяжелой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:72 CDR3 легкой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:73 CDR2 легкой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:74 CDR1 легкой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:75 вариабельная область тяжелой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:76 вариабельная область легкой цепи, МАт 1G10

SEQ ID NO:77 CDR3 тяжелой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:78 CDR2 тяжелой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:79 CDR1 тяжелой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:80 CDR3 легкой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:81 CDR2 тяжелой цепи. МАт 2Н7

SEQ ID NO:82 CDR1 тяжелой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:83 вариабельная область тяжелой цепи, МАт 2Н7

SEQ ID NO:84 вариабельная область легкой цепи, МАт 2Н7.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - данные о ингибировании роста опухолевых клеток линии BeWo в виде 3D-культуры после обработки различными моноклональными антителами к CSF-1R при их применении в концентрации 10 мкг/мл.

Ось X: жизнеспособность, выраженная в виде стандартизованных средних относительных световых единиц (RLU), которые соответствуют содержанию АТФ в клетках (CellTiterGlo-анализ).

Ось Y: изученные зонды: минимальная среда (0,5% сыворотки плода коровы (FBS)), мышиный IgG1 (mIgG1, 10 мкг/мл), мышиный IgG2a (mIgG2a, 10 мкг/мл), только CSF-1, МАт 2F11, МАт 2Е10, МАт2Н7, МАт 1G10 и SC 2-4A5. Наиболее выраженное ингибирование индуцируемого CSF-1 роста обнаружено при применении антител к CSF-1R, предлагаемых в изобретении;

на фиг.2а - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, которые характеризуют связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO:65) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): в то время как для антител МАт 3291 и sc 2-4A5 четко продемонстрировано связывание с указанным с1е1 В4-фрагментом, антитела, предлагаемые в изобретении, например МАт 2F11 и МАт 2Е10, не связывались с фрагментом CSF-1R delD4. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 также не связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;

на фиг.2б - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO:64) (на оси y: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответтвует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R обнаружена способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD;

на фиг 2в: сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO:65) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированное антитело hМАт 2F11-е7 не связывались с фрагментом CSF-1R delD4. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 также не связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;

на фиг.2г - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO:64) (на оси y: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, таких как МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированное антитело hМАт 2F11-e7, обнаружена способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD;

на фиг 2д: сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO:65) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует О RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, таких как 1.2.SM, CXIIG6, ab10676 и МАт3291, обнаружена способность связываться с фрагментом CSF-1R. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 также не связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;

на фиг.2е - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO:64) (на оси y: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, обнаружена способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD;

на фиг.3а-3г - данные об уровнях CSF-1 у обезьян циномолгус после внесения в различных дозах антитела к CSF-1R, предлагаемого в изобретении;

на фиг.4 - данные об эффективности in vivo - ингибирование роста опухолей антителами к CSF-1R, предлагаемыми в изобретении, при оценке с использованием ксенотрансплантата рака молочной железы линии ВТ20.

Пример 1

Создание клеточной линии гибридомы, продуцирующей антитела к CSF-1R

Процедура иммунизации NMRI-мышей

NMRI-мышей иммунизировали с использованием экспрессионного вектора pDisplay™ (фирма Invitrogen, США), кодирующего внеклеточный домен huCSF-1R, путем электропорации. Каждую мышь иммунизировали 4 раза, используя по 100 мкг ДНК. Когда титры в сыворотке антител к huCSF-1R достигали достаточного уровня, мышей подвергали одной дополнительной ревакцинации с использованием 50 мкг смеси 1:1 химеры huCSF-1R ECD/huCSF-1R ECDhuFc в 200 мкл ЗФР, которую вводили внутривенно (i.v.) за 4 и 3 дня до осуществления слияния.

Специфический для антигена ELISA

Титры антител к CSF-1R в сыворотке иммунизированных мышей определяли с помощью специфического для антигена ELISA.

0,3 мкг/мл химеры huCSF-1R-huFc (растворимый внеклеточный домен) иммобилизовывали на сенсибилизированном стрептавидином планшете (MaxiSorb; фирма MicroCoat, Германия, каталожный №.11974998/МС1099) с помощью биотинилированного антитела к Fcγ, взятого в концентрации 0,1 мг/мл (фирма Jackson ImmunoResearch., каталожный №109-066-098), и добавляли конъюгированный с пероксидазой из хрена (HRP) F(ab')₂-фрагмент антимышиного IgG (фирма GE Healthcare, Великобритания, каталожный X2.NA9310V), разведенный в соотношении 1/800 в ЗФР/0,05% Твин 20/0 5% БСА. Сыворотку, полученную после электропорации, разводили в соотношении 1/40 в ЗФР/0,05% Твин 20/0,5% БА и серийно разводили вплоть до 1/1638400. Разведенную сыворотку вносили в лунки. Сыворотку, взятую до осуществления электропорации, применяли в качестве отрицательного контроля. Серийные разведения мышиного антитела к человеческому CSF-1R МАт3291 (фирма R&D Systems, Великобритания) с концентрацией от 500 до 0,25 нг/мл применяли в качестве положительного контроля. Все компоненты инкубировали вместе в течение 1,5 ч, лунки отмывали 6 раз ЗФРТ (ЗФР/0,2% Твин 20) и осуществляли анализы с использованием свежеприготовленного раствора ABTS (1 мг/мл) (ABTS: 2,2'-азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) в течение 10 мин при КТ. Абсорбцию измеряли при длине волны 405 нм.

Создание гибридом

Мышиные лимфоциты можно выделять и сливать с клеточной линией мышиной миеломы, используя основанные на применении ПЭГ стандартные протоколы, с получением гибридом. Затем полученные гибридомы подвергали скринингу в отношении производства антигенспецифических антител. Например, суспензии единичных клеток спленоцитов, выведенных из лимфоцитов, которые получали из иммунизированных мышей, сливали с с несекретирующими Ag8 клетками мышиной миеломы линии P3X63Ag8.653 (АТСС, CRL-1580) с использованием 50% ПЭГ. Клетки высевали с плотностью примерно 10⁴ в плоскодонный 96-луночный титрационный микропланшет с последующей инкубацией в течение примерно двух недель в селективной среде. Затем содержимое индивидуальных лунок подвергали скринингу с помощью ELISA в отношении моноклональных антител к CSF-1R типа IgM и IgG. На стадии интенсивного роста гибридом секретирующие антитела гибридомы пересевали, вновь подвергали скринингу, и если они еще были позитивными в отношении моноклональных антител к CSF-1R человеческого IgG-типа, то их можно было субклонировать с помощью FACS. Затем стабильные субклоны культивировали in vitro с получением антитела в среде для культуры ткани для характеризации. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно отбирать на основе оценки связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD), согласно методу, описанному в примере 4, а также на основе оценки ингибирования роста NH3T3-клеток, трансфектированных CSF-1R дикого типа (зависящая от лиганда передача сигналов) или мутантным CSF-1R L301S Y969F (не зависящая от лиганда передача сигналов) при обработке моноклональными антителами к CSF-1R согласно методу, описанному в примере 5.

Культура гибридом

Продуцирующие тиМАт гибрид омы культивировали в среде RPMI 1640 (фирма PAN, каталожный № (кат. №) Р04-17500), дополненной 2 мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. №35050-038), 1 мМ Na-пируватом (фирма GIBCO, кат. №.11360-039), 1×NEAA (фирма GIBCO, кат. №. 1140-035), 10% FCS (фирма РАА, кат. №А15-649), 1×Pen Strep (пенициллин-стрептомицин) (фирма Roche, кат. №.1074440), 1×Nutridoma-CS (фирма Roche, кат. №1363743), 50 мкМ меркаптоэтанолом (фирма GIBCO, кат. №31350-010) и 50 ед./мл мышиного IL 6 (фирма Roche, кат. №1444581), при 37°С и 5% СО₂. Некоторые из образовавшихся мышиных антител гуманизировали (например, МАт 2F11) и экспрессировали рекомбинантно.

Пример 2

Ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R (ELISA)

При проведении указанного анализа прежде всего осуществляли связывание антитела к CSF-1R с CSF-1R-ECD, после чего путем обнаружения лиганда, не связанного с рецептором, можно было оценивать как распознающие лиганд антитела, так и являющиеся ингибиторами димеризации антитела к CSF-1R. Анализ осуществляли на 384-луночных титрационных микропланшетах (фирма MicroCoat, Германия, кат. №464718) при КТ. После каждой стадии инкубации планшеты отмывали трижды ЗФРТ.

Прежде всего планшеты сенсибилизировали с помощью козьего биотинилированного F(ab')₂-фрагмента антитела к Fcγ (фирма Jackson ImmunoResearch., кат. №109-006-170) в концентрации 0,5 мг/мл в течение 1 часа (ч).

Затем лунки блокировали с помощью ЗФР, дополненного 0,2% Tween^®-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия), в течение 0,5 ч. Химеру huCSF-1R-huFc (75 нг/мл) (которая образовывала димерный растворимый внеклеточный домен huCSF-1R) иммобилизовывали на планшете в течение 1 ч. Затем разведения очищенных антител в ЗФР/0,05% Твин 20/0 5% БСА инкубировали в течение 1 ч. После добавления смеси, содержащей 3 нг/мл CSF-1 (фирма Biomol, Германия, кат. №.60530), 50 нг/мл биотинилированного клона антитела к CSF-1 BAF216 (фирма R&D Systems, Великобритания) и разведенного в соотношении 1:5000 конъюгата стрептавидина и HRP (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. №11089153001), и выдерживания в течение 1 ч планшеты отмывали 6 раз ЗФРТ. Антитело к CSF-1R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве положительного контроля. Планшеты обрабатывали свежеприготовленным раствором субстрата ВМ blue POD (BM blue^®: 3,3'-5,5'-тетраметилбензидин, фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. №11484281001) в течение 30 мин при КТ. Абсорбцию измеряли при длине волны 370 нм. Выявляли снижение абсорбции, если антитело к CSF-1R вызывало высвобождение CSF-1 из димерного комплекса. Все антитела к CSF-1R вызывали выраженное ингибирование взаимодействия CSF-1 с CSF-1R (см. таблицу 1). Антитело к CSF-1R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также у Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве референс-контроля.

Таблица 1:
Рассчитанные значения IC₅₀, характеризующие ингибирование взаимодействие CSF-1/CSF-1R
МАт к CSF-1R	Значения IC₅₀, характеризующие ингибирование CSF-1/CSF-1R [нг/мл]
MAт 2F11	19,3
МАт 2Е10	20,6
МАт 2Н7	18,2
МАт 1G10	11,8
SC-2-4A5	35,2

Пример 3

Ингибирование индуцируемого CSF-1 фосфорилирования CSF-1R в рекомбинантных клетках линии NIH3T3-CSF-1R

4,5×10³ клеток линии NIH3T3, зараженных ретровирусным экспрессионным вектором, несущим полноразмерный CSF-1R, культивировали в среде DMEM (фирма РАА, кат. №Е 15-011), дополненной 2 мМ L-глутамином (фирма Sigma, кат. №G7513), 2 мМ пируватом натрия, 1хзаменимыми аминокислотами, 10% FKS (фирма РАА, кат. №А 15-649) и 100 мкг/мл PenStrep (фирма Sigma, кат. №Р4333 (10 мг/мл)), до достижения конфлюэнтности. Затем клетки отмывали бессывороточной средой DMEM (фирма РАА кат. №15-011), дополненной селенитом натрия (5 нг/мл) (фирма Sigma, кат. №S9133), трансферрином (10 мкг/мл) (фирма Sigma, кат. №Т8158), БСА (400 мкг/мл) (фирма Roche Diagnostics GmbH, кат. №10735078), 4 мМ L-глутамином (фирма Sigma, кат. №07513), 2 мМ пируватом натрия (фирма Gibco, кат. №11360), 1×заменимыми аминокислотами (фирма Gibco, кат. №11140-035), 2-меркаптоэтанолом (0,05 мМ) (фирма Merck, кат. №М7522), 100 мкг/мл PenStrep (фирма Sigma, кат. №Р4333), и инкубировали в 30 мкл этой среды в течение 16 ч, в результате чего происходила повышающая регуляция рецептора. К клеткам добавляли 10 мкл разведенных антител к CSR-1R в течение 1,5 ч. Затем клетки стимулировали с помощью 10 мкл (концентрация 100 нг/мл) huM-CSF-1 (фирма Biomol, кат. №60530) в течение 5 мин. Поле инкубации супернатант удаляли, клетки отмывали дважды 80 мкл охлажденного на льду ЗФР и добавляли 50 мкл свежеприготовленного охлажденного на льду буфера для лизиса (150 мМ NaCl/20 мМ Трис, рН 7,5/1 мМ ЭДТКЛмМ ЭГТК/1% Тритон Х-100/1 таблетка ингибитора протеаз (фирма Roche Diagnostics GmbH, кат. №1836170) на 10 мл буфера 10 мкл/мл/коктейль ингибиторов фосфатаз 1 (фирма Sigma, кат. №Р-2850, 100× маточный раствор)/10 мкл/мл ингибитора протеаз 1 (фирма Sigma, кат. №Р-5726, 100× маточный раствор)/10 мкл/мл 1М NaF). После выдерживания в течение 30 мин на льду планшеты интенсивно встряхивали на шейкере для планшетов в течение 3 мин и затем центрифугировали в течение 10 мин при 2200 об/мин (тип Heraeus Megafuge 10).

Присутствие фосфорилированного рецептора CSF-1 и общее количество рецепторов анализировали с помощью ELISA. Для обнаружения фофорилированного рецептора применяли набор фирмы R&D Systems (кат. №DYC3268-2) согласно инструкциям поставщика. Для обнаружения общего количества рецептора CSF-1R 10 мкл лизата иммобилизовывали на планшете с помощью захватывающего антитела, входящего в набор. Затем добавляли разведенное в соотношении 1:750 биотинилированное антитело к CSF-1R BAF329 (фирма R&D Systems) и разведенный в соотношении 1:1000 конъюгат стрептавидин-HRP. Через 60 мин планшеты обрабатывали свежеприготовленным раствором ABTS^® и определяли абсорбцию. Данные рассчитывали в виде % относительно положительного контроля без антитела и выражали в виде соотношения: количество фосфорилированного рецептора/общее количество рецептора. В качестве отрицательного контроля использовали вариант без добавления M-CSF-1. Антитело к CSF-1R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве референс-контроля.

Таблица 2:
Рассчитанные значения IC₅₀, характеризующие ингибирование фосфорилирования рецептора CSF-1
МАт к CSF-1R	Значения IC₅₀, характеризующие ингибирование фосфорилирования CSF-1R [нг/мл]
MAт 2F11	219,4
МАт 2Е10	752,0
МАт 2Н7	703,4
МАт 1G10	56,6
SC-2-4A5	1006,6

Пример 4

Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)

Получение внеклеточного домена человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5, hCSF-1R-ECD). последовательность которого представлена в SEQ ID NO:64:

Плазмидар pCMV-Fc-hCSF-1R-ECD (7836 пар оснований) кодирует полный ECD человеческого CSF-1R (SEQ ID NO:64), слитый на С-конце с сайтом расщепления протеазой PreScission, за которым располагается состоящий из аминокислот 100-330 человеческий IgG1 и метка 6×His, под контролем промотора CMV. Встречающийся в естественных условиях сигнальный пептид изменяли путем инсерции аминокислот G и S после первого М для создания сайта рестрикции BamHI.

Получение фрагмента человеческого CSF-1R delD4 Скоторый содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5. hCSF-1R-delD4), последовательность которого представлена в SEQ ID NO:65:

hCSF1R-delD4-V1-PreSc-hFc-His клонировали из плазмиды pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD согласно протоколу сайтнаправленного мутагенеза QuikChange XL фирмы Stratagene, используя delD4-for, который имеет последовательность CACCTCCATGTTCTTCCGGTACCCCCCAGAGGTAAG (SEQ ID NO:68) в качестве «прямого» праймера и delD4-rev, который имеет обратную комплементарную последовательность, в качестве «обратного» праймера. Перед осуществлением обычного протокола фирмы Stratagene применяли вариант протокола, опубликованный в BioTechniques, 26, 1999, с.680, для удлинения обоих праймеров в раздельных реакциях с осуществлением трех циклов:

Приготавливали две различные реакционные смеси объемом 50 мкл согласно руководству производителя, каждая из которых содержала 10 нг плазмиды pCMV-preS-Fc-hCSF1R-ECD в качестве матрицы и 10 пМ один из праймеров delD4-for или delD4-rev и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfu, входящей в набор. Осуществляли три ПЦР-цикла (95°С 30 с/55°С 60 с/68°С 8 мин), после чего по 25 мкл каждой из двух реакционных смесей объединяли в новой пробирке и добавляли 0,5 мкл свежеприготовленной ДНК-полимеразы Pfu. Осуществляли обычный ПЦР-протокол, предусматривающий применение 18 температурных циклов согласно руководству по применению набора фирмы Stratagene с последующим конечным расщеплением в течение 2 ч с помощью рестриктазы Dpn1, входящей в набор. Клоны с делецией выявляли путем расщепления с помощью Cel II и Not I и подтверждали секвенированием.

Для получения белка осуществляли кратковременную трансфекцию системы суспензионных клеток Hek293 FreeStyle (фирма Invitrogen) согласно спецификациям производителя. Через 1 неделю 500 мл супернатанта отфильтровывали и вносили в 1-миллилитровую колонку HiTrap MabSelect Xtra (фирма GE healthcare), заполненную белком А (0,2 мл/мин). Колонку отмывали сначала ЗФР, затем 50 мМ Трис/150 мМ NaCl/1 мМ ЭДТК/рН 7,3. В колонку вносили 75 мкл протеазы PreScission (фирма GE, кат. №27-0843-01), разведенной в 375 мкл такого же буфера, и закрытую колонку инкубировали в течение ночи при 4°С с вращением. Колонку помещали на верхнюю часть 1-миллилитровой колонки GSTrap FF (фирма GE helthcare) и требуемый белок элюировали (0,2 мл/мин, фракции объемом 0,2 мл). Объединенные фракции концентрировали, снижая объем с 1,8 мл до 0,4 мл путем центрифужной ультрафильтрации с использованием устройства 3k Nanosep и хроматографировали с помощью устройства для гель-фильтрации S200 HR в ЗФР (0,5 мл/мин).

Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 получали в виде двух фракций в виде димерной молекулы (пул 1, V=1,5 мл; с=0,30 мг/мл; кажущаяся масса по данным ДСН-ПААГ 83 кДа, в восстанавливающих условиях 62 кДа), и в виде мономера (пул 2, V=1,4 мл; с=0,25 мг/мл кажущаяся масса по данным ДСН-ПААГ 62 кДа). Во всех экспериментах применяли димерную форму.

Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (сигналы связывания в виде единиц ответа (RU):

Устройство:	Biacore Т100 (фирма GE Healthcare),
программа:	Т100 Control, версия 2.0.1,
	Т100 Evaluation, версия 2.0.2,
формат анализа	чип: СМ5,
температура:	25°С.

CSF-1R-фрагмент иммобилизовывали посредством аминного сочетания. Для сравнения связывания различных антител к CSF-1R, предлагаемых в изобретении, тестируемое антитело инъецировали в одной концентрации. Антитела к CSF-1R МАт3291 (фирма R&D-Systems) и SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793) применяли в качестве референс-контроля, антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 (депонировано под номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г в DSMZ) применяли в качестве отрицательного контроля, все эти антитела применяли в таких же условиях, что и антитела к CSF-1R, предлагаемые в изобретении.

Аминное сочетание CSF-1R-фрагментов

Применяли стандартный метод аминного сочетания согласно инструкциям производителя: подвижный буфер: ЗФР-Т (фирма Roche, кат. №11666789+0,05% Твин20, кат. №11332465), активация с помощью смеси EDC/NHS, инъекция фрагмента человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO:65) и внеклеточного домена человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субломены D1-D5) (SEQ ID NO:64) в течение 600 с при скорости потока 10 мкл/мин; разбавление в буфере для сочетания NaAc, pH 5,0, с=10 мкг/мл; оставшиеся в конце активированные карбоксильные группы блокировали путем инъекции 1М этаноламина.

Связывание <CSF-1R> МАт 2F11. МАт 2Е10. МАт 3291 и sc2-4A5 и других антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-IR-ECD) при 25°С

Подвижный буфер: ЗФР-Т (фирма Roche, кат. №11666789+0,05% Твин20,кат. №11332465),

Анализируемый образец:

Связывание оценивали при скорости потока 30 мкл/мин с помощью одной инъекции анализируемого образца в концентрации (с), составлявшей 10 нМ (для МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированного hМАт 2F11-е7 во втором эксперименте). Продолжительность каждой инъекции составляла 700 с, продолжительность последующей фазы диссоциации 180 с. Конечную стадию регенерации осуществляли после каждого цикла с помощью 50 мМ NaOH, продолжительность контакта 60 с, скорость потока 30 мкл/мин.

Сигналы оценивали в определенной предназначенной для измерения точке через 10 с после окончания инъекции. Референс-сигналы (сигналы от пустой проточной референс-ячейки (которую обрабатывали только EDC/NHS и этаноламином) вычитали с получением сигналов связывания (в виде RU). Если сигналы связывания несвязывающихся антител были несколько ниже нуля О (МАт 2F11=-3; МАт 2Е10=-2; МАт 1G10=-6, МАт 2Н7=-9; и гуманизированное hМАт 2F11-е7=-7), то значения принимали за нуль.

Таблица 3а:
Связывание <CSF-1R> МАт к человеческому фрагменту CSF-1R delD4 и CSF-1R-ECD и соотношение при 25°С, оцененное с помощью SPR
	Связывание с delD4 [RU]	Связывание с CSF-1R-ECD [RU]	Соотношение связывания антител к CSF-1R c фрагментом CSF-1R delD4/CSF-1R-ECD
МАт 3291	1015	627	1015/627- 1,61
sc2-4A5	374	249	374/249=1,50
MAт 2F11	0	176	0/176=0
hМАт 2F11-е7	0	237	0/237=0
МАт 2Е10	0	120	0/120=0
МАт 1G10	0	2708	0/2708=0
МАт 2Н7	0	147	0/147=0
M<CCR5>Pz03.1C5	2	5	-

У МАт 2F11 и МАт 2Е10 обнаружена способность связываться с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (см. фиг.26); но отсутствие способности связываться с фрагментом CSF-1R delD4 (см. фиг.2а).

У Sc2-4A5 и МАт 3291 обнаружена способность связываться и с CSF-1R-ECD, и с delD4 (см. фиг.2б и 2а).

Таким образом, соотношение связывания с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-1R-ECD антител к CSF-1R МАт 2F11 и МАт 2Е10 заметно ниже чем 1:50 (=0,02), в то время как соотношение связывания МАт 3291 и Sc2-e4A5 составляло 1,61 и 1,50 соответственно и существенно превышало 1:50 (=0,02). У применяемого в качестве отрицательного контроля антитела m<CCR5>Pz03.1C5 не выявлено никакой способности связываться (как и ожидалось).

У МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированного hМАт 2F11-е7 обнаружена способность связываться с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (см. фиг.2 г); но не выявлена способность связываться с фрагментом CSF-1R delD4 (см. фиг.2в). Таким образом, соотношение связывания с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-1R-ECD антител к CSF-1R МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированного hМАт 2F11-е7 заметно ниже чем 1:50 (=0,02).

В другом эксперименте изучали антитела к CSF-1R 1,2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303), CXIIG6 (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/112245), козье поликлональное антитело к CSF-1R ab10676 (фирма Abeam). Антитело к CSF-1R МАт 3291 (фирма R&D-Systems) использовали в качестве референс-контроля. Антитело к CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5 (депонировано под номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г в DSMZ) применяли в качестве отрицательного контроля.

Таблица 3б:
Связывание <CSF-1R> МАт к человеческому фрагменту CSF-1R delD4 и CSF-1R-ECD и соотношение при 25°С, оцененное с помощью SPR
	Связывание с delD4 [RU]	Связывание с CSF-1R-ECD [RU]	Соотношение связывания антител к CSF-IRc фрагментом CSF-1R delD4/CSF-1R-ECD
МАТ3291	1790	1222	1790/1222=1,47
1.2.SM	469	704	469/704=0,67
CXIIG6	1983	1356	1983/1356=1,46
ab10676	787	547	787/547=1,44
m<CCR5>Pz03.1C5	0	0	-

У антител 1.2.SM, CXIIG6, ab10676 и МАт 3291 обнаружена способность связываться и с CSF-1R-ECD, и с del D4 (см. фиг.2е и 2ж).

Соотношение связывания 1.2.SM, CXIIG6, abl0676 и МАт 3291 существенно превышало 1:50 (=0,02). У применяемого в качестве отрицательного контроля антитела m<CCR5>Pz03.1C5 не выявлено никакой способности связываться (как и ожидалось).

Пример 5

Ингибирование роста рекомбинантных клеток NIH3T3-CSF-1R в 3D-культуре путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)

Клетки линии NIH3T3, зараженные с помощью ретровируса либо экспрессионным вектором полноразмерного CSF-1R (SEQ ID NO:62), либо мутантом CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID NO:63), культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (фирма РАА, Пашинг, Австрия), дополненной 2 мМ L-глутамином, 2 мМ пируватом натрия и заменимыми аминокислотами, 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма Sigma, Тауфкирхен, Германия), в сенсибилизированных поли-НЕМА (поли(2-гидроксиэтилметакрилат)) (фирма Polysciences, Уоррингтон, шт.Пенсильвания, США)) чашках для предупреждения прилипания к пластиковой поверхности. Клетки высевали в среду, в которой сыворотку заменяли на селенит натрия (5 нг/мл), трансферрин (10 мг/мл), БСА (400 мкг/мл) и 2-меркаптоэтанол (0,05 мМ). При обработке 100 нг/мл huCSF-1 (фирма Biomol, Гамбург, Германия) экпрессирующие wtCSF-1R клетки формировали плотные сфероиды, которые росли в трех направлениях, свойство, которое называют отсутствием зависимости от прикрепления. Эти сфероиды in situ очень напоминали по их трехмерному строению и организации плотные опухоли. Несущие мутантный CSF-1R рекомбинантные клетки обладали способностью образовывать сфероиды вне зависимости от лиганда CSF-1. Сфероидные культуры инкубировали в течение 3 дней в присутствии антитела в различных концентрациях для определения значений IC₅₀ (концентрация, при которой жизнеспособность клеток ингибировалась на 50%). CellTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках.

Таблица 5а:
МАт к CSF-1R	wtCSF-1R, IC₅₀ [мкг/мл]	Мутантный CSF-1R, IC₅₀ [мкг/мл]
MAт2F11	1,1	8,0
МАт 2Е10	0,49	4,9
МАт 2Н7	0,31	5,3
МАт 1G10	0,29	14,2
SC 2-4A5	10,0	10,0

У применяемого в качестве референс-контроля МАт фирмы R&D-Systems 3291 не обнаружена способность ингибировать пролиферцию несущих мутант CSF-1R рекомбинантных клеток.

В другом эксперименте изучали антитело к CSF-1R, предлагаемое в изобретении, такое как hМАт 2F11-е7, и антитела к CSF-1R 1,2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303), CXIIG6 (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/112245), козье поликлональное антитело к CSF-1R ab10676 (фирма Abeam) и SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, cc.1786-1793).

Сфероидные культуры инкубировали в течение 3 дней в присутствии антитела в различных концентрациях для определения значений IC₃₀ (концентрация, при которой жизнеспособность клеток ингибировалась на 30%). Максимальная концентрация составляла 20 мкг/мл. CellTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках.

Таблица 5б:
Maт к CSF-1R	wtCSF-1R, IC₃₀ [мкг/мл]	Мутант С SF-1R, IC₃₀ [мкг/мл]
hМАт 2F11-е7	4,91	0,54
1.2.SM	1,19	>20 мкг/мл (-19%-ное ингибирование при 20 мкг/мл = 19%-ное стимулирование)
CXIIG6	>20 мкг/мл (21%-ное ингибирование при 20 мкг/мл)	>20 мкг/мл (-36%-ное ингибирование при 20 мкг/мл = 36%-ное стимулирование)
ab10676	14,15	>20 мкг/мл (0% ингибирование при 20 мкг/мл)
SC 2-4A5	16,62	2,56

Пример 6

Ингибирование роста опухолевых клеток линии BeWo в 3D-культуре путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)

Клетки хориокарциномы линии BeWo (ATCC CCL-98) культивировали в среде F12K (фирма Sigma, Штайнхайм, Германия), дополненной 10% FBS (фирма Sigma) и 2 мМ L-глутамином. Высевали по 5×10⁴ клеток/лунку в 96-луночные, сенсибилизированные поли-НЕМА (поли(2-гидроксиэтилметакрилат)) планшеты, которые содержали среду F12K, дополненную 0,5% FBS и 5% БСА. Затем добавляли в концентрации 200 нг/мл huCSF-1 и в концентрации 10 мкг/мл различные моноклональные антитела к CSF-1R и инкубировали в течение 6 дней. CeUTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках, которое выражали в относительных световых единицах (RLU). При обработке имеющих форму сфероидов культур BeWo различными антителами к CSF-1R (10 мкг/мл), было обнаружено ингибирование индуцируемого CSF-1 роста. Для оценки опосредуемого антителом ингибирования среднее значение RLU для нестимулированных BeWo-клеток вычитали из значений, полученных для всех образцов. Средние значения RLU клеток, стимулированных CSF-1, принимали за 100%. Средние значения RLU клеток, стимулированных CSF-1 и обработанных антителами к CSF-1R, расчитывали в виде % по отношению к RLU, полученным при стимуляции CSF-1. В таблице 6 представленны расчетные данные ингибирования роста опухолевых клеток линии BeWo в 3D-культуре после обработки моноклональными антителами к CSF-1R; на фиг.1а и б представленны стандартизованные средние значения RLU.

Таблица 6:
МАт к CSF-1R	% ингибирования при применении антитела в концентрации 10 мкг/мл
только CSF-1	0
МАт 2F11	70
МАт 2Е10	102
МАт 2Н7	103
МАт 1G10	99
SC 2-4A5	39

Пример 7

Ингибирование дифференцировки человеческих макрофагов путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)

Человеческие моноциты выделяли из периферической крови с помощью обогащенного коктейля человеческих моноцитов RosetteSep (фирма StemCell Tech., кат. №15028). Обогащенные популяции моноцитов высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты (2,5×10⁴ клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, кат. №31870), дополненной 10% FCS (фирма GIBCO, кат. №011-090014М), 4 мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. №25030) и 1×PenStrep (фирма Roche, кат. №1074440), при 37°С и 5% CO₂ в увлаженной атмосфере. При добавлении в среду huCSF-1 в концентрации 150 нг/мл можно было обнаружить выраженную дифференцировку с превращением в прикрепленные макрофаги. Эту дифференцировку можно ингибировать, добавляя антитела к CSF-1R. Кроме того, было обнаружено воздействие на выживание моноцитов, которое можно анализировать с помощью CellTiterGlo (СТО)-анализа. На основе зависящего от концентрации ингибирования выживания моноцитов при обработке антителами рассчитывали значения IC₅₀ (см. таблицу 7).

Таблица 7:
MAT к CSF-1R	IC₅₀ [МКГ/МЛ]
MAт 2F11	0,08
МАт 2Е10	0,06
МАт 2Н7	0,03
МАт 1G10	0,06
SC 2-4A5	0,36

При исследовании различных гуманизированных версий МАт 2 F11, например, hМАт 2F11-с11, hМАт 2F11-d8, hМАт 2F11-е7, hМАт 2F11-П2, обнаружены значения IC₅₀, составляющие 0,07 мкг/мл (hМАт 2F11-с11), 0,07 мкг/мл (hМАт 2F11-d8), 0,04 мкг/мл (hМАт 2F11-е7) и 0,09 мкг/мл (hМАт 2F11-f12).

Пример 8

Ингибирование дифференцировки макрофагов обезьяны циномолгус путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)

Моноциты обезьяны циномолгус выделяли из периферической крови с помощью набора для приматов кроме человека, включающего CD 14-микрогранулы (фирма Miltenyi Biotec, кат. №130-091-097) согласно описанию производителя. Обогащенные популяции моноцитов высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты (1-3×10⁴ клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, кат. №31870), дополненной 10% FCS (фирма GIBCO, кат. №011-090014М), 4 мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. №25030) и 1×PenStrep (фирма Roche, кат. №1074440), при 37°С и 5% С02 в увлаженной атмосфере. При добавлении в среду huCSF-1 в концентрации 150 нг/мл можно было обнаружить выраженную дифференцировку в прикрепленные макрофаги. Эту дифференцировку можно ингибировать, добавляя антитела к CSF-1R. Кроме того, было обнаружено воздействие на выживание моноцитов, которое можно анализировать с помощью CellTiterGlo (СТО)-анализа. Жизнеспособность определяли при обработке антителом в концентрации 5 мкг/мл (см. таблицу 8).

Таблица 8:
МАт к CSF-1R	% выживания	% ингибирование (выживания)=(100%-% выживания)
MAт 2F11	4*	96
МАт 2Е10	17**	83
МАт 2Н7	8	92
МАт 1G10	2	98
SC 2-4A5	31	69
среднее значение по 4 экспериментам (3 эксперимента с использованием мышиного, 1 эксперимент с использованием химерного МАт) *среднее значение по 2 экспериментам с использованием только мышиного МАт

Пример 9

Оценка аффинности связывания антител к CSF-1R с человеческим CSF-1R

Устройство:	BIACORE^® А 100,
чип:	СМ5 (Biacore BR-1006-68),
сочетание:	аминное сочетание,
буфер:	ЗФР (Biacore BR-1006-72), рН 7,4, 35°С.

Для оценки аффинности 36 мкг/мл антител к мышиному Fcγ (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR 115-005-071) связывали с поверхностью чипа для иммобилизации антител к CSF-1R. Внеклеточный домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены Dl -D5) (SEQ ID NO: 64) (фирма R&D-Systems, 329-MR или субклонированную плазмиду pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-1R-ECD) добавляли в раствор в различных концентрациях. Ассоциацию измеряли путем инъекции CSF-1R в течение 1,5 мин при 35°С; диссоциацию измеряли путем отмывки поверхности чипа с помощью буфера в течение 10 мин при 35°С. Для расчета кинетических параметров применяли модель связывания 1:1 Лэнгмюра.

Таблица 9:
Данные об аффинности, оцененные с помощью SPR
МАт к CSF-1R	K_D (нМ)	k_a (l/Mc)	k_d (1/c)	t_1/2 (МИН)
MAт 2F11	0,29	1,77E⁺⁰⁵	5.18E^-05	223
МАт 2Е10	0,2	1,52E⁺⁰⁵	2.97E^-05	389
МАт 2Н7	0,21	l,47E⁺⁰⁵	3,12E^-05	370
МАт 1G10	0,36	1,75E⁺⁰⁵	6,28E^-05	184

В другом анализе связывания, который осуществляли с помощью устройства Biacore с использованием CSF-1R ECD (данные не представлены), обнаружена определенная конкуренция антител МАт 2F11 и МАт 2Е10 с антителом (Ат) SC-2-4A5. Однако МАт 2F11/МАт 2Е10 не связывались с фрагментом человеческого CSF-1R delD4, в то время как Ат SC-2-4A5 связывалось с указанным delD4-фрагментом (см. пример 4 и фиг.2а). Таким образом, очевидно, что область связывания МАт 2F11/МАт 2Е10 отличается от области связывания Ат SC-2-4A5, но, вероятно, локализована вблизи нее. При осуществлении указанного конкурентного анализа установлено, что оба антитела МАт 2F11 и МАт 2Е10 не конкурировали с МАт 3291 фирмы R&D-Systems (данные не представлены).

Пример 10

Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3

Устройство:	Biacore T100 (фирма GE Healthcare),
	программа: Т 100 Control, версия 1.1.11,
	В3000 Evaluation, версия 4.01,
	Scrubber, версия 2.0а
формат анализа:	чип СМ5

Антитела к CSF-1R «захватывали» с помощью молекул, иммобилизованных путем аминного сочетания. Используя один цикл кинетических исследований, инъецировали пять возрастающих концентраций фрагмента человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO:66). Фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 субклонировали в экспрессионном векторе pCMV-presS-HisAvitag.

Антитело к CSF-1R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США; Sherr C.J и др., Blood, 73, 1989, сс.1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, и МАт 3291 (фирма R&D-Systems) использовали в качестве референс-контролей.

Молекулы для иммобилизации: антитела к мышиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR 115-005-071) для антител, предлагаемых в изобретении, и контрольное антитело фирмы R&D-Systems МАт 3291 и антитела к крысиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR 112-005-071) для антител, применяемых в качестве референс-контролей и для антитела к CSF-1R SC 2-4A5.

Аминное сочетание для иммобилизации молекул

Использовали стандартные условия аминного сочетания согласно инструкциям производителя: подвижный буфер: буфер HBS-N, активация с помощью смеси EDC/NHS, требуемая плотность лиганда 2000 RU; предназначенные для иммобилизации Ат разводили в буфере для сочетания, таком как NaAc, pH 4,5, с=10 мкг/мл; оставшиеся в конце активированные карбоксильные группы блокировали инъекцией 1 М этаноламина.

Кинетические характеристики связывания фрагментов человеческого CSF-1R D1-D3 с МАт <CSF-1R> (Мат к CSF-1R) при 37°С

Подвижный буфер: ЗФР (Biacore BR-1006-72)

Иммобилизация МАт <CSF-1R> на проточных ячейках 2-4: скорость потока 20 мкл/мин, продолжительность контакта 90 с, концентрация (Aт<CSF-1R>)=50 нМ, разведение с помощью подвижного буфера+1 мг/мл БСА.

Анализируемый образец:

Измерение кинетических характеристик в одном цикле проводили при скорости потока 30 мкл/мин, осуществляя пять последовательных инъекций анализируемого вещества в концентрациях (с), составляющих 7, 8, 31, 25, 125, 500 и 2000 нМ, без регенерации. Продолжительность каждой инъекции составляла 30 с» за ней следовала фаза диссоциации продолжительностью 120 с для первых четырех инъекций и 1200 с для наиболее высокой концентрации (последняя инъекция).

Конечную регенерацию осуществляли после каждого цикла, используя 10 мМ глицин, рН 1,5 (Biacore, BR-1003-54), продолжительность контакта 60 с, скорость потока 30 мкл/мин.

Кинетические параметры рассчитывали с использованием общепринятых двух референс-стандартов (референс-контроль: связывание анализируемого вещества с предназначенной для иммобилизации молекулой; проточная ячейка: субдомен CSF-1R, концентрация «0» в качестве «пустого» контроля) и расчет с помощью модели «кинетика титрования при связывании 1:1 с выделением».

Таблица 10:
Данные об аффинности связывания фрагмента CSF-1R D1-D3, оцененные с помощью SPR
МАт к CSF-1R	Субдомен	K_D (нМ)	k_a (1/Mc)	k_d (1/c)	t_1/2 (мин)
MAт 2F11	D1-D3	отсутствие связывания
МАт 2Е10	D1-D3	отсутствие связывания
МАт 2Н7	D1-D3	отсутствие связывания
МАт 1G10	D1-D3	отсутствие связывания
SC-2-4A5	D1-D3	отсутствие связывания
3291 фирмы R&D-Systems	D1-D3	5,4	2,2E⁺⁵	1,2E^-3	9,6

Установлено, что у антител МАт 2F11, МАт 2Е10 и МАт 1G10 отсутствует связывание с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3.

Кроме того, применяемое в качестве референс-контроля Ат SC-2-4A5 не связывалось с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3.

У применяемого в качестве референс-контроля МАт 3291 фирмы R&D-Systems обнаружена способность связываться с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3.

Пример 11

Повышение уровня CSF-1 в процессе ингибирования CSF-1R у обезьян циномолгус

Уровни сывороточного CSF-1 являются фармакодинимическим маркером нейтрализующей активности в отношении CSF-1R антитела ЬМАт 2F11-е7, которое представляет собой ингибитор димеризации человеческого CSF-1R. В каждой обрабатываемой группе (1 и 10 мг/кг) одному самцу и одной самке обезьян циномолгус вводили внутривенно антитело к CSF-1R hМАт 2F11-е7. Для анализа уровней CSF-1 отбирали образцы крови за 1 неделю до обработки (перед дозированием), через 2, 24, 48, 72, 96, 168 ч после дозирования и еженедельно в течение еще двух недель. Для оценки уровней CSF-1 использовали поступающий в продажу набор для ELISA (Quantikine® для человеческого M-CSF) согласно инструкциям производителя (фирма R&D Systems, Великобритания). Уровни CSF-1 в крови обезьян определяли путем сравнения с применяемыми для построения стандартной кривой образцами CSF-1, входящими в набор.

Введение hМАт 2F11-е7 приводило к резкому повышению уровня CSF-1 ~ в 1000 раз, которое в зависимости от вводимой дозы сохранялось в течение 48 ч (1 мг/кг) или 15 дней (10 мг/кг). Таким образом, ингибитор димеризации CSF-1R обладает преимуществом, заключающимся в отсутствии непосредственной конкуренции с лигандом за связывание с рецептором, и для него характерна резкая повышающая регуляция, по сравнению с лигандзамещающим антителом.

Пример 12

Эффективность in vivo - ингибирование роста опухолей антителами к CSF-1R у SCID-мышей с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров, несущих ксенотрансплантат опухолевых клеток рака молочной железы линии ВТ20

Линия клеток человеческого рака молочной железы ВТ-20 экспрессирует человеческий CSF-1R, но у нее отсутствует экспрессия CSF-1 (Sapi E. и др., Cancer Res, 59, 1999, сс.5578-5585). Поскольку мышиный CSF-1 не обладает способностью активировать человеческий CSF-1R на опухолевых клетках, мышам вводили рекомбинантный человеческий CSF-1 (фирма Biomol, Гамбург, Германия) с помощью осмотических мининаносов (фирма ALZET, Купертино, шт.Калифорния), которые обеспечивали скорость постоянной инфузии CSF-1, составляющую 2 мкг/день (Martin T.A., Carcinogenesis, 24, 2003, сс.1317-1323).

Для непосредственного сравнения эффективности антител, оказывающих воздействие на димеризацию CSF-1R, наряду с лигандзамещающим антителом к CSF-1R при создании изобретении исследовали химерное антитело к CSF-1R МАт 2F11 (антитело, оказывающее воздействие на димеризацию CSF-1R) и антитело 1.2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303) на модели ксенотрансплантата ВТ-20.

SCID-мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров (фирма Charles River, Сульцфельд, Германия) подкожно совместно инъецировали 1×10⁷ клеток линии ВТ-20 (АТСС НТВ-19) и 100 мкл матригеля. Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы, когда средний объем опухолей достигал 100 мм³. Мышей обрабатывали один раз в неделю i.p. соответствующими антителами (см. фиг.4) в буфере, содержащем 20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Размеры опухолей определяли с помощью кронциркуля, начиная с дня определения стадии, и затем дважды в неделю в течение всего периода обработки. Объем опухолей рассчитывали согласно протоколу NCI (Национальный онкологический институт) (масса опухоли=1/2аб², где «а» и «б» представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли соответственно).

Данные анализа роста опухолей представлены на фиг.4. Ингибирование человеческого CSF-1R на опухолевых клетках химерным антителом к CSF-1R МАт 2F11 оказалось статистически более эффективным в отношении опосредуемого ингибирования роста опухолей, чем эффективность антитела к CSF-1R 1.2.SM (антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303).

1. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.

2. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что
а) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, или
б) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 47, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, или
д) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56.

3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 31, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32.

4. Антитело по п. 2, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40.

5. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что
а) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 5, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 6, или
б) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 17, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 19, и вариабельная область содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 21, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 22, или
в) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 26, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 28, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 29, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 30, или
г) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 33, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 34, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 35, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 36, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 37, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 38, или
д) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 41, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 42 и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 43, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 44, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 45, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 49, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 50, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 51, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 52, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 53, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 54.

6. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 26, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 28, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 29, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 30.

7. Антитело по п. 5, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 33, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 34, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 35, и вариабельная область легкой цепи содержит CDR3-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 36, CDR2-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 37, и CDR1-участок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 38.

8. Антитело по одному из пп. 1-7, отличающееся тем, что антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG1 или человеческое антитело подкласса IgG4.

9. Антитело по одному из пп. 1-7, отличающееся тем, что антитело представляет собой человеческое антитело подкласса IgG1.

10. Антитело по пп. 1-7, предназначенное для лечения рака.

11. Антитело по пп. 1-7, предназначенное для лечения потери костной ткани.

12. Антитело по пп. 1-7, предназначенное для предупреждения или лечения метастазов.

13. Антитело по пп. 1-7, предназначенное для лечения воспалительных заболеваний.

14. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения опосредуемых CSF-1R заболеваний, отличающаяся тем, что содержит в эффективном количестве антитело по пп. 1-7 и приемлемые добавки.

15. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по пп. 1-7.

16. Экспрессионный вектор, отличающийся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п. 15, для экспрессии антитела по пп. 1-7 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.

17. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии антитела по пп. 1-7, содержащая вектор по п. 16.

18. Применение антитела по пп. 1-7 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.

19. Применение антитела по пп. 1-7 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения потери костной ткани.

20. Применение антитела по пп. 1-7 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения метастазов.

21. Применение антитела по пп. 1-7 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных заболеваний.

22. Способ получения рекомбинантного антитела по пп. 1-7, отличающийся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту по п. 15 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют антитело из клетки или супернатанта клеточной культуры.

Изобретение относится к области иммунологии. Представлено выделенное антитело или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями, раскрытыми в описании, или с аминокислотными последовательностями вариабельных областей, по меньшей мере на 90% идентичными указанным последовательностям, где вариабельная область легкой цепи содержит CDR1: RASESVEYYGTSLMQ, CDR2: GASNVES и CDR3: QQSRKLPWT, и вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1: TYGIN, CDR2: WIYPRDGSTNFNENFKD и CDR3: LTGGTFLDY, где антитело или его антиген-связывающая часть специфически связывают внеклеточный домен Toll-подобного рецептора 2 и являются антагонистом функции Toll-подобного рецептора 2.

Антитела к человеческому nkg2d и их применения // 2563343

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны выделенное моноклональное антитело и его антиген-связывающий фрагмент, связывающие hNKG2D и поперечно сшивающие не более двух димеров hNKG2D при добавлении к NK или Т клеткам, экспрессирующим NKG2D, включающие: CDR1 тяжелой цепи, содержащий SYYWS; CDR2 тяжелой цепи, содержащий HISYSGSANYNPSLKS; и CDR3 тяжелой цепи, содержащий WDDAFNI; и CDR1 легкой цепи, содержащий RASQSVSSSYLA; CDR2 легкой цепи, содержащий GASSRAT; и CDR3 легкой цепи, содержащий QQYGSSPWT.

Антитела против ох40 и способы их применения // 2562874

Изобретение относится к биохимии. Раскрыто антитело человека, которое специфично связывается с OX40 человека.

Tlr3 связывающие агенты // 2562865

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело, которое специфически связывает TLR3 полипептид, где указанное антитело представляет собой тетрамер, состоящий из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую и одну тяжелую цепь изотипа IgG, и где указанное антитело ингибирует передачу сигнала TLR3 полипептидом без блокирования связывания дсРНК TLR3 лиганда с TLR3 полипептидом.

Антитела к рецепту глюкагона и их использование // 2562110

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Представлено выделенное антитело (Ab7), специфически связывающееся с рецептором глюкагона человека, содержащее тяжелую цепь и легкую цепи, вариабельные области которых содержат аминокислотные последовательности, представленные в описании как SEQ ID NO:12 и 28, соответственно.

Cd3-эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью // 2561457

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к модулированию Т-клеточного иммунитета в отношении клеток, экспрессирующих специфический мембранный антиген предстательной железы (PSMA).

Антитела к her3 и их применения // 2560583

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые связываются с человеческим HER3, к способу их производства, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и к их применению для лечения рака.

Антитело против c-met // 2560257

Изобретение относится к биохимии. Описаны антитело, способное к специфичному связыванию с рецептором c-Met человека и/или способное к специфичному ингибированию тирозинкиназной активности этого рецептора, с улучшенной антагонистической активностью, содержащее модифицированную шарнирную область, и композиция, содержащая такое антагонистическое антитело к c-Met, и его применение в качестве лекарства для лечения рака.

Антитела против bv8 и их применение // 2559542

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложены варианты антител против Bv8 человека или макака, каждое из которых характеризуется тем, что содержит 6 CDR.

Psma×cd3 биспецифическое одноцепочечное антитело с межвидовой специфичностью // 2559531

Гетероциклические аналоги пиримидина в качестве ингибиторов jak // 2564419

Изобретение относится к соединению структурной формулы (I), которое обладает ингибирующей активностью в отношении JAK киназ. В формуле (I) R представляет собой Н; F; Cl; СН3 или CF3; цикл А представляет собой 5-членный ароматический гетероцикл, в котором Z1, Z2 и Z3 независимо выбраны из группы, состоящей из C(R1); N и N(R1), при условии, что, как минимум, один из Z1, Z2, Z3 представляет собой N или N(R1); каждый из R1 независимо представляет собой Н, C(O)R2; Т1; C1-6алкил; где С1-6алкил необязательно замещен одним или несколькими R3, которые являются одинаковыми или различными; R2 выбран из Т1; R4, R4a независимо выбраны из группы, состоящей из Н; Т1; С1-6алкила; где С1-6алкил необязательно замещен одним или несколькими R5, которые являются одинаковыми или различными; Y0 представляет собой (CRY3RY4)n; n означает 0 или 1; одна из групп RY1; RY2; RY3; RY4 представляет собой RY0, и другие выбраны из группы, состоящей из Н и СН3; X1 представляет собой C(R6a) или N; X2 означает C(R6b) или N; X3 означает СН; X4 означает C(R6c); X5 означает C(R6d).

Новый агонист ер4 // 2564414

Изобретение относится к соединению, представленному формулой (1), где каждый из заместителей R1 и R2 независимо представляет собой атом водорода или линейную алкильную группу, включающую 1-3 атома углерода, R3 означает алкильную группу, включающую 1-4 атома углерода, или его фармацевтически приемлемой соли, а также изобретение относится к лекарственному средству, включающему это соединение в качестве антагониста EP4, применимое для профилактики и/или лечения иммунных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, сердечных заболеваний, респираторных заболеваний, глазных заболеваний, почечных заболеваний, заболеваний печени, заболеваний костей, язвенного заболеваний пищеварительного тракта, язвенного колита или болезни Крона, а также неврологических заболеваний, кожных заболеваний и т.п.

Способ и композиция для уменьшения агрегации макромолекул при физиологических условиях // 2563823

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для минимизации воспаления в месте инъекции в процессе подкожного введения анти-СБ20-антитела в концентрации, составляющей от 100 мг/мл до 200 мг/мл, предусматривающий добавление к композиции, содержащей указанную макромолекулу, от 2% до 30% циклодекстрина.

Смесь для грудных детей с пробиотиками и компонентами оболочек жировых шариков молока // 2563355

Предложена питательная композиция, содержащая штамм Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 и оболочки жировых шариков молока (MFGM), в которой MFGM усиливают биологическое действие указанного штамма.

Педиатрические композиции для лечения рассеянного склероза // 2562571

Группа изобретений относится к медицине и фармакологии и касается лечения рассеянного склероза. Предложены: фармацевтическая композиция указанного назначения для детей, содержащая 0,25 мг и менее 2-амино-2-[2-(4-С2-С20алкилфенил)этил]пропан-1,3-диола или его фармацевтически приемлемой соли для введения 1 раз в день, применение указанного соединения (FTY720) по 0,25 мг и менее для изготовления лекарственного средства для лечения, предупреждения или замедления развития рассеянного склероза у пациента педиатрического возраста для введения 1 раз в день и соответствующий способ лечения, предупреждения или замедления развития рассеянного склероза у пациента педиатрического возраста.

Cd3-эпсилон-связывающий домен с межвидовой специфичностью // 2561457

Кислородзамещенные производные 3-гетероароиламинопропионовых кислот и их применение в качестве фармацевтических средств // 2561126

Изобретение относится к соединениям формулы I и их фармацевтически приемлемым солям, где А представляет собой C(R1); D представляет собой N(R2); Е представляет собой N; G выбирают из группы, состоящей из R71-O-C(O)- и R72-N(R73)-С(O)-; R1 выбирают из водорода, галогена и (С1-С6)-алкила; R2 выбирают из (C1-C7)-алкила, (С3-С7)-циклоалкил-CsH2s- и Ar-CsH2s-, где s равен 0, 1, 2 и 3; R10 выбирают из R11-O-, R12-N(R13)-С(О)-О- и Het2-C(O)-О-; R11 выбирают из водорода, R14, (С3-С7)-циклоалкила и Ar; R12 и R13 независимо друг от друга выбирают из водорода, R15 и Ar; R14 представляет собой (C1-С10)-алкил, который необязательно замещен 1-3 одинаковыми или различными заместителями, выбранными из галогена, НО-, R16-O-, оксо, (С3-С7)-циклоалкила, необязательно замещенного 1-3 атомами фтора, Ar, Het1, Het3, ди((C1-C4)-алкил)N-С(О)- и Het1-C(O)-; R15 представляет собой (С1-С6)-алкил; R16 представляет собой (C1-C6)-алкил, который необязательно замещен (С1-С4)-алкил-О-; R30 выбирают из группы, состоящей из R31, R32-CuH2u- и Het3-CuH2u-, где u равен 0; R31, R32 и R33 являются такими, как указано в формуле изобретения; R40 представляет собой водород; R30 и R40 вместе представляют собой (СН2)x, при этом х равен 2, 3, 4 или 5; R50 выбирают из группы, состоящей из водорода и НО-; R60 представляет собой водород; R71, R72 и R73 являются такими, как указано в формуле изобретения; Ar выбирают из группы, состоящей из фенила и ароматического 6-членного моноциклического гетероцикла, который включает один атом азота, при этом фенил и гетероцикл являются необязательно замещенными 1-3 одинаковыми или различными заместителями, выбранными из галогена, (С1-С6)-алкила, необязательно замещенного 1-3 атомами фтора, (C1-C6)-алкил-О-, (C1-C6)-алкил-S(О)m-, H2N-S(O)2- и NC-; Het1, Het2, Het3 и Het4 являются такими, как указано в формуле изобретения; m равен 0, 1 и 2.

Новое производное никотинамида или его соль // 2560163

Изобретение относится к производным никотинамида формулы (I), обладающим свойством ингибитора Syk-киназы, и к фармацевтической композиции на их основе. В общей формуле (I) R1 обозначает атом галогена; R2 обозначает заместитель, представленный следующей формулой (II-1) , в R3 обозначает пиридильную группу, представленную следующими формулами (VIII-1) или (VIII-2), R4 и R5 обозначают атом водорода.

Соединения 8-метил-1-фенилимидазо[1, 5-а]пиразина // 2560162

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым производным 8-метил-1-фенилимидазо[1,5-a]пиразина формулы I или к его фармацевтически приемлемым солям, где R1: 1-2 группы, независимо выбираемые из водорода, гидрокси, (1-6C)алкокси, галогена; R2: Н или (1-6C)алкил; R3: (R31)(R32)CH-O; или (1-6C)алкокси; или гетероарил, который представляет собой индол, пиррол, индазол, пирролопиридин, тиенопиррол, необязательно замещенный 1-2 группами, выбранными из R34, R35, R36, галогена, гидрокси; R31: (1-5C)алкил, необязательно замещенный одним гидрокси; R32: (1-5C)алкил; R34: (1-6C)алкил; R35: (1-6C)алкокси; R36: водород или (1-6C)алкил; R4: , или R4: (1-4C)алкил, независимо замещенный 1 заместителем, выбираемым из R8, гидрокси; где m, n, r равно 1 или 2; Y: CR5 или N; X: O, CHR6, C(R66)(R67), NR7, C=O; Z: O или Z образует с R9 5-членный гетероциклил, замещенный R91; R5: H или (1-6C)алкил; R6: R61, R62, R63, R65, H, гидрокси; R7: R71, R72, R73, R74, H; R8: имидазол; R9: Н или (1-6C)алкил, необязательно замещенный одним или несколькими атомами фтора; R61: амино(1-4C)алкил, [(1-6C)алкил]амино(1-4C)алкил, (ди)[(1-6C)алкил]амино(1-4C)алкил, [(1-4C)алкилкарбонил]амино(1-4C)алкил, [(1-4C)алкоксикарбонил]амино(1-4C)-алкил; R62: (1-4C)алкилкарбонилокси, (3-6C)циклоалкиламинокарбонилокси; R63: амино, [(1-6C)алкил]амино, (ди)[(1-6C)алкил]амино, [(1-6C)алкокси(2-6C)алкил]амино, [(1-6C)алкил][(1-6C)алкокси(2-6C)алкил]амино, [(1-6C)-алкилкарбонил][(1-6C)алкокси(2-6C)алкил]амино; все алкильные группы в R63 необязательно замещены 2 атомами фтора; R65: N-присоединенный гетероциклил, который представляет собой пиперазин, азетидин, морфолин, необязательно замещенный 1 оксогруппой, или 2 атомами фтора или одной группой R651; R66: [(1-6C)алкил]амино(1-4C)алкил; R67: гидрокси; R71: (1-6C)алкил; R72: (1-4C)алкил, замещенный 1 группой R725; R73: R732карбонил, R733карбонил или R735карбонил; R74: гетероциклил, который представляет собой тетрагидропиран или пиперидин, необязательно замещенный одной группой R741; R91: (1-6C)алкил, замещенный 3 атомами фтора; R651: (1-4C)алкил, (1-4C)алкилкарбонил; R725: (ди)[(1-6C)алкил]-аминокарбонил; R732: (1-4C)алкил, амино(1-4C)алкил, (ди)[(1-6C)алкил]-амино(1-4C)алкил, гидрокси(1-4C)алкил, (1-6C)алкокси(1-4C)алкил; R733: (1-6C)алкокси; R735: амино; R741: (1-4C)алкилкарбонил.

Производные дигидроптеридинона, способ их получения и фармацевтическое применение // 2559881

Изобретение относится к новым производным дигидроптеридинона формулы (I), способу их получения (вариантам) и их фармацевтическому применению в качестве ингибиторов Plk киназы.

Бензамидные производные, обладающие противораковой активностью, способ их получения и их применение // 2565079

Изобретение относится к соединению, представленному формулой (I), или его фармацевтически приемлемой соли, где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, незамещенного (C1-C8)алкила, -COR5 и -CO2R6; R1 и R2 также могут циклизоваться с образованием замещенного или незамещенного 4-, 5- или 6-членного кольца, выбранного из морфолина, пиперидина, пирролидина, пиперазина, азетидина, 4-метилпиперазина; R3 представляет собой нитро или нитрозо; R4 выбран из группы, состоящей из этинила, пропинила или циано; R5 выбран из группы, состоящей из незамещенного (C1-C8)алкила или незамещенного арила; R6 представляет собой незамещенный (C1-C8)алкил.